CN101821393A - 诱导t细胞细胞因子的表面分子和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了细胞因子调节剂和使用其在单核细胞谱系来源的细胞中调节细胞因子的产生的方法。特别地，本发明的细胞因子调节剂选择性地结合T淋巴细胞的诱导T细胞细胞因子的表面分子(TCISM)-配体或单核细胞谱系来源的细胞的相应的TCISM受体，从而在单核细胞谱系来源的细胞中调节细胞因子的产生。

Description

诱导T细胞细胞因子的表面分子和使用方法
发明领域
本发明涉及细胞因子调节剂和使用其在单核细胞谱系来源的细胞中调节细胞因子的产生的方法。
发明背景
众多的临床状况由急性和/或慢性炎症介导，所述炎症包括但不限于类风湿性关节炎、多发性硬化、克罗恩病、银屑病、银屑病关节炎、格雷夫斯病(Graves Disease)、自身免疫性多内分泌腺综合征、遗传性蛋白尿综合征(Hereditary ProteinuriaSyndrome)、I型糖尿病、系统性红斑狼疮、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性甲状腺炎、肝炎、获得性免疫缺陷病(HIV)、移植物抗宿主病、同种异体移植疾病(Allograft Disease)、哮喘、皮肤T细胞淋巴瘤、HTLV-I-相关皮肤T细胞淋巴瘤、HTLV-II-相关淋巴瘤、毛细胞白血病(Hairy Cell Leukemia)、特发性CD4+T淋巴细胞减少症或黑色素瘤。据信，牵涉炎症的机制之一是通过活化单核细胞谱系来源的巨噬细胞(Mφ)上调细胞因子。例如，已显示，在损伤中产生的促炎细胞因子例如肿瘤坏死因子-α(TNFα)和白细胞介素-1β(IL-1β)诱导和维持慢性损伤炎症。最近，相关动物模型中的研究显示，T细胞(Tc)在Mφ的活化中起着关键作用；然而，已显示T细胞细胞因子例如白细胞介素-4、10和13(IL-4、IL-10和IL-13)起着抗炎作用或只微弱地诱导TNFα/IL-1β上调。
因此，存在对调控炎症以治疗各种与急性和/或慢性炎症相关的临床状况的需要。
发明概述
本发明的一些方面涉及细胞因子调节剂和使用其在单核细胞谱系来源的细胞中调节细胞因子的产生的方法。在一些特定的实施方案中，本发明提供了促炎细胞因子调节剂和使用其在单核细胞谱系来源的细胞(通常为人单核细胞谱系来源的细胞)中调节促炎细胞因子的产生的方法。不受任何理论的束缚，据信，当单核细胞谱系来源的细胞与不同的效应T细胞群体发生细胞间直接接触时，它们被活化。在TCISM配体和/或TCISM受体的水平上控制适应性(即，获得性)免疫提供了在微生物感染(例如，细菌性皮肤感染)过程中仍然允许先天免疫的治疗性干预。
本发明的一个方面提供了用于在受试者的单核细胞谱系来源的细胞中调节细胞因子的产生的方法，其包括对所述受试者施用细胞因子调节剂，其中所述细胞因子调节剂选择性结合T淋巴细胞的诱导T细胞细胞因子的表面分子(T-cell cytokine-inducingsurface molecule，TCISM)-配体或单核细胞谱系来源的细胞的相应的TCISM-受体，由此细胞因子调节剂与TCISM-配体或TCISM-受体的选择性结合在单核细胞谱系来源的细胞中调节细胞因子的产生。
在一些实施方案中，TCISM-配体包含至少一种表1中所列的TCISM-配体(图19)。在这些实施方案中，在一些情况下TCISM-配体包括CD81、CD21、CD316、α-烯醇化酶、FKBP4、FKBP多基因家族的其他成员、或其组合。FKBP多基因家族的成员包括但不限于FKBP12(FKBP1A)、FKBP12.6(FKBP1B)、FKBP13(FKBP2)、FKBP9(FKBP11)、FKBP22(FKBP14)、FKBP23(FKBP7)、FKBP25(FKBP3)、FKBP36(FKBP6)、FKBP37(AIP)、FKBP38(FKBP8)、FKBP51(FKBP5)、FKBP52(FKBP4)、FKBP60(FKBP9)和FKBP65(FKBP10)。
在其他实施方案中，单核细胞谱系来源的细胞包括单核细胞谱系来源的巨噬细胞、抗原呈递细胞(APC)、树突细胞、郎格汉斯细胞、库普弗细胞(Kuppfler Cell)或其组合。
在其他实施方案中，T淋巴细胞是CD3+T淋巴细胞。
在其他实施方案中，被调节的细胞因子包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-32(IL-32)或其组合。
在其他实施方案中，TCISM-配体是存在于CD3+淋巴细胞上的TCISM-配体。在这些实施方案中，在一些情况下TCISM-配体包括CD81、CD21、CD315、CD316、α-烯醇化酶、FKBP、或其组合。示例性FKBP包括但不限于FKBP4、FKBP12(FKBP1A)、FKBP12.6(FKBP1B)、FKBP13(FKBP2)、FKBP9(FKBP11)、FKBP22(FKBP14)、FKBP23(FKBP7)、FKBP25(FKBP3)、FKBP36(FKBP6)、FKBP37(AIP)、FKBP38(FKBP8)、FKBP51(FKBP5)、FKBP52(FKBP4)、FKBP60(FKBP9)和FKBP65(FKBP10)。
在其他实施方案中，TCISM-受体包括存在于CD68+抗原呈递细胞上的TCISM-受体。在这些实施方案中，在一些情况下TCISM-受体包括CD81的受体、CD21的受体、CD315的受体、CD316的受体、α-烯醇化酶的受体、FK结合蛋白的受体、或其组合。在一些情况下，TCISM-受体包括CD19、CD21、CD225、CD315、CD316、C3dR、CD19、CD81、BCR、CD9、CD81、KAI1/CD82、FK506、雷帕霉素(西罗莫司)、依维莫司、环孢素、他克莫司、其他合成的小分子免疫抑制剂的受体，或其组合。一般地，TCISM-受体是指这样的受体，其存在于单核细胞谱系来源的细胞上，且当与配体结合时，其刺激细胞因子在单核细胞谱系来源的细胞中产生。
本发明的另一个方面提供了用于在受试者中治疗由急性或慢性炎症介导的临床状况的方法，该方法包括对所述受试者施用细胞因子调节剂，其中细胞因子调节剂选择性结合T淋巴细胞的诱导T细胞细胞因子的表面分子(TCISM)-配体或单核细胞谱系来源的细胞的相应的TCISM-受体，由此细胞因子调节剂对细胞因子的产生的调节可用于治疗由急性或慢性炎症介导的临床状况。
在一些实施方案中，细胞因子调节剂选择性结合CD3+淋巴细胞上的TCISM-配体。
在其他实施方案中，细胞因子调节剂选择性结合CD68+单核细胞上的TCISM-受体。
在其他实施方案中，临床状况包括自身免疫性疾病。在这些实施方案中，在一些情况下，自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎、多发性硬化、克罗恩病、银屑病、银屑病关节炎、格雷夫斯病、自身免疫性多内分泌腺综合征、遗传性蛋白尿综合征、I型糖尿病、系统性红斑狼疮、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性甲状腺炎、肝炎、获得性免疫缺陷病(HIV)、移植物抗宿主病、同种异体移植疾病、哮喘、皮肤T细胞淋巴瘤、HTLV-I-相关皮肤T细胞淋巴瘤、HTLV-II-相关淋巴瘤、毛细胞白血病、特发性CD4+T淋巴细胞减少症或黑色素瘤，或其组合。
本发明的另一个方面提供了治疗受试者的自身免疫性疾病的方法，该方法包括对需要此类治疗的受试者施用治疗有效量的针对TCISM-配体的拮抗剂或针对相应的TCISM-受体的拮抗剂。
本发明的另一个方面提供了细胞因子调节剂，其可用于通过选择性结合TCISM-配体和/或TCISM-受体来调节细胞因子的产生。
附图概述
图1是显示促分裂原刺激的人T细胞可通过细胞间接触诱导单核细胞THP-1 Mφ分泌促炎细胞因子的图。
图2是显示不同的激活刺激物诱导不同的T细胞的″TCISM配体″的活性的图。
图3是显示人“细胞因子混合物”在PBMC来源的人T细胞中诱导人TCISM-配体表达的图。
图4是显示细胞因子混合物活化的人PBMC-来源的PanCD3+T细胞不激活人THP-1细胞产生TNF-α的图。
图5是显示升高的IL-12(p70)由新获得的人血单核细胞在与TCISM配体-阳性人CD3+T细胞进行细胞间接触后产生的图。
图6是显示高度纯化的经刺激的人Hut-78T细胞膜在激活人THP-1M细胞分泌TNF-α中比用1％多聚甲醛固定的经刺激的Hut-78完整细胞更有效的图。
