TWI836160B

TWI836160B - 製備用於ｔ細胞治療之ｔ細胞的方法

Info

Publication number: TWI836160B
Application number: TW109141098A
Authority: TW
Inventors: 阿里安佩雷斯; 瑪麗安薩巴諾; 史蒂芬羅森柏格; 尼可拉斯瑞斯弗
Original assignee: 美商凱特製藥公司; 美國聯邦健康暨人群服務部
Priority date: 2015-10-20
Filing date: 2016-10-20
Publication date: 2024-03-21

Abstract

本發明提供用於活體外延緩或抑制T細胞成熟或分化以供T細胞治療的方法，其包含令一或多個來自需要T細胞治療之個體的T細胞與AKT抑制劑及外源性介白素-7(IL-7)和外源性介白素-15(IL-15)中至少一者接觸，其中所產生之T細胞顯現延緩之成熟或分化。於一些實施態樣中，該方法進一步包含投予需要T細胞治療之個體該一或多個T細胞。

Description

製備用於T細胞治療之T細胞的方法

本發明關於製備一或多個用於T細胞治療之T細胞的方法。尤其是，本發明關於藉由令一或多個T細胞與AKT抑制劑(“AKTi”)及外源性介白素-7(IL-7)和外源性介白素-15(IL-15)中至少一者接觸以改善T細胞治療效力的方法。

政府利益聲明

本發明係在執行與國家癌症研究所(NCI)(衛生和公眾服務部的行政機構)之合作研究暨發展協議中創建。美國政府在本發明具有某些的權利。

就其性質而言，人類癌症係由已經歷遺傳或表觀遺傳學轉化成異常細胞之正常細胞所組成。當發生此情況時，癌細胞開始表現不同於正常細胞所表現之蛋白質及其他抗原。這些異常之腫瘤抗原可被身體的先天免疫系統用來特異性靶向和殺死癌細胞。然而，癌細胞採用各種機制來阻止免疫細胞(諸如T和B淋巴細胞)成功靶向癌細胞。

人類T細胞治療係倚賴在體外富集或修飾之人類T細胞來靶向並殺死個體(例如患者)之癌細胞。現已研發各種技術來富集能靶向腫瘤抗原之天然T細胞或經遺傳修飾以特異性靶向已知之癌抗原的T細胞之濃度。這些治療已證明對腫瘤大小和患者的存活具有重大效果。然而，目前已證明預測所給予之T細胞治療在各個患者中是否有效是有困難的。

移植混合之T細胞群為阻礙T細胞治療發揮其全部潛力的因素之一。在習知之T細胞治療中，收集供體T細胞，視需要地修飾之以靶向特定抗原(例如腫瘤細胞)或選擇抗腫瘤特性(例如腫瘤浸潤淋巴細胞)，在活體外擴增並投予有此需要之個體。通常，所產生之T細胞主要包含成熟細胞之混合群體，其中許多為終末分化的。因此，預期這些細胞在體內之持久性是有限的，且最初觀察到之正效果可在無移植之T細胞存在，當腫瘤回復時隨著時間消失。因此，增加在T細胞治療中所使用之T細胞在體內的持久性仍然是需要的。

本發明提供用於活體外延緩或抑制T細胞成熟或分化以供T細胞治療之方法，其包含令一或多個來自需要T細胞治療之個體的T細胞與AKTi及外源性IL-7 和外源性IL-15中至少一者接觸，其中所產生之T細胞顯現延緩之成熟或分化。

本發明進一步提供用於活體外延緩或抑制T細胞成熟或分化之方法，其包含在包含AKTi及外源性IL-7和外源性IL-15中至少一者之培養基中培養一或多個T細胞。

本發明進一步提供用於產生幹細胞樣CD8⁺T細胞之方法，其包含在培養基中培養一或多個T細胞，並包含令該一或多個T細胞與AKTi及外源性IL-7和外源性IL-15中至少一者接觸。

本發明亦提供用於延伸在過繼性細胞治療中之一或多個T細胞在體內之持久性的方法，其包含在投予前令一或多個T細胞與AKTi及外源性IL-7和外源性IL-15中至少一者接觸。

於某些實施態樣中，本發明揭示之方法進一步包含投予有此需要之個體一或多個T細胞。於一些實施態樣中，該個體需要T細胞治療。

本發明進一步提供治療需要T細胞治療之個體的腫瘤之方法，其包含投予該個體一或多個T細胞，其中該一或多個T細胞已與(i)AKTi和(ii)外源性IL-7及/或外源性IL-15接觸。

本發明亦提供在需要T細胞治療之個體中降低或減少腫瘤大小或抑制腫瘤生長之方法，其包含投予該個體一或多個T細胞，其中該一或多個T細胞已與 (i)AKTi和(ii)外源性IL-7及/或外源性IL-15接觸。

於某些實施態樣中，該T細胞治療包含經處理之CAR細胞治療或經處理之TCR細胞治療。於一實施態樣中，該經處理之CAR細胞或經處理之TCR細胞治療係治療個體之腫瘤。

第1A至1F圖顯示CD4⁺T細胞和CD8⁺T細胞在IL-2之存在下或在IL-7和IL-15之存在下培養7天和14天後之表型。第1A和1C圖分別顯示該經IL-2和IL-7/IL-15處理之細胞在第7天被表徵為初始T細胞或中央記憶T細胞(Tcm)者在經培養之CD4⁺T細胞和CD8⁺T細胞的全部群體中之百分比。第1B和1D圖分別顯示該經IL-2和IL-7/IL-15處理之細胞在第7天被表徵為效應記憶T細胞(Tem)或效應T細胞(Teff)者在經培養之CD4⁺T細胞和CD8⁺T細胞的全部群體中之百分比。第1E圖顯示該經IL-2和IL-7/IL-15處理之細胞在第14天被表徵為初始T細胞或中央記憶T細胞(Tcm)者在經培養之CD8⁺T細胞的全部群體中之百分比。第1F圖顯示該經IL-2和IL-7/IL-15處理之細胞在第14天被表徵為效應記憶T細胞(Tem)或效應T細胞(Teff)者在經培養之CD8⁺T細胞的全部群體中之百分比。個別數據點反映個別樣本。水平線表示平均值，誤差棒表示標準差。統計顯著性係由p值指示(“ns”代表“不顯著”)。

第2A至2D圖顯示在IL-7和IL-15之存在下或在IL-7、IL-15和AKTi之存在下培養7天和14天後CD4⁺T細胞和CD8⁺T細胞之表型。第2A和2C圖分別顯示該經IL-7/IL-15和IL-7/IL-15/AKTi處理之細胞在第7天被表徵為初始T細胞或Tcm者在經培養之CD4⁺T細胞和CD8⁺T細胞之全部群體中的百分比。第2B和2D圖分別顯示該經IL-7/IL-15和IL-7/IL-15/AKTi處理之細胞在第7天被表徵為Tem或Teff者在經培養之CD4⁺T細胞和CD8⁺T細胞的全部群體中之百分比。水平線表示平均值，誤差棒表示標準差。統計學顯著性係由p值指示(“ns”代表“不顯著”)。

第3A圖顯示與單獨之IL-2；IL-2和AKTi；IL-7和IL-15；及IL-7、IL-15和AKTi接觸之供體T細胞的轉導效率。轉導效率係以全部T細胞中為CD3⁺且具有陽性可溶性MHC四聚體染色(Tet⁺)者之百分比表示。深灰色棒條代表與IL-2接觸之T細胞樣本中CD3⁺ Tet⁺細胞的百分比。向下條紋棒條代表與IL-2和AKTi接觸之T細胞樣本中CD3⁺ Tet⁺細胞之百分比。淺灰色棒條代表與IL-7和IL-15接觸之T細胞樣本中CD3⁺ Tet⁺細胞的百分比。向上條紋棒條代表與IL-7、IL-15和AKTi接觸之T細胞樣本中CD3⁺ Tet⁺細胞的百分比。誤差棒條表示標準差。第3B圖顯示來自供體1(圓形)、供體2(正方形)和供體3(三角形)之細胞在單獨之IL-2；IL-2和AKTi；IL-7和IL-15；及IL-7、IL-15和AKTi之存在下培養後之四聚體平均螢光強度(MFI)。統計分析指出四聚體MFI中之任何差異並不顯著(p=ns)。

第4A至4D圖說明在IL-2(圓圈)；IL-2和AKTi(正方形)；IL-7和IL-15(三角形)；或IL-7、IL-15和AKTi(倒三角形)之存在下培養之來自四個供體的細胞在7天之期間內細胞擴增的。第4A至4D圖各代表單一供體細胞系之細胞擴增情形。用於擴增方案之來源材料為外周血單核細胞。

第5A至5C圖顯示以第I類TCR(HPV-E6)轉導並在IL-2(圓圈)；IL-2和AKTi(正方形)；IL-7和IL-15(三角形)；或IL-7、IL-15和AKTi(倒三角形)之存在下培養之來自三個供體的細胞在9天之期間內之細胞擴增情形。第5A至5C圖各代表單一供體細胞系之細胞擴增情形。用於擴增方案之來源材料為外周血單核細胞。

第6A至6C圖顯示以第II類TCR(MAGE-A3)轉導並在IL-2(圓圈)；IL-2和AKTi(正方形)；IL-7和IL-15(三角形)；或IL-7、IL-15和AKTi(倒三角形)之存在下培養之來自三個供體的經分離之CD4⁺和CD8⁺細胞在10天之期間內的細胞擴增情形。第6A至6C圖各代表單一供體細胞系之細胞擴增情形。

第7A至7C圖顯示以第II類TCR(MAGE-A3)轉導並在IL-2(圓圈)；IL-2和AKTi(正方形)；IL-7和IL-15(三角形)；或IL-7、IL-15和AKTi(倒三角形)之存在下培養之來自三個供體的經分離之CD4⁺細胞在10天之期間內的細胞擴增情形。第7A至7C圖各代表單一供體細胞系之細胞擴增情形。

第8A至8C圖顯示以第II類TCR(MAGE-A3)轉導並在IL-2(圓圈)；IL-2和AKTi(正方形)；IL-7和IL-15(三角形)；或IL-7、IL-15和AKTi(倒三角形)之存在下培養之來自三個供體的經分離之CD8⁺細胞在10天之期間內的細胞擴增情形。第8A至8C圖各代表單一供體細胞系之細胞。

第9A至9D圖顯示以第II類TCR(MAGE-A3)轉導之來自三個供體的CD4⁺和CD8⁺細胞在8天之期間內的細胞擴增情形。將細胞在IL-7和IL-15之存在下(第9A圖：圓圈；第9B至9C圖：正方形)或IL-7、IL-15和AKTi之存在下(第9A圖：正方形；第9B至9C圖：圓圈)培養。使細胞在XURI^TM細胞擴展系統中在大製造規模下增長。第9A至9D圖各代表單一供體細胞系之細胞擴增情形。擴增方案之來源材料係從CD4⁺和CD8⁺細胞分離出。

第10圖顯示以第I類TCR(HPV-E6)轉導之T細胞的轉導效率。將細胞係在單獨之IL-2；IL-2和AKTi；IL-7和IL-15；或IL-7、IL-15和AKTi之存在下培養。在第2天轉導細胞並在第10天以特異性識別經轉導之TCR的抗mTCRb抗體為細胞染色來測量轉導效率。圖中顯示各培養條件(x軸)之陽性抗mTCRb染色的細胞百分比(y軸)。

第11A至11F圖顯示以來自2個供體之CD4⁺/CD8⁺ T細胞的第II類TCR(MAGE-A3)轉導之T細胞的轉導效率。將細胞在單獨之IL-2；IL-2和AKTi；IL-7和IL-15；或IL-7、IL-15和AKTi之存在下培養。在第2天轉導細胞並在第10天以抗mTCRb抗體(mC TCR PE)為細胞染色來測量轉導效率(第11A和11D圖)。第11B和11E圖顯示各培養條件之抗mTCRb染色之MFI。第11C和11F圖顯示2個供體之表現CDR及經轉導之TCR的細胞之分佈的FACS分析。

第12圖顯示來自4輪製造規模運行(16、21、22和23)之T細胞以第II類TCR(MAGE-A3)轉導之T細胞的轉導效率。在每一輪方面，將細胞分至二種培養條件：依指示添加IL-7和IL-15及添加IL-7、IL-15和AKTi。轉導效率係以抗mTCRb抗體(mC TCR PE)為細胞染色來測量。圖中為顯示各輪(x軸)之陽性抗mTCRb染色的細胞百分比(y軸)。

第13A至13F圖顯示以第II類TCR(MAGE-A3)轉導並在有和無AKTi之各種條件下培養之CD4⁺/CD8⁺ T細胞的分化狀態。將來自供體1(第13A和13D圖)、供體2(第13B和13E圖)及供體3(第13C和13F圖)之T細胞在單獨之IL-2；IL-2和AKTi；IL-7和IL-15；或IL-7、IL-15和AKTi之存在下培養，然後為CD62L表現(此為細胞分化早期階段之標記物)進行染色。第13A至13C圖中呈現各供體在各培養條件(x軸)下之 CD3⁺和CD62L⁺細胞(y軸)的百分比。第13D至13F圖中顯示各供體細胞系在各培養條件(x軸)下之CD62L染色的MFI(y軸)。

第14A至14B圖顯示由來自三輪製造規模運行(21、22和23)之T細胞所製造之細胞因子證明之培養條件對T細胞功能的影響。在IL-7和IL-15或IL-7、IL-15和AKTi之存在下，將以第II類TCR(MAGE-A3)轉導之供體T細胞培養在XURI^TM生物反應器細胞擴增系統中。CD3和IFNg染色陽性(第14A圖)及CD3和TNFa染色陽性(第14B圖)的細胞百分比顯示在第21、22和23各輪中，在有或無AKTi之存在下培養的細胞。

第15圖顯示由以第II類TCR(MAGE-A3)轉導並與陽性和陰性靶的腫瘤細胞系共同培養之供體T細胞所製造之IFNg證明的T細胞活性。以第II類TCR轉導來自二輪製造規模運行(21和22)之T細胞並將其在IL-7和IL-15或IL-7、IL-15和AKTi之存在下培養在XURI^TM生物反應器細胞擴增系統中。然後將細胞與表現TCR靶抗原之腫瘤細胞系(H1299、HT1197或HT1367)或不表現TCR靶抗原之腫瘤細胞系(DU145、SK MEL 28或SK MEL 5)共同培養一整夜。T細胞活性係由在各培養條件下之各細胞系(x軸)所製造之IFNg(以pg/mL顯示)(y軸)指示。誤差棒條指示標準差。

第16A至16D圖顯示由以第I類TCR(HPV-E6)轉導並在有或無AKTi之存在下培養之三個供體T細胞系所製造之IFNg證明的T細胞活性。第16A圖顯示來自三個供體(x軸)之T細胞在單獨之IL-2；IL-2和AKTi；IL-7和IL-15；或IL-7、IL-15和AKTi之存在下與表現TCR抗原之腫瘤細胞系(Caski細胞；子宮頸癌細胞系)共同培養後所製造之IFNg的量(pg/mL；y軸)。第17B至17D圖顯示供體1(第16B圖)中、供體2(第16C圖)及供體3(第16D圖)T細胞在單獨之IL-2(圓圈)；IL-2和AKTi(正方形)；IL-7和IL-15(三角形)；或IL-7、IL-15和AKTi(倒三角形)之存在下，供體T細胞與T2細胞(其裝載滴定量之SCR特異性肽)共同培養後所製造之IFNg(pg/mL；y軸)。誤差棒條指示標準差。

第17A至17D圖為FACS直方圖，其顯示在有(第17B和17D圖)或無AKTi(第17A和17C圖)之存在下培養後T細胞之增殖情形。將來自供體3之T細胞在IL-2(第17A圖)、IL-2和AKTi(第17B圖)、IL-7和IL-15(第17C圖)及IL-7、IL-15和AKTi(第17D圖)中生長並以第II類TCR(MAGE-A3)轉導，再與表現TCR抗原之腫瘤細胞系共同培養4天。藉由羧基螢光素琥珀醯亞胺酯(CFSE)染色來測量T細胞增殖(第17A至17D圖)。L=晚期增殖；M=中期增殖；且E=早期增殖。

第18A至18B圖為顯示來自二輪大規模製造培養運行之T細胞的細胞增殖之FACS直方圖：21(第18A圖)和22(第18B圖)。將T細胞生長在IL-2中及在IL-7、IL-15和AKTi中並以第II類TCR(MAGE-A3)轉導之。在IL-7和IL-15或IL-7、IL-15和AKTi之存在下，將T細胞與表現TCR靶抗原(“陽性靶的”)之腫瘤細胞系或不表現TCR靶抗原(“陰性靶的”)之細胞系共同培養4天。藉由CFSE染色測量T細胞增殖，對該模式標準化，與comp-FITC-A染色相比較(如第16(第18A圖)、21(第18B圖)和22(第18C圖)各輪運行之說明)。

詳細說明

本發明關於製備用於T細胞治療之T細胞的方法。尤其是，本發明關於藉由活體外將一或多個T細胞與AKTi及外源性IL-7和IL-15中至少一者接觸來調控(例如延緩或抑制)T細胞成熟或分化之方法。藉由延遲或抑制T細胞成熟或分化，可將所收集之供體T細胞中之未成熟、分化較少之T細胞(例如中央記憶Tcm細胞之初始T細胞)富集，使該一或多個T細胞一旦被投至個體(例如患者)時增加能之持久性。因此，該經富集之未成熟的T細胞群體較處於混合之分化階段的T細胞群更可能產生持續之抗腫瘤作用。

定義

為了使本發可更容易地被理解，首先定義某些術語。除非本文另有明確規定，如本申請案中所使用之下列各術語應具有下文中所提出之意義。另外之定義闡述於本申請案之全文中。

除非另外定義，否則本文中所使用之所有技術和科學術語具有與本發明之相關技藝的一般技術人士所通常理解的相同含義。例如，Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology,Juo,Pei-Show,2nd ed.,2002,CRC Press；The Dictionary of Cell and Molecular Biology,3rd ed.,1999,Academic Press；及Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology,Revised,2000,Oxford University Press，其提供技術人士本發明所使用之許多術語的一般字典。

單位、前綴及符號係以其國際單位制(SI)所接受之形式表示。數字範圍包括定義該範圍之數字。本文提供之標題並非用來限制本發明之各種態樣(其可藉由參考整篇說明書得到)。因此，緊接在下文中所定義之術語可藉由參考整篇專利說明書而有更完整的定義。

本文所使用之不定冠詞“一(a或an)”應被理解為係指“一或多個”任一敘述或列舉之組分。

術語“約”或“基本上由...組成”係指在由本技藝之一般技術人士所測定之特定數值或組成之可接受的誤差範圍內的數值或組成，這將部分取決於該數值或組成是如何被測量或測定的，即，該測量系統之限制。例如，“約”或“基本上由...組成”可意指經由本技藝中實行在1個標準差之內或超過1個標準差。或者，“約”或“基本上由...組成”可意指高達10%(即，±10%)之範圍。例如，約3mg可包含介於2.7mg和3.3mg(10%)之間的任何數目。此外，尤其是關於生物系統或過程，該術語可意指高達數值之數量級或高達5倍。當在申請案和申請專利範圍中提供特定之數值或組成時，除非另有說明，“約”或“基本上由...組成”的意義應被認為係在該特定數值或組成之可接受的誤差範圍內。

除非另有說明，如本文所描述之任何濃度範圍、百分比範圍、比例範圍或整數範圍應被理解為包括在該所列舉之範圍內的任何整數值且當適當時，包括其分數(諸如一個整數的十分之一及百分之一)。

本文所使用之術語“及/或”被視為具體揭示有或無另一特性或組分存在之該二項具體指明之特性或組分的各項特性或組分。因此，本文之短語，諸如“A及/或B”中所使用之術語“及/或”意圖包括“A和B”、“A或B”、“A”(單獨)和“B”(單獨)。同樣地，短語，諸如“A、B及/或C”中所使用之術語“及/或”意圖包含下列各態樣：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(單獨)；B(單獨)；及C(單獨)。

應理解的是，本文中以語言“包含”描述之任一態樣亦提供以術語“由...組成”及/或“基本上由...組成”描述之其他類似態樣。術語“活化”或“經活化的”係指已被充足刺激以誘導可檢測之細胞增殖的免疫細胞(例如T細胞)狀態。活化亦可能與經誘導之細胞因子產製及可檢測之效應子功能有關。術語“經活化之T細胞”尤其係指正經歷細胞分裂之T細胞。T細胞活化可藉由T細胞增加一或多個生物標誌物之表現(包括，但不限於CD57、PD1、CD107a、CD25、CD137、CD69及/或CD71)來表徵。

“投予”係指利用本技藝之技術熟習人士已知之各種方法和遞送系統的任一者將試劑物理引入個體中。用於投予藉由本發明揭示之方法製備的T細胞之示例性途徑包括靜脈內、肌肉內、皮下、腹膜內、脊柱或其他腸胃道外投予途徑，例如藉由注射或輸注。如本文所使用之短語“腸胃道外投予”意指除了腸內和局部投予外之投予模式，通常係藉由注射，且包括，但不限於靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、淋巴內、病灶內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外和胸骨內注射和輸注，以及體內電穿孔。於一些實施態樣中，藉由本方法製備之T細胞係經由非腸胃道外途徑投予，例如口服。其他非腸胃道外途徑包括局部、表皮或黏膜投予途徑，例如鼻內、陰道、直腸、舌下或局部。投予亦可執行，例如一次、多次及/或在一或多個延長之期間執行。

術語“AKT抑制劑”、“AKTI”或“AKTi”可互換使用且係指能夠阻斷、降低或抑制AKT之活性的任何分子(例如AKT拮抗劑)，包括，但不限於小分子、多核苷酸(例如DNA或RNA)或多肽(例如抗體或其抗原結合部分)。AKT為絲胺酸/蘇胺酸激酶，亦稱為蛋白激酶B或PKB。AKT抑制劑可直接作用在AKT上(例如藉由結合 AKT)，或者其可間接作用(例如藉由干擾AKT和結合伴侶之間的交互作用或藉由抑制PI3K-AKT-mTOR途徑之另一成員的活性)。AKTi之非限制性實例顯示於本申請案之其他部分。

