CN111971028A - 用治疗性纳米生物组合物促进训练免疫 - Google Patents

用治疗性纳米生物组合物促进训练免疫 Download PDF

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Abstract

本发明涉及治疗受训练免疫影响的患者的治疗性纳米生物组合物和方法，以治疗癌症或脓毒症，提高检查点抑制剂治疗的有效性，提供长期的肿瘤消退，治疗缺陷的训练免疫，并提供放射性标记的纳米生物的PET成像，以显示组织中积聚的位置。其中训练免疫是长期降低的反应，是骨髓、脾脏和血液中的骨髓细胞及其干细胞和祖细胞的代谢和表观遗传重排的结果。

Description

用治疗性纳米生物组合物促进训练免疫
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年11月21日提交的、美国专利申请序号62/589,054的优先权，在此通过引用将其整体并入。
关于联邦资助研发的声明
这项发明是在美国国立卫生研究院授予的R01 HL118440赠款的支持下完成的。政府拥有这项发明的某些权利。
技术领域
本发明涉及治疗性纳米生物组合物，以及通过促进训练免疫(trained immunity)来治疗患有癌症或感染的患者的方法，该方法是一种次级长期高反应(secondary long-term hyper-responsiveness)，通过使用纳米生物组合物刺激骨髓、脾脏和血液中的骨髓细胞及其祖细胞和干细胞，表现为由代谢和表观遗传重排(epigenetic rewiring)引起的细胞因子排泄增加。
背景技术
相关技术的描述
目前对遭受癌症的患者的治疗可能是不够的。患有癌症的患者，需要一种持久的治疗范式，而且该治疗范式不会比主要治疗本身在副作用方面造成更多问题。
目前的癌症疗法可以涉及手术、化疗、激素疗法和/或放射治疗，以根除患者体内的肿瘤细胞(例如，参见Stockdale，1998，Medicine，vol.3，Rubenstein and Federman，eds.，Chapter12，Section IV)。最近，癌症疗法还可以包括生物疗法或免疫疗法。所有这些方法都会给患者造成明显的弊端。例如，手术可能由于患者的健康而被禁忌，或可能对于患者来说是不能被接受的。此外，手术可能不能完全清除肿瘤组织。只有当肿瘤组织对辐射表现出比正常组织更高的敏感性时，放射疗法才有效。放射疗法也经常会引起严重的副作用。激素疗法很少以单一药剂给予。虽然激素疗法是有效的，但它通常是在其他治疗方法已经清除了大部分癌细胞后，用来防止或延缓癌症的复发。生物疗法和免疫疗法的数量有限，且可能产生副作用，如皮疹或肿胀、流感样症状，包括发烧、发冷以及疲劳、消化道问题或过敏反应。
至于化疗，有各种可用于癌症治疗的化疗剂。大部分癌症的化疗通过抑制脱氧核糖核酸三磷酸前体的生物合成，直接或间接抑制DNA合成而作用，从而阻止DNA复制和伴随的细胞分裂。Gilman等人、Goodman和Gilman的治疗学的药理学基础，第10版(麦格劳-希尔(McGraw Hill)，纽约)。
尽管有各种化疗药物可用，化疗仍有许多弊端。Stockdale,药物,vol.3,Rubenstein和Federman,eds.,ch.12,sect.10,1998。几乎所有的化疗药物都是有毒的，以及化疗会引起显著的、通常是危险的副作用，包括严重的恶心、骨髓抑制和免疫抑制。此外，即使利用化疗剂的联合用药，许多肿瘤细胞会对化疗剂有抗性或发展出抗性。事实上，那些对在治疗方案中使用的特定化疗剂有抗性的细胞通常被证明对其他药物也具有抗性，即使那些药剂通过与在特定治疗中使用的药剂的作用机制不同的作用机制而作用。这种现象被称为多向耐药性或多药耐药性。因为耐药性，许多癌症对于标准的化疗治疗方案证明是难治性的。尽管如此，仍有显著的需求以安全且有效的方法来治疗、预防和管理由有缺陷的训练免疫引起的癌症，以及其他疾病和病症，特别是对于以标准治疗(例如手术、放射疗法、化疗和激素疗法)难治性的疾病，同时减少或避免与传统疗法相关的毒性和/或副作用。
近十年来，我们对免疫系统的了解已经产生了几种有前途的免疫治疗方法，为患者提供了巨大的好处。今天的临床相关免疫疗法或要么结合效应分子(effectormolecule)，如细胞因子，要么结合适应性免疫的细胞阶段。在自身免疫性疾病和自身炎症性疾病中，抗细胞因子疗法可以成功中和生物活性细胞因子，而在癌症患者中最常用的免疫疗法包括检查点抑制剂药物的应用。这些药物阻止了T细胞，使它们能够清除肿瘤细胞。针对细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)的抗体，以及针对程序性细胞死亡蛋白1(PD1)及其配体PD-L1的抗体，在临床应用方面是最先进的。或者，过继性T细胞疗法涉及从患者处收集这些细胞，在培养中扩大它们的数量，并将它们重新引入身体内。在培养中，T细胞也可以被基因修饰来增加其对肿瘤细胞的亲和力。树突状细胞疗法是另一种获得大量推力的治疗方式。它涉及递呈肿瘤特异性抗原给体外或体内的树突状细胞，以诱导肿瘤特异性T细胞响应。
虽然前面提及的免疫治疗方法集中在T淋巴细胞(其是来自适应性免疫系统的细胞)，但仍有改进治疗方法的需求。
发明内容
因此，为了解决在现有技术中的这些以及其他缺陷，在本发明的优选实施方式中，本发明提供了与先天性免疫系统结合的纳米生物，特别是在骨髓、血液和脾脏中的骨髓细胞及其干细胞和祖细胞，以及利用治疗剂以促进训练免疫来治疗有需要的病人的方法。
训练免疫被定义为一种次级的长期高反应，表现为代谢和表观遗传重排引起的细胞因子分泌增加，以在骨髓、脾脏和血液中的骨髓细胞及其祖细胞和干细胞受到原发性损伤后进行再刺激(restimulation)。训练免疫(也称为先天免疫记忆(innate immunememory))也被定义为利用骨髓先天免疫细胞的二次刺激(secondary stimulus)进行再刺激后的一种长期增长反应(例如，高细胞因子的产生)，通过原发性损伤刺激在骨髓和脾脏中的这些细胞或它们的祖细胞及干细胞而诱导，并通过表观遗传、代谢和转录重排介导。
治疗癌症或脓毒症
在本发明的一个非限制性的优选实施方式中，提供了一种治疗患者的方法，所述方法通过诱导训练免疫来治疗癌症或脓毒症：
(i)给予所述患者有效促进高反应性先天免疫反应的量的纳米生物组合物，
其中所述纳米生物组合物包括(i)纳米级组装物，具有(ii)包含在纳米级组装物中的先天免疫反应促进剂药物，
其中所述纳米级组装物是一种多组分载体组合物，其包括：(a)磷脂，
(b)载脂蛋白A-I(apoA-I)或apoA-I的肽模拟物，
其中所述纳米生物，在水相环境中，是直径尺寸约8nm至400nm之间的纳米盘(nanodisc)或纳米球，
其中所述纳米生物通过一种分子结构被功能化，该分子结构激活或结合病原体识别受体Dectin-1或NOD2，以在骨髓、血液和脾脏中的骨髓细胞及其干细胞和祖细胞中诱导训练免疫，其中激活或结合Dectin-1的分子结构包括，但不限于，β-葡聚糖及其衍生物，例如11-13葡萄糖低聚物，其中激活或结合NOD2的分子结构包括，但不限于，肽聚糖及其衍生物，例如胞壁酰二肽(MDP)以及胞壁酰三肽(MTP)，
其中所述纳米级组装物递送训练免疫-促进剂分子结构到患者的骨髓、血液和/或脾脏中的骨髓细胞、骨髓祖细胞或造血干细胞中，
以此在患者内促进由训练免疫引起的高反应性先天免疫反应，并治疗癌症或脓毒症。
在本发明的一个非限制性的优选实施方式中，纳米级组装物还包括(c)疏水基质，所述疏水基质包括一种或多种甘油三酯、脂肪酸酯、疏水聚合物、或甾醇酯、或其组合物。
在本发明的另一个非限制性的优选实施方式中，纳米级组装物也包括(c)疏水基质，其包括一种或多种甘油三酯、脂肪酸酯、疏水聚合物、或甾醇酯、或其组合物、以及(d)胆固醇。
提高检查点抑制剂的有效性
在本发明的另一个非限制性的优选实施方式中，本发明包括一种治疗患者的方法，所述方法通过诱导训练免疫来提高检查点抑制剂治疗的有效性：
(1)给予所述患者有效促进高反应性先天免疫反应的量的纳米生物组合物，
其中所述纳米生物组合物包括(i)纳米级组装物，具有(ii)包含在纳米级组装物中的先天免疫反应促进剂药物，
其中所述纳米级组装物是一种多组分载体组合物，其包括：(a)磷脂，和
(b)载脂蛋白A-I(apoA-I)或apoA-I的肽模拟物，
其中所述纳米生物，在水相环境中，是直径尺寸约8nm至400nm之间的纳米盘或纳米球，
其中所述纳米生物通过一种分子结构被功能化，该分子结构激活或结合病原体识别受体Dectin-1或NOD2，以在骨髓、血液和脾脏中的骨髓细胞及其干细胞和祖细胞中诱导训练免疫，其中激活或结合Dectin-1的分子结构包括，但不限于，β-葡聚糖及其衍生物，例如11-13葡萄糖低聚物，其中激活或结合NOD2的分子结构包括，但不限于，肽聚糖及其衍生物，例如胞壁酰二肽(MDP)以及胞壁酰三肽(MTP)，
其中所述纳米级组装物递送训练免疫-促进剂分子结构到患者的骨髓、血液和/或脾脏中的骨髓细胞、骨髓祖细胞或造血干细胞中，
以此在患者内促进由训练免疫引起的高反应性先天免疫反应；和
(2)给予所述患者检查点抑制剂；
以此促进由训练免疫引起的高反应性先天免疫反应，改善检查点抑制剂治疗的效果。
在本发明的一个非限制性的优选实施方式中，纳米级组装物还包括(c)疏水基质，其包括一种或多种甘油三酯、脂肪酸酯、疏水聚合物、或甾醇酯、或其组合物。
在本发明的另一个非限制性的优选实施例中，纳米级组装物还包括(c)疏水基质，所述疏水基质包括一种或多种甘油三酯、脂肪酸酯、疏水聚合物、或甾醇酯、或其组合物、以及(d)胆固醇。
促进长期肿瘤缓解
在本发明的一个非限制性的优选实施方式中，提供了一种在已经接受肿瘤诊断的病人中促进长期肿瘤缓解的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)对所述患者给予针对该患者的癌症的标准治疗方案，包括化疗、放射疗法、免疫疗法、及其治疗有效的组合
(2)给予所述患者有效促进高反应性先天免疫反应的量的纳米生物组合物，
其中所述纳米生物组合物包括(i)纳米级组装物，具有(ii)包含在纳米级组装物中的先天免疫反应促进剂药物，
其中所述纳米级组装物是一种多组分载体组合物，其包括：(a)磷脂，和，
(b)载脂蛋白A-I(apoA-I)或apoA-I的肽模拟物，
其中所述促进剂药物是一种分子结构，该分子结构激活或结合病原体识别受体Dectin-1或NOD2，其中激活或结合Dectin-1的分子结构包括，但不限于，β-葡聚糖及其衍生物，例如11-13葡萄糖低聚物，其中激活或结合NOD2的分子结构包括，但不限于，肽聚糖及其衍生物，例如胞壁酰二肽(MDP)以及胞壁酰三肽(MTP)，
其中所述纳米生物，在水相环境中，是直径尺寸约8nm至400nm之间的纳米盘或纳米球，
其中所述纳米级组装物递送促进剂药物到患者的在骨髓、血液和/或脾脏中的骨髓细胞、骨髓祖细胞或造血干细胞，
以此在患者内促进由训练免疫引起的高反应性先天免疫反应；和可选择地，
(3)对所述患者给予检查点抑制剂；
以此促进由训练免疫引起的高反应性先天免疫反应，改善检查点抑制剂治疗的效果。
在本发明的一个非限制性的优选实施例中，纳米级组装物还包括(c)疏水基质，其包括一种或多种甘油三酯、脂肪酸酯、疏水聚合物、或甾醇酯、或其组合物。
在本发明的另一个非限制性的优选实施方式中，纳米级组装物还包括(c)疏水基质，其包括一种或多种甘油三酯、脂肪酸酯、疏水聚合物、或甾醇酯、或其组合物、以及(d)胆固醇。
提供长期先天性训练免疫
在本发明的一个非限制性的优选实施方式中，提供了一种治疗受到缺陷的训练免疫(免疫麻痹)影响的患者的方法，以促进在所述患者中长期高反应性先天免疫反应，包括：
(1)给予所述患者有效促进高反应性先天免疫反应的量的纳米生物组合物，