图7是PHA/PMA刺激的CD3+T细胞、Hut-78、H9、Molt4、Jurkat & Raji细胞中的编码膜蛋白或膜相关蛋白的基因的微阵列2D簇(cluster)的图。
图8是阐明潜在的人T细胞TCISM-配体基因候选物的表达水平的双对数“特征(signature)”基因图。
图9是测量不同的已知的人T细胞膜共刺激蛋白的PMA/PHA刺激的Hut-78T细胞或未经刺激的Hut-78T细胞的FACS分析的图。
图10是显示从被PMA/PHA刺激6小时的Hut-78人T细胞获得的总RNA的定量实时PCR(qRT-PCR)测量的图。
图11是显示抗IFN-γ、CD40L、IFN-γ+CD40L、IL-15或IL-15受体(IL-15R)的中和抗人单克隆抗体不抑制由活化的Hut-78T细胞的纯化的膜驱动的THP-1Mφ细胞中的TNF-α或IL-1β的产生的图。
图12是抗潮霉素的Flp-In 293细胞的FACS分析的图。
图13是显示CD40L+IFN-γ刺激TNF-α产生但不刺激IL-1β产生(使用flp-in分子分析法)的图。
图14是显示在一些情况下抑制T细胞介导的TNFα从人Mφ的产生(即，适应性免疫)，而对LPS-刺激的TNFα和IL-1β的产生(即，先天性免疫)没有任何作用的图。
图15是p的一个可能的机制的示意图。
图16是显示不同的小分子TNFα抑制剂在小鼠的鼠胶原诱导的关节炎中的评估的图。
图17是显示抗-TNFα和IL-1ra治疗小鼠的功效的图。
图18是代表性小鼠的关节组织病理学切片。
图19是列举TCISM-配体的表1。
发明详述
据信，Tc-诱导的Mφ活化的活化机制之一是通过直接的细胞间接触(通过免疫突触机制)。活化的T细胞表达许多已知的和未知的膜相关蛋白。本发明者已发现，在本文中称为诱导Tc细胞因子的表面分子(即，TCISM或TCISM-配体)的此类分子中的一些分子通过选择性结合存在于Mφ中的相应的TCISM-受体来参与细胞间接触信号传导级联，从而导致促炎细胞因子的诱导。
众多的临床状况由急性或慢性炎症介导，所述炎症包括但不限于类风湿性关节炎、多发性硬化、克罗恩病、银屑病、银屑病关节炎、格雷夫斯病、自身免疫性多内分泌腺综合征、遗传性蛋白尿综合征、I型糖尿病、系统性红斑狼疮、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性甲状腺炎、肝炎、获得性免疫缺陷病(HIV)、移植物抗宿主病、同种异体移植疾病、哮喘、皮肤T细胞淋巴瘤、HTLV-I-相关皮肤T细胞淋巴瘤、HTLV-II-相关淋巴瘤、毛细胞白血病、特发性CD4+T淋巴细胞减少症和/或黑色素瘤。本发明者还发现，此类临床状况可通过调节单核细胞谱系来源的巨噬细胞中的细胞因子产生(通过施用可选择性结合T淋巴细胞的TCISM-配体和/或单核细胞谱系来源的细胞的相应的TCISM-受体的细胞因子调节剂或通过例如用iRNA或siRNA抑制TCISM-配体的转录)来治疗。
本发明的一些方面提供了TCISM-配体和在受试者的单核细胞谱系来源的细胞中调节细胞因子的产生(通过施用选择性结合T淋巴细胞的诱导T细胞细胞因子的表面分子(TCISM)-配体或单核细胞谱系来源的细胞的相应的TCISM-受体的细胞因子调节剂或通过抑制TCISM-配体的转录)的方法。
在一些实施方案中，TCISM-配体包括至少一个表1中所列的TCISM-配体(图19)。这些TCISM-配体的相应TCISM-受体可由本领域技术人员容易地确定。例如，通过使用细胞间接触生物测定法，使用中和单克隆或多克隆抗体抑制TCISM-配体与TCISM受体的相互作用。另一个方法是使用经刺激的和未经刺激的Hut-78和H9亚克隆T细胞膜鉴定阻断细胞间接触的单克隆抗体的消减免疫法(SubtractiveImmunization)。不受任何理论的束缚，据信，单核细胞-巨噬细胞的接触介导的活化是诱导细胞因子产生的主要途径。因此，该机制的调节，例如，IL-1和TNF-α的产生在触发水平上的阻断或TCISM-配体或TCISM-受体的表达的抑制(例如，通过siRNA)，可用于治疗由细胞因子的产生介导的临床状况。
本发明的一些组合物和方法可用于选择性结合存在于单核细胞谱系来源的细胞中的TCISM-受体(或通过抑制这样的受体的表达或转录)，从而调节细胞因子在此类单核细胞谱系来源的细胞中的产生。单核细胞谱系来源的细胞包括当被T淋巴细胞活化时产生细胞因子的任何细胞。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法调节促炎细胞因子的产生。
产生细胞因子的示例性单核细胞谱系来源的细胞包括但不限于单核细胞谱系来源的巨噬细胞、抗原呈递细胞(APC)、树突细胞、郎格汉斯细胞和库普弗细胞。
本发明的组合物和方法包括可选择性结合TCISM-配体或TCISM-受体的分子。此外，本发明的组合物和方法还包括可调节TCISM-配体或TCISM-受体的翻译、转录和/或表达的分子。例如，可对T淋巴细胞施用siRNA以调节TCISM-配体的表达。在知道适当的TCISM-配体的情况下，本领域技术人员可容易地鉴定可调节TCISM-配体的表达的适当的siRNA。例如，可以用可商购获得的计算机软件设计针对编码全长蛋白质的信使RNA的siRNA，所述计算机软件使得能够确定在转录过程中最易于去稳定的mRNA区段。
在TCISM的水平上控制适应性(获得性)免疫是有利的，因为治疗性干预在细菌性皮肤感染期间允许先天性(天然)免疫。因此，本发明的一些方面提供了用于调节适应性或获得性免疫同时基本上保持先天性免疫的组合物和方法。
本发明的示例性TCISM-配体、TCISM-受体和/或细胞因子调节剂化合物包括但不限于具有下式的化合物、其类似物和衍生物：
Figure G2008800246470D00081
使用原代人T细胞及自体新鲜获得的人血单核细胞或人T细胞及单核细胞细胞系建立具有高度重现性和经确认有效的细胞间接触生物测定。图1是显示促分裂原刺激的人T细胞可通过细胞间接触诱导单核细胞THP-1 Mφ分泌促炎细胞因子的图。图1是细胞间接触24h和48h时的细胞因子的时程测量(time course measurement)。将THP-1 Mφ中的TNF-α(左图)和IL-1β(右图)产物与不同的PMA/PHA刺激的人T细胞系一起温育。将来自单核细胞系THP-1的细胞与高度纯化的来自经刺激的(“s”)或未经刺激的(ns)静息T细胞的膜制剂一起温育；在温育后24小时或48小时测量细胞因子的产量。在两个时期都从与sHut-78和sH9T细胞一起温育的THP-1Mφ检测到TNF-α和IL-1β的产量的显著增加。提供了一式三份的测量的平均值+/-标准差。如图1中所显示的，在PHA/PMA刺激的Molt4、Jurkat和Raji细胞中只观察到TNF-α和IL-1β的产生的少量诱导，而在静息原代人T细胞、未受刺激的Hut-78、H9、Molt4、Jurkat或Raji细胞中未观察到可检测的产量。还观察到PMA/PHA-刺激的H9细胞和Hut-78细胞(在较低的程度上)诱导了TNF-α和IL-1β的最大THP-1Mφ分泌，表明这些细胞是TCISML阳性的。
PMA/PHA刺激物在人T细胞上提供了TCISML的显著诱导，因为在24h的培养期后，在培养物中产生了升高水平的TNF-α。参见图2。在图2中，从健康人供体血液分离Pan CD3+T细胞，在37℃下刺激6小时，清洗，并用1％的多聚甲醛固定(6h RT)。然后用PBS漂洗细胞，在RT下保持过夜。然后加入PBMC-来源的CD14+Mφ，且在37℃下温育24小时。将细胞培养物上清液离心，过滤灭菌，然后利用ELISA测量细胞因子水平。显示了平均值±SEM(N＝6个单独的供体，一式三份地测量；P＜0.05，与未经刺激的T细胞相比较)。对于用αCD3/αCD28体外刺激的T细胞观察到相当的数据。与单独的完整T细胞对照培养物相比较，在T细胞和Mφ共培养系统中产生了几乎2倍的TNF-α。
如图3中所显示的，结果显示细胞因子混合物#1(IL2+IL6+TNF-α)或#2(IL15+IL6+TNF-α)活化的人T细胞，当以1∶8(血液单核细胞∶T细胞)的比例混合时，可激活人单核细胞产生升高水平的TNF-α和IL-1β(大约100-250pg/ml)。这些细胞因子水平显著高于由单独的被细胞因子活化的、固定的T细胞释放的促炎细胞因子的水平。在图3中，从健康人供体分离Pan CD3+T细胞，将其与不同的细胞因子混合物(■IL2+IL6+TNF-α；