術語“抗體”(Ab)包括，但不限於特異性結合抗原之免疫球蛋白。一般而言，抗體可包含藉由二硫鍵相互連接之至少二個重(H)鏈和二個輕鏈(L)。各H鏈包含一個重鏈可變區(本文縮寫為VH)和一個重鏈恆定區。該重鏈恆定區可包含三或四個恆定結構域CH1、CH2、CH3及/或CH4。各輕鏈包含一個輕鏈可變區(本文縮寫為VL)和一個輕鏈恆定區。輕鏈恆定區可包含一個恆定結構域CL。VH和VL區可進一步細分為高度可變區(稱為互補決定區(CDR))，其間穿插較被保留之區域，稱為框架區(FR)。各VH和VL包含三個CDR和四個FR，從胺基端至羧基端之排列順序如下：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。該重鏈和輕鏈之可變區含有與抗原(例如AKT)交互作用之結合結構域。

免疫球蛋白可源自任何普遍為人所知之同種型，包括，但不限於IgA、分泌型IgA、IgG及IgM。IgG子類亦為本技藝之技術人士所熟知，包括，但不限於人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。“同種型”係指由重鏈恆定區基因編碼之Ab類別或子類(例如IgM或IgG1)。術語“抗體”包括，例如天然產生和非天然產生之Ab；單株和多株Ab；嵌合型和人化Abs；人類或非人類Ab；全合成Ab；及單鏈Ab。非人類Ab可藉由重組方法人化以降低其在人體之免疫原性。當未明確指出且除非上下文另有說明，術語“抗體”亦包括任何上述免疫球蛋白之抗原結合片段或抗原結合部分且包括單價和二價片段或部分及單鏈Ab。

“抗原結合分子”或“抗體片段”係指任何小於整體的抗體部分。抗原結合分子可包括抗原性互補決定區(CDR)。抗體片段之實例包括，但不限於Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、dAb、線性抗體、scFv抗體及從抗原結合分子形成之多特異性抗體。

術語“自體的”係指其來源之個體與其隨後將被引入之個體為相同個體的任何物質。例如本文所描述之經處理之自體細胞治療(eACT^TM)方法涉及從供體(例如患者)收集淋巴細胞，然後將該淋巴細胞經處理以表現，例如CAR構建體，再將該淋巴細胞投予返回同一供體(例如患者)。

術語“同種異體的(allogenic)”係指源自一個個體，然後被引入相同物種之另一個體的任何物質，例如同種異體之T細胞移植。

“癌症”係指特徵為異常細胞在體內失控生長的一大群各種疾病。不受調節之細胞分裂和生長導致形成侵入鄰近組織且亦可透過淋巴系統或血流轉移到身體之遠端部位的惡性腫瘤。“癌症”或“癌症組織”可包括處於不同階段之腫瘤。於某些實施態樣中，該癌症或腫瘤為0期，因而，例如該癌症或腫瘤係在發展的很早期且並未轉移。於一些實施態樣中，該癌症或腫瘤係在第I期，因而，例如該癌症或腫瘤之大小很小，未擴散到附近組織且未轉移。於其他實施態樣中，該癌症或腫瘤為第II期或第III期，因而，例如該癌症或腫瘤較0期或第I期更大，且其已生長進入鄰近組織，但其並未轉移，除了可能轉移至淋巴結外。於其他實施態樣中，該癌症或腫瘤為第IV期，因而，例如該癌症或腫瘤已經轉移。第IV期亦可稱為末期或轉移性癌症。

如本文所使用之“抗腫瘤作用”係指可以腫瘤體積縮小、腫瘤生長受抑制、腫瘤細胞數量減少、腫瘤細胞增殖減少、轉移數目減少、總體或無進展存活增加、預期壽命增加或與該腫瘤相關之各種生理症狀改善呈現之生物學效果。抗腫瘤作用亦可指預防腫瘤發生，例如疫苗。

如本文所使用之術語“無進展存活”(其可縮寫為PFS)係指從治療日期到疾病進展(經由修訂之惡性淋巴瘤的IWG反應標準)或任何原因死亡的日期。

“疾病進展”係藉由在X光片上或不應被報告為不良事件之其他方法測量惡性病變來評估。由於無徵兆和症狀之疾病進展所導致之死亡應報告為原發性腫瘤類型(例如DLBCL)。

如本文所使用之“反應持續時間”(其可縮寫為DOR)係指介於個體之第一客觀反應與確認疾病進展(經由修訂之惡性淋巴瘤的IWG反應標準)或死亡日期之間的期間。

術語“總體生存期”(其可縮寫為OS)之定義為從治療日期到死亡日期之時間。

如本文所使用之“細胞因子”係指可由免疫細胞(包括巨噬細胞、B細胞、T細胞和肥大細胞)釋出以傳播免疫反應之非抗體蛋白。於一些實施態樣中，一或多種細胞因子被釋出以回應T細胞治療。於某些實施態樣中，那些在回應T細胞治療時分泌的細胞因子可為有效之T細胞治療的徵兆。

如本文所使用之“治療有效量”或“治療有效劑量”係指藉由本發明之方法製造之T細胞或DC細胞的量在單獨使用或與另一種治療劑組合使用時可保護個體對抗疾病發作或促進疾病消退，該保護個體對抗疾病發作或促進疾病消退之作用可由疾病症狀之嚴重性降低、疾病無症狀期之頻率和持續時間增加或防止由疾病痛苦造成之損傷或殘疾證明。T細胞或DC細胞促進疾病消退之能力可使用技術熟習之從業人員已知之各種方法評估，諸如在臨床試驗期間在人類個體中、或在預測人體中之效力的動物模型系統中評估、或藉由在活體外分析中分析該試劑之活性評估。

如本文所使用之術語“有效量”或“有效劑量”係指共同引發所需反應之一或多種T細胞成熟抑制劑(例如AKTi、IL-7和IL-15)之量。因此，延緩或抑制T細胞分化或成熟之AKTi的有效量、IL-7之有效量及IL-15之有效量可能較單獨之AKTi的有效量、單獨之IL-7的有效量或單獨之IL-15的有效量低。於其他實施態樣中，AKTi之有效劑量可指，例如降低AKT活性達到期望量(例如達到至少約10%、至少20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或約100%)之AKTi濃度。

如本文所使用之術語“淋巴細胞”可包括天然殺手(NK)細胞、T細胞或B細胞。NK細胞為代表固有免疫系統之主要組分的一種細胞毒性(細胞毒性的)淋巴細胞類型。NK細胞排斥腫瘤和被病毒感染之細胞。其透過細胞凋亡或程序性細胞死亡之過程作用。他們被稱為“天然殺手”，因為他們不需要活化以殺死細胞。T細胞在由細胞介導之免疫(無抗體參與)中發揮主要作用。其T細胞受體(TCR)將他們本身與其他淋巴細胞類型區分開。胸腺(一种免疫系統之特化器官)主要負責T細胞之成熟。

T細胞有數種類型，即：輔助T細胞(例如CD4+細胞、效應T_EFF細胞)、細胞毒性T細胞(亦稱為TC、細胞毒性T淋巴細胞、CTL、T殺手細胞、溶細胞性T細胞、CD8+T細胞或殺手T細胞)、記憶T細胞((i)幹記憶T_SCM細胞，像初始細胞，為CD45RO-、CCR7+、CD45RA+、CD62L+(L-選擇素)、CD27+、CD28+和IL-7Rα+，但它們亦表現大量CD95、IL-2Rβ、CXCR3和LFA-1且顯示眾多記憶細胞特有的功能屬性)；(ii)中央記憶T_CM細胞表現L-選擇素且為CCR7⁺和CD45RO⁺，且其分泌IL-2，但不分泌IFNγ或IL-4及(iii)效應記憶T_EM細胞，然而，不表現L-選擇素或CCR7，但表現CD45RO並製造效應細胞因子，像IFNγ和IL-4)、調節性T細胞(Treg、抑制性T細胞、或CD4+CD25+調節性T細胞)、天然殺手T細胞(NKT)及γδT細胞。在腫瘤內發現之T細胞被稱為“腫瘤浸潤淋巴細胞”或“TIL”。另一方面，B細胞在體液免疫(有抗體參與)中發揮主要作用。其製造抗體和抗原，並發揮抗原呈遞細胞(APC)之作用且在藉由抗原交互作用活化後轉變成記憶B細胞。在哺乳動物中，未成熟之B細胞係在骨髓中形成，其名字係源於此處。

“初始”T細胞係指免疫上維持未分化之成熟T細胞。在胸腺中經過正選擇和負選擇後，T細胞以CD4⁺或CD8⁺初始T細胞之形式出現。在其初始狀態中，T細胞表現L-選擇素(CD62L⁺)、IL-7受體α(IL-7R-α)及CD132，但其不表現CD25、CD44、CD69或CD45RO。如本文所使用之“未成熟”亦可指顯現初始T細胞或未成熟T細胞之表型特徵的T細胞，諸如T_SCM細胞或T_CM細胞。例如，未成熟之T細胞可表現下列一或多者：L-選擇素(CD62L⁺)、IL-7Rα、CD132、CCR7、CD45RA、CD45RO、CD27、CD28、CD95、IL-2Rβ、CXCR3及LFA-1。初始或未成熟之T細胞可與終末分化之效應T細胞，諸如T_EM細胞和T_EFF細胞形成對比。

如本文所指之“T細胞功能”係指健康T細胞之正常特性。於一些實施態樣中，T細胞功能包含T細胞增殖。於一些實施態樣中，T細胞功能包含T細胞活性。於一些實施態樣中，該T細胞功能包含溶細胞活性。於一些實施態樣中，本發明之方法，例如在AKT抑制劑(及可選擇之IL-7及/或IL-15)的存在下培養T細胞，可增加一或多種T細胞功能，從而使該T細胞更適合及/或更有效地用於T細胞治療。於一些實施態樣中，與在缺乏AKT抑制劑(或AKTi、IL-7和IL-15)之條件下培養的T細胞相比較，根據本發明之方法培養之T細胞的T細胞功能增加。於某些實施態樣中，與在缺乏AKT抑制劑(或AKTi、IL-7和IL-15)之條件下培養的T細胞相比較，根據本發明之方法培養之T細胞的T細胞增殖增加。於某些實施態樣中，與在缺乏AKT抑制劑(或AKTi、IL-7和IL-15)之條件下培養的T細胞相比較，根據本發明之方法培養之T細胞之T細胞活性增加。於某些實施態樣中，與在缺乏AKT抑制劑(或AKTi、IL-7和IL-15)之條件下培養的T細胞相比較，根據本發明之方法培養之T細胞之溶細胞活性增加。

如本文所使用細胞“增殖”係指T細胞透過細胞分裂使數目增長的能力。增殖可藉由以羧基螢光素琥珀醯亞胺酯(CFSE)將細胞染色來測量。細胞增殖可在活體外發生，例如在T細胞培養期間，或在體內發生，例如在投予T細胞治療後。

如本文所使用之“T細胞活性”係指健康T細胞之共有活性。於一些實施態樣中，該T細胞活性包含製造細胞因子。於某些實施態樣中，該T細胞活性包含製造一或多種選自下列群組之細胞因子：干擾素-γ(IFNg)、組織壞死因子α(TNFa)及該二者。

如本文所使用之“溶細胞活性”或“細胞毒性”係指T細胞破壞靶細胞之能力。於一些實施態樣中，該靶細胞為癌細胞，例如腫瘤細胞。於一些實施態樣中，該T細胞表現嵌合型抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)，且該靶細胞表現靶抗原。

術語“經基因工程處理的”、“基因編輯”或“經處理的”係指修飾細胞之基因組的方法，包括，但不限於刪除編碼或非編碼區或其部分、或插入編碼區或其部分。於一些實施態樣中，該經修飾之細胞為淋巴細胞，例如T細胞，其可從患者或供體取得。該細胞可經修飾以表現外源性構建體，諸如，例如被併入該細胞之基因組中的嵌合型抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)。

“免疫反應”係指免疫系統之細胞(例如T淋巴細胞、B淋巴細胞、天然殺手(NK)細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、樹突細胞和嗜中性粒細胞)及由這些細胞之任一者或肝臟製造之可溶性大分子(包括Ab、細胞因子及補體)所導致之選擇性地靶向、結合、損壞、破壞及/或從脊椎動物排除入侵之病原體、被病原體感染之細胞或組織、癌性或其他異常細胞，或在自體免疫或病理性發炎的情況中，正常之人類細胞或組織的作用。

術語“免疫治療”係指藉由包含誘導、增強、抑制或以其他方式修飾免疫反應的方法對受疾病折磨、或處於染病或疾病復發之風險中的個體進行之治療。免疫治療之實例包括，但不限於T細胞治療。T細胞治療可包括過繼性T細胞治療、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)免疫治療、自體細胞治療、經處理之自體細胞治療(eACT^TM)及同種異體T細胞移植。然而，本技藝之技術人士將察知本發明所揭示之製備T細胞的方法將可增進任何移植之T細胞治療的有效性。T細胞治療之實例描述於美國專公開案號2014/0154228和2002/0006409、美國專利號5,728,388及國際公開案WO 2008/081035中。

該免疫治療之T細胞可來自本技藝已知之任何來源。例如，T細胞可在活體外從造血幹細胞群分化，或者T細胞可從供體取得。該供體可為個體，例如需要抗癌治療之個體。T細胞可從，例如外周血單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位之組織、腹水、胸腔積液、脾組織及腫瘤取得。另外，T細胞可源自一或多個本技藝中可用之T細胞系。T細胞亦可利用本技藝之技術人士已知之任何數目的技術(諸如FICOLL^TM分離及/或分離術(apheresis))從個體收集之血液單位取得。T細胞亦可從人造胸腺類器官(ATO)細胞培養系統取得，該系統複製人類胸腺環境以支持T細胞在體外從初級和重新編程之多能幹細胞有效分化。分離T細胞以用於T細胞治療的其他方法揭示於美國專利公開案號2013/0287748(其全文以引用方式併入本文)中。

術語“經處理之自體細胞治療”(其可縮寫成“eACT^TM”，亦稱為過繼性細胞轉移)為一種過程，藉由此過程可收集患者自身之T細胞，接著將該T細胞經基因工程改變以識別並靶向一或多個表現在一或多個特定之腫瘤細胞或惡性腫瘤的細胞表面上之抗原。T細胞可經處理以表現，例如嵌合型抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)。CAR陽性(+)T細胞係經處理以表現對連接胞內信號傳導部分(其包含共刺激結構域和活化結構域)之特定腫瘤抗原具特異性的胞外單鏈可變片段(scFv)。該共刺激結構域可源自，例如CD28、CTLA4、CD16、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、程序性死亡-1(PD-1)、程序性死亡配體-1(PD-L1)、誘導型T細胞共刺激分子(ICOS)、ICOS-L、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1(CD1 1a/CD18)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT(腫瘤壞死因子超家族成員14；TNFSF14)、NKG2C、Igα(CD79a)、DAP-10、Fcγ受體、第I類MHC分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞因子受體、整合素、傳信淋巴細胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK細胞受體、BTLA、Toll配體受體、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD1 1d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD1 1a、LFA-1、ITGAM、CD1 1b、ITGAX、CD1 1c、 ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、特異性結合CD83之配體或彼等之任何組合。該活化結構域可源自，例如CD3，諸如CD3ζ、ε、δ、γ或類似物。於某些實施態樣中，該CAR係經設計成具有二、三、四或更多個共刺激結構域。該CAR scFv可被設計成靶向，例如CD19，其為由B細胞譜系中之細胞表現的跨膜蛋白，包括所有正常之B細胞和B細胞惡性腫瘤，包括，但不限於NHL、CLL及非T細胞ALL。示例性CAR+ T細胞治療和構建體描述於美國專利公開案號2013/0287748、2014/0227237、2014/0099309和2014/0050708中，這些參考文獻之全文以引用方式併入本文。

如本文所使用之“患者”包括任何患有癌症(例如淋巴瘤或白血病)之人類。本文中，術語“個體”和“患者”可互換使用。本文中，術語“供體個體”係指其細胞被取得以供進一步在活體外進行處理的個體。該供體個體可為欲以藉由本文所描述之方法產生之細胞群治療的癌症患者(即，自體供體)，或可為捐贈淋巴細胞樣本之個人，該淋巴細胞樣本當藉由本文所描述之方法產生細胞群時將用於治療不同的個體或癌症患者(即，同種異體供體)。那些接受藉由本發明方法製備之細胞的個體可稱為“受體個體”。

本文中所使用之“刺激”係指由刺激分子與其同源配體結合所誘導出之初級反應，其中該結合介導信號轉導事件。“刺激分子”為在T細胞上之分子，例如特異性結合存在於抗原呈遞細胞上之同源刺激性配體的T細胞受體(TCR)/CD3複合物。“刺激配體”為當存在於抗原呈遞細胞(例如人工抗原呈遞細胞(aAPC)、樹突細胞、B細胞，等)上時可特異性結合T細胞上之刺激分子，從而介導T細胞之初級反應的配體，該T細胞之初級反應包括，但不限於活化、起始免疫反應、增殖，等。刺激性配體包括，但不限於裝載肽之第I類MHC分子、抗CD3抗體、超級激動劑抗CD28抗體及超級激動劑抗CD2抗體。如本文所用之“經活化的”或“活性”係指已被刺激之T細胞。活性T細胞可藉由表現一或多個選自下列群組之標記物來表徵：CD137、CD25、CD71、CD26、CD27、CD28、CD30、CD154、CD40L及CD134。

術語“外源性”係指任何源自外部來源的物質。例如，外源性IL-7或外源性IL-15可從市場購得或經重組產生。當添加在一或多個T細胞中或與一或多個T細胞接觸時，“外源性IL-7”或“外源性IL-15”表示該IL-7及/或IL-15並非由T細胞產生。於一些實施態樣中，該T細胞在與外源性IL-7或IL-15混合之前可含有微量由該T 細胞製造或從具有該T細胞之個體中分離出的IL-7及/或IL-15(即，內源性IL-7或IL-15)。本文中所描述之一或多個T細胞可透過本技藝中已知之任何方式與外源性IL-7及/或外源性IL-15接觸，包括在培養中添加經分離之IL-7及/或IL-15、在培養基中包含IL-7及/或IL-15或由該培養中該一或多個T細胞以外之一或多個細胞(諸如由飼養層)表現IL-7及/或IL-15。

如本文所使用之術語“持久性”係指，例如該一或多個投予個體之移植的T細胞或其後代(例如分化或成熟之T細胞)在個體內維持可檢測之水準一段期間的能力。如本文所使用者，增加該一或多個移植之T細胞或其後代(例如分化或成熟之T細胞)之持久性係指增加該移植之T細胞在投予後可在個體中檢測到之時間量。例如，該一或多個移植之T細胞在體內之持久性可增加達至少約1天、至少約2天、至少約3天、至少約4天、至少約5天、至少約6天、至少約7天、至少約8天、至少約9天、至少約10天、至少約11天、至少約12天、至少約13天、在至少約14天、至少約3週、至少約4週、至少約1個月、至少約2個月、至少約3個月、至少約4個月、至少約5個月或至少約6個月。此外，與該一或多個並非藉由本文所揭示之本發明方法製備之移植的T細胞相比較，該一或多個移植之T細胞在體內之持久性可增加達至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約4.5倍、至少約 5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍或至少約10倍。

本文中，術語“減少(reducing)”和“降低(decreasing)”可互換使用且表示少於該原始物的任何變化。“減少”和“降低”為相對的術語，需要比較測量前和測量後之間的結果。“減少”和“降低”包括完全耗竭。於一些實施態樣中，術語“減少”和“降低”包括比較藉由本發明揭示之方法(例如，與AKTi及IL-7和IL-15中至少一者接觸)製備的T細胞與非藉由本方法製備之T細胞之間的T細胞作用。

如本文所使用之術語“調控”T細胞成熟係指利用本文所描述之任何干預來控制一或多個T細胞之成熟，例如分化。於一些實施態樣中，“調控”係指延緩或抑制T細胞成熟。於其他實施態樣中，“調控”係指加速或促進T細胞成熟。尤其是，本文所使用之“延緩或抑制T細胞成熟”係指維持一或多個T細胞在未成熟或未分化之狀態。例如，“延緩或抑制T細胞成熟”可指將T細胞維持在初始或T_CM狀態，與進展至T_EM或T_EFF狀態相反。“延緩或抑制T細胞成熟”亦可指增加或富集在T細胞混合群體中之未成熟或未分化之T細胞(例如初始T細胞及/或T_CM細胞)的整體百分比。T細胞之狀態(例如，諸如成熟或未成熟)可藉由，例如篩選各種基因之表現及是否存有表現在該T細胞表面上之各種蛋白質來測定。例如存有一或多個選自由下列所組成之群組的標記物可為不太成熟、未分化之T細胞的指示：L-選擇素(CD62L+)、IL-7R-α、CD132、CR7、CD45RA、CD45RO、CD27、CD28、CD95、IL-2Rβ、CXCR3、LFA-1及彼等之任何組合。

“治療(treatment或treating)”個體係指在個體上執行任何類型之干預或過程，或投予個體一或多個藉由本發明製備之T細胞以逆轉、減輕、改善、抑制、減緩或預防與疾病相關之症狀、併發症、或病症、或生化標記之發作、進展、發展、嚴重或復發。於一實施態樣中，“治療(treatment或treating)”包括部分緩解。於另一實施態樣中，“治療(treatment或treating)”包括完全緩解。

本發明之各個態樣進一步詳細描述於下列小節中。

製備免疫細胞之方法

本發明關於製備用於細胞治療之免疫細胞(例如淋巴細胞或樹突細胞)的方法。據發現，某些在活體外經處理之細胞(例如CAR T細胞、TCR細胞或樹突細胞)在投予患者後並不像在活體外經處理後那樣有效。不欲受限於任何理論，值得注意的是，有一個原因可能是該淋巴細胞可能在投予患者之前在活體外過早分化。於某些實施態樣中，本發明提出藉由添加AKTi及外源性IL-7和外源性IL-15中至少一者來延緩、防止或抑制細胞在活體外過早分化。