其中所述纳米生物组合物包括(i)纳米级组装物，具有(ii)包含在纳米级组装物中的促进剂药物，
其中所述纳米级组装物是一种多组分载体组合物，其包括：(a)磷脂，和，
(b)apoA-I或apoA-I的肽模拟物，
其中，所述促进剂药物是一种分子结构，该分子结构激活或结合病原体识别受体Dectin-1或NOD2，以在骨髓、血液和脾脏中的骨髓细胞及其干细胞和祖细胞中诱导训练免疫，其中激活或结合Dectin-1的分子结构包括，但不限于，β-葡聚糖及其衍生物，例如11-13葡萄糖低聚物，其中激活或结合NOD2的分子结构包括，但不限于，肽聚糖及其衍生物，例如胞壁酰二肽(MDP)以及胞壁酰三肽(MTP)，
其中所述纳米生物，在水相环境中，自组装进入直径尺寸约8nm至400nm之间的纳米盘或纳米球中，
其中所述纳米级组装物递送药物到患者的骨髓、血液和/或脾脏中的骨髓细胞、骨髓祖细胞或造血干细胞中，
并以此在患者内促进高反应性先天免疫反应；和可选择地，
(2)在给予纳米生物组合物后，给予所述患者检查点抑制剂；
以此促进由训练免疫引起的高反应性先天免疫反应，改善检查点抑制剂治疗的效果。
在本发明的一个非限制性的优选实施方式中，纳米级组装物还包括(c)疏水基质，其包括一种或多种甘油三酯、脂肪酸酯、疏水聚合物、或甾醇酯、或其组合物。
在本发明的另一个非限制性的优选实施方式中，纳米级组装物还包括(c)疏水基质，其包括一种或多种甘油三酯、脂肪酸酯、疏水聚合物、或甾醇酯、或其组合物、以及(d)胆固醇。
体内药物积聚的PET成像
在本发明的一个非限制性的优选实施例中，提供了一种纳米生物组合物，用于对受到训练免疫影响的患者的骨髓、血液和/或脾脏中的纳米生物的积聚成像，所述纳米生物组合物包括：(i)纳米级组装物，具有(ii)包含在纳米级组装物中的促进剂药物，以及(iii)包含在纳米级组装物中的正电子放射断层造影术(PET)放射性同位素，
其中所述纳米级组装物是一种多组分载体组合物，其包括：(a)磷脂，和，
(b)apoA-I或apoA-I的肽模拟物，
其中所述促进剂药物是一种分子结构，该分子结构激活或结合病原体识别受体Dectin-1或NOD2，以在骨髓、血液和脾脏中的骨髓细胞及其干细胞和祖细胞中诱导训练免疫，其中激活或结合Dectin-1的分子结构包括，但不限于，β-葡聚糖及其衍生物，例如11-13葡萄糖低聚物，其中激活或结合NOD2的分子结构包括，但不限于，肽聚糖及其衍生物，例如胞壁酰二肽(MDP)以及胞壁酰三肽(MTP)，
其中所述PET成像放射性同位素选自89Zr、124I、64Cu、18F和86Y，和其中该PET成像放射性同位素使用合适的螯合剂络合纳米生物，以形成稳定的纳米生物-放射性同位素螯合物，
其中所述纳米生物，在水相环境中，自组装进入直径尺寸约8nm至400nm之间的纳米盘或纳米球中，
其中所述纳米级组装物递送稳定的纳米生物-放射性同位素螯合物到患者的骨髓、血液和/或脾脏中的骨髓细胞、骨髓祖细胞或造血干细胞中，
在本发明的一个非限制性的优选实施例中，纳米级组装物还包括(c)疏水基质，其包括一种或多种甘油三酯、脂肪酸酯、疏水聚合物、或甾醇酯、或其组合物。
在本发明的另一个非限制性的优选实施例中，纳米级组装物还包括(c)疏水基质，其包括一种或多种甘油三酯、脂肪酸酯、疏水聚合物、或甾醇酯、或其组合物、以及(d)胆固醇。
在本发明的一个非限制性的优选实施方式中，提供了一种正电子放射断层造影术(PET)方法，所述方法对受到训练免疫影响的患者的骨髓、血液和/或脾脏中的纳米生物的积聚进行成像，所述方法包括：(1)以有效促进高反应性先天免疫反应的量，对所述患者给予纳米生物组合物，
其中所述纳米生物组合物包括(i)纳米级组装物，具有(ii)包含在纳米级组装物中的促进剂药物，以及(iii)包含在纳米级组装物中的正电子放射断层造影术(PET)放射性同位素，
其中所述纳米级组装物是一种多组分载体组合物，其包括：(a)磷脂，和，
(b)apoA-I或apoA-I的肽模拟物，
其中，所述促进剂药物是一种分子结构，该分子结构激活或结合病原体识别受体Dectin-1或NOD2，以在骨髓、血液和脾脏中的骨髓细胞及其干细胞和祖细胞中诱导训练免疫，其中激活或结合Dectin-1的分子结构包括，但不限于，β-葡聚糖及其衍生物，例如11-13葡萄糖低聚物，其中激活或结合NOD2的分子结构包括，但不限于，肽聚糖及其衍生物，例如胞壁酰二肽(MDP)以及胞壁酰三肽(MTP)，
其中所述PET成像放射性同位素选自89Zr、124I、64Cu、18F和86Y，和其中该PET成像放射性同位素使用合适的螯合剂络合纳米生物，以形成稳定的纳米生物-放射性同位素螯合物，
其中所述纳米生物，在水相环境中，自组装进入直径尺寸约8nm至400nm之间的纳米盘或纳米球中，
其中所述纳米级组装物递送稳定的纳米生物-放射性同位素螯合物到患者的骨髓、血液和/或脾脏中的骨髓细胞、骨髓祖细胞或造血干细胞中，
和
(2)对患者进行PET成像，以可视化患者体内的骨髓、血液和/或脾脏中的稳定的纳米生物-放射性同位素螯合物的生物分布。
在本发明的一个非限制性的优选实施方式中，纳米级组装物还包括(c)疏水基质，所述疏水基质包括一种或多种甘油三酯、脂肪酸酯、疏水聚合物、或甾醇酯、或其组合物。
在本发明的另一个非限制性的优选实施方式中，纳米级组装物还包括(c)疏水基质，其包括一种或多种甘油三酯、脂肪酸酯、疏水聚合物、或甾醇酯、或其组合物、以及(d)胆固醇。
在一个非限制性的优选实施方式中，放射性药物成像的方法包括，对所述患者给予有纳米生物组合物的检查点抑制剂的附加步骤，
以此促进由训练免疫引起的高反应性先天免疫反应，改善检查点抑制剂治疗的效果。
在本发明的一个非限制性的优选实施方式中，提供了一种方法，其中高反应性先天免疫反应被促进至少7至30天。
在本发明的一个非限制性的优选实施方式中，提供了一种方法，其中高反应性先天免疫反应被促进至少30天到100天。
在本发明的一个非限制性的优选实施方式中，提供了一种方法，其中高反应性先天免疫反应被促进多于100天并长达3年。
在本发明的一个非限制性的优选实施方式中，提供了一种方法，其中受到训练免疫影响的患者患有膀胱、血管、骨、脑、乳腺、宫颈、胸、结肠、子宫内膜、食道、眼、头、肾、肝、淋巴结、肺、口、颈、卵巢、胰腺、前列腺、直肠、皮肤、胃、睾丸、喉咙、甲状腺、尿路上皮或子宫的癌症。
在本发明的一个非限制性的优选实施方式中，提供了一种方法，其中给予所述纳米生物组合物一次，和，其中，高反应性先天免疫反应被促进至少30天。
在本发明的一个非限制性的优选实施方式中，提供了一种方法，其中在多次给药方案的每一天中，每天至少给予一次纳米生物组合物，和，其中高反应性先天免疫反应被促进至少30天。
在本发明的一个非限制性的优选实施方式中，所述促进剂药物是MDP、MTP、β-葡聚糖、糖的聚合物、ox-LDL、BCG、细菌肽聚糖、病毒肽、激活或结合Dectin-1或NOD2的药物或化合物或聚合物、炎症体促进剂、代谢途径促进剂、和/或造血干细胞(HSC)、共同骨髓祖(CMP)、或骨髓细胞中的表观遗传通路促进剂。
在本发明的一个非限制性的优选实施方式中，提供了一种方法，其中所述训练免疫被定义为一种次级长期高反应，表现为代谢和表观遗传重排引起的细胞因子分泌增加，在纳米生物给药后进行再刺激，以在骨髓中产生骨髓细胞及其祖细胞和干细胞的原发性损伤。
在本发明的一个非限制性的优选实施方式中，提供了一种方法，其中所述训练免疫被定义为通过纳米生物给药后，高细胞因子产生的长期增长反应，以产生骨髓先天免疫细胞的二次刺激，骨髓先天免疫细胞在纳米生物给药后，被诱导产生原发性损伤，刺激在骨髓的这些细胞或其祖细胞及干细胞，并通过表观遗传、代谢和转录重排介导。
在本发明的非限制性的优选实施方式中，提供了一种方法，其中所述促进剂药物是NOD2受体促进剂、mTOR促进剂、核糖体蛋白S6激酶β-1(S6K1)促进剂、组蛋白H3K27脱甲基酶促进剂、BET溴区结构域阻断促进剂(BET bromodomain blockade promoter)、组蛋白甲基转移酶和乙酰基转移酶促进剂、DNA甲基转移酶和乙酰基转移酶促进剂、炎症小体促进剂、丝氨酸/苏氨酸激酶Akt促进剂、缺氧诱导因子1-α促进剂，也称为HIF-l-α，组蛋白和DNA脱甲基酶和脱乙酰酶抑制剂、以及其中一种或多种的混合物。
在本发明的一个非限制性的优选实施方式中，提供了一种方法，其中所述患者患有严重的脓毒症或处于感染性休克中。
在本发明的一个非限制性的优选实施方式中，提供了一种方法，其中所述患者患有与肺部、腹部、肾脏或血液循环系统(bloodstream)的细菌性、病毒性或真菌性感染相关的脓毒症。
在本发明的一个非限制性的优选实施方式中，提供了一种方法，其中治疗方案包括给予患者所述纳米生物组合物两次或更多次剂量，以在骨髓、血液和/或脾脏中的骨髓细胞、骨髓祖细胞和造血干细胞中产生药物积聚。
在本发明的一个非限制性的优选实施方式中，提供了一种方法，包括与纳米生物组合物一起共同给予癌症药物而作为联合疗法。
纳米生物组合物
在本发明的一个非限制性优选实施方式中，提供了一种用于促进训练免疫的纳米生物组合物，包括：
(i)纳米级组装物，具有(ii)包含在纳米级组装物中的促进剂药物，
其中所述(i)纳米级组装物是一种多组分载体组合物，其包括：
(a)磷脂，
(b)apoA-I或apoA-I的肽模拟物，
其中所述促进剂药物是一种分子结构，该分子结构激活或结合病原体识别受体Dectin-1或NOD2，以在骨髓、血液和脾脏中的骨髓细胞及其干细胞和祖细胞中诱导训练免疫，其中激活或结合Dectin-1的分子结构包括，但不限于，β-葡聚糖及其衍生物，例如11-13葡萄糖低聚物，其中激活或结合NOD2的分子结构包括，但不限于，肽聚糖及其衍生物，例如胞壁酰二肽(MDP)以及胞壁酰三肽(MTP)，
其中所述纳米生物，在水相环境中，自组装进入直径尺寸约8nm至400nm之间的纳米盘或纳米球中，
其中所述纳米级组装物递送药物到患者的骨髓、血液和/或脾脏中的骨髓细胞、骨髓祖细胞或造血干细胞中，
并以此在患者内促进高反应性先天免疫反应。
在本发明的一个非限制性的优选实施方式中，纳米级组装物还包括(c)疏水基质，其包括一种或多种甘油三酯、脂肪酸酯、疏水聚合物、或甾醇酯、或其组合物。
在本发明的另一个非限制性的优选实施方式中，纳米级组装物还包括(c)疏水基质，其包括一种或多种甘油三酯、脂肪酸酯、疏水聚合物、或甾醇酯、或其组合物、以及(d)胆固醇。
在本发明的一个非限制性的优选实施方式中，提供了一种用于促进训练免疫的纳米生物组合物，其中所述促进剂药物是MDP、MTP、β-葡聚糖、糖的聚合物、ox-LDL、BCG、细菌肽聚糖、病毒肽、Dectin-1、炎症小体促进剂、代谢途径促进剂、和/或造血干细胞(HSC)、共同骨髓祖细胞(CMP)、或骨髓细胞中的表观遗传途径促进剂。
在本发明的非限制性的优选实施方式中，提供了一种用于促进训练免疫的纳米生物组合物，其中所述促进剂药物是NOD2受体促进剂、mTOR促进剂、核糖体蛋白S6激酶β-1(S6K1)促进剂、HMG-CoA还原酶促进剂(他汀类)、组蛋白H3K27脱甲基酶促进剂、BET溴区结构域阻断促进剂、组蛋白甲基转移酶和乙酰基转移酶促进剂、DNA甲基转移酶和乙酰基转移酶促进剂、炎症小体促进剂、丝氨酸/苏氨酸激酶Akt促进剂、缺氧诱导因子1-α促进剂，也称为HIF-l-α，以及其中一种或多种的混合物。
放射性标记的纳米生物
在本发明的一个非限制性的优选实施方式中，提供了一种纳米生物组合物，用于在骨髓、血液和脾脏中积聚成像，所述纳米生物组合物包括：
(i)纳米级组装物，具有(ii)包含在纳米级组装物中的促进剂药物，以及(iii)包含在纳米级组装物中的正电子放射断层造影术(PET)放射性同位素，
其中所述纳米级组装物是一种多组分载体组合物，其包括：(a)磷脂，和，