Figure G2008800246470D00091
IL-15+IL-6+TNF-α；未被刺激的T细胞)一起在37℃下温育8天，进行清洗，然后用新鲜的1％的多聚甲醛进行固定(6h RT)。然后用PBS漂洗细胞，在RT下保持过夜。随后加入新鲜获得的人血单核细胞，将其与T细胞一起温育(在37℃进行24小时)。收集细胞培养物上清液，利用ELISA测量细胞因子水平。显示了平均值±SEM(N＝4个单独的供体，一式三份地测量)。用来自相同供体的纯化的Pan CD3+T细胞进行两个分开的实验以验证这些发现。
还检测用细胞因子混合物#1或#2刺激的人PBMC-来源的CD3+T细胞是否诱导足以激活人THP-1细胞产生TNF-α和IL-1β的TCISM的表达。如图4中所示，与被细胞因子活化的T细胞组合的THP-1细胞导致产生升高水平的TNF-α，然而，诱导的细胞因子水平没有显著高于由单独的经多聚甲醛固定的、被细胞因子刺激的T细胞诱导的细胞因子水平。在图4中，从健康人供体分离Pan CD3+T细胞，将其与不同的细胞因子混合物(■IL2+IL6+TNF-α；
Figure G2008800246470D00101
IL-15+IL-6+TNF-α；
Figure G2008800246470D00102
未被刺激的T细胞)一起在37℃下温育8天，进行清洗，然后用新鲜的4％的多聚甲醛进行固定(6h RT)。随后用PBS漂洗细胞，在RT下保持过夜，然后将其加入至THP-1细胞中(在37℃下进行24小时)。如上收集细胞培养物上清液，然后通过ELISA测量细胞因子水平。显示了平均值±SEM。
如图5中所示，用PMA/PHA或αCD3/αCD28体外刺激从健康人自愿者的外周血获得的Pan CD3+人T细胞，进行6小时，然后用新鲜的1％的多聚甲醛在室温下固定过夜。然后，向组织培养板中加入新鲜获得的人血单核细胞，在37℃下将其与固定的T细胞一起温育，进行6小时或24小时的培养。然后如上所述收集上清液，且利用ELISA测量不同的Th1和Th2细胞因子水平。PMA/PHA刺激的T细胞有效地活化人血单核细胞，使其以大约1000至1250pg/ml的水平产生IL-12(p70)，特别是在6小时的细胞间接触之后(图4)。类似地，αCD3/αCD28-刺激的T细胞也有效地激活人血单核细胞的IL-12(p70)的释放，尽管程度较低。最后，两种类型的被刺激的人T细胞在这两个不同的时期都能活化人血单核细胞，使其产生IL-1β和TNF-α。
比较PMA/PHA和αCD3/αCD28刺激的Hut-78T细胞与PMA/PHA和αCD3/αCD28刺激的Hut-78T细胞的膜的活性(活化THP-1细胞产生TNF-α的活性)(参见图6)。显示PMA/PHA刺激的Hut-78T细胞的数据用于举例说明目的。用相同的Hut-78细胞培养物批次进行这些研究以减少生物测定的变异性。结果显示，与用1％的多聚甲醛固定的经刺激的Hut-78相比较，经刺激的Hut-78T细胞的纯化的膜在体外诱导THP-1细胞的TNF-α产生中更有效。还进行混合和匹配“反加”实验(mix and match″add back″experiment)以证明在低速和高速离心步骤过程中TCISM主要存在于纯化的膜级分中，而非Parbomb细胞上清液(例如，细胞溶胶)级分中(参见图6)。在图6中，如上所述制备膜，然后在细胞间接触生物测定中将其与THP-1细胞组合。在24小时的培养后，取出上清液，对其进行离心，过滤灭菌，然后利用ELISA测量细胞因子水平。显示了平均值+/-SD。
典型的阵列特征谱(array profiling)“热图(heatmap)”示于图7，其为PHA/PMA刺激的CD3+T细胞、Hut-78、H9、Molt4、Jurkat & Raji细胞中编码膜蛋白质或膜相关蛋白的基因的微阵列2维(2D)簇。进行至少4个实验(倍数变化＞2且P值＜0.01)。在图7中，红色代表基因表达水平＞2.0(即；高于阵列特征谱背景水平)，绿色代表基因表达水平＜2.0(即；低于阵列特征谱背景水平)。在数据检查(data review)的计算机评估阶段，只考虑人T细胞膜相关的且在TCISM(+)T细胞系中上调的和在TCISM(-)T细胞系中下调的基因。检查50,000个由微阵列实验产生的基因中的大约10,000个基因，其中焦点集中于在Hut-78和H9细胞中被上调但在人Molt-4和Jurkat T细胞中不被上调的T细胞基因上。
从具有大约100个潜在的人T细胞TCISM候选物的经评审的(curated)列表产生双对数强度图(其在线性标度上绘制)以鉴定TCISM候选物。这些图(参见，例如，图8)描述了“未改变的”、“特征”、“下调的”和“上调的”T细胞基因产物，以及基因产物的相对表达水平(与总的阵列特征谱结果相比较)。鉴定了5个候选人T细胞TCISM基因：白喉毒素受体或肝素结合EGF(DTR，包含EGF元件的粘蛋白样激素受体2(EMR2)，Adamlysin-17(ADAM或解联蛋白和金属蛋白酶)TNFα-转化酶(TACE，TNF受体超家族成员9(TNFRSF9或LIGHT)，以及用于细胞间接触阳性对照的目的(基于公开的科技文献的综述)，TNFRSF5或CD40配体(CD40L)。
为了确认TCISM候选基因在PMA/PHA-刺激的Hut-78和H9亚克隆T细胞中的表达，进行实时qRT-PCR(参见图9)。TCISM候选物DTR和LIGHT满足预先设定的标准，因为两个基因都在经刺激的Hut-78和H9T细胞中高表达，但在Molt-4和Jurkat T细胞或RajiB细胞中不上调。然而，TACE和EMR2在TCISM(-)人Raji B细胞系中都被高度上调。FACS也用于验证这些分子在被活化的H9细胞上的存在(参见图10)。
在细胞间接触生物测定中检测大约50个不同的可商购获得的抗已知的人T细胞表面蛋白的中和单克隆抗体(包括抗ALCAM、CD6、β2-整联蛋白、CD69、CD23、CD40-CD40L和LAG-3的mAb)。已发现，它们在该系统中对促炎细胞因子的产生的抑制不超过大约30％。观察到的更有效的多克隆抗体制剂之一是抗-ADAM-17(TACE)。用可获得的多克隆抗体进行这些实验。在生物测定中使用高特异性的抗CD40L mAb没有显著阻断TNF-α或IL-1β细胞因子的产生(参见图11)。在图11中，用PMA/PHA刺激Hut-78细胞，进行6小时，在此时如之前所述制备纯化的膜。将Hut-78膜和所示浓度的抗人mAb加至共培养孔，并且让其在37℃下温育2小时。然后向共培养孔中加入新近传代的定居(resident)THP-1细胞，并在37℃下保持24小时。收集上清液以进行TNF-α和IL-1βELISA。图11显示在各mAb浓度上进行的两个分开的实验(进行一式三份的细胞因子测量)。
FACS分析显示，经转染的293细胞(图12)一致地在它们的细胞表面上表达升高水平的TCISML基因产物。在图12中，用p0G44将pcDNA5/FRT/DTR、EMR2-07(包含EGF样结构域1、2和5的同种型)或CD40L分别共转染入Flp-In 293细胞和Jurkat细胞，然后在500mg/ml潮霉素中选择集落。用细胞解离缓冲液(disassociationbuffer)使细胞脱落，然后通过FACS进行分析。(抗CD97与EMR2-07发生交叉反应，用于检测EMR2-07的表达)。在数次细胞培养传代后表达保持稳定，这表明它们适合用于细胞间接触测定。在细胞间接触测定中使用经转染的293细胞进行初步实验(参见图13)。DTR和CD40L构建体有效地增加sHut-78m驱动的TNF-α/IL-1β的THP-1诱导(图13)。向测定中加入外源IFN-γ导致CD40L-诱导的Mφ活化的水平和随后TNF-α释放的水平增加(图13的左图)，但不导致IL-1β释放的水平增加(图13的右图)。对于用CD40L转染的293或Jurkat细胞，此类作用是高度可重现的。
在健康人T细胞和从具有活性Ps和PsA的患者获得的T细胞中鉴定了人T细胞TCISM。如所观察到的，体外细胞间接触生物测定是鉴定共培养物中的人T细胞与人Mφ之间的免疫突触机制的高度可重现的人细胞因子“读出系统”。已观察到，PMA/PHA-刺激的H9细胞和Hut-78细胞诱导TNF-α和IL-1β的THP-1分泌(表明这些细胞是TCISM阳性的)，而PHA/PMA刺激的Molt4、Jurkat、Raji细胞和静息原代人T细胞、未经刺激的Hut-78、H9、Molt4、Jurkat或Raji细胞是TCISM阴性(图1)。