於一實施態樣中，本發明關於活體外調控，例如延緩或抑制T細胞或DC細胞成熟或分化之方法，該方法係藉由將一或多個自供體個體取得之T細胞與AKT抑制劑及外源性IL-7和外源性IL-15中至少一者(或該二者)接觸來進行。延緩或抑制T細胞或DC細胞成熟或分化可增加所收集之T細胞或DC細胞群中之未成熟、分化程度較低之細胞(例如中央記憶T_CM細胞之初始T細胞)的百分比。因此，本文所描述之方法可用於增加細胞治療(例如T細胞治療或DC細胞治療)中之移植的T細胞或DC細胞或其後代在體內之持久性。此外，本發明提供所產生之T細胞或DC細胞顯現活體外和體內擴增增加及優越之抗腫瘤活性。

於另一實施態樣中，本發明包括活體外調控(例如延緩或抑制)細胞(例如T細胞)成熟或分化以供細胞治療(例如T細胞治療)之方法，其包含令一或多個來自需要細胞治療(例如T細胞治療)之個體的細胞(例如T細胞或DC細胞)與(i)AKT抑制劑及外源性介白素-7(IL-7)和外源性介白素-15(IL-15)中至少一者接觸，其中所產生之T細胞顯現延遲之成熟或分化。接觸可包含直接在該一或多個T細胞或含有該T細胞之緩衝劑或培養基中添加(i)該AKT抑制劑及(ii)外源性IL-7及/或外源性IL-15，混合(i)該AKT抑制劑及(ii)外源性IL-7及/或外源性IL-15與其他組分，及/或將該一或多個細胞添加在包含下列群組之培養基中：(i)該AKT抑制劑及(ii)外源性IL-7及/或外源性IL-15。於某些實施態樣中，該一或多個T細胞不與外源性介白素-2(IL-2)接觸。進一步之T細胞製備方法描述於本文他處。

本發明證明令一或多個T細胞或DC細胞在活體外與AKT抑制劑和IL-7和IL-15中至少一者接觸可使樣本中之初始T細胞和T_CM細胞的濃度相對於更為終末分化之T細胞而言較為增加。因此，於另一實施態樣中，本發明包括用於產生幹細胞樣CD4⁺T細胞或CD8⁺T細胞的方法，其包含將一或多個T細胞在含有下列群組之培養基中培養：(i)AKT抑制劑和(ii)外源性IL-7、外源性IL-15或該二者。於其他實施態樣中，本發明包括富集樣本中之CD8⁺/CD45RA⁺/CCR7⁺ T細胞群之方法，其包含(a)從個體取得一或多個T細胞；(b)令該一或多個T細胞與(i)AKT抑制劑和(ii)外源性IL-7、外源性IL-15或該二者接觸；及(c)在AKT抑制劑和外源性IL-7、外源性IL-15或該二者之存在下擴增該一或多個T細胞。產生及增加未成熟和未分化之T細胞或DC細胞的濃度可增加該細胞在移植入需要細胞治療(例如T細胞治療或DC細胞治療)之個體時在體內之持久性。因此，於另一實施態樣中，本發明包括用於延長該在過繼性細胞治療中之一或多個T細胞或DC細胞在體內之持久性的方法，其包含在投予個體之前令該一或多個T細胞或DC細胞與(i)AKT抑制劑和(ii)外源性IL-7、外源性IL-15或該二者接觸；其中該體內持久性相對於未與AKT抑制劑和外源性IL-7、外源性IL-15或該二者接觸之T細胞而言被延長。

本發明所揭示之方法包含活體外調控(例如延緩或抑制)一或多個T細胞或DC細胞成熟或分化。該一或多個T細胞或DC細胞之成熟或分化的延緩或抑制情形可藉由本技藝中已知之任何方法測量。例如，該一或多個T細胞或DC細胞之成熟或分化的延緩或抑制情形可藉由檢測是否存有一或多個生物標記物來測量。該一或多個生物標記物之存在可藉由本技藝中已知之任何方法檢測，包括，但不限於免疫組織化學及/或螢光活化之細胞分選(FACS)。於一些實施態樣中，該一或多個生物標記物係選自由下列所組成之群組：L-選擇素(CD62L⁺)、IL-7Rα、CD132、CCR7、CD45RA、CD45RO、CD27、CD28、CD95、IL-2Rβ、CXCR3、LFA-1或彼等之任何組合。於某些實施態樣中，該一或多個T細胞或DC細胞之成熟或分化的延緩或抑制情形可藉由檢測是否存有L-選擇素(CD62L⁺)、IL-7Rα及CD132之一或多者來測量。本技藝之技術熟習人士將察知雖然本發明之方法可增加所收集之細胞群中之未成熟和未分化之T細胞或DC細胞的相對比例，一些成熟和分化的細胞仍可能存在。因此，該一或多個T細胞或DC細胞之成熟或分化的延緩或抑制情形可藉由在該一或多個細胞與AKT抑制劑及外源性IL-7和外源性IL-15中至少一者接觸之前和之後計算細胞群中之未成熟和未分化之細胞的總百分比來測量。於一些實施態樣中，本發明揭示之方法增加未成熟和未分化之T細胞在T細胞群中之百分比。於某些實施態樣中，該一或多個與 AKT抑制劑及外源性IL-7和外源性IL-15中至少一者接觸之T細胞包含至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或約100%之未成熟或未分化的T細胞。於其他實施態樣中，該一或多個與AKT抑制劑及外源性IL-7和外源性IL-15中至少一者接觸之T細胞或DC細胞包含至少約10%到至少約90%、至少約20%到至少約80%、至少約30%到至少約70%、至少約40%到至少約60%、至少約10%到至少約50%、至少約20%、至少約40%、至少約35%到至少約45%、至少約20%到至少約60%、或至少約50%到至少約90%之未成熟或未分化之T細胞或DC細胞。於某些實施態樣中，該未成熟或未分化之T細胞為初始T細胞及/或中央記憶T_CM細胞。

本發明所揭示之方法包含令一或多個T細胞或DC細胞與AKT抑制劑及外源性IL-7和外源性IL-15一或多者接觸。於一些實施態樣中，該方法包含令一或多個T細胞或DC細胞與AKT抑制劑、外源性IL-7和外源性IL-15接觸。於另一實施態樣中，該方法包含令一或多個T細胞或DC細胞與AKT抑制劑和外源性IL-7接觸。於另一實施態樣中，該方法包含令一或多個T細胞或DC細胞與AKT抑制劑和外源性IL-15接觸。於一個特定之實施態樣中，該一或多個T細胞或DC細胞亦與外源性IL-2接觸。於另一實施態樣中，該一或多個T細胞或DC細胞不與外源性IL-2接觸。

該一或多個T細胞或DC細胞可透過本技藝中已知之任何方式與AKT抑制劑和外源性IL-7及/或IL-15接觸。例如，該AKT抑制劑和IL-7/IL-15可添加在用於培養該一或多個T細胞或DC細胞的培養基中。或者，該AKT抑制劑和IL-7/IL-15可由一或多個與該一或多個T細胞或DC細胞共同培養之細胞(例如由飼養細胞層)產生。該AKT抑制劑、IL-7和IL-15可以一起添加或可個別添加。例如，可將該AKT抑制劑添加在培養基中，而IL-7及/或IL-15可由與該一或多個T細胞共同培養之細胞產生。

此外，該一或多個T細胞或DC細胞可同時、在不同時間、在重疊時間或依序與該AKT抑制劑和外源性IL-7及/或外源性IL-15接觸。例如，該一或多個T細胞或DC細胞可先與外源性IL-7及/或外源性IL-15接觸，再與AKT抑制劑接觸。或者，該一或多個T細胞或DC細胞可先與AKT抑制劑接觸，再與外源性IL-7及/或外源性IL-15接觸。於一特定之實施態樣中，該一或多個T細胞或DC細胞先單獨與外源性IL-7及/或外源性IL-15接觸，然後再與該AKT抑制劑和外源性IL-7及/或外源性IL-15同時接觸。於另一實施態樣中，該一或多個T細胞或DC細胞先單獨與AKT抑制劑接觸，然後再與該AKT 抑制劑和外源性IL-7及/或外源性IL-15同時接觸。於一些實施態樣中，清洗該一或多個T細胞或DC細胞以除去該AKT抑制劑、外源性IL-7及/或外源性IL-15。

本發明之一或多個T細胞或DC細胞可投予個體以用於T細胞或DC細胞治療中。因此，該一或多個T細胞或DC細胞可從需要T細胞治療之個體或從供體收集。一旦收集後，可先將該一或多個T細胞處理一段任何合適之期間，再投予個體。在此期間，可在從供體收集T細胞與投予個體之間的任何期間令該一或多個T細胞與AKT抑制劑、外源性IL-7及/或外源性IL-15接觸。例如，該一或多個T細胞可與該AKT抑制劑、外源性IL-7及/或外源性IL-15接觸(例如在該AKT抑制劑、外源性IL-7及/或外源性IL-15之存在下培養)至少約1天、至少約2天、至少約3天、至少約4天、至少約5天、至少約6天、至少約7天、至少約8天、至少約9天、至少約10天、至少約11天、至少約12天、至少約13天、或至少約14天。於一些實施態樣中，該一或多個T細胞與該AKT抑制劑、外源性IL-7及/或外源性IL-15接觸(例如在該AKT抑制劑、外源性IL-7及/或外源性IL-15之存在下培養)約1天至約14天、約1天至約10天、約1天至約7天、約1天至約6天、約1天至約5天、約1天至約4天、約1天至約3天、約1天至約2天、約2天至約3天、約2天至約4天、約2天至約5天、或約2天至約6天。於一特定之實施態樣中，該一或多個T細胞與該 AKT抑制劑、外源性IL-7及/或外源性IL-15之接觸(例如在該AKT抑制劑、外源性IL-7及/或外源性IL-15之存在下培養)係從收集T細胞的那天(例如第0天)開始到將T細胞投予個體的那天。於另一實施態樣中，該一或多個T細胞與該AKT抑制劑、外源性IL-7及/或外源性IL-15之接觸(例如在該AKT抑制劑、外源性IL-7及/或外源性IL-15之存在下培養)係從第0天開始到投予、從第1天開始到投予、從第2天開始到投予、從第3天開始到投予、從第4天開始到投予、從第5天開始到投予、或從第6天開始到投予。於一些實施態樣中，在投予前先清洗該一或多個T細胞以除去AKT抑制劑、外源性IL-7及/或外源性IL-15。

於某些實施態樣中，本發明針對活體外調控(例如延緩或抑制)T細胞或DC細胞成熟或分化之方法，該方法係藉由令一或多個從供體個體取得之T細胞或DC細胞與AKT抑制劑及外源性IL-7和外源性IL-15(或二者)中至少一者接觸，其中該一或多個細胞不與外源性IL-2接觸。於一實施態樣中，與該一或多個以單獨之IL-2或IL-2和AKTi處理之細胞相比較，該一或多個以AKTi及IL-7和IL-15(或二者)中至少一者處理，但不以IL-2處理之細胞顯現被較高程度地延緩或抑制成熟或分化。與該一或多個以單獨之IL-2或IL-2和AKTi處理之細胞相比較，該一或多個T細胞或DC細胞可顯示未成熟、分化程度較低之細胞(例如中央記憶T_CM細胞之初始T細胞)的百分比增加。因此，本文所描述之方法可用於增加在細胞治療(即，T細胞治療或DC細胞治療)中之移植的T細胞或DC細胞或其後代在體內之持久性。此外，由本發明產生之T細胞或DC細胞表現出在活體外和體內的擴增增加及優越的抗腫瘤活性。於一些實施態樣中，該一或多個T細胞為CD4細胞。於其他實施態樣中，該一或多個T細胞為CD8細胞。於特定之實施態樣中，該與AKTi及IL-7和IL-15中至少一者之接觸係進行至少1天、至少約2天、至少約3天、至少約4天、至少約5天、至少約6天、至少約7天、至少約8天、至少約9天、至少約10天、至少約11天、至少約12天、或約13天。於其他實施態樣中，該與AKTi及IL-7和IL-15中至少一者之接觸係進行一天以上到少於14天、少於13天、少於12天、少於11天、少於10天、少於9天或少於8天。

本文所描述之方法可進一步包括富集從供體取得之淋巴細胞群。富集淋巴細胞群(例如該一或多個T細胞)可藉由任何合適之分離方法實現，包括，但不限於使用分離介質(例如FICOLL-PAQUE^TM、ROSETTESEP^TM HLA總淋巴細胞富集混合物、淋巴細胞分離介質(LSA)(MP Biomedical目錄編號0850494X)、或類似物)分離、藉由過濾或淘選進行之細胞大小、形狀或密度分離法、免疫磁性分離法(例如磁活化之細胞分選系統，MACS)、螢光分離法(例如螢光活化之細胞分選系統，FACS)或基於小珠之管柱分離法。

本文所描述之方法可進一步包含在適當條件下以一或多種T細胞刺激劑刺激淋巴細胞群以產生經活化之T細胞群。該一或多種合適之T細胞刺激劑的任意組合可用於產生經活化之T細胞群，包括，但不限於靶向T細胞刺激或共刺激分子之抗體或其功能片段(例如抗-CD2抗體、抗CD3抗體、抗CD28抗體或其功能性片段)或任何其他合適之有絲分裂原，例如十四烷醯佛波醋酸酯(tetradecanoyl phorbol acetate)(TPA)、植物血凝素(phytohaemagglutinin)(PHA)、刀豆球蛋白A(concanavalin A)(conA)、脂多醣(LPS)、美洲商陸有絲分裂原(pokeweed mitogen)(PWM))或T細胞刺激或共刺激分子之天然配體。

如本文所描述之用於刺激淋巴細胞群之合適條件可包括溫度、時間量及/或在一定之CO₂水準的存在下。於某些實施態樣中，該用於刺激之溫度為約34℃、約35℃、約36℃、約37℃或約38℃。於某些實施態樣中，該用於刺激之溫度為約34至38℃。於某些實施態樣中，該用於刺激之溫度為約35至37℃。於某些實施態樣中，該用於刺激之溫度為約36至38℃。於某些實施態樣中，該用於刺激之溫度為約36至37℃或約37℃。

另一用於刺激如本文所描述之淋巴細胞群的條件可包括用於刺激之時間。於一些實施態樣中，該用於刺激之時間為約24至72小時。於一些實施態樣中，該用於刺激之時間為約24至36小時、約30至42小時、約36至48小時、約40至52小時、約42至54小時、約44 至56小時、約46至58小時、約48至60小時、約54至66小時或約60至72小時。於一特定之實施態樣中，該用於刺激之時間為約48小時或至少約48小時。於其他實施態樣中，該用於刺激之時間為約44至52小時。於某些實施態樣中，該用於刺激之時間為約40至44小時、約40至48小時、約40至52小時或約40至56小時。

用於刺激如本文所描述之淋巴細胞群的其他條件可包括CO₂水準。於一些實施態樣中，該用於刺激之CO₂水準為約1.0至10% CO_2。於一些實施態樣中，該用於刺激之CO₂水準為約1.0%、約2.0%、約3.0%、約4.0%、約5.0%、約6.0%、約7.0%、約8.0%、約9.0%、或約10.0% CO_2。於一實施態樣中，該用於刺激之CO₂水準為約3至7% CO_2。於其他實施態樣中，該用於刺激之CO₂水準為約4至6% CO_2。再於其他實施態樣中，該用於刺激之CO₂水準為約4.5至5.5% CO_2。於一特定之實施態樣中，該用於刺激之CO₂水準為約5% CO_2。

用於刺激該淋巴細胞群之條件可包含溫度，用於刺激之時間量及/或存在一定水準之CO₂的任意組合。例如，刺激淋巴細胞群之步驟可包含在存有4.5至5.5% CO₂之CO₂水準下，在約36至38℃之溫度下以一或多種T細胞刺激劑刺激該淋巴細胞群共約44至52小時之時間量。

可用於本發明之方法的淋巴細胞之濃度為約1.0至10.0×10⁶細胞/mL。於某些實施態樣中，該淋巴細胞之濃度為約1.0至2.0×10⁶細胞/mL、約1.0至3.0×10⁶細胞/mL、約1.0至4.0×10⁶細胞/mL、約1.0至5.0×10⁶細胞/mL、約1.0至6.0×10⁶細胞/mL、約1.0至7.0×10⁶細胞/mL、約1.0至8.0×10⁶細胞/mL、1.0至9.0×10⁶細胞/mL、或約1.0至10.0×10⁶細胞/mL。於某些實施態樣中，該淋巴細胞之濃度為約1.0至2.0×10⁶細胞/mL。於某些實施態樣中，該淋巴細胞之濃度為約1.0至1.2×10⁶細胞/mL、約1.0至1.4×10⁶細胞/mL、約1.0至1.6×10⁶細胞/mL、約1.0至1.8×10⁶細胞/mL、或約1.0至2.0×10⁶細胞/mL。於某些實施態樣中，該淋巴細胞之濃度為至少約1.0×10⁶細胞/mL、至少約1.1×10⁶細胞/mL、至少約1.2×10⁶細胞/mL、至少約1.3×10⁶細胞/mL、至少約1.4×10⁶細胞/mL、至少約1.5×10⁶細胞/mL、至少約1.6×10⁶細胞/mL、至少約1.7×10⁶細胞/mL、至少約1.8×10⁶細胞/mL、至少約1.9×10⁶細胞/mL、至少約2.0×10⁶細胞/mL、至少約4.0×10⁶細胞/mL、至少約6.0×10⁶細胞/mL、至少約8.0×10⁶細胞/mL、或至少約10.0×10⁶細胞/mL。

根據刺激該淋巴細胞群之步驟可使用抗CD3抗體(或其功能片段)、抗CD28抗體(或其功能片段)或抗CD3和抗CD28抗體之組合。可使用任何可溶性或經固定之抗CD2、抗CD3及/或抗CD28抗體或彼等之功能片段(例如選殖株OKT3(抗CD3)、選殖株145-2C11(抗CD3)、選殖株UCHT1(抗CD3)、選殖株L293(抗CD28)、選殖株 15E8(抗CD28))。於一些態樣中，該抗體可從本技藝已知之供應商購得，包括，但不限於Miltenyi Biotec、BD Biosciences(例如MACS GMP CD3純1mg/mL，部件編號170-076-116)及eBioscience公司。此外，本技藝之技術熟習人士將理解如何藉由標準方法製造抗CD3及/或抗CD28抗體。於一些實施態樣中，該根據刺激該淋巴細胞群之步驟所使用之一或多種T細胞刺激劑包括在T細胞因子之存在下靶向T細胞刺激或共刺激分子之抗體或功能性片段。於一態樣中，該一或多種T細胞刺激劑包括抗CD3抗體及IL-2。於某些實施態樣中，該T細胞刺激劑包括濃度為約20ng/mL至100ng/mL之抗CD3抗體。於某些實施態樣中，該抗CD3抗體之濃度為約20ng/mL、約30ng/mL、約40ng/mL、約50ng/mL、約60ng/mL、約70ng/mL、約80ng/mL、約90ng/mL、或約100ng/mL。於一特定之實施態樣中，該抗CD3抗體之濃度為約50ng/mL。於一替代之實施態樣中，不需要T細胞活化。於該等實施態樣中，該刺激淋巴細胞群以產生活化之T細胞群的步驟從方法中被省略，而該可富集T淋巴細胞之淋巴細胞群係根據下列步驟轉導。

本文所描述之方法可包含使用單一週期轉導，以包含編碼細胞表面受體之核酸分子的病毒載體轉導該經活化之T細胞群，以產生經轉導之T細胞群。數種重組病毒已被用來作為病毒載體以將遺傳物質遞送至細胞。可根據該轉導步驟使用之病毒載體可為任何親嗜性或雙嗜性病毒載體，包括，但不限於重組逆轉錄病毒載體、重組慢病毒載體、重組腺病毒載體及重組腺相關病毒(AAV)載體。於一些實施態樣中，該方法進一步包含以逆轉錄病毒轉導該一或多個T細胞。於一實施態樣中，該用於轉導經活化之T細胞群的病毒載體為MSGV1γ逆轉錄病毒載體。於某些實施態樣中，該用於轉導經活化之T細胞群的病毒載體為Kochenderfer,J.Immunother.32(7)：689-702(2009)中所描述之PG13-CD19-H3載體。根據此實施態樣之一個態樣，該病毒載體係生長在懸浮培養中，該懸浮培養係在特定用於製造病毒載體之培養基中(本文稱為“病毒載體接種物”)。任何適合用於生長病毒載體之生長培養基及/或補充品均可用於根據本文所描述之方法的病毒載體接種物。根據一些態樣，該病毒載體接種物再在轉導步驟期間被添加在如下文中描述之無血清培養基。

於一些實施態樣中，可以逆轉錄病毒轉導該一或多個T細胞。於一實施態樣中，該逆轉錄病毒包含編碼細胞表面受體之異源基因。於一特定之實施態樣中，該細胞表面受體能夠結合靶細胞表面上(例如在腫瘤細胞之表面上)之抗原。

用於轉導如本文所描述之經活化的T細胞群之條件可包含特定時間、在特定溫度下及/或在特定水準之CO₂的存在下。於某些實施態樣中，該用於轉導之溫度為約34℃、約35℃、約36℃、約37℃、或約38℃。於一實施態樣中，該用於轉導之溫度為約34至38℃。於另一實施態樣中，該用於轉導之溫度為約35至37℃。於另一實施態樣中，該用於轉導之溫度為約36至38℃。再於另一實施態樣中，該用於轉導之溫度為約36至37℃。於一特定之實施態樣中，該用於轉導之溫度為約37℃。

於某些實施態樣中，該用於轉導之時間為約12至36小時。於一些實施態樣中，該用於轉導之時間為約12至16小時、約12至20小時、約12至24小時、約12至28小時或約12至32小時。於其他實施態樣中，該用於轉導之時間為約20小時或至少約20小時。於一實施態樣中，該用於轉導之時間為大約16至24小時。於其他實施態樣中，該用於轉導之時間為至少約14小時、至少約16小時、至少約18小時、至少約20小時、至少約22小時、至少約24小時、或至少約26小時。