(b)apoA-I或apoA-I的肽模拟物，
其中，所述促进剂药物是一种分子结构，该分子结构激活或结合病原体识别受体Dectin-1或NOD2，以在骨髓、血液和脾脏中的骨髓细胞及其干细胞和祖细胞中诱导训练免疫，其中激活或结合Dectin-1的分子结构包括，但不限于，β-葡聚糖及其衍生物，例如11-13葡萄糖低聚物，其中激活或结合NOD2的分子结构包括，但不限于，肽聚糖及其衍生物，例如胞壁酰二肽(MDP)以及胞壁酰三肽(MTP)，
其中所述PET成像放射性同位素选自89Zr、124I、64Cu、18F和86Y，和其中该PET成像放射性同位素使用合适的螯合剂络合纳米生物，以形成稳定的纳米生物-放射性同位素螯合物，
其中所述纳米生物，在水相环境中，自组装进入直径尺寸约8nm至400nm之间的纳米盘或纳米球中，
其中所述纳米级组装物递送稳定的纳米生物-放射性同位素螯合物到患者的骨髓、血液和/或脾脏中的骨髓细胞、骨髓祖细胞或造血干细胞中。
在本发明的一个非限制性的优选实施方式中，纳米级组装物还包括(c)疏水基质，所述疏水基质包括一种或多种甘油三酯、脂肪酸酯、疏水聚合物、或甾醇酯、或其组合物。
在本发明的另一个非限制性的优选实施方式中，纳米级组装物还包括(c)疏水基质，所述疏水基质包括一种或多种甘油三酯、脂肪酸酯、疏水聚合物、或甾醇酯、或其组合物、以及(d)胆固醇。
制备方法
在本发明的一个非限制性优选实施方式中，提供了一种用于制备抑制训练免疫的纳米生物组合物的方法，所述方法包括步骤：
将促进剂药物包含在纳米级组装物中；
其中所述纳米级组装物是一种多组分载体组合物，其包括：(a)磷脂，和，
(b)apoA-I或apoA-I的肽模拟物，
其中，所述促进剂药物是一种分子结构，该分子结构激活或结合病原体识别受体Dectin-1或NOD2，以在骨髓中的骨髓细胞及其干细胞和祖细胞中诱导训练免疫，
其中所述纳米生物，在水相环境中，自组装进入直径尺寸约8nm至400nm之间的纳米盘或纳米球中，
其中所述纳米级组装物递送药物到患者的骨髓、血液和/或脾脏中的骨髓细胞、骨髓祖细胞或造血干细胞中，
并以此在患者内促进高反应性先天免疫反应。
在本发明的一个非限制性的优选实施方式中，纳米级组装物还包括(c)疏水基质，所述疏水基质包括一种或多种甘油三酯、脂肪酸酯、疏水聚合物、或甾醇酯、或其组合物。
在本发明的另一个非限制性的优选实施方式中，纳米级组装物还包括(c)疏水基质，所述疏水基质包括一种或多种甘油三酯、脂肪酸酯、疏水聚合物、或甾醇酯、或其组合物、以及(d)胆固醇。
在本发明的一个非限制性的优选实施方式中，纳米级组装物还包括结合到放射性同位素螯合剂的磷脂。
在本发明的一个非限制性的优选实施方式中，提供了一种用于制备抑制训练免疫的纳米生物组合物的方法，其中促进剂药物是MDP、MTP、β-葡聚糖、糖的聚合物、ox-LDL、BCG、细菌肽聚糖、病毒肽、Dectin-1、炎症小体促进剂、代谢途径促进剂、和/或造血干细胞(HSC)、共同骨髓祖细胞(CMP)、或骨髓细胞中的表观遗传途径促进剂。
在本发明的一个非限制性的优选实施方式中，提供了一种用于制备抑制训练免疫的纳米生物组合物的方法，其中使用微流体、放大微流化技术(scale-up microfluidizertechnology)、超声处理、有机相到水相的输注(organic-to-aqueous infusion)或脂质膜水化(lipid film hydration.)来组合组装物。
附图说明
为了说明本发明，在附图中描述了本发明的特定实施例。然而，本发明不限于附图中描述的实施例的精确布置和设备。
图1是显示人单核细胞的细胞因子IL-6(图1A)和TNF-α(图1B)浓度的图，该人单核细胞暴露于训练免疫诱导药物(BCG、MDP或MTP-HDL)24小时，此后，再将细胞洗涤并静置5天，然后用LPS进行再刺激。增加的细胞因子产生显示了MTP-HDL诱导训练免疫的能力。
图2显示了小鼠的最大密度投影(MIP)PET图像，该小鼠被静脉注射89Zr标记的MTP-HDL。在骨髓中发现高摄取。
图3是获自C57BL/6小鼠的剂量-反应曲线的图，所述小鼠在其腹部接种B16F10肿瘤细胞以生长黑色素瘤。该动物被以不同次数(1、2或3次)用不同剂量的MTP-HDL(胞壁酰三肽功能化HDL纳米生物)处理。描述了肿瘤体积与肿瘤细胞接种后时间的函数关系以及与不同治疗方法的函数关系。
图4是骨髓中每毫升单核细胞的图，显示了3次静脉MDP-HDL注射后几天vs.对照的单核细胞数量。
图5是显示了对照vs.MDP-HDL的骨髓FDG-PET成像结果的图，FDG的摄取、糖类似物以标准摄取值(SUV)表示。
图6是PD-1抑制剂、MTP-HDL以及PD-1抑制剂和MTP-HDL治疗组合的比较图，显示了肿瘤体积对比肿瘤接种后天数。肿瘤接种后第8、11、13天静脉给予MTP-HDL。在第11天和14天给予检查点抑制剂药物。
图7是CTLA-4抑制剂、MTP-HDL以及CTLA-4和MTP-HDL联合的治疗组合比较图，显示了肿瘤体积对比肿瘤接种后天数。肿瘤接种后第8、11、13天静脉给予MTP-HDL。在第11天和14天给予检查点抑制剂药物。
图8是PD-1+CTLA-4抑制剂、MTP-HDL以及PD-1+CTLA-4抑制剂和MTP-HDL治疗组合的比较图，显示了肿瘤体积对比肿瘤接种后天数。肿瘤接种后第8、11、13天静脉给予MTP-HDL。在第11天和14天给予检查点抑制剂药物。
图9是PD-1+CTLA-4抑制剂、MTP-HDL以及PD-1+CTLA-4抑制剂和MTP-HDL治疗组合的比较图，其中继续MTP-HDL治疗，显示了肿瘤体积对比肿瘤接种后天数。肿瘤接种后第8、11、13、15、17天静脉给予MTP-HDL。在第11天和14天给予检查点抑制剂药物。
图10是第三次MTP-HDL注射后24小时时的流式细胞仪结果图，并显示了存活的CD11b+骨髓细胞的百分比vs.各种治疗以及PBS对照。
图11是第三次MTP-HDL注射后24小时时的流式细胞仪结果图，并显示了存活的骨髓单核细胞的百分比vs.各种治疗以及PBS对照。
图12是第三次MTP-HDL注射后24小时时的流式细胞仪结果图。图12A显示了存活的CD11b+血细胞的百分比vs.各种治疗以及PBS对照。图12B显示了存活的CD11b+脾细胞的百分比vs.各种治疗以及PBS对照。
图13是第三次MTP-HDL注射后24小时时的流式细胞仪结果图。图13A显示了存活的血单核细胞的百分比vs.各种治疗以及PBS对照的。图13B显示了存活的脾单核细胞的百分比vs.各种治疗以及PBS对照。
图14是在表观遗传、细胞和系统水平上，控制训练免疫的过程原理图的图示。最初确定的“训练剂(trainer)”包括真菌的PAMPβ-葡聚糖和细菌的PAMP肽聚糖/BCG。训练免疫是表观遗传调节的，在再刺激时导致更强的反应。骨髓祖细胞可以受到刺激，在很长时间段里产生“训练的”骨髓细胞，以此为持久治疗干预提供强力框架。
图15是一个细胞的图示，显示了训练免疫在细胞水平上受到细菌、真菌和新陈代谢途径的调节，导致了在细胞因子分泌的基础上的表观遗传修饰。
图16是过程的概述的图示，并显示了抑制(绿色)或促进(红色)训练免疫的骨髓亲和纳米材料(bone marrow-avid nanomaterial)可用于启动免疫系统并治疗各种病症，范围从心血管疾病及其临床后果、自身免疫紊乱、到脓毒症和感染，以及癌症。
图17是通过促进训练免疫，实现启动对免疫检查点阻断疗法的免疫系统敏感性的图示。
图18是放射性同位素标记方法的图像说明。
图19是使用纳米生物传递的放射性同位素的PET成像的图像说明，并显示了鼠、兔子、猴子和猪模型的骨髓和脾脏中的纳米生物积聚。
具体实施方式
本发明涉及用于提高训练免疫的纳米生物组合物、制造这种纳米生物的方法、将药物包含在所述纳米生物中的方法、以及将药物与功能化连接部分(如磷脂、脂肪链、甾醇)结合的前体药物制剂。
炎症是由先天免疫细胞触发的，作为抵抗组织损伤的一种防御机制。一种免疫记忆的古老机制，称为训练免疫，也称为先天免疫记忆，其定义为利用骨髓先天免疫细胞二次刺激进行再刺激后的长期增长反应(例如，高细胞因子产生)，通过刺激骨髓中的这些细胞或其祖细胞和干细胞的原发性损伤而诱导，并由表观遗传、代谢和转录重排介导。
训练免疫被定义为次级长期高反应，表现为由代谢和表观遗传重排引起的细胞因子分泌增加，以在骨髓、血液和/或脾脏中的骨髓细胞、骨髓祖细胞或造血干细胞的原发性损伤后进行再刺激。
本发明在一个优选实施例中涉及一种骨髓细胞特异性纳米免疫疗法，该疗法基于递送携带或具有包含的刺激物的纳米生物，该刺激物在训练免疫基础上促进表观遗传和代谢修饰。本发明涉及通过促进训练免疫，治疗患有癌症的患者的治疗性纳米生物组合物和方法，其是一种长期增长高反应，其是通过原发性损伤诱发骨髓、脾脏和血液的骨髓细胞及其干细胞和祖细胞的代谢和表观遗传重排的结果，且其特征是利用一个或多个的二次刺激进行再刺激后的细胞因子排泄增加。
定义
治疗(treating)和治疗(treatment)
状态、紊乱或病症的“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”一词包括：
(1)预防或延缓在人身上发展的该状态、紊乱或病症的临床症状的出现，该人可能患有或易患有该状态、紊乱或病症，但其尚未经历或显示出该状态、紊乱或病症的临床症状；或
(2)抑制该状态、紊乱或病症，即阻止、减少或延缓疾病的发展或其复发(在维持治疗的情况下)或其至少一种临床症状、迹象、或检测；或
(3)减轻疾病，即造成该状态、紊乱或病症或其临床、亚临床症状或迹象中至少一项的消退。
纳米生物
术语“纳米生物”指的是(i)纳米级组装物，具有(ii)包含在纳米级组装物中的促进剂药物，其中所述药物是炎症小体促进剂、代谢途径促进剂、和/或造血干细胞(HSC)、共同骨髓祖(CMP)、或骨髓细胞中的表观遗传途径促进剂。
纳米级组装物
术语“纳米级组装物”(NA)指的是一种用于携带活性有效载荷(例如，药物)的多组分载体组合物。所述纳米级组装物包括亚成分：(a)磷脂，(b)载脂蛋白A-I(apoA-I)或apoA-I的肽模拟物，和可选地(c)疏水基质。该纳米级组装物还可以可选地包括(d)胆固醇。
术语“纳米级组装物”(NA)也指的是一种多组分载体组合物，其包括：(a)磷脂，(b)载脂蛋白A-I(apoA-I)或apoA-I的肽模拟物，以及(c)疏水基质，所述疏水基质包括一种或多种甘油三酯、脂肪酸酯、疏水聚合物、以及甾醇酯。所述纳米级组装物还可以可选地包括(d)胆固醇。
磷脂
术语“磷脂”指的是一种两亲性化合物，其由两个疏水脂肪酸“尾”和一个由一个磷酸基组成的亲水“头”而组成。两种成分通过甘油分子连接在一起。该磷酸基可以用简单的有机分子(如胆碱、乙醇胺或丝氨酸)来修饰。
胆碱指的是一种必需的、生物活性营养素，化学式为R-(CH2)2-N-(CH2)4。当磷酸部分为R-时，其被称为磷酸胆碱。
合适的磷脂的实例包括，不限于，磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、鞘磷脂或其他神经酰胺，以及含磷脂的油，例如卵磷脂油。可以使用磷脂的组合、或磷脂与其他物质的混合物。
可用于本组合物的磷脂的非限制性实例包括磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酸/酯(PA)以及溶血磷脂酰胆碱。