使用下列标准确定TCISM候选物：(A)与膜相关的；(B)在经刺激的Hut-78和H9细胞中上调超过2倍，但在Molt4、Jurkat和Raji细胞中不上调的；和(C)高表达水平必须得到qRT-PCR和FACS的验证。
用αCD 3/αCD28或人细胞因子混合物体外刺激的原代T细胞也在测定中增加促炎细胞因子(PIC)活性。PMA/PHA或αCD3/αCD28刺激的T细胞增强Mφ的活化以产生IL-12。已在银屑病损伤中检测到IL-12。据信，IL-12主要刺激幼稚(
Figure G2008800246470D00131
)Th细胞中的IFN-γ产生并且在Th1应答的扩展和稳定中起作用。
对来自正常健康供体与来自银屑病患者的PBMC来源的T细胞进行微阵列分析，以鉴定人T细胞TCISML分子和其经由人MφTCISMR的信号转导途径(其导致炎症和皮肤疾病(cutaneous skindisease))。使用来自健康供体、PsA和CPP患者的人T细胞的微阵列分析已鉴定了TCISM分子，包括白喉毒素受体(DTR；HB-EGF)和粘蛋白样表皮生长因子家族成员(EMR4；CD97)。还观察到许多TNF家族成员(包括4-1BB(TNFSF14)、OX-40、LIGHT(TNFSF9)和CD40L(CD154；TNFSF5))的上调。
使用大约50个不同的可商购获得的中和单克隆抗体，通过细胞间接触测定验证人TCISM候选物。在许多情况下，发现这些试剂在该系统中在24-96小时的时期内对促炎细胞因子的产生的抑制不超过30％(参见图11)。“Flip-in”转染系统法用于鉴定来自微阵列实验的5个初始候选TCISML基因候选物，包括：EMR2、DTR、4-1BB、LIGHT和CD40L。将TCISM候选基因的全长cDNA转染入TCISM阴性293和Jurkat细胞，在细胞间接触生物测定中进行表征，结果显示DTR和CD40L有效地增加T细胞驱动的MφTNF-α/IL-1β。向测定中加入外源IFN-γ导致CD40L-诱导的Mφ活化的水平和随后TNF-α释放的水平增加，但不导致IL-1β释放的水平增加(图12a-b和13)。
一些已鉴定的导致炎症和皮肤疾病的人Mφ TCISMR(TCISM-受体)包括DTR、CD97、4-1BB、OX-40、LIGHT和CD40L。将TCISM候选基因的全长cDNA转染入TCISM阴性293和Jurkat细胞，在细胞间接触生物测定中进行表征，结果显示DTR和CD40L有效地增加T细胞驱动的TNFα/IL-1β的Mφ产生。
银屑病
本发明的一个特定方面提供了用于治疗银屑病的组合物和方法。银屑病(Ps)是影响大约2％的美国人口的慢性皮肤障碍。不受任何理论的束缚，并且如图15中图解说明的，据信Ps的病理学牵涉表皮的增殖和分化、血管生成和角质形成细胞的过度增殖以及活化的T-细胞(Tc)、巨噬细胞(Mφ)、树突细胞(DC)、郎格汉斯细胞(LC)和嗜中性粒细胞(PMN)至损伤的皮肤内的浸润。在活跃的损伤处产生的促炎细胞因子(PIC)(包括肿瘤坏死因子-α(TNFα)，白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-32(IL-32))据信诱导和维持疾病例如银屑病关节炎(PsA)和Ps中的慢性皮肤炎症。据信，通过活化Mφ上调细胞因子负责此类障碍的发病机制。已表明，T细胞在Mφ的活化中起着至关重要的作用；然而，已显示Tc细胞因子例如白细胞介素-4、10和13(IL-4、IL-10和IL-13)起着抗炎作用或只微弱地诱导TNFα/IL-1β上调。据信，Tc-诱导的Mφ活化的活化机制是通过直接的细胞间接触(通过皮肤中的免疫突触机制)进行的。
免疫突触(IS)在抗原呈递细胞(APC)和T细胞之间的界面处形成，据信其是负责抗原识别和T细胞活化的结构。IS最初发现于T细胞与B细胞之间，或T细胞与包含MHC的平板双分子层(planarbilayer)之间。据信其是通过T细胞受体-主要组织相容性复合物(TCR-MHC)在称为中央超分子活化簇(c-SMAC)的IS中心区域的累积和白细胞功能相关抗原1(LFA-1)-细胞间粘着分子-1(ICAM-1)在称为外周(p-)SMAC(pSMAC)的外部IS区域中的累积而形成的。已显示成熟IS包含富集有LFA-1、踝蛋白、VLA-4、ADAP和转铁蛋白受体的pSMAC。pSMAC围绕富集有TCR、CD4或CD8共受体、CD28共刺激分子、CD2、PKCθ等的cSMAC。
Ps皮肤的特征在于角质形成细胞的过度增殖，其导致脊状和钉状的夸张模式。已显示皮肤中的角质形成细胞、DC和Mφ都产生TNFα、IL-1β和IL-32。虽然IS控制银屑病自身抗原-特异性皮肤淋巴细胞抗原(CLA)阳性T细胞的活化，但至关重要的分子组分包括TCR和围绕其的一圈粘着分子例如LFA-1，所述分子可结合由邻近细胞例如角质形成细胞或APC表达的ICAM-1。因此，IS是治疗方法的逻辑靶标。例如，阿来西普是重组融合蛋白，其结合记忆效应T细胞上的CD2，从而抑制它们的活化并且减少此类细胞的数目。依法珠单抗是抗CD11a分子的人源化单克隆抗体(Mab)。CD11a和CD18包含LFA-1的亚基。
本发明者已显示，在人T细胞的表面上存在TCISM，其通过驱动Mφ的活化以产生促炎细胞因子来介导皮肤炎症。在TCISM的水平上控制适应性(获得性)免疫是有利的，因为治疗性干预在细菌性皮肤感染期间允许先天性免疫。
银屑病是具有几个临床表现的皮肤遗传性病症。最常见的类型是寻常性银屑病(psoriasis vulgaris)(或斑块状银屑病(Plaque psoriasis)[Ps])，其在人体的特征部位发生为慢性、复发性、鳞屑性(scaling)丘疹和斑块。目前，银屑病的疗法并不令人满意。Ps的特征在于活化的T细胞对皮肤的浸润和角质形成细胞的异常增殖。由于被T细胞、角质形成细胞、DC和LC过度产生，已报导TNFα的浓度在Ps损伤中比在未受牵连的皮肤(在患Ps的患者和正常人中)中更高。
自身免疫性疾病
人的自身免疫性疾病例如Ps和银屑病关节炎(PsA)是慢性综合征，其特征在于与抗表达自身抗原的组织的适应性体液(自身抗体)或细胞(自身反应性T细胞)应答的诊断结果组合的典型的、通常复发性的临床症状。重要的人自身免疫性疾病通常与病毒或细菌感染共存或由其触发，并且与某些MHC等位基因相关。先天性免疫系统包括范围从上皮的非特异性屏障功能至病原体的高度选择性识别(通过使用种系编码的受体)的宿主防御的集合。这些不同元件的共同特征是对感染或组织破坏的快速和直接(blunt)应答。在另一方面，适应性免疫系统使用体细胞重排的抗原受体基因来产生针对几乎任何抗原的受体。适应性免疫应答速度较慢但更灵活，并且能够抵抗已进化至逃避先天性应答的感染。
先天性免疫系统通过识别病原体中的保守基序以及许多细胞应激或死亡的其他标志来进行应答。先天性免疫系统的细胞组分包括DC、单核细胞、Mφ、粒细胞和天然杀伤T细胞(NKT)以及在生物体和其环境之间形成界面的皮肤、肺和消化道上皮细胞。先天性系统的非细胞元件是非常多样的，范围从角质层的简单屏障功能至复杂途径例如补体级联。这些元件通过物理阻断来阻止病原体的进入，或当细胞被侵入时，使它们能够直接破坏或通过吞噬细胞破坏病原体。先天性免疫系统还已进化至识别对于许多种类的病原体来说是共同的分子模式。此类分子模式称为病原体相关分子模式(PAMP)。PAMP识别通过使用一组种系编码的、进化上保守的病原体-识别受体(PRR)来进行。Toll-样受体(TLR)是非常重要的一组病原体受体，它们在先天性免疫细胞上和不同组织的细胞(包括内皮细胞、上皮细胞和成纤维细胞)上表达。已在人中鉴定了对于不同的微生物分子是特异性的10个TLR家族成员。TLR与它们的微生物配体的结合导致吞噬细胞的活化，以及促炎细胞因子和抗微生物肽的释放。此类分子据信也激活DC起始适应性免疫应答。
T细胞在免疫应答中是重要的，且可基于它们的迁移模式和功能能力将其分为许多独特的子集。幼稚T细胞主要在血液与淋巴结之间再循环(通过表达归巢受体L-选择蛋白和CCR7来辅助的模式)。幼稚T细胞保持多能状态并且具有相对静止的效应子程序(effector program)，因为它们从血液通过淋巴器官再循环，检查激活MHC-肽复合物的DC。通过整合来自活化的DC和来自细胞因子环境的信号的复杂机制，幼稚T细胞被驱动通过快速的几轮分裂(其与分泌对抗不同种类病原体所必需的效应细胞因子的能力密切相关)。可将CD4+T辅助细胞功能性地分成Th1(分泌干扰素[IFN]γ)和Th2(分泌白细胞介素[IL]-4)子集，以及最近鉴定的其他Th子集(其包括Tr1(分泌IL-10)、Th3(产生转化生长因子[TGF]β)、ThFH(滤泡辅助细胞)、外周诱导的(peripherally-induced)调节性T细胞(Treg；FoxP3-阳性)和Th17(产生IL-17A)细胞)。其他子集的发现无疑将激起鉴定潜在的调节转录因子的兴趣，所述转录因子可能牵涉修饰参与效应子功能的特征细胞因子基因的机制。