於某些實施態樣中，該用於轉導之CO₂的水準為約1.0至10% CO_2。於其他實施態樣中，該用於轉導之CO₂的水準為約1.0%、約2.0%、約3.0%、約4.0%、約5.0%、約6.0%、約7.0%、約8.0%、約9.0%、或約10.0% CO₂。於一實施態樣中，該用於轉導之CO₂的水準為約3至7% CO₂。於另一實施態樣中，該用於轉導之CO₂的水準為約4至6% CO₂。於另一實施態樣中，該用於轉導之CO₂的水準為約4.5至5.5% CO₂。於一特定之實施態樣中，該用於轉導之CO₂的水準為約5% CO₂。

於一些實施態樣中，如本文所描述之經活化的T細胞群之轉導可以任何組合在特定溫度及/或存有特定之CO₂水準下執行特定之時間：在約36至38℃之溫度下，存有約4.5至5.5%之CO₂水準下，執行約16至24小時之時間量。

本文所描述之方法可包含擴增該經轉導之一或多個T細胞群一段特定之時間，以產生經處理之T細胞群。擴增之預定時間可為任何允許產生下列群組之合適時間：(i)在經處理之T細胞群中具有足夠之細胞數以用於投予患者至少一個劑量，(ii)與典型之較長過程相比較，具有有利比例之幼年型細胞的經處理之T細胞群，或(iii)(i)和(ii)二者。此時間將取決於由T細胞表現之細胞表面受體、所使用之載體、具有治療效果所需之劑量及其他變量。因此，於一些實施態樣中，該用於擴增之預定時間可為1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、或21天以上。於一些態樣中，該用於擴增之時間較本技藝中已知之擴增方法短。例如，該用於擴增之預定時間可縮短至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、或可縮短至少75%以上。於一些態樣中，該用於擴增之時間為約3天，且該從富集淋巴細胞群到產生經處理之T細胞的時間為約6天。

用於擴增該經轉導之T細胞群的條件可包括溫度及/或存有一定之CO₂水準_。於某些實施態樣中，該溫度為約34℃、約35℃、約36℃、約37℃、或約38℃。於一實施態樣中，該溫度約34至38℃。於另一實施態樣中，該溫度為約35至37℃。於另一實施態樣中，該溫度為約36至38℃。再於另一實施態樣中，該溫度為約36至37℃。於一特定之實施態樣中，該溫度為約37℃。於某些實施態樣中，該CO₂之水準為1.0至10% CO₂。於其他實施態樣中，該CO₂之水準為約1.0%、約2.0%、約3.0%、約4.0%、約5.0%、約6.0%、約7.0%、約8.0%、約9.0%、或約10.0% CO₂。於一實施態樣中，該CO₂之水準為約4.5至5.5% CO₂。於另一實施態樣中，該CO₂之水準為約5% CO₂。於其他實施態樣中，該CO₂之水準為約3.5%、約4.0%、約4.5%、約5.0%、約5.5%，或約6.5% CO₂。於一些實施態樣中，該用於擴增該經轉導之T細胞群的條件可包括任何組合之溫度及/或存有一定水準之CO₂。例如，用於擴增該經轉導之T細胞群的條件包含約36至38℃之溫度及存有約4.5至5.5% CO₂之CO₂水準。

本文所描述之方法的各個步驟可在封閉之系統中進行。於某些實施態樣中，該封閉系統為利用任何合適之細胞培養袋(例如Miltenyi Biotec MACS® GMP Cell Differentiation Bags、Origen Biomedical PermaLife Cell Culture bags)之封閉的袋培養系統。於一些實施態樣中，該用於封閉之袋培養系統中之細胞培養袋係在轉導步驟期間塗覆重組型人纖連蛋白(fibronectin)片段。該重組型人纖連蛋白片段可包括三個功能結構域：中央細胞結合結構域、肝素結合結構域II及CS1-序列。該重組型人纖連蛋白片段可藉由協助靶細胞和病毒載體之共定位來增加逆轉錄病毒轉導之免疫細胞的基因效率。於某些實施態樣中，該重組型人纖連蛋白片段為RETRONECTIN®(Takara Bio公司，日本)。於某些實施態樣中，該細胞培養袋係塗覆濃度為1至60μg/mL或約1至40μg/mL之重組型人纖連蛋白片段。於其他實施態樣中，該細胞培養袋係塗覆濃度為約1至20μg/mL、20至40μg/mL或40至60μg/mL之重組型人纖連蛋白片段。於一些實施態樣中，該細胞培養袋係塗覆濃度為約1μg/mL、約2μg/mL、約3μg/mL、約4μg/mL、約5μg/mL、約6μg/mL、約7μg/mL、約8μg/mL、約9μg/mL、約10μg/mL、約11μg/mL、約12μg/mL、約13μg/mL、約14μg/mL、約15μg/mL、約16μg/mL、約17μg/mL、約18μg/mL、約19μg/mL、或約20μg/mL之重組型人纖連蛋白片段。於其他實施態樣中，該細胞培養袋係塗覆約2至5μg/mL、約2至10μg/mL、約2至20μg/mL、約2至25μg/mL、約2至30μg/mL、約2至35μg/mL、約2-40μg/mL、約2至50μg/mL、或約2至60μg/mL之重組型人纖連蛋白片段。於某些實施態樣中，該細胞培養袋係塗覆至少約2μg/mL、至少約5μg/mL、至少約10μg/mL、至少約15μg/mL、至少約20μg/mL、至少約25μg/mL、至少約30μg/mL、至少約40μg/mL、至少約50μg/mL、或至少約60μg/mL之重組型人纖連蛋白片段。於一特定之實施態樣中，該細胞培養袋係塗覆至少約10μg/mL之重組型人纖連蛋白片段。該用於封閉之袋培養系統中之細胞培養袋可選擇性地在轉導步驟期間以人白蛋白血清(HSA)阻斷。於一替代之實施態樣中，該細胞培養袋在轉導步驟期間不以HSA阻斷。

於其他態樣中，(a)至(d)中至少一者係使用不含添加之血清的無血清培養基進行：(a)令淋巴細胞群與AKT抑制劑及外源性IL-7和外源性IL-15中至少一者接觸，(b)刺激該淋巴細胞群，(c)轉導經活化之T細胞群及(d)擴增該經轉導之T細胞群。於一些態樣中，(a)至(d)各步驟係使用不含添加之血清的無血清培養基進行。於另一態樣中，(a)至(d)中至少一者係使用無血清培養基進行：(a)令淋巴細胞群與AKT抑制劑及外源性IL-7和外源性IL-15中至少一者接觸，(b)刺激該淋巴細胞群，(c)轉導該經活化之T細胞群及(d)擴增該經轉導之T細胞群。於一些態樣中，(a)至(d)各步驟係使用不含添加之血清的無血清培養基進行。如本文所提及之術語“無血清基質”或“無血清培養基”意指所使用之生長培養基未補充血清(例如人血清或牛血清)。換句話說，於一些實施態樣中，該培養基中未添加為個別分開且不同成分之血清來支持該培養細胞之生存力、活化和生長。任何合適之T細胞生長培養基可根據本文所描述之方法用於培養懸浮液中之細胞。例如，T細胞生長培養基可包括，但不限於包含合適量之緩衝液、鎂、鈣、丙酮酸鈉及碳酸氫鈉之無菌、低葡萄糖溶液。於一實施態樣中，該T細胞生長培養基為OPTMIZER^TM(Life Technologies公司)。相對於用於產生經處理之T細胞的典型方法，本文所描述之方法可使用未補充血清(例如人或牛血清)之培養基。

AKT抑制劑

AKT激酶家族具有三種高度同源之同種型：AKT1(PKBα)，AKT2(PKBβ)及AKT3(PKBγ)，其各具有獨特及重疊之功能。作為PI3K-AKT-mTOR信號傳導途徑之一部分，AKT作用在PI3K之下游以活化mTOR，在該細胞中引起多種反應，包括存活、生長、增殖、遷移及代謝反應。

本技藝中已知之任何AKT抑制劑均可用於本發明，包括AKT1、AKT2、AKT3之任何抑制劑或彼等之任何組合。該AKT抑制劑可選自下列群組：A6730、B2311、124018、GSK2110183(阿氟思替(afuresertib))、沛利福新(Perifosine)(KRX-0401)、GDC-0068(伊帕思替(ipatasertib))、RX-0201、VQD-002、LY294002、A-443654、A-674563、阿克緹(Akti)-1、阿克緹-2、阿克緹-1/2、AR-42、API-59CJ-OMe、ATI-13148、AZD-5363、飄兒菜基磷酸膽鹼(erucylphosphocholine)、GSK-2141795(GSK795)、KP372-1、L-418、NL-71-101、PBI-05204、PIA5、PX-316、SR13668、曲西立濱(triciribine)、GSK 690693(CAS # 937174-76-0)、FPA 124(CAS # 902779- 59-3)、米替福新(Miltefosine)、PHT-427(CAS # 1 191951-57-1)、10-DEBC鹽酸鹽、Akt抑制劑III、Akt抑制劑VIII、MK-2206二鹽酸鹽(CAS # 1032350-13-2)、SC79、AT7867(CAS # 857531-00-1)、CCT128930(CAS # 885499-61-6)、A-674563(CAS # 552325-73-2)、AGL 2263、AS-041 164(5-苯並[1,3]二噁茂-5-基伸甲基-噻唑啶-2,4-二酮)、BML-257(CAS # 32387-96-5)、XL-418、CAS # 612847-09-3、CAS # 98510-80-6、H-89(CAS # 127243-85-0)、OXY-111A、3-[1-[[4-(7-苯基-3H-咪唑並[4,5-g]喹噁啉-6-基)苯基]甲基]六氫吡啶-4-基]-1H-苯並咪唑-2-酮及彼等之任何組合。該AKT抑制劑亦可選自1-{1-[4-(7-苯基-1H-咪唑並[4,5-g]喹噁啉-6-基)苄基]六氫吡啶-4-基}-1,3-二氫-2H-苯並咪唑-2-酮；N,N-二甲基-1-[4-(6-苯基-1H-咪唑並[4,5-g]喹噁啉-7-基)苯基]甲基-胺；1-{1-[4-(3-苯基苯並[g]喹噁啉-2-基)苄基]六氫吡啶-4-基}-1,3-二氫-2H-苯並咪唑-2-酮；1-{1-[4-(7-苯基-1H-咪唑並[4,5-g]喹噁啉-6-基)苄基]六氫吡啶-4-基}-1,3-二氫-2H-苯並咪唑-2-酮；N,N-二甲基-1-[4-(6-苯基-1H-咪唑並[4,5-g]喹噁啉-7-基)苯基]甲基-胺；1-{1-[4-(3-苯基苯並[g]喹噁啉-2-基)苄基]六氫吡啶-4-基}-1,3-二氫-2H-苯並咪唑-2-酮(亦稱為3-[1-[[4-(7-苯基-3H-咪唑並[4,5-g]喹噁啉-6-基)苯基]甲基]六氫吡啶-4-基]-1H-苯並咪唑-2-酮)；具有包含式I、式II、式III、式IV、式V、式VI、式VII和式VIII之結構(揭示於2007年9月25日出版之美國專利案第7273869號中，該篇專利案全文以引用方式併入本文)的化合物；其立體異構物；揭示於2007年9月25日出版之美國專利案第7273869號(其全文以引用方式併入本文)中之任何AKTi；及彼等之任何組合。於一實例中，該AKTi包含式I。

於一特定之實施態樣中，該AKT抑制劑為3-[1-[[4-(7-苯基-3H-咪唑並[4,5-g]喹噁啉-6-基)苯基]甲基]六氫吡啶-4-基]-1H-苯並咪唑-2-酮。於另一實施態樣中，該AKT抑制劑為Akt抑制劑VIII。

於一些實施態樣中，該AKT包含由式I所說明之結構式：

其中：a為0或1；b為0或1；m為0、1或2；n為0、1或2；p為0、1、2或3；r為0或1；s為0或1；t為2、3、4、5或6；u、v和x係獨立選自：CH和N；w係選自鍵、CH和N；y和z係獨立選自：CH和N，惟y和z中至少一者為N；R¹係獨立選自：1)(C=O)_aO_bC₁-C₁₀烷基，2)(C=O)_aO_b芳基，3)C_2-C₁₀烯基，4)C₂-C₁₀炔基，5)(C=O)_aO_b雜環基，6)(C=O)_aO_bC₃-C₈環烷基，7)CO₂H，8)鹵素，9)CN，10)OH，11)O_bC₁-C₆全氟烷基，12)O_a(C=O)_bNR⁷R₈，13)NR^c(C=O)NR⁷R⁸，14) S(O)_mR^a，15)S(O)₂NR⁷R^8，16)NR^cS(O)_mR^a，17)合氧基，18)CHO，19)NO₂，20)NR^c(C=O)O_bR^a，21)O(C=O)O_bC₁-C₁₀烷基，22)O(C=O)O_bC₃-C₈環烷基，23)O(C=O)O_b芳基和24)O(C=O)O_b-雜環；該烷基、芳基、烯基、炔基、雜環基和環烷基可選擇地被一或多個選自R^z之取代基所取代；R²係獨立選自：1)(C=O)_aO_bC₁-C₁₀烷基，2)(C=O)_aO_b芳基，3)C₂-C₁₀烯基，4)C₂-C₁₀炔基，5)(C=O)_aO_b雜環基，6)(C=O)_aO_bC₃-C₈環烷基，7)CO₂H，8)鹵素，9)CN，10)OH，11)O_bC₁-C₆全氟烷基，12)O_a(C=O)_bNR⁷R⁸，13)NR^c(C=O)NR⁷R⁸，14)S(O)_mR^a，15)S(O)₂NR⁷R⁸，16)NR^cS(O)_mR^a，17)CHO，18)NO₂，19)NR^c(C=O)O_bR^a，20)O(C=O)O_bC₁-C₁₀烷基，21)O(C=O)O_bC₃-C₈，22)O(C=O)O_b芳基，和23)O(C=O)O_b-雜環；該烷基、芳基、烯基、炔基、雜環基和環烷基可選擇地被一、二或三個選自R^z之取代基所取代；R³和R⁴係獨立選自：H、C₁-C₆-烷基和C₁-C₆-全氟烷基，或者R³和R⁴結合以形成-(CH₂)_t-，其中該碳原子之一可選擇地被選自下列群組之部分所替代：O、S(O)_m、-N(R^b)C(O)-及-N(COR^a)-；R⁵和R⁶係獨立選自：1)H，2)(C=O)O_bR^a，3)C_1-C₁₀烷基，4)芳基，5)C_2-C₁₀烯基，6)C₂-C₁₀炔基，7)雜環基，8)C₃-C₈環烷基，9)SO₂R^a，和10)(C=O)NR^b ₂，該烷基、環烷基、芳基、雜環基、烯基和炔基可選擇地被一或多個選自R^z之取代基所取代，或者R⁵和R⁶可與彼等所連接之氮一起形成單環或雙環形雜環，各環中具有5至7員且可選擇地含有，除了氮之外，一或二個選自N、O和S之另外的雜原子，該單環或雙環形雜環可選擇地被Q取代且亦可選擇地被一或多個選自R^z之取代基所取代；Q係選自：-NR⁷R⁸、芳基和雜環基，該芳基和雜環基可選擇地被一至三個選自R^z之取代基所取代；R⁷和R⁸係獨立選自：1)H，2)(C=O)O_bC₁-C₁₀烷基，3)(C=O)O_bC₃-C₈環烷基，4)(C=O)O_b芳基，5)(C=O)O_b雜環基，6)C₁-C₁₀烷基，7)芳基，8)C₂-C₁₀烯基，9)C₂-C₁₀炔基，10)雜環基，11)C₃-C₈環烷基，12)SO₂R^a，和13)(C=O)NR^b ₂；該烷基、環烷基、芳基、雜環基、烯基和炔基可選擇地被一或多個選自R^z之取代基所取代，或者R⁷和R⁸可與彼等所連接之氮一起形成單環或雙環形雜環，各環中具有5至7員且可選擇地含有，除了氮之外，一或二個選自N、O和S之另外的雜原子，該單環或雙環形雜環可選擇地被一或多個選自R^z之取代基所取代；R^z係選自：1)(C=O)_rO_s(C₁-C₁₀)烷基，2)O_r(C₁-C₃)全氟烷基，3)(C₀-C₆)亞烷基-S(O)_mR^a，4)合氧基，5)OH，6)鹵素，7)CN，8)(C=O)_rO_s(C₂-C₁₀)烯基，9)(C=O)_rO_s(C₂-C₁₀)炔基，10)(C=O)_rO_s(C₃-C₆)環烷基，11)(C=O)_rO_s(C₀-C₆)亞烷基-芳基，12)(C=O)_rO_s(C₀-C₆)亞烷基-雜環基，13)(C=O)_rO_s(C₀-C₆)亞烷基-N(R^b)₂，14)C(O)R^a，15)(C₀-C₆)亞烷基-CO₂R^a，16)C(O)H，17)(C_0-C₆)亞烷基-CO₂H，18)C(O)N(R^b)₂，19)S(O)_mR^a，20)S(O)₂N(R^b)₂，21)NR^c(C=O)O_bR^a，22)O(C=O)O_bC₁-C₁₀烷基，23)O(C=O)O_bC₃-C₈環烷基，24)O(C=O)O_b芳基和25)O(C=O)O_b-雜環；該烷基、烯基、炔基、環烷基、芳基和雜環基可選擇地被至多三個選自下列群組之取代基所取代：R^b、OH、(C₁-C₆)烷氧基、鹵素、CO₂H、CN、O(C=O)C₁-C₆烷基、合氧基及N(R^b)₂；R^a為經取代或未經取代之(C_1-C₆)烷基、經取代或未經取代之(C_2-C₆)烯基、經取代或未經取代之(C_2-C₆)炔基、經取代或未經取代之(C_3-C₆)環烷基、經取代或未經取代之芳基、(C_1-C₆)全氟烷基、2,2,2-三氟乙基、或經取代或未經取代之雜環基；且R^b為H、(C_1-C₆)烷基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之苄基、經取代或未經取代之雜環基、(C_3-C₆)環烷基、(C=O)OC₁-C₆烷基、(C=O)C₁-C₆烷基或S(O)₂R^a；R^c係選自：1)H，2)C_1-C₁₀烷基，3)芳基，4)C_2-C₁₀烯基，5)C_2-C₁₀炔基，6)雜環基，7)C₃-C₈環烷基，8)C₁-C₆全氟烷基，該烷基、環烷基、芳基、雜環基、烯基和炔基可選擇地被一或多個選自R^z之取代基所取代；或其醫藥上可接受之鹽或立體異構體。

於某些實施態樣中，可直接(例如藉由結合AKT之分子)或間接(例如藉由干擾該PI3K-AKT-mTOR信號傳導途徑之另一成員)抑制該AKT信號傳導。因此，該AKT抑制劑可為抑制該PI3K-AKT-mTOR信號傳導途徑之一或多個成員之活性的分子。例如，可令一或多個T細胞與AKT抑制劑、PI3K抑制劑、mTOR抑制劑或彼等之組合接觸。

該用於本文所描述之方法的AKT抑制劑之量可為能夠降低或抑制該在一或多個T細胞中之AKT活性的量(即有效量)。於另一實施態樣中，該用於本發明之AKT抑制劑之量可為能夠在活體外與外源性IL-7及/或外源性IL-15組合以延緩或抑制T細胞或DC細胞成熟或分化的量。因此，於一實施態樣中，該一或多個T細胞可與濃度為至少約1nM、至少約10nM、至少約50nM、至少約100nM、至少約200nM、至少約300nM、至少約400nM、至少約500nM、至少約1μM、至少約2μM、至少約3μM、至少約4μM、至少約5μM、至少約6μM、至少約7μM、至少約8μM、至少約9μM、至少約10μM、至少約11μM、至少約12μM、至少約13μM、至少約14μM、至少約15μM、至少約16μM、至少約17μM、至少約18μM、至少約19μM、至少約20μM、至少約25μM、至少約30μM、至少約35μM、至少約40μM、至少約45μM、至少約50μM、至少約60μM、至少約70μM、至少約80μM、至少約90μM、至少約100μM、至少約200μM、至少約300μM、至少約400μM、至少約500μM或至少約1mM之AKT抑制劑(例如3-[1-[[4-(7-苯基-3H-咪唑並[4,5-g]喹噁啉-6-基)苯基]甲基]六氫吡啶-4-基]-1H-苯並咪唑-2-酮)接觸。於另一實施態樣中，該一或多個T細胞可與濃度為約1nM至約1mM、約10nM至約1mM、約100nM至約1mM、約1μM至約1mM、約10μM至約1mM、約100μM至約1mM、約1nM至約100μM、約1nM至約10μM、約 1nM至約1μM、約1nM至約100nM、約1nM至約50nM、約100nM至約100μM、約500nM至約50μM、約1μM至約50μM、約1μM至約10μM、或約5μM至約10μM之AKT抑制劑(例如3-[1-[[4-(7-苯基-3H-咪唑並[4,5-g]喹噁啉-6-基)苯基]甲基]六氫吡啶-4-基]-1H-苯並咪唑-2-酮)接觸。

根據本方法可達成任何AKT活性之降低。例如，藉由AKT抑制劑可降低或抑制AKT活性達至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、在至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約99%、或約100%。

外源性IL-7和外源性IL-15

介白素-7(IL-7)為促進淋巴細胞穩態之細胞因子且為T細胞發展所必要的。內源性IL-7係由胸腺和骨髓中之上皮細胞產生且其受體，IL-7受體α(IL-7R-α)係由T細胞之子集(包括初始T細胞及T_CM細胞)表現。IL-7信號傳導出現各種酪胺酸激酶，包括轉錄(Jak/STAT)途徑之Janus激酶/信號轉導子和活化子、PI3K及Src族酪胺酸激酶。

本文所描述之方法可使用任何外源性IL-7。於一些實施態樣中，該外源性IL-7為人IL-7。於一些實施態樣中，該外源性IL-7為野生型IL-7。於其他實施態樣中，該外源性IL-7為重組型IL-7。該IL-7可藉由本技藝中已知之任何方法製造及取得，包括，但不限於從一或多個IL-7製造細胞分離出IL-7或從市售之IL-7取得。