具体实例包括：DDPC CAS-3436-44-0 1,2-二癸酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、DEPA-NA CAS-80724-31-8 1,2--二芥酰基-sn-甘油-3-磷酸盐(钠盐)、DEPC CAS-56649-39-9 1,2-二芥酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、DEPE CAS-988-07-2 1,2-二芥酰基-sn-甘油-3-磷脂乙醇胺、DEPG-NA 1,2-二芥酰基-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(1-甘油…)(钠盐)、DLOPC CAS-998-06-1 1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、DLPA-NA 1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸盐(钠盐)、DLPC CAS-18194-25-7 1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、DLPE 1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、DLPG-NA 1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(1-甘油…)(钠盐)、DLPG-NH4 1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(1-甘油…)(铵盐)、DLPS-NA 1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸(钠盐)、DMPA-NA CAS-80724-3 1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸盐(钠盐)、DMPC CAS-18194-24-6 1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、DMPE CAS-988-07-2 1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、DMPG-NACAS-67232-80-8 1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(1-甘油…)(钠盐)、DMPG-NH41,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(1-甘油…)(铵盐)、DMPG-NH4/NA 1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(1-甘油…)(钠盐/铵盐)、DMPS-NA 1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸(钠盐)、DOPA-NA 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸盐(钠盐)、DOPC CAS-4235-95-4 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、DOPE CAS-4004-5-1 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、DOPG-NA CAS-62700-69-0 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(1-甘油…)(钠盐)、DOPS-NA CAS-70614-14-1 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸(钠盐)、DPPA-NA CAS-71065-87-7 1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸盐(钠盐)、DPPC CAS-63-89-81,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、DPPE CAS-923-61-5 1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、DPPG-NA CAS-67232-81-9 1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(1-甘油…)(钠盐)、DPPG-NH4 CAS-73548-70-6 1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(1-甘油…)(铵盐)、DPPS-NA 1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸(钠盐)、DSPA-NA CAS-108321-18-21,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸盐(钠盐)、DSPC CAS-816-94-4 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、DSPE CAS-1069-79-0 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、DSPG-NA CAS-67232-82-0 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(1-甘油…)(钠盐)、DSPG-NH4 CAS-108347-80-4 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(1-甘油…)(铵盐)、DSPS-NA 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸(钠盐)、EPC卵磷脂(Egg-PC)、HEPC氢化卵磷脂(Hydrogenated Egg PC)、HSPC氢化大豆磷脂(Hydrogenated Soy PC)、LYSOPCMYRISTIC CAS-18194-24-6 1-肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、LYSOPC PALMITIC CAS-17364-16-8 1-棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、LYSOPC STEARIC CAS-19420-57-6 1-硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、乳鞘磷脂、MPPC 1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、MSPC 1-肉豆蔻酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、PMPC 1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、POPC CAS-26853-31-6 1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、POPE 1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、POPG-NA CAS-81490-05-31-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(1-甘油…)(钠盐)、PSPC 1-棕榈酰基-2-硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、SMPC 1-硬脂酰基-2-肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、SOPC 1-硬脂酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、SPPC 1-硬脂酰基-2-棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱。
在一些优选实施例中，磷脂的特定非限制性实例包括：二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、大豆卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)、二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(DMPS)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)、二棕榈酰鞘磷脂(DPSP)、二硬脂酰鞘磷脂(DSSP)及其混合物。
在某一实施例中，当本组合物包括(基本由其组成或由其组成)两种或更多种类型的磷脂时，两种类型的磷脂的重量比范围可以从约1：10至约10：1、从约2：1至约4：1、从约1：1至约5：1、从约2：1至约5：1、从约6：1至约10：1、从约7：1至约10：1、从约8：1至约10：1、从约7：1至约9：1、或从约8：1至约9：1。例如，两种类型的磷脂的重量比可以为约1：10、约1：9、约1：8、约1：7、约1：6、约1：5、约1：4、约1：3、约1：2、约1：1、约2：1、约3：1、约4：1、约5：1、约6：1、约7：1、约8：1、约9：1或约10：1。
在一个实施例中，本纳米级组装物的(a)磷脂包括(基本由其组成或由其组成)双链二酰基磷脂和单链酰基-磷脂/溶血脂(lysolipid)的混合物。
在一个实施例中，(a)磷脂是磷脂与溶血脂的混合物，是(DMPC)、和(MHPC)。
DMPC与MHPC的重量比范围可以从约1：10至约10：1、从约2：1至约4：1、从约1：1至约5：1、从约2：1至约5：1、从约6：1至约10：1、从约7：1至约10：1、从约8：1至约10：1、从约7：1至约9：1、或者从约8：1至约9：1。DMPC至MHPC的重量比可以为约1：10、约1：9、约1：8、约1：7、约1：6、约1：5、约1：4、约1：3、约1：2、约1：1、约2：1、约3：1、约4：1、约5：1、约6：1、约7：1、约8：1、约9：1、或约10：1。
在一个实施例中，(a)磷脂是磷脂与溶血脂的混合物，是(POPC)和(PHPC)。
POPC与PHPC的重量比范围可以从约1：10至约10：1、从2：1至约4：1、从约1：1至约5：1、从约2：1至约5：1、从约6：1至约10：1、从约7：1至约10：1、从约8：1至约10：1、从约7：1至约9：1、或从约8：1至约9：1。POPC与PHPC的重量比可以为约1：10、约1：9、约1：8、约1：7、约1：6、约1：5、约1：4、约1：3、约1：2、约1：1、约2：1、约3：1、约4：1、约5：1、约6：1、约7：1、约8：1、约9：1或约10：1。
要注意的是，在链长从C4到C30、饱和或不饱和、顺式或反式、未被取代的或被1-6个侧链取代的、以及添加或不添加溶血脂的所有磷脂被考虑用于本文描述的纳米级组装物或纳米颗粒/纳米生物中。
此外，也考虑了其他合成变体和具有其他磷脂头基的变体。
“溶血脂”，如本文所使用，包括(酰基，单链)，例如在非限制性实施例中的l-肉豆蔻酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(MHPC)、l-棕榈酰基-2--十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(PHPC)和1-硬脂酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(SHPC)。