免疫突触(IS)在抗原呈递细胞与T细胞之间的界面上形成，并且据信是负责抗原识别和T细胞活化的结构。最初在T细胞与B细胞之间或T细胞与包含MHC的平板双分子层之间发现IS。其通过T细胞受体-主要组织相容性复合物(TCR-MHC)在称为中央超分子活化簇(c-SMAC)的中心IS区域的累积和白细胞功能相关抗原1(LFA-1)-细胞间粘着分子-1(ICAM-1)在称为外周(p-)SMAC(pSMAC)的外部区域中的累积而形成。成熟突触包含富集有LFA-1、踝蛋白、VLA-4、ADAP和转铁蛋白受体的pSMAC。pSMAC围绕富集有TCR、CD4或CD8共受体、CD28共刺激分子、CD2、PKCθ等的cSMAC。
在APC的表面上表达的配体据信招募特异性受体至IS接触位点。共刺激分子CD28和细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4)至突触的招募被其配体B7-1和B7-2在APC上的表达有差别地增强。虽然CD28和CTLA4结合这两个配体中的任一个，但当在APC上表达时，B7-2招募CD28以及B7-1招募CTLA4至突触。配体在APC上的接触位点中的稳定性也是非常重要的，因为CD28、CTLA-4和蛋白激酶C-θ的招募需要B7-1的细胞质结构域的存在。
银屑病皮肤的特征在于角质形成细胞的过度增殖，其导致脊状和钉状的夸张模式。皮肤中的角质形成细胞、DC和Mφ都能产生TNFα。虽然IS控制银屑病自身抗原-特异性皮肤淋巴细胞抗原(CLA)阳性T细胞的活化，但一些至关重要的分子组分包括TCR和围绕其的一圈粘着分子例如LFA-1，所述分子可结合由邻近细胞例如角质形成细胞或APC表达的ICAM-1。突触的LFA-1组分据信在银屑病中非常重要，因为阻断该粘着相互作用的治疗剂(抗LFA-1抗体；依法珠单抗)已被美国食品与药品管理局(FDA)批准用于治疗银屑病。其他的贡献分子(包括其他粘着分子和共刺激分子)也影响T细胞的应答性，例如，细胞表面分子对CD2：LFA-3和CD28：CD80/CD86。
类风湿性关节炎
类风湿性关节炎(RA)是也涉及IS信号转导的炎性疾病。用于治疗RA的潜在方法之一包括抑制存在于T细胞与抗原呈递细胞之间的IS上的分子。据信，细胞因子的上调的机制是接触依赖性的。在细胞表面上存在多个可介导此类功能的候选蛋白。
已显示，由T细胞受体复合物活化的T细胞诱导单核细胞的IL-10合成。这部分依赖于内源TNFα和IL-1的水平，且已显示T细胞膜TNFα是重要的接触介导的信号。然而，当TNFα和IL-1被中和时，IL-10合成仍然进行，从而表明存在IL-10合成所需的不依赖于TNF/IL-1的信号。
特别有趣的是TNF/TNF-R家族的成员，其包括CD40、CD27、CD30、OX-40和LTβ。这些TNF-R分子的配体据信在T细胞活化后被上调，此外，据信，CD40L、4-1BB、CD27L、CD30在活化后作为可溶性介体(mediator)被释放。已观察到，CD40L与CD40之间的相互作用对于在T细胞与单核细胞相互作用后诱导IL-1和IL-12的合成是非常重要的，且最近观察到其介导人小胶质细胞在与抗-CD3-刺激的T细胞相互作用后产生IL-10。
T细胞免疫球蛋白粘蛋白
T细胞免疫球蛋白粘蛋白(TIM)是在T细胞上表达的包含共同结构基序的I型膜糖蛋白。TIM基因家族位于小鼠的11号染色体上和人的5q33上。基因组分析已在小鼠中鉴定了8个家族成员(TIM-1至TIM-8)，在人中鉴定了3个家族成员(TIM-1、TIM-3和TIM-4)。所有成员共有包含IgV、粘蛋白、跨膜和胞质结构域的特征结构。该基因家族在免疫应答的调控中起作用。
之前被鉴定为甲型肝炎病毒受体的TIM-1共刺激T细胞增殖和细胞因子产生。TIM-1在所有活化的T细胞上表达，当CD4+T细胞两极分化时，以更高的水平在Th2细胞上表达(相对于Th1细胞)。已显示，当与肽或APC或抗CD3和CD28的交联抗体一起培养时，激动性单克隆抗-TIM-1抗体(3B3)体外共刺激T细胞。当在免疫应答期间体内施用时，抗-TIM-1抗体促进T细胞的体外增殖，甚至在抗原性再刺激(antigenic re-stimulation)不存在的情况下亦如此。与对照处理相比较，其还增加Th1和Th2原型细胞因子(prototypiccytokine)的产量。此外，抗-TIM-1抗体消除高剂量耐受性的诱导并且当用抗原鼻内免疫和攻击小鼠时，还可恢复AHR。因此推测TIM-1用作所有T细胞的共刺激分子，其对Th2细胞的作用可能比对Th1细胞的作用更强。
已证明，与Th2细胞相比较，TIM-3优先在体外极化的人CD4+Th1细胞上表达。因此，TIM-3的表达可用于鉴定人Th1细胞。此外，据信TIM-3有助于Th1细胞的体内调控。例如，在实验性自身免疫性脑炎(EAE)模型中对小鼠施用TIM-3-特异性抗体导致Th1-驱动的EAE的进展加速。此外，抗-TIM-3抗体诱导Mφ的活化和克隆性T细胞增殖，对于此，需要Mφ与T细胞之间的相互作用。这些数据似乎显示TIM-3在负调节T细胞对Mφ的活化中的作用。TIM-3/TIM-3配体相互作用也在耐受性中起作用。用全长和可溶性TIM-3 Ig融合蛋白对小鼠的治疗消除了使用高剂量水性抗原诱导的耐受性。类似地，TIM-3-缺陷型小鼠不能产生耐受性。事实上，Ig融合蛋白治疗的小鼠和TIM-3-缺陷型小鼠在施用高剂量的水性抗原后，都展示与对照相比增加的T细胞增殖和IL-2的产量。
TIM-4据信是TIM-1的天然配体。与其他TIM分子不同，TIM-4显示不在T细胞中表达，相反地在APC中(特别是在成熟淋巴DC中)表达。迄今为止未发现正调控TIM样家族分子(其介导Th1 T-细胞-驱动的Mφ活化)。本发明者已显示TIM-1和TIM-3在PMA/离子霉素活化的H9或原代人CD3+T细胞中都不上调。鉴定参与免疫突触的胞质蛋白、膜蛋白和核内蛋白的蛋白质组学方法
蛋白质组学技术可用于表征疾病的生物标记和生物特征(biosignature)以及揭示关于功能性亚蛋白质组和网络的信息。虽然许多蛋白质组学应用提供了关于亚系统(其在对疾病、损伤或药物的应答中发生变化)的一般信息，但蛋白质组学还可用于鉴定之前未被表征的参与生物化学应答(例如MAPK信号转导、趋化性、黑色素瘤肿瘤发生和转移，以及MHC II类诱导的细胞死亡等)的蛋白质。双向凝胶电泳(2DGE)和质谱法的组合是用于蛋白质组学应用的分析技术之一。与通过串联质谱法和后期数据库检索算法进行的蛋白质的直接和无偏鉴定偶联的2DGE的定量能力提供了优良的技术平台，借助于该平台可获得细胞系统、血浆、皮肤等中的蛋白表达变化的特征谱。互补发现平台(complementary discovery platform)是多维色谱蛋白质和肽分离技术，接着用于蛋白质鉴定的串联质谱法和数据库检索。随后使用选择的反应监测来定量相关分子。
宿主防御和炎性疾病
促炎性、多效性细胞因子TNFα和IL-1β在宿主防御和炎性疾病过程中起着至关重要的作用。已在Ps疾病靶组织和患有炎性皮肤病的患者的循环系统(circulation)中发现TNFα和IL-1β的过表达。T细胞和单核细胞-Mφ的一个主要功能是释放各种细胞因子，包括IL-1β和/或TNFα。这些分子反过来参与下游部分例如IL-32(由角质形成细胞和Mφ产生)的诱导和释放，最终导致角质形成细胞的过度增殖和Ps的发生。不受任何理论的束缚，据信，在更末端的水平(例如，在T细胞驱动的单核细胞-Mφ的活化的水平上，可能在适应性应答和/或IS形成期间的不同时期)上阻断这些细胞因子的产生，可导致新型分子药物发现靶标(其被设计用于特异性抑制这些细胞因子)，从而产生对于Ps患者具有更小的副作用的更安全的治疗剂。
在参考下列不意欲限定本发明的实施例后，对本领域技术人员来说，本发明的另外的目的、有利方面和新特征将变得明显。
实施例
细胞系的培养