本文所描述之方法可使用任何濃度之IL-7。例如，本方法可包括令該一或多個T細胞與至少約0.001ng/ml之IL-7、至少約0.005ng/ml之IL-7、至少約0.01ng/ml之IL-7、至少約0.05ng/ml之IL-7，至少約0.1ng/ml之IL-7、至少約0.5ng/ml之IL-7、至少約1.0ng/ml之IL-7、至少約1ng/ml之IL-7、至少約2ng/ml之IL-7、至少約3ng/ml之IL-7、至少約4ng/ml之IL-7、至少約5ng/ml之IL-7、至少約6ng/ml之IL-7、至少約7ng/ml之IL-7、至少約8ng/ml之IL-7、至少約9ng/ml之IL-7、至少約10ng/ml之IL-7、至少約11ng/ml之IL-7、至少約12ng/ml之IL-7、至少約13ng/ml之IL-7、至少約14ng/ml之IL-7、至少約15ng/ml之IL-7、至少約20ng/ml之IL-7、至少約25ng/ml之IL-7、至少約30ng/ml之IL-7、至少約35ng/ml之IL-7、至少約40ng/ml之IL-7、至少約45ng/ml之IL-7、至少約50ng/ml之IL-7、至少約100ng/ml之IL-7、至少約200ng/ml之IL-7、至少約300ng/ml之IL-7、至少約400ng/ml之IL-7、至少約500ng/ml之IL-7、或至少約1000ng/ml之IL-7接觸。於一實施態樣中，該一或多個T細胞係與約0.001至約500ng/ml之IL-7、約0.01至約100ng/ml之IL-7、約0.1至約50ng/ml之IL-7、約1至約10ng/ml之IL-7、約1至約5ng/ml之IL-7、約5至約10ng/ml之IL-7、約3至約7ng/ml之IL-7、或約4至約6ng/ml之IL-7接觸。於一特定之實施態樣中，該一或多個T細胞係與約5ng/ml之IL-7接觸。

介白素-15(IL-15)為促進T細胞增殖之細胞因子。其係由單核細胞/巨噬細胞譜系、血液來源之樹突細胞、骨髓基質細胞及胸腺之上皮細胞的成員表現。IL-15透過其受體(IL-15受體)傳導信號以，例如活化Jak/STAT途徑、刺激Ras/Raf/MAPK途徑並活化NF-κB。

本文所描述之方法可使用任何外源性IL-15。於一些實施態樣中，該外源性IL-15為人IL-15。於一些實施態樣中，該外源性IL-15為野生型IL-15。於其他實施態樣中，該外源性IL-15為重組型IL-15。該IL-15可藉由本技藝中已知之任何方法製造及取得，包括，但不限於從一或多個IL-15製造細胞分離出IL-15或從市售之IL-15取得。

本文所描述之方法可使用任何濃度之IL-15。例如，本方法可包括令該一或多個T細胞與至少約0.001ng/ml之IL-15、至少約0.005ng/ml之IL-15、至少約0.01ng/ml之IL-15、至少約0.05ng/ml之IL-15，至少約0.1ng/ml之IL-15、至少約0.5ng/ml之IL-15、至少約1.0ng/ml之IL-15、至少約1ng/ml之IL-15、至少約2 ng/ml之IL-15、至少約3ng/ml之IL-15、至少約4ng/ml之IL-15、至少約5ng/ml之IL-15、至少約6ng/ml之IL-15、至少約7ng/ml之IL-15、至少約8ng/ml之IL-15、至少約9ng/ml之IL-15、至少約10ng/ml之IL-15、至少約11ng/ml之IL-15、至少約12ng/ml之IL-15、至少約13ng/ml之IL-15、至少約14ng/ml之IL-15、至少約15ng/ml之IL-15、至少約20ng/ml之IL-15、至少約25ng/ml之IL-15、至少約30ng/ml之IL-15、至少約35ng/ml之IL-15、至少約40ng/ml之IL-15、至少約45ng/ml之IL-15、至少約50ng/ml之IL-15、至少約100ng/ml之IL-15、至少約200ng/ml之IL-15、至少約300ng/ml之IL-15、至少約400ng/ml之IL-15、至少約500ng/ml之IL-15、或至少約1000ng/ml之IL-15接觸。於一實施態樣中，該一或多個T細胞係與約0.001至約500ng/ml之IL-15、約0.01至約100ng/ml之IL-15、約0.1至約50ng/ml之IL-15、約1至約10ng/ml之IL-15、約1至約5ng/ml之IL-15、約5至約10ng/ml之IL-15、約3至約7ng/ml之IL-15、或約4至約6ng/ml之IL-15接觸。於一特定之實施態樣中，該一或多個T細胞係與約5ng/ml之IL-15接觸。

於一些實施態樣中，該一或多個T細胞係與外源性IL-7接觸，但不與外源性IL-15接觸。於其他實施態樣中，該一或多個T細胞係與外源性IL-15接觸，但不與外源性IL-7接觸。再於其他實施態樣中，該一或多個T 細胞係同時與外源性IL-7和外源性IL-15接觸。當該一或多個T細胞同時接觸外源性IL-7和外源性IL-15二者時，該一或多個T細胞可與相等或不同濃度之外源性IL-7和外源性IL-15接觸。於某些實施態樣中，該一或多個T細胞係與相等濃度之外源性IL-7和外源性IL-15接觸。於其他實施態樣中，該一或多個T細胞係與不同濃度之外源性IL-7和外源性IL-15接觸。於一實施態樣中，該一或多個T細胞所接觸之外源性IL-7的濃度高於外源性IL-15。於另一實施態樣中，該一或多個T細胞所接觸之外源性IL-7的濃度低於外源性IL-15。於一特定之實施態樣中，該一或多個T細胞與約5ng/ml之外源性IL-7和約5ng/ml之外源性IL-15接觸。

此外，該一或多個T細胞可在相同時間(例如同時)或不同時間(例如依序)與外源性IL-7和外源性IL-15接觸。於一些實施態樣中，該一或多個T細胞可先與外源性IL-7接觸，再與外源性IL-15接觸。於其他實施態樣中，該一或多個T細胞可先與外源性IL-15接觸，再與外源性IL-7接觸。於一些實施態樣中，該一或多個T細胞可在相同時間與外源性IL-7和外源性IL-15接觸。

T細胞

本文所描述之一或多個T細胞可從任何來源取得，包括，例如人供體。該供體可為需要抗癌治療之個體，例如以藉由本文所描述之方法產生之T細胞治療者 (即，自體供體)，或可為捐贈淋巴細胞樣本之個體，當藉由本文所描述之方法產生之細胞群產生時，該細胞群將被用於治療不同的個體或癌症患者(即，同種異體供體)。該淋巴細胞群可藉由本技藝中所使用之任何合適方法取得。例如，該淋巴細胞群可藉由任何合適之體外方法、靜脈穿刺或其他可取得血液及/或淋巴細胞樣本之血液收集方法取得。於一實施態樣中，該淋巴細胞群係藉由分離術(apheresis)取得。該一或多個T細胞可從任何包含一或多個T細胞之組織(包括，但不限於腫瘤)收集。於一些實施態樣中，腫瘤或其一部分係從個體收集並從該腫瘤組織中分離出一或多個T細胞。任何T細胞均可用於本發明所揭示之方法中，包括任何適合用於T細胞治療之T細胞。例如，該可用於本發明之一或多個細胞可選自由下列所組成之群組：腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、細胞毒性T細胞、CAR T細胞、經處理之TCR T細胞、天然殺手T細胞、樹突細胞及外周血淋巴細胞。於一特定之實施態樣中，該T細胞為腫瘤浸潤白血球。於某些實施態樣中，該一或多個T細胞表現CD8，例如為CD8⁺ T細胞。於其他實施態樣中，該一或多個T細胞表現CD4，例如為CD4⁺ T細胞。

本文所描述之方法可用於延緩或抑制T細胞在活體外成熟或分化，該方法係經由將來自供體之一或多個T細胞與AKT抑制劑及外源性IL-7和外源性IL-15中至少一者接觸來進行。本發明者已發現以AKT抑制劑和 IL-7及/或IL-15處理一或多個T細胞可在活體外增加初始及未成熟T細胞之濃度。尤其是，在處理後，該一或多個T細胞可表現一或多個指示未分化或未成熟之T細胞的基因。該一或多個指示未分化或未成熟之T細胞的基因可選自下列群組：CD8、CD45RA、CCR7、CD45RO、CD62L、CD28、CD95、IL-7Rα、CXCR4、TCF7、FOXO1、ID3、BCL6和彼等之任何組合。例如，令一或多個T細胞與AKT抑制劑和IL-7及/或IL-15接觸可導致表現一或多個指示未分化或未成熟之T細胞的基因之細胞的百分比增加，該一或多個指示未分化或未成熟之T細胞的基因係選自CD8、CD45RA、CCR7和彼等之任何組合。

於其他實施態樣中，該一或多個T細胞在與AKT抑制劑和外源性IL-7及/或外源性IL-15接觸後可表現CCR7和CD45RO。於一特定之實施態樣中，相較於與AKT抑制劑及外源性IL-7和外源性IL-15中至少一者接觸之前，該一或多個T細胞在接觸之後有較大之百分比表現CCR7和CD45RO。於另一實施態樣中，該一或多個T細胞在與AKT抑制劑和外源性IL-7及/或外源性IL-15接觸後可表現CCR7和CD45RA。於一特定之實施態樣中，相較於與AKT抑制劑及外源性IL-7和外源性IL-15中至少一者接觸之前，該一或多個T細胞在接觸之後有較大之百分比表現CCR7和CD45RA。於另一實施態樣中，相較於未與AKT抑制劑和外源性IL-7及/或外源性IL-15接觸之T細胞所表現的CCR7、CD45RO和CD45RA，該T細胞在與AKT抑制劑和外源性IL-7及/或外源性IL-15接觸之後顯示增加表現CCR7、CD45RO、CD45RA或彼等之任何組合。

於其他實施態樣中，該一或多個T細胞在與AKT抑制劑和外源性IL-7及/或外源性IL-15接觸之後表現CD62L、CD28或該二者。於一特定之實施態樣中，相較於與AKT抑制劑及外源性IL-7和外源性IL-15中至少一者接觸之前，該一或多個T細胞在與彼等接觸之後有較大之百分比表現CD62L、CD28或該二者。於另一實施態樣中，相較於未與AKT抑制劑和外源性IL-7及/或外源性IL-15接觸之T細胞所表現的CD62L和CD28，該一或多個T細胞在與AKT抑制劑和外源性IL-7及/或外源性IL-15接觸之後顯示增加表現CD62L、CD28或該二者。

於一特定之實施態樣中，相較於未與該AKT抑制劑和外源性IL-7及/或外源性IL-15接觸之T細胞所表現的CD95、IL-7受體α(IL-7Rα)、CXCR4、TCF7、FOXO1、ID3、BCL6、CD62L和CD45RA，該T細胞在與AKT抑制劑和外源性IL-7及/或外源性IL-15接觸之後顯示表現CD95、IL-7受體α(IL-7Rα)、CXCR4、TCF7、FOXO1、ID3、BCL6、CD62L、CD45RA和彼等之任何組合增加。

T細胞治療

本發明提供活體外調控(例如延緩或抑制)T細胞成熟或分化以供T細胞治療之方法，其包含令一或多個來自需要T細胞治療之個體的T細胞與(i)AKT抑制劑及外源性介白素-7(IL-7)和外源性介白素-15(IL-15)中至少一者接觸，其中所產生之T細胞顯現延緩之成熟或分化。於一些實施態樣中，該方法進一步包括投予有此需要之個體一或多個T細胞。本技藝之技術熟習人士將理解該藉由本文所描述之方法產生之一或多個T細胞可用於任何包含投予患者一或多個T細胞之治療患者的方法中。

例如，但不限於此，本文所描述之方法可增進T細胞治療之效力，該T細胞治療可為選自由下列所組成之群組的過繼性T細胞治療：腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)免疫治療、自體細胞治療、經處理之自體細胞治療(eACT^TM)、同種異體T細胞移植、非T細胞移植及彼等之任何組合。過繼性T細胞治療廣泛包括在活體外選擇、富集並投予患者識別且能夠結合腫瘤細胞之自體或同種異體T細胞之任何方法。TIL免疫治療為一種類型之過繼性T細胞治療，其中係在活體外分離並富集能夠浸潤腫瘤組織之淋巴細胞並投予患者。該TIL細胞可為自體或異體。自體細胞治療為一種過繼性T細胞治療，其涉及從患者分離出能夠靶向腫瘤細胞之T細胞，在活體外富集該T細胞，再將該T細胞投回至同一患者。同種異體T細胞移植可包括移植在體外擴增之天然產生的T細胞或經基因工程處理的T細胞。經處理之自體細胞治療(如上文中較詳細之描述)為一種過繼性T細胞治療，其中係分離出患者自身之淋巴細胞，經基因工程修飾之以表現腫瘤靶向分子，在體外擴增並投回至該患者。非T細胞移植可包括以非T細胞(諸如，但不限於天然殺手(NK)細胞)進行之自體或異體治療。

於一特定之實施態樣中，本發明之T細胞治療為經處理之自體細胞治療(eACT^TM)。根據本實施態樣，該方法可包括從供體收集血細胞。然後，可將該分離出之血細胞(例如T細胞)與AKT抑制劑及一或多種外源性IL-7和外源性IL-15接觸。然後，可將該T細胞進行處理以表現嵌合型抗原受體(“經處理之CAR T細胞”)或T細胞受體(“經處理之TCR T細胞”)。於一特定之實施態樣中，係將該與AKT抑制劑及一或多種外源性IL-7和外源性IL-15接觸之經處理之CAR T細胞或經處理之TCR T細胞投予個體。於一些實施態樣中，該經處理之T細胞係治療個體之腫瘤。

於一些實施態樣中，該一或多個T細胞係以包含編碼細胞表面受體之異源基因的逆轉錄病毒轉導。於一特定之實施態樣中，該細胞表面受體能夠結合靶細胞表面上之抗原(例如腫瘤細胞之表面上)。於一些實施態樣中，該細胞表面受體為嵌合型抗原受體或T細胞受體。

於一實施態樣中，該一或多個T細胞可經處理以表現嵌合型抗原受體。該嵌合型抗原受體可包含結合腫瘤抗原之結合分子。該結合分子可為抗體或其抗原結合分子。例如，該抗原結合分子可選自scFv、Fab、Fab'、Fv、F(ab')2和dAb，及彼等之任何片段或組合。

該嵌合型抗原受體可進一步包含鉸鏈區。該鉸鏈區可源自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE、IgM、CD28或CD8α之鉸鏈區。於一特定之實施態樣中，該鉸鏈區係源自IgG4之鉸鏈區。

該嵌合型抗原受體亦可包含跨膜結構域。該跨膜結構域可為任何作為免疫細胞上之共受體的跨膜分子之跨膜結構域，或為免疫球蛋白超家族之一員的跨膜結構域。於某些實施態樣中，該跨膜結構域係源自CD28、CD28T、CD8α、CD4或CD19之跨膜結構域。於一特定之實施態樣中，該跨膜結構域包含源自CD28跨膜結構域之結構域。於另一實施態樣中，該跨膜結構域包含源自CD28T跨膜結構域之結構域。

該嵌合型抗原受體可進一步包含一或多個共刺激信號傳導區。例如，該共刺激信號傳導區可為CD28、CD28T、OX-40、41BB、CD27、誘導型T細胞共刺激劑(ICOS)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247、Igα(CD79a)或Fcγ受體之信號傳導區。於一特定之實施態樣中，該共刺激信號傳導區為CD28信號傳導區。於另一實施態樣中，該共刺激信號傳導區為CD28T信號傳導區。

於一實施態樣中，該嵌合型抗原受體進一步包含CD3ζ信號傳導結構域。

該嵌合型抗原受體可經處理以靶向特定之腫瘤抗原。於一些實施態樣中，該腫瘤抗原係選自707-AP(707丙胺酸脯胺酸)、AFP(α(a)-胎蛋白)、ART-4(由T4細胞識別之腺癌抗原)、BAGE(B抗原；b-鏈蛋白(b-catenin)/m、b-鏈蛋白/突變的)、BCMA(B細胞成熟抗原)、Bcr-abl(斷點簇區-Abelson)、CAIX(碳酸酐酶IX)、CD19(分化簇19)、CD20(分化簇20)、CD22(分化簇22)、CD30(分化簇30)、CD33(分化簇33)、CD44v7/8(分化簇44，外顯子7/8)、CAMEL(黑色素瘤上由CTL識別之抗原)、CAP-1(癌胚抗原肽-1)、CASP-8(半胱天冬酶-8)、CDC27m(突變之細胞分裂週期27)、CDK4/m(經突變之週期蛋白依賴型激酶4)、CEA(癌胚抗原)、CT(癌症/睾丸(抗原))、Cyp-B(親環素B)、DAM(分化抗原黑色素瘤)、EGFR(表皮生長因子受體)、EGFRvIII(表皮生長因子受體變體III)、EGP-2(表皮糖蛋白2)、EGP-40(表皮糖蛋白40)、Erbb2、3、4(紅血球母細胞性白血病病毒致癌基因同源物-2、-3、4)、ELF2M(突變之延伸因子2)、ETV6-AML1(Ets變體基因6/急性骨髓性白血病1基因ETS)、FBP(葉酸結合蛋白)、fAchR(胎兒乙醯膽鹼受體)、G250(糖蛋白250)、GAGE(G抗原)、GD2(二唾液酸神經節苷脂(disialoganglioside)2)、GD3(二唾液酸神經節苷脂3)、GnT-V(N-乙醯葡糖胺轉移酶V)、Gp100(糖蛋白100kD)、HAGE(螺旋酶(helicose)抗原)、HER-2/neu(人表皮受體-2/神經學；亦稱為EGFR2)、HLA-A(人白血球抗原A)、HPV(人乳頭狀瘤病毒)、HSP70-2M(突變之熱休克蛋白70-2)、HST-2(人印戒腫瘤(signet ring tumor)-2)、hTERT或hTRT(人端粒酶逆轉錄酶)、iCE(腸羧基酯酶)、IL-13R-a2(介白素-13受體亞單位α-2)、KIAA0205、KDR(激酶插入結構域受體)、κ輕鏈、LAGE(L抗原)、LDLR/FUT(低密度脂質受體/GDP-L-岩藻糖：b-D-半乳糖苷酶2-a-L岩藻糖基轉移酶)、LeY(路易斯-Y抗體)、L1CAM(L1細胞黏附分子)、MAGE(黑色素瘤抗原)、MAGE-A1(黑色素瘤相關抗原1)、MAGE-A3、MAGE-A6、間皮素(mesothelin)、鼠CMV感染之細胞、MART-1/Melan-A(由T細胞識別之黑色素瘤抗原-1/黑色素瘤抗原A)、MC1R(黑皮質素(melanocortin)1受體)、肌球蛋白/m(突變之肌球蛋白)、MUC1(黏蛋白1)、MUM1、MUM2、MUM3(突變之黑色素瘤泛蛋白1、2、3)、NA88-A(患者M88之NA cDNA選殖株)、NKG2D(天然殺手細胞2族，成員D)配體、NY-BR-1(紐約乳房分化抗原1)、NY-ESO-1(紐約食道鱗狀細胞癌-1)、癌胚抗原(h5T4)、P15(蛋白15)、p190次要bcr-ab1(190KD bcr-ab1蛋白質)、Pml/RARa(前髓細胞性白血病/視黃酸受體a)、PRAME(優先表現之黑色素瘤抗原)、PSA(前列腺特異性抗原)、PSCA(前列腺幹細胞抗原)、PSMA(前列腺特異性膜抗原)、RAGE(腎抗原)、RU1或RU2(腎泛蛋白1或2)、SAGE(肉瘤抗原)、SART-1或SART-3(鱗狀抗原排斥腫瘤1或3)、SSX1、SSX2、SSX3、SSX4(滑膜肉瘤X1、X2、X3、X4)、TAA(腫瘤相關抗原)、TAG-72(腫瘤相關糖蛋白72)、TEL/AML1(轉位Ets家族性白血病/急性髓系白血病1)、TPI/m(突變之磷酸丙糖(triosephosphate)異構酶)、TRP-1(酪胺酸酶相關性蛋白1或gp75)、TRP-2(酪胺酸酶相關性蛋白2)、TRP-2/INT2(TRP-2/內含子2)、VEGF-R2(血管內皮生長因子受體2)、WT1(腎母細胞瘤(Wilm's tumor)基因)及彼等之任何組合。於一特定之實施態樣中，該腫瘤抗原為CD19。

於另一實施態樣中，該T細胞治療包含投予患者經處理之表現T細胞受體的T細胞(“經處理之TCR T細胞”)。該T細胞受體(TCR)可包含結合腫瘤抗原之結合分子。於一些實施態樣中，該腫瘤抗原係選自由下列所組成之群組：707-AP、AFP、ART-4、BAGE、BCMA、Bcr-abl、CAIX、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44v7/8、CAMEL、CAP-1、CASP-8、CDC27m、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGP-2、EGP-40、Erbb2、3、4、ELF2M、ETV6-AML1、FBP、fAchR、G250、GAGE、GD2、GD3、GnT-V、Gp100、HAGE、HER-2/neu、HLA-A、HPV、HSP70-2M、HST-2、hTERT或hTRT、iCE、IL-13R-a2、KIAA0205、KDR、κ-輕鏈、LAGE、LDLR/FUT、LeY、L1CAM、MAGE、MAGE-A1、間皮素、鼠CMV感染之細胞、MART-1/Melan-A、MC1R、肌球蛋白/m、MUC1、MUM1、MUM2、MUM3、NA88-A、NKG2D配體、NY-BR-1、NY-ESO-1、癌胚抗原、P15、p190次要bcr-abl、 Pml/RARa、PRAME、PSA、PSCA、PSMA、RAGE、RU1或RU2、SAGE、SART-1或SART-3、SSX1、SSX2、SSX3、SSX4、TAA、TAG-72、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、VEGF-R2、WT1及彼等之任何組合。

於一實施態樣中，該TCR包含結合病毒致癌基因之結合分子與。於一特定之實施態樣中，該病毒致癌基因係選自人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、艾伯斯坦-巴爾(Epstein-Barr)病毒(EBV)及人類嗜T淋巴細胞病毒(HTLV)。