载脂蛋白A-I(apoA-I)(ApoA1)
术语“载脂蛋白A-I”或“apoA-I”，也为“载脂蛋白A1”或“ApoA1”，指的是通过人类的APOA1基因编码的蛋白质，且本文所使用的还包括apoA-I的肽模拟物。载脂蛋白A1(apoA-I)是在纳米级组装物中的亚成分(b)
疏水基质
术语“疏水基质”指的是纳米生物的核心或填充物或结构修饰剂。结构修饰包括(1)使用疏水基质，以增加或设计仅由(a)磷脂和(b)apoA-I制成的纳米级组装物的粒度，(2)增加或降低(设计)纳米级组装物颗粒的刚度，(3)增加或降低(设计)纳米级组装物颗粒的粘度，并(4)增加或降低(设计)纳米级组装物颗粒的生物分布特性。
纳米级组装物粒度、刚度、粘度和/或生物分布，可以通过加入的疏水分子的数量和类型来调节。在非限制性实例中，仅由(a)磷脂和(b)apoA-I制成的纳米级组装物可以有10nm-50nm的直径。添加(c)疏水基质分子，如甘油三酯，将纳米级组装物从最小的10nm膨胀到至少30nm。在本发明的范围内，添加更多的甘油三酯可以将纳米级组装物的直径增加到至少50nm、至少75nm、至少100nm、至少150nm、至少200nm、至少300nm和最大400nm。
生产方法可以制备统一尺寸的纳米级组装物颗粒，或通过不过滤或通过制备一系列不同尺寸的纳米组装颗粒并在后期生产步骤中将它们再组合，制备组装非统一尺寸的纳米级组装物颗粒混合物。纳米级组装物颗粒的尺寸越大，可以包含的药物就越多。然而，更大的尺寸，例如>120nm，可以限制、阻止或减慢纳米级组装物颗粒在正在被治疗的患者的组织中的扩散。更小的纳米级组装物颗粒不能在每个颗粒中容纳同样多的药物，但能够进入骨髓、血液或脾脏，或受训练免疫影响的局部组织，例如移植物及周围组织、动脉粥样硬化斑块等等(生物分布)。
在一次给药或方案中，使用非统一纳米颗粒尺寸的混合物可以在先天免疫高反应中产生一个即时下降，并同时在先天免疫高反应中产生一个可以持续数天、数周、数月和数年的持续的、长期的下降，其中纳米生物已经逆转、修饰或再调节造血干细胞(HSC)、共同骨髓祖(CMP)、以及骨髓细胞(如单核细胞、巨噬细胞以及其他短寿命的循环细胞)的代谢、表观遗传和炎症小体的途径。
添加其他(c)疏水基质分子，例如胆固醇、脂肪酸酯、疏水聚合物、甾醇酯和不同类型的甘油三酯或其特定混合物，可以进一步设计纳米级组装物，以强调特定目的的特定期望特性。尺寸、刚度和粘度会影响承载和生物分布。
通过非限制性实例的方式，最大承载能力可以由纳米级组装物颗粒内部的体积除以载药球体的体积来决定。
颗粒：假定一个具有2.2nm-3.0nm磷脂壁的100nm球形颗粒，其具有内部直径为94nm的体积(大)@4/3π(r)3。
药物：假定刺激物在12×12×35埃或为1.2×1.2×3.5nm的圆柱，其中，多个药物分子圆柱体，例如七或就九个，等，可以假定一个3.5nm直径球体，其具有半径为1.75nm的容积(小)@4/3π(r)3。
最大承载能力(计算)：约487k 3.5nm球体在一个100nm的颗粒内。
生物学相关的脂质包括脂肪酰基类、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、甾醇脂、孕烯醇酮脂、糖脂和聚酮。超过42,000多种脂质的完整清单可以在https://www.lipidmaps.org.中获得。
甘油三酯
术语“甘油三酯”及类似术语指一种源自于甘油和三个脂肪酸的酯。本说明书中用来描述甘油三酯的符号与下面用来描述脂肪酸的符号相同。甘油三酯可以包括甘油与和如下脂肪酸的任意组合：C18：l、C14：l、C16：1、多不饱和的和饱和的(脂肪酸)。脂肪酸可以以任何顺序附着在甘油分子上，例如，任何脂肪酸都可以与甘油分子的任何羟基基团反应以形成酯键。C18：1脂肪酸的甘油三酯简单地指甘油三酯的脂肪酸成分来源于或基于C18：1脂肪酸。也就是说，C18：1甘油三酯是甘油和三个各具有18个碳原子的脂肪酸的酯，每个脂肪酸都有一个双键。类似地，C14：1甘油三酯是甘油和三个各具有14个碳原子的脂肪酸的酯，每个脂肪酸都有一个双键。同样，C16：1甘油三酯是甘油和三个各具有16个碳原子的脂肪酸的酯，每个脂肪酸都有一个双键。
C18：1脂肪酸的甘油三酯与C14：1和/或C16：1脂肪酸的结合指的是：(a)C18：1甘油三酯与C14：1甘油三酯或C16：1甘油三酯或两者混合；或(b)甘油三酯的至少一个脂肪酸成分来源于或基于C18：1脂肪酸，而其他两个来源于或基于C14：1脂肪酸和/或C16:1脂肪酸。
脂肪酸
术语“脂肪酸”及类似术语指的是具有饱和或不饱和的长脂肪族尾巴的羧酸。脂肪酸可以酯化成磷脂和甘油三酯。本文所使用的，脂肪酸链长包括从C4到C30、饱和或不饱和、顺式或反式、未取代或被1-6个侧链取代的。不饱和脂肪酸在碳原子之间有一个或多个双键。饱和脂肪酸不含任何双键。本说明书中用于描述脂肪酸的符号包括用于碳原子的大写字母“C”，后跟一个描述脂肪酸中碳原子数的数字，后跟一个冒号和另一个代表该脂肪酸中双键数目的数字。例如，C16：l表示具有一个双键的16个碳原子的脂肪酸，例如棕榈油酸。在这个符号中，冒号后面的数字既不指定脂肪酸中双键的位置，也不指定与双键的碳原子结合的氢原子是否为彼此顺式的。此符号的其他实例包括C18：0(硬脂酸)、C18：1(油酸)、C18：2(亚油酸)、C18：3(a-亚麻酸)以及C20：4(花生四烯酸)。
甾醇和甾醇酯
术语“甾醇”，例如，但不限于胆固醇，也可以用在本文所描述的方法和化合物中。甾醇是动物或植物的甾体，其在C-3处仅含一个羟基而不含其他官能团。一般来说，甾醇含27到30个碳原子，并且在5/6位以及偶尔在7/8、8/9或其他位中含有一个双键。除了这些不饱和的种类外，其他甾醇是通过氢化反应获得的饱和化合物。一个合适的动物甾醇的实例是胆固醇。合适的植物甾醇的典型实例，从应用角度看优选的是，麦角甾醇、菜籽甾醇、豆甾醇、芸苔甾醇以及，优选地，谷甾醇或谷甾烷醇以及，更具体地，是β-谷甾醇或β-谷甾烷醇。除了提到的植物甾醇外，优选使用它们的酯。酯的酸成分可以回到对应于式(I)的羧酸：
R1CO—OH(I)
其中R1CO是含有2至30个碳原子和0和/或1、2或3个双键的脂肪族、线状或支链酰基基团。典型的实例为乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、辛酸、2-乙基己酸、癸酸、月桂酸、异十三烷酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、异硬脂酸、油酸、反油酸、岩芹酸、亚油酸、共轭亚油酸(CLA)、亚麻酸、桐油酸、花生酸、鳕油酸、山嵛酸、芥酸。
疏水聚合物
用于组成基质的疏水聚合物可以选自被批准用于人类使用(即，生物相容性以及FDA批准)的聚合物组。这样的聚合物包括，例如，但不限于以下聚合物、这种聚合物的衍生物、共聚物、嵌段共聚物、支化聚合物、以及聚合物共混物：聚烯烃二羧酸酯(polyalkenedicarboxlate)、聚酸酐、聚(天冬氨酸)、聚酰胺、聚丁二酸丁二酯(PBS)、聚丁二酸丁二酯-共己二酸(PBSA)、聚(ε-己内酯)(PCL)、聚碳酸酯，包括聚亚烷基碳酸酯(PC)、聚酯，包括脂肪族聚酯以及聚酯酰胺、聚丁二酸乙二酯(PES)、聚乙交酯(PGA)、聚亚胺和聚亚烷基亚胺(PI、PAI)、聚乳酸(PLA、PLLA、PDLLA)、聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、聚(l-赖氨酸)、聚甲基丙烯酸酯、多肽、聚原酸酯、聚对二氧环己酮(poly-p-dioxanones，PPDO)、(疏水)改性多糖、聚硅氧烷和聚烷基硅氧烷、聚脲、聚氨酯和聚乙烯醇。
前药
如本文所用的并除非另有说明，术语“前药”指的是一种化合物的衍生物，其可以在生物条件下(体外或体内)水解、氧化或发生其他反应以提供该化合物。前药的实例包括，但不限于，本发明的纳米生物组合物的衍生物，包括可生物水解的部分，例如可生物水解的酰胺、可生物水解的酯、可生物水解的氨基甲酸酯、可生物水解的碳酸盐、可生物水解的脲、以及可生物水解的磷酸盐类似物。前药的其他实例包括本发明的纳米生物组合物的衍生物，其包括—NO、—NO2、—ONO、或—ONO2部分。
前药通常可以用众所周知的方法制备，例如在1Burger's Medicinal Chemistiyand Drug Discovery,172-178,949-982(Manfred E.Wolffed.,5th ed.1995)，和Designof Prodrugs(H.Bundgaard ed.,Elselvier,N.Y.1985)。
增加药物与纳米生物的兼容性可以使用下述策略实现。药物共价偶联到疏水部分，如胆固醇。如果需要，前药(制备)方法可以通过不稳定的结合来实现，产生例如一种可酶解分裂的前药。
随后，衍生药物被包含在用于体内药物递送的脂基纳米生物中。药物衍生化的主要目的是形成一种与母体药物相比，疏水性更高的药物结合物(drug-conjugate)。因此，与母体药物相比，药物结合物在纳米生物中的保留被提高了，从而导致减少了泄漏并改善了对靶组织的递送。在该前药策略的情况下，不同类型的疏水部分可能造成不同的体内分裂率，从而影响生成活性药物的速度，且由此影响纳米生物-药物结构的整体治疗效果。
可生物水解
如本文中所使用，且除非另有说明，术语“可生物水解的酰胺”、“可生物水解的酯”、“可生物水解的氨基甲酸酯”“可生物水解的碳酸盐”、“可生物水解的脲”、“生物水解的磷酸盐”分别地指的是化合物的酰胺、酯、氨基甲酸酯、碳酸盐、脲或磷酸盐，其：1)不受化合物的生物活性干扰，但可以赋予该化合物在体内中的有利性质，例如摄取、作用持续时间或起效时间；或2)为生物惰性，但在体内转化为生物活性化合物。可生物水解的酯的实例包括，但不限于，低级烷基酯、低级酰氧基烷基酯(如乙酰氧基甲基酯、乙酰氧基乙基酯、氨基羰基氧基甲基酯、新戊酰氧基甲基酯和新戊酰氧基乙基的酯)、内酯(如酞酸酯和硫代酞酸酯)、低级烷氧基酰氧基烷基酯(如甲氧羰基-氧甲基酯、乙氧基羰基氧乙基酯、以及异丙氧基羰基氧乙基酯)、烷氧烷基酯、胆碱酯和酰氨烷基酯(如乙酰氨甲酯)。可生物水解的酰胺的实例包括，但不限于，低烷基酰胺、α-氨基酸酰胺、烷氧基酰胺和烷基氨基烷基羰基酰胺。可生物水解的氨基甲酸酯的实例包括，但不限于，低烷基胺、取代的乙二胺、氨基酸、羟烷基胺、杂环胺以及杂芳香环胺、以及聚醚胺。
制备纳米级组装物的方法
方法如下所述，并且有这些方法有关的变体。
方法1.
A.磷脂、(前)药物以及可选的甘油三酯或聚合物被溶解(通常在氯仿、乙醇或乙腈中)。然后，该溶液在真空下蒸发形成这些成分的膜。随后，加入缓冲溶液以使该膜水化并产生囊泡悬浮液。
B.磷脂、(前)药物以及可选的甘油三酯或聚合物被溶解(通常在氯仿、乙醇或乙腈中)。这个溶液在搅拌条件下被注入-或逐滴添加-到温和地被加热的缓冲溶液中，直到有机溶剂完全蒸发，产生囊泡悬浮液。
对于囊泡悬浮液，用A或B产生，加入载脂蛋白A-I(apoA-I)(注意，apoA-I也可以已经在B中)-逐滴使用以避免变性，并使用尖端超声波发生器对产生的混合物超声30分钟，同时使用外部冰水浴进行完全冷却。所获得的含有纳米生物以及其他副产品的溶液被转移到Sartorius Vivaspin管中，该Sartorius Vivaspin管的截留分子量取决于纳米生物的预估尺寸(通常使用具有10.000-100.000kDa截留的Vivaspin管)。离心该管，直至～90％的溶剂体积已通过过滤器。随后，加入大约等同于剩余溶液体积的缓冲液体积并再次旋转该管，直到大约一半体积通过过滤器。重复这两次之后，剩余溶液通过聚醚砜0.22μm注射器过滤器，产生最终的纳米生物溶液。
方法2.