在由补充有10％(v/v)FCS血清、2mM L-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素和100单位/ml链霉素的RPMI 1640(Biochrom，Berlin，Germany)组成的标准培养基中培养人细胞系。从ATCC获得Hut 78、H9、Molt4、Jurkat、Raji和THP-1细胞系。
细胞分离
外周血单核细胞(PBMC)。通过Ficoll密度梯度离心分离PBMC。获得的PBMC的成活力＞95％，如通过台盼蓝染色所测定的。在Neubauer计数室(Neubauer chamber)(Zeiss，Oberkochen，Germany)中定量存活的细胞，然后将其贮存于液氮中。
CD3+T细胞
再次以1,500rpm离心解冻的PBMC，进行5分钟。弃去上清液，将沉淀重悬浮于MACS缓冲液中。以108个细胞/0.8ml缓冲液的浓度将细胞分离成单细胞悬浮液。每108个细胞加入大约0.2ml的半抗原-抗体混合物。充分混合所得的混合物，然后在冰上温育20分钟。通过加入20x标记体积来清洗细胞，离心，然后除去上清液。以108个细胞/0.8ml缓冲液的浓度重悬浮细胞沉淀。每108个细胞加入大约0.2ml MACS抗-半抗原微珠(Anti-Hapten MicroBead)以磁性标记细胞。将混合物在冰上温育15分钟，用20x的体积进行清洗(将来自Leukophoresis packs的冷冻细胞通过45μm孔隙的过滤器以除去成簇的死细胞)，离心，然后弃去上清液。以108个细胞/1ml MACS缓冲液的浓度重悬浮细胞，将LS+柱置于适当的MACS分离器的磁场中。通过用3ml缓冲液清洗来制备柱子。将细胞悬浮液应用于柱子，使未标记的细胞通过该柱子。收集流出物作为阴性级分，其代表富集的T细胞级分。用4x 3ml缓冲液漂洗柱子，收集流出物。在细胞清洗后，以106个细胞/ml的浓度将细胞沉淀重悬浮于50ml组织培养基中。通过CD3-FITC标记和FACS分析测定T细胞纯度(＞95％)。
单核细胞
方法与CD3+T细胞分离的相同。
细胞的免疫分型
在FACS培养基[包含1％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲溶液(PBS)]中清洗收获的细胞，然后在4℃下用直接缀合有异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)的抗体染色，进行20分钟。此后，用PBS清洗细胞3次，通过FACScan(Becton Dickinson，Heidelberg，Germany)，使用CellQuest软件(Becton Dickinson)进行分析。抗体如下：PE标记的抗-小鼠IgG、抗-人CD40L和CD137。
细胞间接触测定
用冷PBS清洗原代T细胞或H9细胞，然后以5x 106个细胞/ml将细胞沉淀重悬浮于新制备的1％多聚甲醛中。在冰上将细胞固定2小时，然后用20倍体积的冷PBS清洗3次。在第三次清洗后，将细胞在4℃下于PBS中保持过夜以使多聚甲醛扩散。对细胞进行离心，并再清洗一次。将固定的T细胞以1x 107个细胞/ml重悬浮于培养基中，然后分配入96孔U形底平板(大约1x 106/ml的THP-1细胞，每孔100μl)。以8x、4x和2x 106个细胞/ml加入原代T细胞或H9细胞(每孔100μl)。将平板在37℃下、增湿的5％CO2中温育48小时。以1,500rpm离心平板5分钟，将上清液(120μl)转移入新平板。在-20℃下贮存上清液直至使用。
Hut-78的质膜的制备
将大约5x 108个经刺激的或未经刺激的Hut-78细胞悬浮于10ml包含蛋白酶抑制剂的高渗缓冲液(50mM Tris-Cl(pH 7.4)、25mM KCl、5mM MgCl2、200uM PMSF、1x完全蛋白酶抑制剂)中，然后使用杜恩斯匀浆器在冰上进行匀浆(20下)。通过在4℃下以4000xg离心15分钟弃去细胞核和未破碎的细胞级分，然后在4℃下使用SW40转子28K(100,000xg)对上清液进行超速离心，进行45分钟。用22G注射器针头将膜沉淀重悬浮于9ml PBS中，然后将其加至1ml的200mM CHAPS中。将匀浆物在冰上温育1小时。将大约1ml等分的悬浮质膜(5x 107个细胞当量/ml)贮存在-80℃下。
RNA样品的制备和杂交
按照厂商的方案，使用RNeasy MinElute试剂盒(Qiagen)和Qiagen Mini RNeasy试剂盒提取和纯化RNA。如Expression Analysis Technical Manual(Affymetrix，两循环方案)中所述，对于各样品使用100ng的总RNA进行cDNA合成。使用BioArray High-Yield Transcript Labeling试剂盒(Enzo)进行cRNA反应。将15微克经标记的cRNA片段化，然后按照厂商的说明书将其杂交至GAPS Slides(Corning)。
Flp-In转染
建立稳定的TCISM配体(TCISML)-阴性T细胞系，然后用微阵列实验中鉴定的TCISML候选基因(包括：EMR2、DTR、4-1BB、LIGHT和CD40L)的cDNA对其进行转染。按照厂商的方案使用称为“Flp-In”法的转染系统(其使用Flp-In重组酶)。使用贴壁293细胞(贴壁细胞对照)或TCISM-阴性Jurkat细胞制备8个不同的构建体(包含EGF结构域2和5的pcDNA5/FRT/EMR-2-04、包含EGF结构域1、2和5的pcDNA5/FRT/EMR-2-05、包含EGF结构域1、2和5的pcDNA5/FRT/EMR-02-07、pcDNA/FRT/DTR、pcDNA3/4-1BB、pcDNA5/FRT/LIGHT、pcDNA5/FRT/CD40L和pcDNA5/FRT对照)。
小分子测定
通过使用T细胞膜-Mφ细胞接触生物测定法，鉴定差异性阻断抗-CD3/抗-CD28活化的T细胞介导的-但非LPS刺激的-外周血定居CD14+Mφ的TNFα和IL-1β产生的小分子拮抗剂。选择几种激酶抑制剂并且使用经验证的T细胞膜-Mφ接触生物测定法就这些化合物在阻断TNFα和/或IL-1β的产生中的作用对其进行评估。经证明，化合物C(p38 MAP激酶抑制剂)显示完全抑制T细胞介导的人Mφ的TNFα产生，而对LPS-刺激的TNFα和IL-1β的产生不具有任何显著作用(参见图14)。其他化合物C类似物以大约相同的程度(大约50-100％的抑制)抑制活化的T细胞膜-刺激的和LPS-刺激的Mφ的TNFα和IL-1β产生，或者对于LPS-刺激的Mφ活化显示更少的对细胞因子产生的抑制(大约30-50％的对LPS-活化的细胞因子产生的抑制对大约100％的对T细胞介导的细胞因子产生的抑制)。因此，使用人T细胞和Mφ进行的活化的T细胞膜-Mφ接触生物测定可用于建立高通量筛选，所述高通量筛选用重组TCISM(经鉴定和克隆后)鉴定具有口服活性的小分子拮抗剂，其特异性靶向适应性-但非LPS介导的-先天性免疫。一些特异性干扰T细胞介导的Mφ活化，从而导致增加细胞因子产量(但不增加LPS介导的Mφ细胞因子释放)的具有口服活性的小分子TNFα和/或IL-1β抑制剂，在T细胞介导的皮肤病例如Ps中具有有利的治疗/副作用特征谱。
数据分析
用统计软件″SIGMASTAT″-SIGMAPLOT V.9的工具(Systat Software，San Jose，CA)进行统计评估。使用学生氏t检验比较使用siRNA和/或小分子化合物敲除的活化的H9细胞的组中与活化的H9细胞的组中的细胞因子的浓度。所有比较的显著性水平都以0.05的共同标准设定。
统计的考虑因素(Statistical Consideration)
通过比较对照细胞、经刺激的细胞和其中已使用siRNA和/或小分子化合物敲除潜在的TCISM候选物的表达的经刺激的细胞之间的生物测定的读出结果(readout)，可容易地验证候选蛋白质。
使用小分子化合物的一个有利方面是能够阐明TCISM的p38信号转导途径活性并且其是具有口服活性的抑制TCISM的试剂。
TCISM配体候选物的鉴定