於另一實施態樣中，該TCR包含結合睾丸、胎盤或胎兒腫瘤抗原之結合分子。於一特定之實施態樣中，該睾丸、胎盤或胎兒腫瘤抗原係選自由下列所組成之群組：NY-ESO-1、滑液肉瘤X斷點2(SSX2)、黑色素瘤抗原(MAGE)及彼等之任何組合。

於另一實施態樣中，該TCR包含結合譜系特異性抗原之結合分子。於一特定之實施態樣中，該譜系特異性抗原係選自由下列所組成之群組：由T細胞識別之黑色素瘤抗原-1(MART-1)、gp100、前列腺特異性抗原(PSA)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、前列腺幹細胞抗原(PSCA)及彼等之任何組合。

於一實施態樣中，該T細胞治療包含投予該患者經處理之CAR T細胞，該CAR T細胞表現結合CD19之嵌合型抗原受體且進一步包含CD28共刺激結構域和CD3-ζ信號傳導區。於一特定之實施態樣中，該T細胞治療包含投予患者KTE-C19。

於一實施態樣中，該抗原性部分亦包括，但不限於艾伯斯坦-巴爾(Epstein-Barr)病毒(EBV)抗原(例如EBNA-1、EBNA-2、EBNA-3、LMP-1、LMP-2)、A型肝炎病毒抗原(例如VP1、VP2、VP3)、B型肝炎病毒抗原(例如HBsAg、HBcAg、HBeAg)、C型肝炎病毒抗原(例如包膜糖蛋白E1和E2)、單純皰疹病毒第1型、第2型或第8型(HSV1、HSV2或HSV8)病毒抗原(例如糖蛋白gB、gC、gC、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL.gM、UL20、UL32、US43、UL45、UL49A)、巨細胞病毒(CMV)病毒抗原(例如糖蛋白gB、gC、gC、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL.gM或其他包膜蛋白)、人類免疫缺陷病毒(HIV)病毒抗原(糖蛋白gp120、gp41或p24)、流感病毒抗原(例如血凝素(HA)或神經胺酸酶(NA))、麻疹或腮腺炎病毒抗原、人類乳頭狀瘤病毒(HPV)病毒抗原(例如L1、L2)、副流感病毒病毒抗原、德國麻疹病毒(rubella virus)病毒抗原、呼吸道融合病毒(respiratory syncytial virus)(RSV)病毒抗原或水痘帶狀皰疹病毒(varicella zoster virus)病毒抗原。於該等實施態樣中，該細胞表面受體可為能識別在經病毒感染之靶細胞上的任何上述病毒抗原之任何TCR或任何CAR。

於其他實施態樣中，該抗原部分與具有免疫或發炎功能障礙之細胞有關。該等抗原性部分可包括，但不限於髓鞘鹼性蛋白(MBP)、髓鞘蛋白脂質蛋白(PLP)、髓鞘少突膠質糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein)(MOG)、癌胚抗原(CEA)、胰島素原、麩胺醯胺脫羧酶(GAD65、GAD67)、熱休克蛋白(HSP)或任何其他涉及或與病原自體免疫過程相關之組織特異性抗原。

本文所揭示之方法可涉及T細胞治療，其包含轉移一或多個T細胞予患者。該T細胞可以治療有效量投予。例如T細胞(例如經處理之CAR+T細胞或經處理之TCR+T細胞)之治療有效量可為至少約10⁴個細胞、至少約10⁵個細胞、至少約10⁶個細胞、至少約10⁷個細胞、至少約10⁸個細胞、至少約10⁹個細胞或至少約10¹⁰個細胞。於另一實施態樣中，該T細胞(例如經處理之CAR+T細胞或經處理之TCR+T細胞)之治療有效量為約10⁴個細胞、約10⁵個細胞、約10⁶個細胞、約10⁷個細胞或約10⁸個細胞。於一特定之實施態樣中，該T細胞(例如經處理之CAR+T細胞或經處理之TCR+T細胞)之治療有效量為約2×10⁶個細胞/kg、約3×10⁶個細胞/kg、約4×10⁶細胞/kg、約5×10⁶個細胞/kg、約6×10⁶個細胞/kg、約7×10⁶個細胞/kg、約8×10⁶個細胞/kg、約9×10⁶個細胞/kg、約1×10⁷個細胞/kg、約2×10⁷個細胞/kg、約3×10⁷個細胞/kg、約4×10⁷個細胞/kg、約5×10⁷個細胞/kg、約6×10⁷細胞/kg、約7×10⁷個細胞/kg、約8×10⁷個細胞/kg或約9×10⁷個細胞/kg。

於一些實施態樣中，該患者係在施予‧T細胞治療之前經預調理。該患者可根據本技藝已知之任何方法進行預調理，包括，但不限於以一或多種化療藥物及/或放射治療進行治療。於一些實施態樣中，該在T細胞治療之前的預調理可包括任何減少內源性淋巴細胞之數量、移除細胞因子積貯、提高一或多種穩態細胞因子或促炎因子之血清水準、增進調理後投予之T細胞的效應子功能、增進抗原呈遞細胞活化及/或可用性的治療或彼等之任何組合。於一實施態樣中，該預調理包含增加個體中一或多種細胞因子之血清水準。

癌症治療

本發明之方法可用於治療個體之癌症、減少腫瘤大小、殺死腫瘤細胞、防止腫瘤細胞增殖、防止腫瘤生長、從患者排除腫瘤、防止復發腫瘤、防止腫瘤轉移、誘導患者緩解或彼等之任何組合。於某些實施態樣中，該方法誘導完全反應。於其他實施態樣中，該方法誘導局部反應。

於一實施態樣中，本發明針對治療需要T細胞治療之個體的腫瘤之方法，其包含投予該個體一或多個T細胞，其中該一或多個T細胞已與(i)AKT抑制劑和(ii)外源性IL-7及/或外源性IL-15接觸。於另一實施態樣中，本發明針對減少或降低需要T細胞治療之個體的腫瘤大小或抑制腫瘤生長的方法，其包含投予該個體一或多個T細胞，其中該一或多個T細胞已與(i)AKT抑制劑和(ii) 外源性IL-7及/或外源性IL-15接觸。於某些實施態樣中，該一或多個T細胞未接觸外源性IL-2。

該可被治療之癌症包括未血管化、基本上尚未血管化、或血管化之腫瘤。該癌症亦可包括實體或非實體腫瘤。於某些實施態樣中，該癌症可選自源自下列群組之腫瘤：急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、急性髓細胞性白血病(AML)、腺樣囊性癌、腎上腺皮質癌、癌瘤、AIDS相關之癌症、肛門癌、闌尾癌、星形細胞瘤、非典型畸胎/橫紋肌樣瘤、中樞神經系統、B細胞白血病、淋巴瘤或其他B細胞惡性腫瘤、基底細胞癌、膽管癌、膀胱癌、骨癌、骨肉瘤及惡性纖維組織細胞瘤、腦幹膠質瘤、腦腫瘤、乳癌、支氣管腫瘤、伯基特淋巴瘤、類癌腫瘤、中樞神經系統癌、子宮頸癌、脊索瘤、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、慢性髓細胞性白血病(CML)、慢性骨髓增生性疾病、詰腸癌、結腸直腸癌、顱咽管瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、胚胎性腫瘤、中樞神經系統、子宮內膜癌、成腦室管膜細胞瘤(ependymoblastoma)、室管膜瘤、食道癌、嗅神經母細胞瘤、尤因肉瘤族腫瘤、顱外生殖細胞瘤、性腺外生殖細胞腫瘤、肝外膽管癌、眼癌、骨纖維組織細胞瘤、惡性和骨肉瘤、膽囊癌、胃部(胃)癌、胃腸道類癌腫瘤、胃腸道間質瘤(GIST)、軟組織肉瘤、生殖細胞瘤、妊娠滋養細胞腫瘤、神經膠質瘤、髮細胞白血病、頭頸癌、心臟癌、肝細胞癌(肝)癌、組織細胞增多症、何杰金氏淋巴瘤、下嚥癌、眼內黑色素瘤、胰島細胞瘤(內分泌胰腺)、卡波西肉瘤、腎癌、朗格漢斯(langerhans)細胞組織細胞增生症、喉癌、白血病、唇和口腔癌、肝癌(原發性)、原位小葉癌(LCIS)、肺癌、淋巴瘤、巨球蛋白血症、男性乳癌、骨骼惡性纖維組織細胞瘤和骨肉瘤、髓母細胞瘤、髓上皮瘤、黑色素瘤、梅克爾細胞癌(merkel cell carcinoma)、間皮瘤、不明原發灶鱗狀細胞癌之頸部轉移、涉及NUT基因之中線道癌、口癌、多發性內分泌腫瘤症候群、多發性骨髓瘤/漿細胞贅生物、蕈樣肉芽腫、骨髓增生異常症候群、骨髓增生異常/骨髓增殖性惡性腫瘤、慢性骨髓性白血病(CML)、急性髓細胞性白血病(AML)、骨髓瘤、多發骨髓增生病症、鼻腔和鼻竇癌、鼻咽癌、神經母細胞瘤、非何杰金氏淋巴瘤、非小細胞肺癌、口癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤和骨骼之惡性纖維組織細胞瘤、卵巢癌、胰臟癌、乳頭狀瘤病、副神經節瘤、鼻旁竇和鼻腔癌、副甲狀腺癌、陰莖癌、咽癌、嗜鉻細胞瘤(pheochromocytoma)、中分化松果體實質瘤(pineal parenchymal tumors of intermediate differentiation)、成松果體細胞瘤(pineoblastoma)和幕上原始神經外胚層腫瘤(supratentorial primitive neuroectodermal tumor)、腦下垂體瘤、漿細胞腫瘤/多發性骨髓瘤、胸膜肺母細胞瘤、妊娠和乳癌、原發性中樞神經系統(CNS)淋巴瘤、前列腺癌、直腸癌、腎細胞(腎)癌、腎盂和輸尿管、移行細胞癌、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、塞扎裡症候群(sézary syndrome)、小細胞肺癌、小腸癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、鱗狀頸癌、胃(胃部)癌、幕上原始神經外胚層腫瘤、T細胞淋巴瘤、皮膚癌、睾丸癌、咽喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲狀腺癌、腎盂和輸尿管之移行細胞癌、滋養細胞腫瘤、輸尿管和腎盂癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉瘤、陰道癌、外陰癌、華氏巨球蛋白血症(Waldenström macroglobulinemia)、腎母細胞瘤(Wilms Tumor)。

於一實施態樣中，該方法可用於治療腫瘤，其中該腫瘤為淋巴瘤或白血病。淋巴瘤和白血病為特異影響淋巴細胞之血液癌症。血液中之所有白血球係源自在骨髓中發現之單一類型多能造血幹細胞。此幹細胞同時產生骨髓性祖細胞和淋巴性祖細胞，該骨髓性祖細胞和淋巴性祖細胞再產生在體內發現之各種類型的白血球。從骨髓性祖細胞產生之白血球包括T淋巴細胞(T細胞)、B淋巴細胞(B細胞)、天然殺手細胞和漿細胞。從淋巴性祖細胞產生之白血球包括巨核細胞、肥大細胞、嗜鹼性粒細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、單核細胞和巨噬細胞。淋巴瘤和白血病可能影響患者中一或多種之這些細胞類型。

一般而言，淋巴瘤可被分成至少二個子群：何杰金氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤。非何杰金氏淋巴瘤(NHL)為源起於B淋巴細胞、T淋巴細胞或天然殺手細胞之異質性癌症群。在美國，B細胞淋巴瘤佔報告病例之80-85%。估計2013年中約有69,740個新NHL病例且有19,000人死於相關疾病。非何杰金氏淋巴瘤為最普遍之惡性血液疾病且為男性和女性之新癌症的第七大，佔所有新癌症病例之4%且為與癌症相關之死亡的3%。

瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)為NHL之最常見的亞型，約佔NHL病例之30%。美國每年約有22,000名新診斷之DLBCL病例。其被歸類為侵襲性淋巴瘤，大多數患者可以常規化療(NCCN指南NHL 2014)治癒。

DLBCL之第一線治療通常包括具有利妥昔單抗(rituximab)之含有蒽環類的方案，諸如R-CHOP(利妥昔單抗、環磷醯胺、阿黴素、長春新鹼和強的松)，其具有約80%之客觀反應率和約50%之完全反應率(Coiffier 2002)，約三分之一患者對初次治療而言為難治性疾病或在R-CHOP後復發(Sehn 2005)。對於那些在第一線治療之反應後復發的患者而言，約40-60%之患者可藉由額外之化療獲得第二反應。符合自體幹細胞移植(ASCT)條件之患者的第二線治療之標準護理包括利妥昔單抗及聯合化療，諸如R-ICE(利妥昔單抗、異環磷醯胺(ifosfamide)、卡鉑(carboplatin)和依托泊苷(etoposide))及R-DHAP(利妥昔單抗、地塞米松(dexamethasone)、阿糖胞苷(cytarabine)和順鉑(cisplatin))，其各具有約63%之客觀反應率和約26%之完全反應率(Gisselbrecht 2010)。對第二線治療有反應及被認為足夠適合移植之患者接受以高劑量化療和ASCT強化，此在約一半之移植患者中有療效(Gisselbrecht 2010)。ASCT失敗之患者的預後非常差且無具療效之選擇。

與DLBCL相比較，原發性縱隔大B細胞淋巴瘤(Primary mediastinal large B cell lymphoma)(PMBCL)具有明顯的臨床、病理學和分子特性。PMBCL被認為從胸腺(骨髓)B細胞而來且佔被診斷為DLBCL之患者的約3%。PMBCL通常在三、四十歲的年輕成年人中被診斷出，女性稍微佔多數。基因表現分析表明PMBCL中之異常途徑與何杰金氏淋巴瘤重疊。PMBCL之初始治療通常包括具有利妥昔單抗之含有蒽環的治療方案，諸如輸注劑量調整之依托泊苷、阿黴素和環磷醯胺與長春新鹼、強的松和利妥昔單抗(DA-EPOCH-R)，且有或沒有涉及區域放射治療。

濾泡性淋巴瘤(FL)(一種B細胞淋巴瘤)為最常見之惰性(緩慢生長)NHL形式，佔所有NHL之約20%至30%。有些具有FL之患者會組織學上轉變(TFL)成DLBCL，此DLBCL更具侵略性且與預後較差有關。15年間組織學轉變成DLBCL之年發生率約為3%，隨後幾年轉變之風險持續下降。組織學轉變之生物學機制尚不清楚。TFL之初始治療受到先前對濾泡性淋巴瘤之治療影響，但通常包括具有利妥昔單抗之含有蒽環類的治療方案，以排除該疾病之侵略性組分。

用於復發/難治性PMBCL和TFL之治療選項類似於DLBCL。鑑於這些疾病的發病率較低，在這些患者群中尚未進行大規模前瞻性隨機研究。具有化療難治性疾病之患者具有與難治性DLBCL類似或更差之預後。

總之，具有難治性、侵略性NHL(例如DLBCL、PMBCL和TFL)之患者具有重大未被滿足之醫療需求，進一步研究新治療在這些人群中是必要。

因此，於一些實施態樣中，該方法可用於治療淋巴瘤或白血病，其中該淋巴瘤或白血病是B細胞惡性腫瘤。B細胞惡性腫瘤之實例包括，但不限於非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL/CLL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、FL、邊緣區淋巴瘤(MZL)、淋巴結外(MALT淋巴瘤)、淋巴結(單核細胞樣B細胞淋巴瘤)、脾、瀰漫性大細胞淋巴瘤、B細胞慢性淋巴細胞白血病/淋巴瘤、伯基特淋巴瘤及淋巴母細胞淋巴瘤。於一些實施態樣中，該淋巴瘤或白血病係選自B細胞慢性淋巴細胞白血病/小細胞淋巴瘤、B細胞幼淋巴細胞白血病、淋巴漿細胞淋巴瘤(例如瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(Waldenström macroglobulinemia))、脾邊緣區淋巴瘤、髮細胞白血病、漿細胞腫瘤(例如漿細胞骨髓瘤(即，多發性骨髓瘤)或漿細胞瘤)、淋巴結外邊緣區B細胞淋巴瘤(例如MALT淋巴瘤)、淋巴結邊緣區B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤(FL)、轉化之濾泡性淋巴瘤(TFL)、原發性皮膚濾泡中心淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、艾伯斯坦-巴爾病毒陽性DLBCL、淋巴瘤樣肉芽腫病、原發性縱隔(胸腺)大B細胞淋巴瘤(PMBCL)、血管內大B細胞淋巴瘤、ALK+大B細胞淋巴瘤、漿母細胞性淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤、從HHV8相關之多中心型卡斯特雷曼氏(Castleman's)病產生之大B細胞淋巴瘤、伯基特(Burkitt)淋巴瘤/白血病、T細胞幼淋巴細胞白血病、T細胞大顆粒淋巴細胞白血病、侵略性NK細胞白血病、成人T細胞白血病/淋巴瘤、淋巴結外NK/T細胞淋巴瘤、腸病相關之T細胞淋巴瘤、肝脾T細胞淋巴瘤、胚母NK細胞淋巴瘤、蕈樣黴菌病/塞扎裡症候群(Mycosis fungoides/Sezary syndrome)、原發性皮膚間變性大細胞淋巴瘤、淋巴瘤樣丘疹病、外周T細胞淋巴瘤、血管免疫母細胞T細胞淋巴瘤、退化性大細胞淋巴瘤、B淋巴母細胞性白血病/淋巴瘤、具復發遺傳異常之B淋巴母細胞性白血病/淋巴瘤、T淋巴母細胞白血病/淋巴瘤及何杰金氏淋巴瘤。於一些實施態樣中，該癌症對一或多種先前之治療不反應及/或該癌症在一或多種先前之治療後復發。

於某些實施態樣中，該癌症係選自濾泡性淋巴瘤、轉化之濾泡性淋巴瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤和原發性縱隔(胸腺)大B細胞淋巴瘤。於一特定之實施態樣中，該癌症為瀰漫性大B細胞淋巴瘤。

於一些實施態樣中，該癌症對一或多種之化療、放療、免疫治療(包括T細胞治療及/或以抗體或抗體-藥物軛合物治療)、自體幹細胞移植或彼等之任何組合無反應或該癌症已在治療後復發。於一特定之實施態樣中，該癌症為難治性瀰漫性大B細胞淋巴瘤。

於一些實施態樣中，該癌症係藉由投予個體一或多個T細胞治療，其中該一或多個T細胞與(i)AKT抑制劑及(ii)外源性IL-7及/或外源性IL-15接觸。於某些實施態樣中，在投予該個體一或多個T細胞前先清洗該一或多個T細胞以除去該AKT抑制劑、外源性IL-7及/或外源性IL-15。於一些實施態樣中，該一或多個T細胞包含經處理之CAR細胞或經處理之TCR細胞。於一實施態樣中，該經處理之CAR細胞或經處理之T細胞治療個體之腫瘤。

套組

本發明之範圍亦包括套組，例如藥學套組，其包含用於在活體外接觸T細胞之AKT抑制劑及一或多種外源性IL-7和外源性IL-15。套組通常包括指示該套組內容物之意圖用途和使用說明的標籤。術語“標籤”包括任何提供在該套組上或與該套組一起提供，或以其他方式伴隨套組之書寫或記錄材料。

於一些實施態樣中，本發明提供用於製備一或多個用於T細胞治療之T細胞的套組，以用於需要T細胞治療之個體，該套組包括：

(i)AKT抑制劑，

(ii)外源性IL-7，及

(iii)指示將一或多個意圖用於T細胞治療之T細胞與AKT抑制劑和外源性IL-7接觸之用法說明。

於其他實施態樣中，本發明提供用於製備一或多個用於T細胞治療之T細胞的套組，以用於需要T細胞治療之個體，該套組包括：

(i)AKT抑制劑，

(ii)外源性IL-15，及

(iii)指示將一或多個意圖用於T細胞治療之T細胞與AKT抑制劑和外源性IL-15接觸之用法說明。

於其他實施態樣中，本發明提供了一種套組，本發明提供用於製備一或多個用於T細胞治療之T細胞的套組，以用於需要T細胞治療之個體，該套組包括：

(i)AKT抑制劑，

(ii)外源性IL-7，

(iii)外源性IL-15，及

(iii)指示將一或多個意圖用於T細胞治療之T細胞與AKT抑制劑、外源性IL-7及/或外源性IL-15接觸之用法說明。

本發明藉由下列實施例進一步說明，該實施例不應被解釋為進一步限制。本申請案全文中所引用之所有參考資料的內容以引用方式被明確地併入本文。

下列實施例旨在說明本發明之各種實施態樣。因此，所討論之具體實施態樣不應被解釋為用來限制本發明之範圍。例如，雖然下列實施例針對以抗CD19嵌合型抗原受體(CAR)轉導之T細胞，本技藝之技術熟習人士將理解本文所描述之方法可適用於以任何CAR轉導之T細胞。本技藝之技術熟習人士將清楚明白可在不脫離本發明之範圍的情況下製造各種等效項、改變和修飾，可理解的是，該八等效實施態樣應被包括在本文中。另外，本揭示內容中列舉之所有參考資料的全部內容以引用方式併入本文，如同其全部列於本文中。

實施態樣

E1.一種用於活體外延緩或抑制T細胞成熟或分化以供T細胞治療之方法，其包含令一或多個來自需要T細胞治療之個體的T細胞與AKT抑制劑及外源性介白素-7(IL-7)和外源性介白素-15(IL-15)中至少一者接觸，其中所產生之T細胞顯現延緩之成熟或分化及/或其中所產生之T細胞顯現相對於無AKT抑制劑存在時所培養之T細胞的T細胞功能而言具有提升之T細胞功能。

E2.一種用於活體外提升T細胞功能以供T細胞治療之方法，其包含令一或多個來自需要T細胞治療之個體的T細胞與AKT抑制劑及外源性介白素-7(IL-7)和外源性介白素-15(IL-15)中至少一者接觸，其中所產生之T細胞顯現相對於無AKT抑制劑存在時所培養之T細胞的T細胞功能而言具有提升之T細胞功能。