在一个可替代的方法中，磷脂、(前)药物和可选的甘油三酯或聚合物被溶解(通常在乙醇或乙腈中)，并装载到注射器中。此外，在磷酸盐缓冲盐水中的载脂蛋白A-I(apoA-I)溶液被装载进第二注射器。使用微流体泵，使用微涡平台混合两个注射器的内容物。获得的含有纳米生物和其他副产品的溶液被转移到Sartorius Vivaspin管中，该SartoriusVivaspin管的截留分子量取决于颗粒的预估尺寸(通常使用具有10.000-100.000kDa截留的Vivaspin管)。离心该管，直至～90％的溶剂体积已通过过滤器。随后，加入大约等同于剩余溶液体积的缓冲液体积并再次旋转该管，直到大约一半体积通过过滤器。重复这两次之后，剩余溶液通过聚醚砜0.22μm注射器过滤器，产生最终纳米生物溶液。
微流化方法
根据本发明的另一优选方法中，微流化技术被用来制备纳米级组装物和最终的纳米生物组合物。微流化器是利用淹没射流原理制备小颗粒尺寸材料的设备。在操作微流化器以获得纳米颗粒的过程中，高压泵迫使预混料流通过所谓的互作用腔(interactionchamber)，该互作用腔由在陶瓷块中的通道系统组成，其使预混料分成两股流。在微流化中，互作用腔内产生精确控制的剪切、湍流和空化力。两股流高速重组，以产生剪切。以此获得的产品可以被回收进微流化器，以获得越来越小的颗粒。
与传统的碾磨工艺相比，微流化的优点包括最终产品的污染大大下降了，且易于生产规模扩大。
联合疗法-含有检查点抑制剂的纳米生物递送
在本发明的主题范围内所还考虑的是检查点抑制剂以及与训练免疫诱导纳米生物的联合治疗。
检查点抑制剂
检查点抑制剂指的是一种药物，这种药物能阻断某些类型的免疫系统细胞(如T细胞和某些癌细胞)制造的某些蛋白质。这些蛋白质有助于控制免疫反应，并可以防止T细胞杀死癌细胞。当这些蛋白质被阻断时，免疫系统的“刹车”被释放，T细胞能够更好地杀死癌细胞。在T细胞或癌细胞中发现的检查点蛋白的实例包括PD-1/PD-L1和CTLA-4/B7-1/B7-2。一些免疫检查点抑制剂被用来治疗癌症。
检查点抑制剂背景
在免疫系统中，免疫检查点抑制剂调节T细胞的功能。T细胞在细胞介导的免疫中起着核心作用。检查点蛋白与特定的配体相互作用，该配体发送信号给T细胞，并实质上关闭或抑制T细胞的功能。癌细胞利用这一系统推动在其表面上检查点蛋白的高水平表达，从而控制进入肿瘤微环境的T细胞表面的T细胞表达检查点蛋白，以此抑制抗癌免疫反应。同样地，检查点蛋白的抑制会导致T细胞功能完全或部分恢复，并对癌细胞产生免疫反应。检查点蛋白的实例包括，但不限于，CTLA-4、PD-L1、PD-L2、PD-1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4(属于CD2家族分子，且在所有NK、γδ和记忆性CD8+(αβ)T细胞上表达)、CD160(也称为BY55)、CGEN-15049、CHK1和CHK2激酶、A2aR和多种B-7家族配体。
检查点抑制剂的类型
检查点抑制剂包括以统计意义显著的方式，阻断或抑制免疫系统的抑制途径的任何药物。这种抑制剂可以包括小分子抑制剂，或者可以包括结合并阻断或抑制免疫检查点受体的抗体或其抗原结合片段，或结合并阻断或抑制免疫检查点受体配体的抗体。
说明性的检查点分子，其可以以阻断或抑制再激活免疫反应为目标，包括，但不限于，CTLA-4、PD-L1、PD-L2、PD-1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、GAL9、LAG3、TIM3、VISTA、KIR、2B4(属于CD2家族分子，且在所有NK、γδ和记忆性CD8+(αβ)T细胞上表达)、CD160(也称为BY55)、CGEN-15049、CHK1和CHK2激酶、A2aR和多种B-7家族配体。B7家族配体包括，但不限于，B7-1、B7-2、B7-DC、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H5、B7-H6和B7-H7。
检查点抑制剂包括抗体或其抗原结合片段、其他结合蛋白、生物治疗剂或小分子，其结合并阻断或抑制CTLA-4、PD-L1、PD-L2、PD-1、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160和CGEN-15049中的一种或多种的活性。
说明性的免疫检查点抑制剂包括曲美母单抗(Tremelimumab)(CTLA-4阻断抗体)、抗OX40、PD-L1单克隆抗体(抗B7-H1；MEDI4736)、MK-3475(PD1阻断剂)、纳武单抗(Nivolumab)(抗PD1抗体)、CT-011(抗PD1抗体)、BY55单克隆抗体、AMP224(抗PDL1抗体)、BMS-936559(抗PDL1抗体)、MPLDL3280A(抗PDL1抗体)、MSB0010718C(抗PDL1抗体)以及伊匹单抗(Yervoy)/伊匹木单抗(ipilimumab)(抗CTLA-4检查点抑制剂)。检查点蛋白配体包括，但不限于，PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、CD28、CD86和TIM-3。
阻断PD-1的检查点抑制剂包括纳武单抗(欧狄沃(Opdivo))、以及派姆单抗(pembrolizumab)(健痊得(Keytruda))。纳武单抗和派姆单抗用于有黑色素瘤皮肤癌、霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌以及尿道癌(尿路上皮癌)的人群的治疗。尿路包括肾的中心(肾盂)、将尿液从肾脏输送到膀胱的管子(输尿管)、膀胱、以及将尿液从膀胱排出体外的管子(尿道)。
阻断CTLA-4的检查点抑制剂包括伊匹木单抗(伊匹单抗)，其被用于晚期黑色素瘤的治疗。
阻断PD-L1的检查点抑制剂包括阿特珠单抗(atezolizumab)(也称为MPDL3280A)。阿特珠单抗是一种肺癌和尿路上皮癌的治疗。它还在临床试验用于其他癌症，包括乳腺癌。
程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)是一种288个氨基酸的细胞表面蛋白分子，在T细胞和前B(pro-B)细胞上表达，并在它们的命运/分化中起重要作用。PD-1有两个配体，PD-L1和PD-L2，它们是B7家族的成员。PD-1在肿瘤特异性逃逸免疫监视中起重要作用。PD-1在黑色素瘤浸润性T淋巴细胞(TIL)中上调(Dotti(2009)Blood 114(8):1457-58)。肿瘤已被发现表达PD-1配体(PDL-1和PDL-2)，其当在CTL中与PD-1的上调相结合时，可能是T细胞功能的丧失和CTL无法介导有效的抗肿瘤反应的一个影响因素。
黑色素瘤的临床试验已经表明，抗PD-1的阻断物(blockade)有强力的抗肿瘤反应。PD-1抑制在晚期黑色素瘤、卵巢癌、非小细胞肺、前列腺、肾细胞、以及结直肠癌情况中的显著益处也已被描述。在小鼠模型中的研究已将这一证据应用于胶质瘤治疗。在胶质瘤小鼠中，抗PD-1的阻断物辅佐放疗，促进细胞毒性T细胞群以及相关的长期生存的益处。
鉴于本文中提供的结果，本公开的一个方面包括，用任何检查点抑制剂结合一种或多种训练免疫诱导纳米生物(如MDP-HDL、MTP-HDL、PG-HDL、BG-HDL和UA-HDL)的任何实体肿瘤的联合治疗。
抗体检查点抑制剂
本公开的一个方面提供了检查点抑制剂，该检查点抑制剂是的抗体，可以作为PD-1的抑制剂，从而通过调节PD-1调控免疫反应。在一个实施例中，抗PD-1抗体可以是抗原结合片段。本文中公开的抗PD-1抗体能够与人PD-1结合并使PD-1的活性受损，从而抑制免疫细胞表达PD-1的功能。PD-1和PD-L1阻断剂的实例被描述在美国专利号7,488,802；7,943,743；8,008,449；8,168,757；8,217,149、以及PCT公布的专利申请号：W003042402、WO2008156712、W02010089411、W02010036959、WO2011066342、WO2011159877、WO2011082400、以及WO2011161699。
目前有几种PD-1抑制剂正在临床试验中测试。CT-011是一种抗PD-1的人源化IgG1单克隆抗体。最近已经完成了接受自体干细胞移植的弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)受试者的II期临床试验。初步结果显示，70％的受试者在随访期结束时无进展，对比在对照组中的47％；且82％的受试者还活着，对比在对照组中的62％。该试验确定CT-011不仅阻断PD-1的功能，而且还增强自然杀伤细胞的活性，以此增强抗肿瘤免疫反应。
BMS 936558是一种以PD-1为目标的全人IgG4单克隆抗体。在I期试验中，在患有晚期、难治性恶性肿瘤受试者中，每两周给药一次BMS-936558，显示出持久的部分或完全消退。在患有有黑色素瘤(28％)和肾细胞癌(27％)的受试者中，观察到了最显著应答率，但在有非小细胞肺癌(NSCLC)的受试者中也观察到了实质性的临床活性，且一些应答持续了一年以上。
BMS 936559是一种以PD-1配体PD-L1为目标的全人IgG4单克隆抗体。I期结果显示，每两周给药一次这种药物，会引起持久的反应，特别是在患有黑色素瘤的受试者中。根据患有晚期NSCLC、黑色素瘤、RCC、或卵巢癌的受试者中的癌症类型，客观应答率(Objective response rate)范围从6％到17％)，有些受试者经历的应答持续一年或更长。
MK3475是一种人源化IgG4抗PD-1单克隆抗体，在III期研究中与化疗对比，单独或与化疗结合作为用于晚期胃部或胃食管交界部(GEJ)腺癌的一线疗法。MK3475目前正在进行众多的全球性III期临床试验。
MPDL 3280A(阿特珠单抗)是一种单克隆抗体，其也以PD-L1为目标。MPDL 3280A获得了美国食品和药物管理局(U.S.Food and Drug Administration，FDA)的突破性疗法认定(Breakthrough Therapy Designation)，用于NSCLC表达PD-L1和在标准治疗期间或之后进展的人群的治疗。
AMP 224是第二PD-1配体(PD-L2和IgG1)的胞外区的融合蛋白，具有阻断PD-L2/PD-1相互作用的潜力。AMP-224目前在具有晚期癌症的受试者中作为单一疗法，正进行I期测试。
Medi 4736是一种抗PD-L1抗体，其在这项剂量递增研究中已显示出一个可接受的安全性和持久的临床活性。作为单一疗法和联合疗法，Medi 4736在多种癌症中的扩展和发展仍在进行中。
因此，在某些实施例中，PD-1阻断剂包括抗PD-1抗体和类似的结合蛋白，如纳武单抗(MDX 1106、BMS 936558、ONO 4538)、全人IgG4抗体(该全人IgG4抗体通过其配体PD-L1和PD-L2结合并阻断PD-1的活化)；派姆单抗(pembrolizumab)/派姆单抗(lambrolizumab)(MK-3475或SCH 900475)，一种抗PD-1的人源化单克隆IgG4抗体；CT-011，一种结合PD-1的人源化抗体；AMP-224是一种B7-DC的融合蛋白；一种抗体Fc部分；用于PD-L1(B7-H1)阻断物的BMS-936559(MDX-1105-01)。其他免疫检查点抑制剂包括，淋巴细胞激活基因-3(LAG-3)抑制剂，如IMP321，一种可溶性Ig融合蛋白(Brignone et al.,2007,J.Immunol.179:4202-4211)。其他免疫检查点抑制剂包括B7抑制剂，如B7-H3和B7-H4抑制剂。特别是，抗B7-H3抗体MGA271(Loo et al.,2012,Clin.Cancer Res.July 15(18)3834)。还包括TIM3(T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3)抑制剂(Fourcade et al.,2010,J.Exp.Med.207:2175-86和Sakuishi et al.,2010,J.Exp.Med.207:2187-94)。