细胞间接触生物测定表明，TCISML在从PMA/PHA刺激的原代T细胞、Hut-78和H9细胞获得的纯化的膜上-但不在Molt4、Jurkat或RAJI B细胞中-高表达。来自活化的细胞与未活化的细胞的表达特征谱数据(使用18个单独的TCISML(+)对TCISML(-)比较条件)显示，这些不同的细胞系之间的基因表达显著不同。计算机评估显示，TCISM分子在TCISML(+)T细胞系中上调，在TCISML(-)T细胞系中下调。完全检查由微阵列实验产生的50,000个基因中的大约10,000个基因。使用下列标准确定TCISML候选物：(1)它们是膜相关的；(2)它们在经刺激的Hut-78和H9细胞中-但不在Molt4、Jurkat和Raji细胞中-被上调超过2倍；和(3)它们的表达水平得到qRT-PCR的确认。随后的数据分析将总共10,000个基因缩减至仅100多个膜相关蛋白。双对数强度图鉴定了5个候选人T细胞TCISML基因：白喉毒素受体或肝素-结合EGF(DTR或HB-EGF)、包含EGF元件的粘蛋白样激素受体2(EMR2；CD97)、4-1BB(TNFRSF14)、OX-40(CD134)、TNF受体超家族成员9(TNFRSF9或LIGHT；CD248)和CD40配体(CD40L；TNFRSF5)。FAC用于确认这些分子在活化的H9细胞上的存在。qRT-PCR也用于确定这些基因是否是TCISM候选物。
使用11cm IPG条pH 4-6在第一向中分离来自经刺激的和未经刺激的H9细胞的膜制剂的蛋白质，然后使用10.5-14％的梯度SDS-PAGE凝胶在第二向中分离所述蛋白质。将代表至少1.5倍的表达变化(通过用ImageMaster分析)的标记的点切下，使用胰蛋白酶进行消化，然后通过nanoLC/MS/MS在Agilent超高容量离子阱(Ultrahigh capacity ion trap)上进行分析。
凝胶分析
在脱色和用水漂洗后在Typhoon 9400荧光扫描仪(GEHealthcare)上以200像素的分辨率进行成像。如下所述使用IMAGE-Master platinum II软件版本5.0(GE Healthcare)，将经刺激的和未经刺激的制剂中的蛋白质点进行匹配。
将各蛋白质点的强度(3-维体积)针对凝胶上检测到的所有点的总强度进行标准化。在比较凝胶之前，单独地调整检测阈值以产生平均1500个蛋白质点/凝胶。条件之间的明显的点强度的变化是用于切取随后使用质谱法进行鉴定的点的标准。使用OneTouch PlusSpot Picker(The Gel Company)，用1.5mm枪头切取目的点。
凝胶内消化
使用胰蛋白酶在凝胶点中消化蛋白质。简而言之，混合来自至少2个重复实验的点，用1/1乙腈和100mM碳酸氢铵脱色一次，然后用100％乙腈浓缩，并进行真空干燥。用25ng/μl胰蛋白酶再水化点，并且在37℃下温育过夜。收集上清液，使用含有30％乙腈的1％甲酸(水性的)将其与2份另外的提取物混合。将混合的提取物真空浓缩至大约10μL，并在-80℃下贮存直至使用。
胰蛋白酶消化物的LC/MS/MS分析
利用反相纳升电喷雾LC-MS/MS(Agilent 1100 HPLC，75μm ID x 15cm柱，Zorbax C18)分析大约30％的凝胶内消化的样品。缓冲液A是0.1％甲酸。使用逐渐增加的缓冲液B(90％ACN，0.1％甲酸)的梯度以300nl/分钟的流速将肽从分离柱洗脱入质谱仪。在350至1800Da的m/z范围内收集谱(Agilent LC/MSD Trap XCT Ultra)。对于6个最丰富的m/z值收集了3个MS/MS谱，然后将这些质量从分析中排除(1分钟)，选择接下来的6个最丰富的m/z值进行片段化。
使用数据库检索进行蛋白质鉴定
通过使用Mascot(Matrix Science)和Spectrum Mill(Agilent)程序检索NCBInr和SwissProt数据库来鉴定蛋白质。对于Mascot，使用10,000的强度阈值和最小0.2％的相对丰度产生所得的谱的化合物列表，将其归类在5个扫描中。化合物列表输出为.mgf文件，然后使用针对人的分类过滤器(taxonomy filter)检索数据库。数据库检索中使用的参数如下：单同位素质量、2.0Da的肽质量允差(mass tolerance)、0.7Da的碎片离子质量允差、只允许2个漏切(missed cleavage)的胰蛋白酶消化的肽、Cys的脲甲基化(carbamidomethylation)作为固定修饰和脱酰胺作用(N，Q)和乙酰化(K)作为可变修饰。相似的参数用于SpectrumMill检索。高于13的SpectrumMill蛋白质评分、和高于10的肽评分以及高于70％的评定的百分数强度(SPI)是初始击中确认(initial hit validation)的截断值。有效的蛋白质鉴定需要至少两个肽匹配。使分子量和pI值与凝胶相互关联来帮助证实鉴定。
与皮肤炎症相关的TCISM的鉴定
用PMA/离子霉素刺激人T细胞淋巴瘤H9细胞。使用离液裂解缓冲液(7M尿素、2M硫脲、4％CHAPS)裂解细胞，然后使用可商购获得的膜蛋白质提取试剂盒分离膜蛋白。将样品(200μg)加载至11cm pH4-7的IPG条上，并在通过SDS page分离前聚焦30,000Vhr。使用ImageMaster软件对点进行匹配和相对量测量。将在经刺激的与未经刺激的样品之间显示大于2倍的变化的蛋白质切下，用胰蛋白酶进行凝胶内消化，然后使用Agilent Ultra离子阱通过nanoLC/MS/MS进行分析。使用SpectrumMill和MASCOT算法鉴定蛋白质。使用Western印迹、siRNA抑制和细胞间接触生物测定确认蛋白质的鉴定、定量和功能。
从完全细胞裂解物或膜分级分离样品观察到大约30个在初步实验中在表达上发生至少2倍的变化的蛋白质点，并通过nLC/MS/MS对其进行了鉴定。在这些蛋白质中，进一步基于它们在人T细胞中的潜在功能研究5个潜在的候选物-膜联蛋白VI、烯醇化酶、FKBP4、CD81、CD316和埃兹蛋白(Ezrin)。这些蛋白的Western印迹显示，FKBP4和埃兹蛋白的表达在T细胞活化后显著增加，而烯醇化酶的表达显示减少。膜联蛋白VI、CD81和CD316的表达在PMA/离子霉素处理后未改变。特别有趣的是FKBP4和埃兹蛋白。FKBP或FK506结合蛋白据信是具有脯氨酰异构酶活性的亲免素，其用作包含脯氨酸残基的蛋白质的蛋白质折叠伴侣。其还结合用于治疗罹患自身免疫性障碍的患者的免疫抑制剂分子他克莫司(最初称为FK506)。FBKP-他克莫司复合物抑制钙神经素(calcineurin)，并可能通过干扰FKBP4与干扰素调节因子-4(IRF-4)的结合来阻断T淋巴细胞转导途径中的信号转导。埃兹蛋白据信是具有富含脯氨酸的区域的肌动蛋白结合蛋白。据信，其受磷酸肌醇脂质调控并且是Lck酪氨酸激酶的底物。最近发现，磷酸化的埃兹蛋白是促成SLE患者中增加的T细胞极化、粘附和迁移的原因。据信，埃兹蛋白也是介导T细胞浸润至皮肤从而引起导致银屑病的皮肤炎症的至关重要的蛋白质之一。
本发明者还显示，阿来西普(Amevive；Biogen-Idec)和依法珠单抗(Raptiva；Genentech)，两种目前可获得的银屑病治疗剂，在上述模型系统中不抑制T细胞-驱动的Mφ的细胞因子产生。已报导这些试剂的机制通过介导功能障碍性免疫突触(IS)的形成来选择性灭活人T细胞的亚群。不受任何理论的束缚，据信，在一些情况下，亲免素(包括但不限于FKBP4)，在与埃兹蛋白协同作用的情况下，可用作支架蛋白以保持突触相互作用并介导有效的经由IS的信号转导。这些T细胞靶的功能作用可通过使用siRNA抑制和细胞间接触生物测定(使用ECL进行细胞因子的读出)来容易地评估。
体内关节炎研究
在第0天用CII+CFA免疫小鼠，在第21天用CII+IFA进行加强免疫。每组使用总共10只DBA雌性小鼠。如所显示的施用药物，在爪子肿胀/关节炎的初始症状显现的第一天开始施用。各组小鼠施用下表中所示的不同的TCISM调节剂。按照Bendele等人，Arthritis& Rheumatism，2000，43(12)，pp 2648-2659的方法评估平均关节炎评分(参见下面的数据)。图16显示不同TCISM-配体调节剂的平均关节炎评分(作为时间的函数)的图。图17展示了显示对照(大鼠IgG、HA)、抗-TNFα治疗的小鼠和IL-1ra治疗的小鼠的图。在图17中，大鼠抗小鼠TNFα单克隆抗体(R&D Systems)用作阳性对照，以证实抑制TNFα或称为IL-1ra(白细胞介素-1受体拮抗剂；Amgen)的IL-1抑制剂的治疗效果。在显示胶原诱导的关节炎的症状后8天治疗小鼠。