E3.如E1或E2之方法，其中該改善之T細胞功能係選自由下列所組成之群組：

(i)T細胞增殖增加；

(ii)細胞因子製造增加；

(iii)溶細胞活性增加；及

(iv)(i)至(iii)之任何組合。

E4.一種用於在T細胞治療前在活體外增加T細胞增殖的方法，其包含令一或多個來自需要T細胞治療之個體的T細胞與AKT抑制劑及外源性介白素-7(IL-7)和外源性介白素-15(IL-15)中至少一者接觸，其中所產生之T細胞顯現相對於無AKT抑制劑存在時經培養之T細胞的T細胞增殖增加T細胞增殖。

E5.一種用於在T細胞治療前在活體外增加細胞因子製造之方法，其包含令一或多個來自需要T細胞治療之個體的T細胞與AKT抑制劑及外源性介白素-7(IL-7)和外源性介白素-15(IL-15)中至少一者接觸，其中所產生之T細胞顯現相對於無AKT抑制劑存在時所培養之T細胞的細胞因子製造而言具有細胞因子製造增加。

E6.如E3或E5之方法，其中該細胞因子製造增加係選自由下列所組成之群組：(i)干擾素γ(IFNg)製造增加，(ii)組織壞死因子α(TNFa)製造增加及(iii)IFNg和TNFa製造增加。

E7.一種用於活體外增加T細胞溶細胞活性以供T細胞治療之方法，其包含令一或多個來自需要T細胞治療之個體的T細胞與AKT抑制劑及外源性介白素-7(IL-7)和外源性介白素-15(IL-15)中至少一者接觸，其中所產生之T細胞顯現相對於無AKT抑制劑存在時經培養之T 細胞的溶細胞活性增加溶細胞活性。

E8.一種用於活體外延緩或抑制T細胞成熟或分化以供T細胞治療之方法，其包含令一或多個來自需要T細胞治療之個體的T細胞與AKT抑制劑及外源性介白素-7(IL-7)和外源性介白素-15(IL-15)中至少一者接觸，其中所產生之T細胞顯現延緩之成熟或分化。

E9.如E1至E 8中任一項之方法，其中該接觸包含在含有下列群組之培養基中培養該一或多個T細胞：(i)AKT抑制劑和(ii)外源性IL-7及/或外源性IL-15。

E10.如E1至E9中任一項之方法，其中該一或多個T細胞不與外源性介白素-2(IL-2)接觸。

E11.如E1至E10中任一項之方法，其中該T細胞係經清洗以除去AKT抑制劑、外源性IL-7及/或外源性IL-15。

E12.如E1至E11中任一項之方法，其中該AKT抑制劑係選自由下列所組成之群組：A6730、B2311、124018、GSK2110183(阿氟思替)、沛利福新(KRX-0401)、GDC-0068(伊帕思替)、RX-0201、VQD-002、LY294002、A-443654、A-674563、阿克緹-1、阿克緹-2、阿克緹-1/2、AR-42、API-59CJ-OMe、ATI-13148、AZD-5363、飄兒菜基磷酸膽鹼、GSK-2141795(GSK795)、KP372-1、L-418、NL-71-101、PBI-05204、PIA5、PX-316、SR13668、曲西立濱、GSK 690693(CAS # 937174-76-0)、FPA 124(CAS # 902779-59-3)、米替福新、PHT-427(CAS # 1 191951-57-1)、10-DEBC鹽酸鹽、Akt抑制劑III、Akt抑制劑VIII、MK-2206二鹽酸鹽(CAS # 1032350-13-2)、SC79、AT7867(CAS # 857531-00-1)、CCT128930(CAS # 885499-61-6)、A-674563(CAS # 552325-73-2)、AGL 2263、AS-041 164(5-苯並[1,3]二噁茂-5-基伸甲基-噻唑啶-2,4-二酮)、BML-257(CAS # 32387-96-5)、XL-418、CAS # 612847-09-3、CAS # 98510-80-6、H-89(CAS # 127243-85-0)、OXY-111A、3-[1-[[4-(7-苯基-3H-咪唑並[4,5-g]喹噁啉-6-基)苯基]甲基]六氫吡啶-4-基]-1H-苯並咪唑-2-酮及彼等之任何組合。

E13.如E1至E12中任一項之方法，其中該AKT抑制劑包括選自由下列所組成之群組的化合物：(i)3-[1-[[4-(7-苯基-3H-咪唑並[4,5-g]喹噁啉-6-基)苯基]甲基]六氫吡啶-4-基]-1H-苯並咪唑-2-酮；(ii)N,N-二甲基-1-[4-(6-苯基-1H-咪唑並[4,5-g]喹噁啉-7-基)苯基]甲胺；或(iii)1-{1-[4-(3-苯基苯並[g]喹噁啉-2-基)苄基]六氫吡啶-4-基}-1,3二氫-2H-苯並咪唑-2-酮。

E14.如E1至E13中任一項之方法，其中該AKT抑制劑為選自由下列所組成之群組的化合物：(i)3-[1-[[4-(7-苯基-3H-咪唑並[4,5-g]喹噁啉-6-基)苯基]甲基]六氫吡啶-4-基]-1H-苯並咪唑-2-酮；(ii)N,N-二甲基-1-[4-(6-苯基-1H-咪唑並[4,5-g]喹噁啉-7-基)苯基]甲胺；或(iii)1-{1-[4-(3-苯基苯並[g]喹噁啉-2-基)苄基]六氫吡啶-4-基}-1,3二氫-2H-苯並咪唑-2-酮。

E15.如E1至E14中任一項之方法，其中該AKT抑制劑為3-[1-[[4-(7-苯基-3H-咪唑並[4,5-g]喹噁啉-6-基)苯基]甲基]六氫吡啶-4-基]-1H-苯並咪唑-2-酮。

E16.如E15之方法，其中該AKT抑制劑之量為約1nM至約1mM。

E17.如E15之方法，其中該AKT抑制劑之量係選自由下列所組成之群組：至少約1nM、至少約10nM、至少約50nM、至少約100nM、至少約200nM、至少約300nM、至少約400nM、至少約500nM、至少約1μM、至少約2μM、至少約3μM、至少約4μM、至少約5μM、至少約6μM、至少約7μM、至少約8μM、至少約9μM、至少約10μM、至少約11μM、至少約12μM、至少約13μM、至少約14μM、至少約15μM、至少約16μM、至少約17μM、至少約18μM、至少約19μM、至少約20μM、至少約25μM、至少約30μM、至少約35μM、至少約40μM、至少約45μM、至少約50μM、至少約60μM、至少約70μM、至少約80μM、至少約90μM、至少約100μM、至少約200μM、至少約300μM、至少約400μM、至少約500μM或至少約1mM。

E18.如E15之方法，其中該AKT抑制劑之量為約8μM。

E19.如E1至E18中任一項之方法，其中該外源性IL-7之量為約0.001至約500ng/ml。

E20.如E1至E18中任一項之方法，其中該外源性IL-7之量為約1至約10ng/ml。

E21.如E1至E18中任一項之方法，其中該外源性IL-7之量為至少約5ng/ml。

E22.如E1至E21中任一項之方法，其中該外源性IL-15之量為約0.001至約500ng/ml。

E23.如E1至E21中任一項之方法，其中該外源性IL-15之量為約1至約10ng/ml。

E24.如E1至E21中任一項之方法，其中該外源性IL-15之量為至少約5ng/ml。

E25.如E1至E24中任一項之方法，其中該一或多個T細胞表現CD8。

E26.如E25之方法，其中該一或多個T細胞係選自由下列所組成之群組：腫瘤浸潤淋巴細胞、細胞毒性T細胞、CAR T細胞、經處理之TCR T細胞、天然殺手T細胞及外周血淋巴細胞。

E27.如E1至E26中任一項之方法，其中該一或多個T細胞係從需要抗癌治療之個體收集。

E28.如E27之方法，其中該一或多個T細胞係從需要抗癌治療之個體的腫瘤收集。

E29.如E20或E28之方法，其中該一或多個T細胞包含一或多個腫瘤浸潤白血球(TIL)。

E30.如E1至E29中任一項之方法，其中該T細胞被活化。

E31.如E30之方法，其中該T細胞係在封閉的系統中活化。

E32.如E31之方法，其中該封閉系統包含封閉之袋系統。

E33.如E1至E32中任一項之方法，其中該T細胞係經擴增。

E34.如E32之方法，其中該T細胞係在活體外擴增。

E35.如E32之方法，其中該T細胞係在體內擴增。

E36.如E1至E35中任一項之方法，其中該一或多個T細胞與AKT抑制劑和外源性IL-7及/或外源性IL-15接觸可延長該T細胞在體內之持久性。

E37.如E1至E36中任一項之方法，其中該一或多個T細胞與AKT抑制劑及外源性IL-7和外源性IL-15中至少一者接觸之後，所產生之T細胞表現一或多個指示未分化或未成熟之T細胞的基因。

E38.如E37之方法，其中該一或多個指示未分化或未成熟之T細胞的基因係選自由下列所組成之群組：CD8、CD45RA、CCR7及彼等之任何組合。

E39.如E1至E38中任一項之方法，其進一步包含以逆轉錄病毒轉導該T細胞。

E40.如E39之方法，其中該逆轉錄病毒包含編碼細胞表面受體之異源基因。

E41.如E40之方法，其中該細胞表面受體能夠結合靶細胞表面上之抗原。

E42.如E41之方法，其中該靶細胞為腫瘤細胞。

E43.如E41或E42之方法，其中該細胞表面受體為T細胞受體(TCR)或嵌合型抗原受體(CAR)。

E44.如E41至E43中任一項之方法，其中該細胞表面受體能夠結合選自由下列所組成之群組的抗原：707-AP(707丙胺酸脯胺酸)、AFP(α(a)-胎蛋白)、ART-4(由T4細胞識別之腺癌抗原)、BAGE(B抗原；b-鏈蛋白/m、b-鏈蛋白/經突變的)、BCMA(B細胞成熟抗原)、Bcr-abl(斷點簇區-Abelson)、CAIX(碳酸酐酶IX)、CD19(分化簇19)、CD20(分化簇20)、CD22(分化簇22)、CD30(分化簇30)、CD33(分化簇33)、CD44v7/8(分化簇44，外顯子7/8)、CAMEL(黑色素瘤上由CTL識別之抗原)、CAP-1(癌胚抗原肽-1)、CASP-8(半胱天冬酶-8)、CDC27m(突變之細胞分裂週期27)、CDK4/m(突變之週期蛋白依賴型激酶4)、CEA(癌胚抗原)、CT(癌症/睾丸(抗原))、Cyp-B(親環素B)、DAM(分化抗原黑色素瘤)、EGFR(表皮生長因子受體)、EGFRvIII(表皮生長因子受體，變體III)、EGP-2(表皮糖蛋白2)、EGP-40(表皮糖蛋白40)、Erbb2、3、4(紅血球母細胞性白血病病毒致癌基因同源物-2、-3、4)、ELF2M(突變之延伸因子2)、ETV6-AML1(Ets變異體基因6/急性骨髓性白血病1基因ETS)、FBP(葉酸結合蛋白)、fAchR(胎兒乙醯膽鹼受體)、G250(糖蛋白250)、GAGE(G 抗原)、GD2(二唾液酸神經節苷脂2)、GD3(二唾液酸神經節苷脂3)、GnT-V(N-乙醯葡糖胺轉移酶V)、Gp100(糖蛋白100kD)、HAGE(螺旋酶抗原)、HER-2/neu(人表皮受體-2/神經學；亦稱為EGFR2)、HLA-A(人白血球抗原A)、HPV(人乳頭狀瘤病毒)、HSP70-2M(突變之熱休克蛋白70-2)、HST-2(人印戒腫瘤-2)、hTERT或hTRT(人端粒酶逆轉錄酶)、iCE(腸羧基酯酶)、IL-13R-a2(介白素-13受體亞單位α-2)、KIAA0205、KDR(激酶插入結構域受體)、κ輕鏈、LAGE(L抗原)、LDLR/FUT(低密度脂質受體/GDP-L-岩藻糖：b-D-半乳糖苷酶2-a-L岩藻糖基轉移酶)、LeY(路易斯-Y抗體)、L1CAM(L1細胞黏附分子)、MAGE(黑色素瘤抗原)、MAGE-A1(黑色素瘤相關抗原1)、間皮素、鼠CMV感染之細胞、MART-1/Melan-A(由T細胞識別之黑色素瘤抗原-1/黑色素瘤抗原A)、MC1R(黑皮質素1受體)、肌球蛋白/m(突變之肌球蛋白)、MUC1(黏蛋白1)、MUM1、MUM2、MUM3(突變之黑色素瘤泛蛋白1、2、3)、NA88-A(患者M88之NA cDNA選殖株)、NKG2D(天然殺手細胞第2組成員D)配體、NY-BR-1(紐約乳房分化抗原1)、NY-ESO-1(紐約食道鱗狀細胞癌-1)、癌胚抗原(h5T4)、P15(蛋白15)、p190次要bcr-ab1(190KD bcr-ab1蛋白)、Pml/RARa(前髓細胞性白血病/視黃酸受體a)、PRAME(優先表現之黑色素瘤抗原)、PSA(前列腺特異性抗原)、PSCA(前列腺幹細胞抗原)、PSMA(前列腺特異性膜抗原)、RAGE(腎抗原)、RU1或RU2(腎泛蛋白1或2)、 SAGE(肉瘤抗原)、SART-1或SART-3(鱗狀抗原排斥腫瘤1或3)、SSX1、SSX2、SSX3、SSX4(滑膜肉瘤X1、X2、X3、X4)、TAA(腫瘤相關抗原)、TAG-72(腫瘤相關糖蛋白72)、TEL/AML1(轉位Ets家族性白血病/急性髓系白血病1)、TPI/m(突變之磷酸丙糖異構酶)、TRP-1(酪胺酸酶相關性蛋白1或gp75)、TRP-2(酪胺酸酶相關性蛋白2)、TRP-2/INT2(TRP-2/內含子2)、VEGF-R2(血管內皮生長因子受體2)、WT1(腎母細胞瘤基因)及彼等之任何組合。

E45.如E1至E44中任一項之方法，其進一步包含投予有此需要之個體所產生之T細胞。

E46.一種治療需要T細胞治療之個體的腫瘤之方法，其包含對該個體投予一或多個T細胞，其中該一或多個T細胞已與(i)AKT抑制劑及(ii)外源性IL-7及/或外源性IL-15接觸。

E47.一種在需要T細胞治療之個體中降低或減少腫瘤大小或抑制腫瘤生長之方法，其包含對該個體投予一或多個T細胞，其中該一或多個T細胞已與(i)AKT抑制劑及(ii)外源性IL-7及/或外源性IL-15接觸。

E48.如E46或E47之方法，其中該一或多個T細胞未曾與外源性IL-2接觸。

E49.如E46至E48中任一項之方法，其中該T細胞在與AKT抑制劑和外源性IL-7及/或外源性IL-15接觸之後表現CCR7和CD45RO。

E50.如E46至E48中任一項之方法，其中該 T細胞在與AKT抑制劑和外源性IL-7、外源性IL-15或該二者接觸之後表現CCR7和CD45RA。

E51.如E46至E48中任一項之方法，其中與由未與AKT抑制劑和外源性IL-7及/或外源性IL-15接觸之T細胞所表現之CCR7、CD45RO和CD45RA相比較，該T細胞在與AKT抑制劑和外源性IL-7及/或外源性IL-15接觸之後顯現增加CCR7、CD45RO、CD45RA之表現。

E52.如E46至E51中任一項之方法，其中該T細胞在與AKT抑制劑和外源性IL-7及/或外源性IL-15接觸之後表現CD62L、CD28或該二者。

E53.如E46至E52中任一項之方法，其中與由未與AKT抑制劑和外源性IL-7及/或外源性IL-15接觸之T細胞所表現之CD62L和CD28相比較，該T細胞在與AKT抑制劑和外源性IL-7及/或外源性IL-15接觸之後顯現增加CD62L、CD28或該二者之表現。

E54.如E46至E53中任一項之方法，其中與由未與AKT抑制劑和外源性IL-7及/或外源性IL-15接觸之T細胞所表現之CD95、IL-7受體α(IL-7Rα)、CXCR4、TCF7、FOXO1、ID3、BCL6、CD62L和CD45RA相比較，該T細胞在與AKT抑制劑和外源性IL-7及/或外源性IL-15接觸之後顯現增加CD95、IL-7受體α(IL-7Rα)、CXCR4、TCF7、FOXO1、ID3、BCL6、CD62L、CD45RA或彼等之任何組合之表現。

E55.如E46至E54中任一項之方法，其中該一或多個T細胞係從供體中分離出。

E56.如E55之方法，其中該供體為個體。

E57.如E46至E56中任一項之方法，其中該腫瘤為癌症。

E58.如E57之方法，其中該癌症係選自下列群組：骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭部或頸部之癌症、皮膚或眼內惡性黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區域之癌症、胃癌、睾丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、陰戶癌、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、原發性縱隔大B細胞淋巴瘤(PMBC)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、轉化之濾泡性淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤(SMZL)、食道癌、小腸癌、內分泌系統之癌症、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、慢性或急性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)(包括非T細胞ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、兒童之實體腫瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎或輸尿管之癌症、腎盂之癌症、中樞神經系統(CNS)之腫瘤、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管發生、脊椎腫瘤、腦幹神經膠質瘤、腦下垂體腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、T細胞淋巴瘤、包括由石棉所誘發之癌症的環境誘發癌症、其他B細胞惡性腫瘤及彼等之任何組合。

E59.如E1至E58中任一項之方法，其中該T細胞治療包含經處理之CAR細胞治療或經處理之TCR細胞治療。

E60.如E59之方法，其中該經處理之CAR細胞或經處理之TCR細胞治療可治療個體之腫瘤。

實施例1

在IL-2、IL-7、IL-15及/或AKT抑制劑之存在下，以相等的平皿接種濃度將供體T細胞培養10天。將CD4⁺ T細胞和CD8⁺ T細胞培養7和14天後測定培養之T細胞的T細胞表型(i)比較在單獨之IL-2之存在下培養與在IL-7和IL-15之存在下培養的結果及(ii)比較在IL-7和IL-15之存在下培養與在IL-7、IL-15和AKT抑制劑之存在下培養的結果(第1A圖-第1F圖)。當細胞係在IL-7和IL-15之存在下生長時可觀察到有較多幼年型T細胞之趨勢。尤其是，與以IL-2處理之細胞相比較，在以IL-7/IL-15處理之細胞中可觀察到明顯較高百分比之初始和TCM CD4⁺細胞(p=0.03，n=6)(第1A圖)，而較成熟之效應子T細胞的百分比則未觀察到有差異(第1B圖)。此效果在長期培養後在CD4⁺隔室中並未保持(數據未顯示)。類似之效果可在CD8⁺隔室中觀察到，與以IL-2處理之細胞培養相比較，在以IL-7/IL-15處理之細胞培養中可觀察到初始和TCM細胞之百分比明顯較高(p=0.03，n=6)(第1C圖)，而效應子T細胞之百分比明顯較低(p=0.03，n=6)(第 1D圖)。然而，不像在CD4⁺隔室中，在CD8⁺隔室中仍可在長期培養後觀察到此效果(第1E圖，p=0.03，n=6；及第1F圖，p=0.03，n=6)。

在CD4⁺和CD8⁺二種隔室中，添加AKT抑制劑可進一步增加朝向較多未成熟T細胞之趨勢。第7天時，與以IL-7/IL-15處理之細胞相比較，在以IL-7/IL-15/AKTi處理之細胞中可觀察到初始和TCM CD4⁺細胞之百分比稍微較高(第2A圖)，且與以IL-7/IL-15處理之細胞相比較，以IL-7/IL-15/AKTi處理之細胞中可觀察到效應子T細胞之百分比稍微較低(第2B圖)。培養14天之細胞中未觀察到明顯差異(數據未顯示)。然而第7天在CD8⁺隔室中可觀察到明顯差異。尤其是，第7天時，與以IL-7/IL-15處理之細胞相比較，在以IL-7/IL-15/AKTi處理之細胞中可觀察到初始和Tcm CD4⁺細胞之百分比顯著較高(p=0.03，n=6)(第2C圖)，且與以IL-7/IL-15處理之細胞相比較，在以IL-7/IL-15/AKTi處理之細胞中可觀察到效應子T細胞之百分比顯著降低(p=0.03，n=6)(第2D圖)。然而，第14天時並未觀察到此效果(數據未顯示)。

為了測定將T細胞與IL-2、IL-7及/或IL-15和AKT抑制劑之一或多者接觸是否對轉導效率有影響，在刺激後2天，在OriGen PERMALIFE^TM PL30袋中以攜帶第I類TCR之逆轉錄病毒轉導從3個供體收集之T細胞。然後，將經轉導之細胞在下列群組之存在下培養10天：(i)IL-2；(ii)IL-2和AKT抑制劑；(iii)IL-7和IL-15；和(iv)IL-7、IL-15及AKT抑制劑。然後分析T細胞之CD3表現及陽性可溶性MHC四聚體染色(Tet⁺)(此為成功轉導之指標)。根據該培養條件，在轉導效率上未觀察到重大差異(第3A圖)且在各培養條件之間未觀察到四聚體平均螢光強度(MFI)之顯著差異(第3B圖)。

實施例2

在各種條件下調查AKTi抑制劑對細胞擴增之影響。首先，依下述評估AKTi培養條件對各種供體細胞來源之影響。使用高密度離心處理來自4個健康供體之分離術製品以取得到外周血單核細胞(PBMC)(第4A至4D圖)。計算來自4個供體之細胞數並使用OKT3(針對CD3之單株抗體)刺激之，在下列群組之存在下培養7至10天：IL-2(圓圈)；IL-2和AKTi(正方形)；IL-7和IL-15(三角形)；或IL-7、IL-15和AKTi(倒三角形)(第4A至4D圖)。觀察各供體細胞系在各培養條件下之細胞擴增，而AKTi對細胞擴增沒有負面影響(第4A至4D圖)。