联合疗法-含抗癌药物的纳米生物递送
抗癌药物的实例包括，但不限于：阿西维辛；阿柔比星；盐酸阿考达唑；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；六甲蜜胺；安波霉素；醋酸阿美蒽醌；安吖啶；阿那曲唑；氨茴霉素；天冬酰胺酶；曲林菌素；阿扎胞苷；阿扎替派；含氮霉素；巴马司他；苯佐替派；比卡鲁胺；比生群；盐酸化物；二甲磺酸双奈法德(bisnafide dimesylate)；比折来新；硫酸博莱霉素；布喹那钠；溴匹立明；白消安；放线菌素C；卡普睾酮；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡氮芥；盐酸卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；塞来昔布(COX-2抑制剂)；苯丁酸氮芥；西罗里霉素；顺铂；克拉屈滨；甲磺酸克立那托；环磷酰胺；阿糖胞苷；达卡巴嗪；放线菌素D；盐酸柔红霉素；地西他滨；右奥马铂；地扎胍宁；甲磺酸地扎胍宁；地吖醌(diaziquone)；多西他赛；多柔比星；盐酸多柔比星；屈洛昔芬；枸橼酸屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；；重氮霉素；依达曲沙；盐酸依氟鸟氨酸；依沙芦星；恩洛铂；恩普氨酯；依匹哌啶；盐酸表柔比星；厄布洛唑；盐酸依索比星；雌二醇氮芥；雌二醇氮芥磷酸钠；依他硝唑；足叶乙甙；磷酸足叶乙甙；氯苯乙嘧胺；盐酸法倔唑；法扎拉滨；维甲酰酚胺；氟尿苷；磷酸氟达拉滨；氟尿嘧啶；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星钠；吉西他滨；盐酸吉西他滨；羟基脲(hydroxyurea)；盐酸依达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；异丙铂；伊立替康；盐酸伊立替康；醋酸兰瑞肽；来曲唑；醋酸亮丙瑞林；盐酸利阿唑；洛美曲索钠；洛莫司汀；盐酸洛索蒽醌；马索罗酚；美登素；盐酸氮芥；醋酸甲地孕酮；醋酸美仑孕酮；米尔法兰；美诺立尔；巯嘌呤；甲氨喋呤；甲氨喋呤钠；氯苯氨啶；美妥替哌；米丁度胺；米托卡星；丝裂红素；米托洁林；米托马星；丝裂霉素；米托司培；米托坦；盐酸米托蒽醌；霉酚酸；诺考达唑；诺加霉素；奥马铂；奥昔舒仑；紫杉醇；培门冬酶；佩里霉素；戊氮芥；硫酸培洛霉素；培磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；盐酸吡咯蒽醌；普卡霉素；普洛美坦；卟吩姆钠；泊非霉素；泼尼氮芥；盐酸甲基苄肼；嘌呤霉素；盐酸嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素；利波腺苷；沙芬戈；盐酸沙芬戈；司莫司汀；辛曲秦；司帕福赛特钠(sparfosate sodium)；稀疏霉素；盐酸锗螺胺；螺莫司汀；螺铂；链黑菌素；链脲霉素；磺氯苯脲；他利霉素；替可加兰钠(tecogalansodium)；泰索帝；替加氟；盐酸替洛蒽醌；替莫泊芬；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酯；硫咪嘌呤；硫乌嘌呤；塞替派；噻唑呋林；替拉扎明；枸橼酸托瑞米芬；醋酸曲托龙；磷酸曲西立滨；三甲曲沙；葡糖醛酸三甲曲沙；曲普瑞林；盐酸妥布氯唑；尿嘧啶氮芥；乌瑞替派；伐普肽；维替泊芬；硫酸长春花碱；硫酸长春新碱；长春地辛；硫酸长春地辛；硫酸长春匹定；硫酸长春甘酯；硫酸环氧长春碱；酒石酸长春瑞滨；硫酸长春罗定；硫酸长春利定；伏氯唑；折尼铂；净司他丁；以及盐酸佐柔比星。
其他抗癌药物包括，但不限于：20-epi-l,25-二羟基维生素D3(20-epi-l,25dihydroxyvitamin D3)；5-乙炔尿嘧啶(5-ethynyluracil)；阿比特龙；阿克拉霉素；酰基富烯；腺环戊醇(adecypenol)；阿多来新；阿地白介素；ALL-TK拮抗剂；六甲蜜胺；氨莫司汀；阿米多(amidox)；氨磷汀；氨基酮戊酸；氨柔比星；安吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；穿心莲内酯；血管生成抑制剂；D拮抗剂；G拮抗剂；安雷利克斯(antarelix)；抗背部化形态发生蛋白-1(anti-dorsalizing morphogenetic protein-1)；抗雄性激素，前列腺癌；抗雌激素；抗癌酮(antineoplaston)；反义寡核苷酸；阿菲迪霉素甘氨酸盐(aphidicolin glycinate)；细胞凋亡基因调节剂；细胞凋亡调节剂；脱嘌呤核酸；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶；阿苏拉尼(asulacrine)；阿他美坦；阿莫司汀、海洋环肽1(axinastatin 1)；海洋环肽2(axinastatin 2)；海洋环肽3(axinastatin 3)；阿扎司琼、阿扎毒素；重氮酪氨酸(azatyrosine)；巴卡汀III(baccatin)衍生物；巴拉醇(balanol)；巴马司他；BCR/ABL拮抗剂；苯并氯辛(benzochlorin)；苯甲酰星形孢菌素(benzoylstaurosporine)；β内酰胺衍生物；beta-alethine；贝塔克拉霉素B；白桦酸；bFGF抑制剂；比卡鲁胺；比生群；双氮杂环丙烷基精胺；双奈法德(bisnafide)；比斯他西(bistratene A)；比折来新；溴匹立明；布度钛；丁硫氨酸硫酸亚胺；钙泊三醇；卡弗他丁(calphostin C)；喜树碱(camptothecin)衍生物；卡培他滨；甲酰胺-氨基-三唑；羧基酰胺基三唑；CaRest M3；CARN 700；衍生自软骨的抑制剂；卡折来新；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；栗精胺；抗菌肽B；西曲瑞克；二氢卟酚；磺胺氯喹喔啉(chloroquinoxaline sulfonamide)；西卡前列素；顺式卟啉；克拉屈滨；氯米芬类似物；克霉唑；克里霉素A(collismycin A)；克里霉素B(collismycin B)；考布他汀A4；考布他汀类似物；科纳基尼(conagenin)；克拉贝司丁816(crambescidin 816)；克立那托；念珠藻素8；念珠藻素A衍生物；库拉辛A(curacin A)；环戊烯蒽醌(cyclopentanthraquinone)；cycloplatam；cypemycin；阿糖胞苷十八碳磷酸酯钠(cytarabine ocfosfate)；溶细胞因子；磷酸己烷雌酚(cytostatin)；达昔单抗(dacliximab)；地西他滨；脱氢膜海鞘素B(dehydrodidemnin B)；德舍瑞林；地塞米松；右异环磷酰胺(dexifosfamide)；右雷佐生；右维拉帕米；地吖醌；膜海鞘素B(didemnin B)；地多克斯(didox)；二乙基去甲精胺(diethylnor spermine)；二氢-5-氮胞苷；二氢紫杉醇(dihydrotaxol)；9-多喜霉素(9-dioxamycin)；二苯螺莫司汀；多西他赛；二十二烷醇；多拉司琼；去氧氟尿苷；多柔比星；屈洛昔芬；屈大麻酚；多卡米星SA(duocarmycin SA)；依布硒啉；依考莫司汀；依地福新；依决洛单抗(edrecolomab)；依氟鸟氨酸(eflomithine)；榄香烯；乙嘧替氟；表柔比星；爱普列特；雌二醇氮芥类似物；雌激素激动剂；雌激素拮抗剂；依他硝唑；磷酸足叶乙甙；依西美坦；法倔唑；法扎拉滨；维甲酰酚胺；非格司亭；非那雄胺；黄酮吡醇；氟卓斯汀；普拉睾酮(fluasterone)；氟达拉滨；盐酸氟多若辛(fluorodaunorunicin hydrochloride)；福酚美克；福美斯坦；福司曲星；福莫司汀；钆特萨卟啉(gadolinium texaphyrin)；硝酸镓；加洛他滨；加尼瑞克；明胶酶抑制剂；吉西他滨；谷胱甘肽抑制剂；西磺非(hepsulfam)；heregulin；六亚甲基二乙酰胺；金丝桃素；伊班膦酸；依达比星；艾多昔芬；伊决孟酮；伊莫福新；伊洛马司他；伊马替尼(例如
Figure BDA0002579278700000271
)；咪喹莫特；免疫刺激肽；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；白细胞介素；碘苄胍；碘多柔比星；4-依波米醇(ipomeanol，4-)；伊罗普拉；伊索拉定；异苯嘎唑(isobengazole)；软海绵素B(isohomohalicondrin B)；伊他司琼；叶克立得(jasplakinolide)；卡哈立得F(kahalalide F)；片螺素-N三醋酸酯；兰瑞肽；雷纳霉素(leinamycin)；来格司亭；香菇多糖硫酸盐(lentinan sulfate)；乐普他丁(leptolstatin)；来曲唑；白血病抑制因子；白细胞α干扰素；亮丙瑞林+雌性激素+孕酮；亮丙瑞林；左咪唑；利阿唑；直链多胺类似物；脂糖肽；亲脂性铂化合物；利索里胺7(lissoclinamide 7)；洛铂；蚯蚓磷脂；洛美曲索；氯尼达明；洛索蒽醌；洛索立宾；勒托替康；镥特萨卟啉(lutetium texaphyrin)；利索茶碱；裂解肽；美坦新；曼诺他丁A(mannostatin A)；马立马司他；马索罗酚；乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂(maspin)；基质溶素抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；美诺立尔(menogaiil)；美巴龙(merbarone)；美替瑞林(meterelin)；蛋氨酸酶；甲氧氯普胺；MIF抑制剂；米非司酮；米替福新；米立司亭；米托胍腙；二溴卫矛醇；丝裂霉素类似物；米托萘胺；米托托新(mitotoxin)成纤维细胞生长因子-皂素；米托蒽醌；莫法罗汀；莫拉司亭；西妥昔单抗(Erbitux)，人绒毛膜促性腺激素；单磷酰脂A+分枝杆菌(myobacterium)细胞壁sk；莫哌达醇；莫司汀抗癌药物(mustard anticanceragent)；印度洋海绵B(mycaperoxide B)；分枝杆菌细胞壁提取物；美拉普龙(myriaporone)；N-乙酰基地那林(N-acetyldinaline)；N取代苯甲酰胺；那法瑞林；纳洛酮+喷他佐辛；纳帕维；萘萜二醇(naphterpin)；那托司亭；奈达铂；奈莫柔比星；奈立膦酸；尼鲁米特；尼萨霉素(nisamycin)；一氧化氮调节剂；氮氧化物抗氧化剂；尼图仑(nitrullyn)；奥利默森(oblimersen)
Figure BDA0002579278700000281