图18是代表性小鼠的关节组织病理学。在图18中，A图表示从用同种型-对照大鼠抗小鼠MAb治疗的患有胶原诱导的关节炎的DBA小鼠(阴性对照)获得的膝关节，其显示在该对照治疗过程中没有发生炎症。图B显示存在最低限度的炎症，其已在从阴性对照小鼠获得的膝关节中发生。图C显示在第+13天(即；在胶原诱导的关节炎的诱导后+13天)产生严重的炎症，且单核细胞和滑膜细胞浸润至从用化合物H治疗的小鼠(50mg/kg P.O.每天一次，始于第+1天)获得的膝关节内。图D显示在第+13天(即；在胶原诱导的关节炎的诱导后+13天)产生严重的炎症，且单核细胞和滑膜细胞浸润至从用化合物H治疗的小鼠(50mg/kg P.O.每天一次，始于第+1天)获得的膝关节内。图E显示在第+13天(即；在胶原诱导的关节炎的诱导后+13天)产生减轻的炎症，且几乎没有单核细胞和滑膜细胞浸润至从用化合物C治疗的小鼠(50mg/kg P.O.每天一次，始于第+1天)获得的膝关节内。图F显示在第+13天(即；在胶原诱导的关节炎的诱导后+13天)产生减轻的炎症，几乎没有单核细胞和滑膜细胞的浸润，从用化合物H治疗的小鼠(50mg/kg P.O.每天一次，始于第+1天)获得的软骨和骨得到保护。表：不同的小分子TNFα抑制剂在鼠胶原诱导的关节炎中的评估对照：PBSCpd X：9-[(1R，3R)-反式-环戊烷-3-醇]腺嘌呤(腺苷A3拮抗剂；10mg/kg；PO)BLX50：BLX-WS1(p38a MAPK抑制剂；50mg/kg；PO)BLX25：BLX-WS1(p38a MAPK抑制剂；25mg/kg；PO)Cpd D：p38α/βMAPK抑制剂；50mg/kg；PO；Cpd H：PKC抑制剂；50mg/kg；PO
已提供本发明的上述论述用于举例说明和描述目的。上述内容不意欲将本发明限定为本文中公开的形式。虽然本发明的说明书已包括一个或多个实施方案和某些变化和改变的描述，但在理解本公开内容后，其他变化和改变也在本发明的范围内，例如，其可在本领域技术人员的能力和知识范围内。期望获得这样的权利，其包括备选实施方案至允许的程度，包括交替的、可互换的和/或等价的结构、功能、范围或步骤(至所请求保护的那些)，无论此类交替的、可互换的和/或等价的结构、功能、范围或步骤是否在本文中公开，并且不意欲公开开放任何可获专利保护的主题内容。

Claims (20)

1.用于在受试者的单核细胞谱系来源的细胞中调节细胞因子的产生的方法，该方法包括对所述受试者施用细胞因子调节剂，其中所述细胞因子调节剂选择性结合T淋巴细胞的诱导T细胞细胞因子的表面分子(TCISM)-配体或单核细胞谱系来源的细胞的相应的TCISM-受体，由此所述细胞因子调节剂与TCISM-配体或TCISM-受体的结合在单核细胞谱系来源的细胞中调节细胞因子的产生。
2.权利要求1的方法，其中所述TCISM-配体包括至少一种表1中所列的TCISM-配体。
3.权利要求2的方法，其中TCISM-配体包括CD81、CD21、CD316、α-烯醇化酶、FKBP4、FKBP多基因家族的其他成员、或其组合。
4.权利要求1的方法，其中单核细胞谱系来源的细胞包括单核细胞谱系来源的巨噬细胞、抗原呈递细胞(APC)、树突细胞、郎格汉斯细胞、库普弗细胞或其组合。
5.权利要求1的方法，其中所述T淋巴细胞是CD3+T淋巴细胞。
6.权利要求1的方法，其中被调节的细胞因子包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-32(IL-32)或其组合。
7.权利要求1的方法，其中TCISM-配体是存在于CD3+淋巴细胞上的TCISM-配体。
8.权利要求7的方法，其中TCISM-配体包括CD81、CD21、CD315、CD316、α-烯醇化酶、FKBP或其组合。
9.权利要求1的方法，其中所述TCISM-受体包括存在于CD68+抗原呈递细胞上的TCISM-受体。
10.权利要求9的方法，其中所述TCISM-受体包括CD81的受体、CD21的受体、CD315的受体、CD316的受体、α-烯醇化酶的受体、FK结合蛋白的受体或其组合。
11.权利要求10的方法，其中所述TCISM-受体包括存在于CD19、CD21、CD225、CD315、CD316、C3dR、CD19、CD81、BCR、CD9、CD81、KAI1/CD82上的TCISM-配体的受体或其组合。
12.用于治疗受试者中由急性或慢性炎症介导的临床状况的方法，该方法包括对所述受试者施用细胞因子调节剂，其中所述细胞因子调节剂选择性结合T淋巴细胞的诱导T细胞细胞因子的表面分子(TCISM)-配体或单核细胞谱系来源的细胞的相应的TCISM-受体，由此细胞因子调节剂对细胞因子的产生的调节用于治疗由急性或慢性炎症介导的临床状况。
13.权利要求12的方法，其中所述细胞因子调节剂选择性结合存在于CD3+淋巴细胞的表面上的TCISM-配体。
14.权利要求12的方法，其中所述细胞因子调节剂选择性结合存在于CD68+单核细胞的表面上的TCISM-受体。
15.权利要求12的方法，其中所述临床状况包括自身免疫性疾病。
16.权利要求15的方法，其中T淋巴细胞介导的自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎、多发性硬化、克罗恩病、银屑病、银屑病关节炎、格雷夫斯病、自身免疫性多内分泌腺综合征、遗传性蛋白尿综合征、I型糖尿病、系统性红斑狼疮、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性甲状腺炎、肝炎、获得性免疫缺陷病(HIV)、移植物抗宿主病、同种异体移植疾病、哮喘或其组合。
17.权利要求12的方法，其中所述临床状况包括癌症。
18.权利要求12的方法，其中所述临床状况包括皮肤T细胞淋巴瘤、HTLV-I-相关皮肤T细胞淋巴瘤、HTLV-II-相关淋巴瘤、毛细胞白血病、特发性CD4+T淋巴细胞减少症、黑色素瘤或其组合。
19.用于治疗受试者的自身免疫性疾病的方法，该方法包括对需要此类治疗的受试者施用治疗有效量的针对TCISM-配体的拮抗剂或针对相应的TCISM-受体的拮抗剂。
20.用于在受试者的单核细胞谱系来源的细胞中调节细胞因子的产生的方法，该方法包括对所述受试者施用siRNA，其中所述siRNA抑制T淋巴细胞的诱导T细胞细胞因子的表面分子(TCISM)-配体的基因的转录，由此对TCISM-配体的转录的抑制在受试者中减少细胞因子的产生。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5593992A (en) * 1993-07-16 1997-01-14 Smithkline Beecham Corporation Compounds
GB9713726D0 (en) * 1997-06-30 1997-09-03 Ciba Geigy Ag Organic compounds
US7067144B2 (en) * 1998-10-20 2006-06-27 Omeros Corporation Compositions and methods for systemic inhibition of cartilage degradation
AU2003286611A1 (en) * 2002-10-24 2004-05-13 Sangstat Medical Corporation Cytomodulating peptides and methods for treating neurological disorders
CL2004000366A1 (es) * 2003-02-26 2005-01-07 Pharmacia Corp Sa Organizada B USO DE UNA COMBINACION DE UN COMPUESTO DERIVADO DE PIRAZOL INHIBIDOR DE QUINASA p38, Y UN INHIBIDOR DE ACE PARA TRATAR DISFUNCION RENAL, ENFERMEDAD CARDIOVASCULAR Y VASCULAR, RETINOPATIA, NEUROPATIA, EDEMA, DISFUNCION ENDOTELIAL O INSULINOPATIA.
ATE509635T1 (de) * 2003-08-28 2011-06-15 Dainippon Sumitomo Pharma Co Mittel zur vorbeugung oder heilung entzündlicher darmerkrankungen mit anti-cd81-antikörper als aktivem inhaltsstoff

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