接著，評估經第I類TCR(HPV-E6)轉導之PBMC。再次使用高密度離心處理來自3個供體之分離術製品以取得PBMC，計算細胞數並使用OKT3刺激之。然後，在下列群組之存在下培養來自3個供體之細胞：IL-2(圓圈)；IL-2和AKTi(正方形)；IL-7和IL-15(三角形)；或IL-7、IL-15和AKTi(倒三角形)(第5A至5C圖)。第2天，以第I類TCR(HPV-E6)轉導細胞。觀察各供體細胞系在各培養條件下之細胞擴增，而AKTi對細胞擴增沒有負面影響(第5A至5C圖)。

接著，評估AKTi培養條件對CD4⁺/CD8⁺ T細胞之影響。再次使用高密度離心處理來自3個健康供體之分離術製品以取得PBMC。然後，將PBMC與抗-CD4和抗-CD8抗體小珠一起培養，再使用CLINIMACS®系統(Miltenyi Biotec)選擇CD4⁺和CD8⁺細胞。計算來自三個供體之CD4⁺和CD8⁺細胞數並使用OKT3和抗-CD28抗體刺激之。然後，將細胞在下列群組之存在下進行培養：IL-2(圓圈)；IL-2和AKTi(正方形)；IL-7和IL-15(三角形)；或IL-7、IL-15和AKTi(倒三角形)(第6A至6C圖)。第2天，以第II類TCR(MAGE-A3)轉導細胞。觀察各供體細胞系在各培養條件下之細胞擴增，而AKTi對細胞擴增沒有負面影響(第6A至6C圖)。

然後，分別評估CD4+和CD+T細胞。再次使用高密度離心處理來自3個健康供體之分離術製品以取得PBMC。然後，將PBMC與抗-CD4小珠(第7A至7C圖)或抗-CD8小珠(第8A至8C圖)一起培養並使用CLINIMACS®系統(Miltenyi Biotec)選擇靶細胞。然後，計算來自三個供體之細胞數並使用OKT3和抗-CD28抗體刺激之。再將細胞在下列群組之存在下進行培養：IL-2(圓圈)；IL-2和AKTi(正方形)；IL-7和IL-15(三角形)；或IL-7、IL-15和AKTi(倒三角形)。第2天，以第II類TCR(MAGE-A3)轉導細胞。觀察來自各供體細胞系之下 CD4⁺(第7A至7C圖)和CD8⁺(第8A至8C圖)在各培養條件之細胞擴增，而AKTi對細胞擴增沒有負面影響。

然後，評估培養條件在大製造規模培養期間之影響。再次使用高密度離心處理來自4個健康供體之分離術製品以取得外周血單核細胞PBMC(第9A至9D圖)。然後，將PBMC與抗-CD4和抗-CD8小珠一起培養並使用CLINIMACS®系統選擇CD4⁺/CD8⁺細胞。計算CD4⁺/CD8⁺細胞之數目並使用OKT3和抗-CD28刺激之。然後，在下列群組之存在下，在XURI^TM細胞擴增系統(GE Healthcare Life Sciences)中以大製造規模培養細胞8天：IL-7和IL-15(第9A圖：圓圈；第9B至9C圖：正方形)，或IL-7、IL-15和AKTi(第9A圖：正方形；第9B至9C圖：圓圈)。培養第2天，以第II類TCR(MAGE-A3)轉導細胞。觀察各供體細胞系在各培養條件下之細胞擴增，而AKTi對細胞擴增沒有負面影響(第9A至9D圖)。

實施例3

調查在AKTi之存在下培養後對T細胞轉導效率之影響。在IL-2、IL-2和AKTi；IL-7和IL-15；或IL-7、IL-15和AKTi之存在下刺激預先冷凍之供體T細胞，再培養10天。刺激後第2天，在T-75組織培養瓶中以第I類TCR(HPV-E6)轉導細胞(第10圖)，或在OriGen PERMALIFE^TM袋中以第II類TCR(MAGE-A3)轉導細胞 (第11A至11F圖)。在第10天，藉由抗mTCRb抗體染色測量T細胞轉導效率(第10圖和第11A至11F圖)。AKTi對轉導效率沒有負面影響(第10、11A、11B、11D和11E圖)，雖然該抗mTCRb染色MFI顯示相對於單獨之IL-7和IL-15，在IL-7、IL-15和AKTi之存在下培養的細胞具有稍強之整體強度(第11C和11F圖)。

在製造規模培養之T細胞可觀察到類似之結果(第12圖)。在IL-7和IL-15或IL-7、IL-15和AKTi之存在下將來自4個製造規模運行之預先冷凍的供體T細胞(21、22和23)培養在OriGen PERMALIFE^TM袋中。刺激後第2天，以第II類TCR(MAGE-A3)轉導細胞。然後，使細胞生長在XURI^TM生物反應器細胞擴增系統中。在第8天，藉由抗mTCRb(mC TCR PE)抗體染色測定T細胞轉導效率。顯示在各培養條件下每次運行中表現經轉導之TCR的CD3⁺細胞之百分比(第12圖)。在大規模製造條件下，相較於在單獨之IL-7和IL-15中培養的細胞，在IL-7、IL-15和AKTi之存在下生長的細胞具有較大之轉導效率(第12圖)。

實施例4

為了測定各種培養條件對分化狀態的影響，以第II類TCR(MAGE-A3)轉導來自三個供體之CD4⁺/CD8⁺ T細胞並在IL-2；IL-2和AKTi；IL-7和IL-15；及IL-7、IL-15和AKTi之存在下培養之。然後，以針對CD62L(此為早期分化階段之標記)之抗體將細胞染色。測定在各培養條件下，來自供體1、2和3之各細胞中CD62L表現染色為陽性之細胞的百分比(分別為第13A、13B和13C圖)。平均螢光強度(MFI)指出與無AKTi存在時所培養之細胞相比較，在AKTi之存在下所培養的細胞在陽性細胞之表面上具有較高之CD62L水準(第13D至13E圖)。

實施例5

為了測定AKTi對T細胞功能之效果，在各種條件下培養後評估細胞因子之製造和T細胞增殖。將來自4個製造規模運行之T細胞(21、22和23)在IL-2；IL-2和AKTi；IL-7和IL-15；及IL-7、IL-15和AKTi之存在下培養在OriGen PERMALIFE^TM袋中。第2天，以第II類TCR(MAGE-A3)轉導T細胞，然後在IL-7和IL-15或IL-7、IL-15和AKTi之存在下使細胞生長在XURI^TM生物反應器細胞擴增系統中。以PMA+離子黴素(Ionomycin)+布雷非德菌素A(BrefaldinA)+莫能菌素(Monesin)刺激T細胞5.5小時。細胞內流式細胞術顯示在AKTi之存在下培養的細胞之T細胞活性增加，此可由細胞因子IFNg(第14A圖)和TNFa(第14B圖)之製造產量增加證實。

為了進一步確認AKTi增加T細胞活性，依上述培養來自2個製造規模運行(21和22)之T細胞並與陽性(H1299、HT1197和HT1367)和陰性(DU145、SK MEL 28和SK MEL 5)靶的腫瘤細胞系共同培養過夜。在AKTi之存在下培養的細胞顯示在各測試之培養條件下製造較多之IFNg(第15圖)，這表明與AKTi一起培養之細胞具有較未與AKTi一起培養之細胞更強之效力來反應刺激。

在小規模之供體T細胞培養中可觀察到類似之結果。刺激來自供體1、供體2和供體3之細胞；在IL-2；IL-2和AKTi；IL-7和IL-15；或IL-7、IL-15和AKTi之存在下培養細胞；並依上述，在刺激後第2天以第I類TCR進行轉導。將T細胞與腫瘤細胞系(Caski細胞；第16圖)或與裝載滴定量之TCR特異性肽的T2細胞(第16B至16D圖)共同培養過夜。如同在上述之大規模製造實驗中所觀察者，與無AKTi存在時培養之細胞相比較，在AKTi之存在下培養的細胞製造較大量之IFNg(第16A至16D圖)。TCR特異性肽之滴定顯示幾乎在所有水準下，AKTi培養條件均誘導出較大之IFNg產量。

亦發現在AKTi之存在下培養後，T細胞之增殖增加。依上述，在刺激後第2天以第II類TCR(MAGE-A3)轉導來自供體1、供體2和供體3之T細胞。以CFSE將T細胞染色並與腫瘤細胞系(陽性對照)共同培養4天。與無AKTi存在時生長之細胞(第17A和17C圖)相比較，在AKTi之存在下生長的細胞(第17B和17D圖)可觀察到T細胞增殖增加。第17A至17D圖顯示來自供體3之代表性數據，其中在IL-2和AKTi(第17B圖)及IL-7、IL-15和AKTi(第17D圖)之存在下培養的細胞較無AKTi存在時培養之細胞(第17A和17C圖)具有較多百分比之細胞被表徵為在晚期(L)或中期(M)增殖。

亦觀察到在大規模製造培養條件下T細胞的增殖增加。依上述，在刺激後第2天以第II類TCR(MAGE-A3)轉導來自二個大規模製造運行(21和22)之T細胞。以CFSE將T細胞染色並與陽性腫瘤細胞系或陰性細胞系共同培養4天。各21A/21B(第18A圖)和22A/22B(第18B圖)之運行中，在AKTi之存在下生長之細胞中可觀察到T細胞增殖增加。

實施例6

為了測定AKTi對T細胞之溶細胞活性的影響，依上述將表現螢光素酶之靶細胞與T細胞在各種培養條件(單獨之IL-2；IL-2和AKTi；IL-7和IL-15；或IL-7、IL-15和AKTi)共同培養一段在16至96小時之範圍內的期間。然後，將T細胞與表現螢光素酶之靶細胞共同培養。藉由螢光素酶強度測量靶細胞生存力，從而使降低之螢光素酶強度指明T細胞識別及靶的特異性滅殺作用。因此，螢光素酶水準降低為T細胞之細胞毒性的直接測量。預期在AKT抑制劑之存在下培養的細胞將較無AKT抑制劑存在時培養之細胞具有較高之細胞毒性。

Claims

一種初始CD4⁺T細胞群，其係藉由方法製備，該方法包含於無外源性介白素-2(IL-2)存在下令CD4⁺T細胞於活體外與AKT抑制劑、外源性介白素-7(IL-7)及外源性介白素-15(IL-15)接觸。
如請求項1之初始CD4⁺T細胞群，其中該接觸達1至14天。
如請求項1之初始CD4⁺T細胞群，其中該接觸達1至10天。
如請求項1之初始CD4⁺T細胞群，其中該IL-7和IL-15各以至少7ng/ml之濃度存在。
如請求項1之初始CD4⁺T細胞群，其中該IL-7和IL-15各以至少10ng/ml之濃度存在。
如請求項1之初始CD4⁺T細胞群，其中該方法藉由延緩或抑制該CD4⁺T細胞成熟或分化以延長所產生之初始CD4⁺T細胞的活體內持續性。
如請求項1之初始CD4⁺T細胞群，其中所產生之初始CD4⁺T細胞顯現相對於無AKT抑制劑存在下經培養之CD4⁺T細胞的T細胞功能改善之T細胞功能，其中該改善之T細胞功能係選自由下列所組成之群組：(i)T細胞增殖增加；(ii)細胞因子製造增加；(iii)溶細胞活性增加；及(iv)(i)至(iii)之任何組合。
如請求項7之初始CD4⁺T細胞群，其中該細胞因子製造增加係選自由下列所組成之群組：(i)干擾素γ(IFNg)製造增加；(ii)組織壞死因子α(TNFa)製造增加；及(iii)IFNg和TNFa製造增加。
如請求項1之初始CD4⁺T細胞群，其中所產生之初始CD4⁺T細胞係用於治療需要T細胞治療之個體的腫瘤。
如請求項9之初始CD4⁺T細胞群，其中該腫瘤之大小降低或減少或該腫瘤之生長受抑制。
如請求項1之初始CD4⁺T細胞群，其中該AKT抑制劑係選自由下列所組成之群組：A6730、B2311、124018、GSK2110183(阿氟思替(afuresertib))、沛利福新(Perifosine)(KRX-0401)、GDC-0068(伊帕思替(ipatasertib))、RX-0201、VQD-002、LY294002、A-443654、A-674563、阿克緹(Akti)-1、阿克緹-2、阿克緹-1/2、AR-42、API-59CJ-OMe、ATI-13148、AZD-5363、飄兒菜基磷酸膽鹼(erucylphosphocholine)、GSK-2141795(GSK795)、KP372-1、L-418、NL-71-101、PBI-05204、PIA5、PX-316、SR13668、曲西立濱(triciribine)、GSK 690693(CAS # 937174-76-0)、FPA 124(CAS # 902779-59-3)、米替福新(Miltefosine)、PHT-427(CAS # 1 191951-57-1)、10-DEBC鹽酸鹽、Akt抑制劑III、Akt抑制劑VIII、MK-2206二鹽酸鹽(CAS # 1032350-13-2)、SC79、AT7867(CAS # 857531-00-1)、CCT128930(CAS # 885499-61-6)、 A-674563(CAS # 552325-73-2)、AGL 2263、AS-041 164(5-苯並[1,3]二噁茂-5-基伸甲基-噻唑啶-2,4-二酮)、BML-257(CAS # 32387-96-5)、XL-418、CAS # 612847-09-3、CAS # 98510-80-6、H-89(CAS # 127243-85-0)、OXY-1 1 1 A、3-[1-[[4-(7-苯基-3H-咪唑並[4,5-g]喹噁啉-6-基)苯基]甲基]六氫吡啶-4-基]-1H-苯並咪唑-2-酮、N,N-二甲基-1-[4-(6-苯基-1H-咪唑並[4,5-g]喹噁啉-7-基)苯基]甲胺、1-{1-[4-(3-苯基苯並[g]喹噁啉-2-基)苄基]六氫吡啶-4-基}-1,3-二氫-2H-苯並咪唑-2-酮及彼等之任何組合。
如請求項11之初始CD4⁺T細胞群，其中該AKT抑制劑為3-[1-[[4-(7-苯基-3H-咪唑並[4,5-g]喹噁啉-6-基)苯基]甲基]六氫吡啶-4-基]-1H-苯並咪唑-2-酮。
如請求項1之初始CD4⁺T細胞群，其中：(i)該AKT抑制劑之量為1nM至1mM；(ii)該外源性IL-7之量為0.001至500ng/ml；(iii)該外源性IL-15之量為0.001至500ng/ml；或(iv)(i)至(iii)之任何組合。
如請求項1之初始CD4⁺T細胞群，其中：(i)該AKT抑制劑之量為8μM；(ii)該外源性IL-7之量為至少5ng/ml；(iii)該外源性IL-15之量為至少5ng/ml；或(iv)(i)至(iii)之任何組合。
如請求項1之初始CD4⁺T細胞群，其中該CD4⁺T細胞係選自由下列所組成之群組：腫瘤浸潤淋巴細胞、細胞毒性T細胞、CAR T細胞、經處理之TCR T細胞、天然殺手T細胞、外周血淋巴細胞及腫瘤浸潤白血球。
如請求項1之初始CD4⁺T細胞群，其進一步包含以逆轉錄病毒轉導該CD4⁺T細胞。
如請求項16之初始CD4⁺T細胞群，其中該逆轉錄病毒包含編碼T細胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR)之異源基因。
如請求項17之初始CD4⁺T細胞群，其中該TCR或CAR能夠結合選自由下列所組成之群組的抗原：707-AP(707丙胺酸脯胺酸)、AFP(α-胎蛋白)、ART-4(由T4細胞識別之腺癌抗原)、BAGE(B抗原；b-鏈蛋白(b-catenin)/m、b-鏈蛋白/經突變的)、BCMA(B細胞成熟抗原)、Bcr-abl(斷點簇區域-Abelson)、CAIX(碳酸酐酶IX)、CD19(分化簇19)、CD20(分化簇20)、CD22(分化簇22)、CD30(分化簇30)、CD33(分化簇33)、CD44v7/8(分化簇44，外顯子7/8)、CAMEL(黑色素瘤上由CTL識別之抗原)、CAP-1(癌胚抗原肽-1)、CASP-8(半胱天冬酶-8)、CDC27m(突變之細胞分裂週期27)、CDK4/m(經突變之週期蛋白依賴型激酶4)、CEA(癌胚抗原)、CT(癌症/睾丸(抗原))、Cyp-B(親環素B)、DAM(分化抗原黑色素瘤)、EGFR(表皮生長因子受體)、EGFRvIII(表皮生長因子受體變體III)、EGP-2(表皮糖蛋白2)、EGP-40(表皮糖蛋白40)、Erbb2、3、4(紅血球母細胞性白血病病毒致癌基因同源物2、3、4)、ELF2M(突變之延伸因子2)、ETV6-AML1(Ets變異體基因6/急性骨髓性白血病1基因ETS)、FBP(葉酸結合蛋白)、fAchR(胎兒乙醯膽鹼受體)、G250(糖蛋白250)、GAGE(G抗原)、GD2(二唾液酸神經節苷脂(disialoganglioside)2)、GD3(二唾液酸神經節苷脂3)、GnT-V(N-乙醯葡糖胺轉移酶V)、Gp100(糖蛋白100kD)、HAGE(螺旋酶(helicose)抗原)、HER-2/neu(人表皮受體-2/神經學；亦稱為EGFR2)、HLA-A(人白血球抗原A)、HPV(人乳頭狀瘤病毒)、HSP70-2M(突變之熱休克蛋白70-2)、HST-2(人印戒腫瘤(signet ring tumor)-2)、hTERT或hTRT(人端粒酶逆轉錄酶)、iCE(腸羧基酯酶)、IL-13R-a2(介白素-13受體亞單位α-2)、KIAA0205、KDR(激酶插入結構域受體)、κ輕鏈、LAGE(L抗原)、LDLR/FUT(低密度脂質受體/GDP-L-岩藻糖：b-D-半乳糖苷酶2-a-L岩藻糖基轉移酶)、LeY(路易斯-Y抗體)、L1CAM(L1細胞黏附分子)、MAGE(黑色素瘤抗原)、MAGE-A1(黑色素瘤相關性抗原1)、MAGE-A3、MAGE-A6、間皮素(mesothelin)、鼠CMV感染之細胞、MART-1/Melan-A(由T細胞識別之黑色素瘤抗原-1/黑色素瘤抗原A)、MC1R(黑皮質素(melanocortin)1受體)、肌球蛋白/m(突變之肌球蛋白)、MUC1(黏蛋白1)、MUM1、MUM2、MUM3(突變之黑色素瘤泛蛋白1、2、3)、NA88-A(患者 M88之NA cDNA選殖株)、NKG2D(天然殺手細胞2族成員D)配體、NY-BR-1(紐約乳房分化抗原1)、NY-ESO-1(紐約食道鱗狀細胞癌-1)、癌胚抗原(h5T4)、P15(蛋白15)、p190次要bcr-ab1(190KD bcr-ab1蛋白)、Pml/RARa(前髓細胞性白血病/視黃酸受體a)、PRAME(優先表現之黑色素瘤抗原)、PSA(前列腺特異性抗原)、PSCA(前列腺幹細胞抗原)、PSMA(前列腺特異性膜抗原)、RAGE(腎抗原)、RU1或RU2(腎泛蛋白1或2)、SAGE(肉瘤抗原)、SART-1或SART-3(鱗狀抗原排斥腫瘤1或3)、SSX1、SSX2、SSX3、SSX4(滑液肉瘤X1、X2、X3、X4)、TAA(腫瘤相關抗原)、TAG-72(腫瘤相關糖蛋白72)、TEL/AML1(轉位Ets家族性白血病/急性髓系白血病1)、TPI/m(突變之磷酸丙糖(triosephosphate)異構酶)、TRP-1(酪胺酸酶相關性蛋白1或gp75)、TRP-2(酪胺酸酶相關性蛋白2)、TRP-2/INT2(TRP-2/內含子2)、VEGF-R2(血管內皮生長因子受體2)、WT1(腎母細胞瘤(Wilm's tumor)基因)及彼等之任何組合。
如請求項1之初始CD4⁺T細胞群，其中所產生之初始CD4⁺T細胞：(i)表現CCR7和CD45RO；(ii)表現CCR7和CD45RA；(iii)顯現與由未與該AKT抑制劑、該外源性IL-7及該外源性IL-15接觸之CD4+T細胞所表現的CCR7、CD45RO及CD45RA相比較，CCR7、CD45RO、CD45RA或彼等之任何組合的表現增加； (iv)表現CD62L、CD28或該二者；(v)顯現與由未與該AKT抑制劑、該外源性IL-7及該外源性IL-15接觸之CD4⁺T細胞所表現的CD62L和CD28相比較，CD62L、CD28或該二者的表現增加；(vi)在與該AKT抑制劑、該外源性IL-7及該外源性IL-15接觸後，顯現與由未與該AKT抑制劑、該外源性IL-7及該外源性IL-15接觸之CD4⁺T細胞所表現的CD95、IL-7受體α(IL-7Rα)、CXCR4、TCF7、FOXO1、ID3、BCL6、CD62L及CD45RA相比較，CD95、IL-7Rα、CXCR4、TCF7、FOXO1、ID3、BCL6、CD62L、CD45RA或彼等之任何組合的表現增加；或(vii)(i)至(vi)之任何組合。
如請求項9之初始CD4⁺T細胞群，其中該腫瘤為選自由下列所組成之群組的癌症：骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭部或頸部之癌症、皮膚或眼內惡性黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區域之癌症、胃癌、睾丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、陰戶癌、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、原發性縱隔大B細胞淋巴瘤(PMBC)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、轉化之濾泡性淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤(SMZL)、食道癌、小腸癌、內分泌系統之癌症、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、慢性或急性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、兒童之實體腫瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎或輸尿管之癌症、腎盂之癌症、中樞神經系統(CNS)之腫瘤、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管發生、脊椎腫瘤、腦幹神經膠質瘤、腦下垂體腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、T細胞淋巴瘤、包括由石棉所誘發之癌症的環境誘發癌症、其他B細胞惡性腫瘤及彼等之任何組合。
如請求項20之初始CD4⁺T細胞群，其中該急性淋巴母細胞性白血病(ALL)為非T細胞ALL。
如請求項1之初始CD4⁺T細胞群，其中該CD4⁺T細胞係自體的。
如請求項1之初始CD4⁺T細胞群，其中該CD4⁺T細胞係同種異體的。
如請求項17之初始CD4⁺T細胞群，其中該TCR或該CAR結合CD19或BCMA。