O6-苄基鸟嘌呤；奥曲肽；奥克西农(okicenone)；寡核甘酸；奥那司酮；恩丹西酮；恩丹西酮；奥拉辛(oracin)；口服细胞因子诱导剂；奥马铂；奥沙特隆；奥沙利铂；奥沙霉素(oxaunomycin)；紫杉醇；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；帕洛胺(palauamine)；帕米托左新(palmitoylrhizoxin)；帕米磷酸；人参炔三醇；帕诺米芬；副杆菌素(parabactin)；帕折普汀；培门冬酶；培得星(peldesine)；木聚硫钠；喷司他丁；喷曲唑(pentrozole)；全氟溴烷(perflubron)；培磷酰胺；紫苏醇；苯阿诺霉素(phenazinomycin)；苯乙酸盐；磷酸酶抑制剂；毕西巴尼；盐酸毛果芸香碱；吡柔比星；吡曲克辛；普斯婷A(placetin A)；普斯婷B(placetin B)；纤溶酶原激活物抑制剂；铂络合物；铂化合物；铂-三胺络合物；卟吩姆钠；甲基丝裂霉素；泼尼松；丙基双吖啶酮(propyl bis-acridone)；前列腺素J2；蛋白酶体抑制剂；基于蛋白质A免疫调制剂；蛋白激酶C抑制剂；蛋白激酶C抑制剂，微藻；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；紫红素；吡唑啉吖啶；吡醇羟乙酯血红蛋白聚氧乙烯结合物；raf拮抗剂；雷替曲塞；雷莫司琼；ras法尼基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；脱甲基化瑞替普汀(retelliptine demethylated)；铼Re186依替膦酸盐；根瘤菌素；核酶；RII视黄醇酰胺(RII retin amide)；罗希吐碱；罗莫肽；罗喹美克；如格吉农(rubiginone B1)；如波西(mboxyl)；沙芬戈；萨托平(saintopin)；SarCNU；沙克非托A(sarcophytol A)；沙莫司亭；Sdi 1模拟物；司莫司汀；衰老细胞衍生抑制剂1(senescence derived inhibitor 1)；正义寡核苷酸(sense oligonucleotide)；信号转导抑制剂；西佐喃；索布佐生；硼卡钠；苯乙酸钠；索喔醇(solverol)；生长调节素结合蛋白；索纳明；膦门冬酸；斯皮卡霉素D(spicamycin D)；螺莫司汀；斯耐潘定(splenopentin)；海绵抑制素1(spongistatin 1)；角鲨胺；斯皮酰胺(stipiamide)；基质分解素抑制剂；苏非诺辛(sulfinosine)；强效血管活性肠肽拮抗剂；苏拉地他(suradista)；苏拉明；苦马豆素；他莫司汀；他莫昔芬甲碘化物(tamoxifen methiodide)；牛磺莫司汀；他扎罗汀；替可加兰钠(tecogalan sodium)；替加氟；tellurapyrylium；端粒酶抑制剂；替莫泊芬；替尼泊苷；四氯癸烷氧化物(tetrachlorodecaoxide)；四唑胺(tetrazomine)；噻布拉亭(thaliblastine)；噻可拉林(thiocoraline)；血小板生成素；血小板生成素模拟物；胸腺法新(thymalfasin)；胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南；促甲状腺激素；乙基锡初紫红素(tin ethyl etiopurpurin)；替拉扎明；环戊二烯钛二氯化物(titanocene bichloride)；陶普森亭(topsentin)；托瑞米芬；转译抑制剂；维甲酸；三乙酰尿苷；曲西立滨；三甲曲沙；曲普瑞林；托烷司琼；妥罗雄脲；酪氨酸激酶抑制剂；酪氨酸磷酸化抑制剂；UBC抑制剂；乌苯美司；衍生自生殖窦的生长抑制因子(Urogenital sinus-derived growth inhibitoryfactor)；尿激酶受体拮抗剂；伐普肽；伐若啉B(variolin B)；维拉雷琐；藜芦胺；维丁(verdins)；维替泊芬；长春瑞滨；维克萨汀(vinxaltine)；维他辛；伏氯唑；扎诺特隆；折尼铂；亚苄维C；以及净司他丁斯酯。
小分子次级药物
小分子药物可以被用于与本发明的纳米生物联合疗法，该纳米生物包括对乙酰氨基酚、乙酰水杨酸、阿霉素、硫唑嘌呤、克拉霉素、双磷酸盐、白消安、卡培他滨、卡铂、塞来昔布、氯喹、顺铂、环磷酰胺、环孢霉素、阿糖胞苷、d-青霉胺、氮烯咪胺、柔红霉素、地塞米松、二氟尼柳、多西他赛、阿霉素雌莫司汀磷酸钠(doxorubicin estramustine sodiumphosphate)、足叶乙甙、依托昔布、非诺洛芬、氟灭酸、氟尿嘧啶、氟比洛芬、更昔洛韦、吉西他滨、格立得(gliadel)、GM-CSF、羟氯喹布洛芬、IL-2、吲哚美辛、干扰素α、伊立替康、酮洛芬、来氟米特、甲酰四氢叶酸、罗美昔布、甲氯芬那酸、甲芬那酸、米尔法兰、甲基强的松龙、甲氨喋呤、萘普生、尼美舒利、反义寡核苷酸(oblimersen)、奥沙普秦、紫杉醇、帕米膦酸盐(palmitronate)、帕瑞昔布、聚乙二醇化干扰素α、保泰松、吡罗昔康、强的松、强的松龙、丙卡巴嗪(procarbazineremicade)、罗非昔布(rofecoxib)、甾体类、柳氮磺胺吡啶、舒林酸、他莫昔芬、紫杉醇、泰索帝、替莫唑胺(temodar)、替莫唑胺(temozolomide)、替诺昔康、塞替派、拓扑替康、戊地昔布、长春花碱、长春新碱、长春瑞滨以及唑来膦酸。
剂量
剂量将一般为受体(哺乳动物)每天5μg至100mg/kg体重范围内，且更通常的是每天5μg至10mg/kg体重范围内。这个量可以以单剂量每天或更通常地以亚剂量的数量(例如2、3、4、5或6)每天来给予，以使每天的总剂量是相同的。其盐或溶剂的有效量，可以以包括促进剂的纳米生物化合物的有效量的比例来确定，其中，该促进剂或其药学上可接受的盐、溶剂、多晶型、互变异构体或前药，使用纳米级组装物(IMPEPi-NA)被配制为纳米生物。
癌症
本文所使用的，术语“癌症”包括，但不限于，实体肿瘤和血源性肿瘤。术语“癌症”指的是皮肤组织、器官、血液以及血管的疾病，包括，但不限于，膀胱、血管、骨、脑、乳腺、宫颈、胸、结肠、子宫内膜、食管、眼、头、肾、肝、淋巴结、肺、口、颈、卵巢、胰腺、前列腺、直肠、皮肤、胃、睾丸、咽喉、甲状腺、尿路上皮、和子宫的癌症。
特定癌症包括，但不限于，晚期恶性肿瘤、淀粉样变性、神经母细胞瘤、脑膜瘤、血管外皮细胞瘤、多发性脑转移瘤、多形性胶质母细胞瘤、胶质母细胞瘤、脑干胶质瘤、预后不良的恶性脑瘤、恶性胶质瘤、复发性恶性胶质瘤、间变性星形细胞瘤、间变性少突胶质瘤、神经内分泌肿瘤、直肠腺癌、Dukes C&D结直肠癌、不能切除的结直肠癌、转移性肝细胞癌、卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)、核型急性髓细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、皮肤B细胞淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤、低级滤泡性淋巴瘤、恶性黑色素瘤、恶性间皮瘤、恶性胸腔积液间皮瘤综合征、腹膜癌、乳头状浆液性癌、妇科肉瘤、软组织肉瘤、硬皮病(scelroderma)、皮肤血管炎、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、平滑肌肉瘤、进行性骨化纤维发育不良、激素难治性前列腺癌、高危切除软组织肉瘤、不能切除的肝细胞癌、华氏巨球蛋白血症、郁积型骨髓瘤、惰性骨髓瘤、输卵管癌、非雄激素依赖型前列腺癌、雄激素依赖型阶段IV非转移性前列腺癌、激素不敏感型前列腺癌、化疗不敏感型前列腺癌、甲状腺乳头状癌、甲状腺滤泡状癌、甲状腺髓样癌以及平滑肌瘤。在特定实施例中，癌症是转移性的。在另一实施例中，癌症是难治性的或对化疗或放射有抵抗；特别是，对于沙利度胺是难治性的。
一般药学定义
本文所使用的，“预防有效”量是在受试者中，一种将要被给予受试者的物质有效预防或延缓给定病理状况的发作的量。预防有效量指的是一种在剂量上并用于必要的时间段，以实现预期预防结果的有效剂量。通常，由于预防剂量被用在受试者疾病之前或疾病的更早期，因此预防有效量将少于治疗有效量。
本文所使用的，“治疗有效”量是一种将要被给予受试者的物质有效治疗、改善或减轻受试者正遭受给定病理状况的症状或原因的量。
在一个实施例中，每次剂量的治疗或预防有效量从约1mg药剂/kg受试者至约1g药剂/kg受试者。在另一实施例中，治疗或预防有效量从约10mg药剂/kg受试者至500mg药剂/kg受试者。在另一实施例中，治疗或预防有效量从约50mg药剂/kg受试者至200mg药剂/kg受试者。在另一实施例中，治疗或预防有效剂量为约100mg药剂/kg受试者。在又一实施例中，治疗或预防有效量选自50mg药剂/kg受试者、100mg药剂/kg受试者、150mg药剂/kg受试者、200mg药剂/kg受试者、250mg药剂/kg受试者、300mg药剂/kg受试者、400mg药剂/kg受试者以及500mg药剂/kg受试者。
本发明的药物组合物可以适合于通过任何适当的途径给药，例如通过口服(包括口腔或舌下)、吸入、鼻腔、眼部或肠外(包括静脉和肌肉内)途径。这样的组合物可以通过药学领域中已知的任何方法来制备，例如通过将活性成分与载体或赋形剂相结合。肠外剂型是优选的。
肠外剂型可以通过多种途径对患者给药，包括，但不限于，皮下、静脉(包括团注)、肌肉内、以及动脉内。因为它们的给药通常绕过患者的抗污染物的天然防御，所以肠外剂型在对患者给药之前，优选为无菌或能被灭菌。肠外剂型的实例包括，但不限于，准备注射的溶液、准备溶解或悬浮在药学上可接受的注射用载体中的干燥产品、准备注射的混悬剂以及乳剂。
在本领域技术人员公知的合适载体可用于提供本发明的肠外剂型。实例包括，但不限于：USP注射用水；水性载体，例如，但不限于，氯化钠注射液、格林注射液、右旋糖苷注射液、右旋糖苷与氯化钠注射液、以及乳酸格林注射液；水溶性载体例如，但不限于，乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇；和非水性载体，例如，但不限于，玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、以及苯甲酸苄酯
本文中公开的增加一种或多种活性成分的溶解度的化合物，也可以包含在本发明的肠外剂型中。例如，环糊精及其衍生物可以被用来增加本发明的纳米级颗粒及其衍生物的溶解度。
药物组合物或剂型的pH还可以被调整，以改善一种或多种活性成分的递送。类似地，溶剂载体的极性、它的离子强度、或张力可以被调节，以改善递送。化合物，如硬脂酸盐，还可以被添加到药物组合物或剂型中，以利于改变一种或多种活性成分的亲水性或亲脂性，从而改善递送。在这方面，硬脂酸盐可以作为制剂的脂质载体、作为乳化剂或表面活性剂、以及作为递送增强或渗透增强剂。活性成分的不同盐、水合物或溶剂可以被用来进一步调整产生的组合物的性质。
用于体内药物积聚的PET成像的放射性标记
在本发明的非限制性优选实施例中，提供了放射性药物组合物和在受训练免疫影响的患者的骨髓、血液和/或脾脏内的纳米生物积聚的放射性药物成像方法，包括：
(i)以有效促进高反应先天免疫反应的量，对所述患者给予纳米生物组合物，
其中所述纳米生物组合物包括(i)纳米级组装物，具有(ii)包含在纳米级组装物中的促进剂药物，以及(iii)包含在纳米级组装物中的正电子放射断层造影术(PET)成像剂。
其中所述纳米级组装物是一种多组分载体组合物，其包括：(a)磷脂，和，(b)apoA-I或apoA-I的肽模拟物，和可选地(c)疏水基质，所述疏水基质包括一种或多种甘油三酯、脂肪酸酯、疏水聚合物、或甾醇酯、或其组合物，以及可选地(d)胆固醇，其中所述促进剂药物是一种分子结构，该分子结构激活或结合病原体识别受体Dectin-1或NOD2，以在骨髓、血液和脾脏中的骨髓细胞及其干细胞和祖细胞中诱导训练免疫，其中激活或结合Dectin-1的分子结构包括，但不限于，β-葡聚糖及其衍生物，例如11-13葡萄糖低聚物，其中激活或结合NOD2的分子结构包括，但不限于，肽聚糖及其衍生物，例如胞壁酰二肽以及胞壁酰三肽，
其中所述PET成像剂选自89Zr、124I、64Cu、18F和86Y，以及其中所述PET成像剂使用合适的螯合剂络合纳米生物，以形成稳定的药物-试剂螯合物(drug-agent chelate)，
其中所述纳米生物，在水相环境中，自组装进入直径尺寸约8nm至400nm之间的纳米盘或纳米球中，
其中所述纳米级组装物递送稳定的药物-试剂螯合物到患者的骨髓、血液和/或脾脏中的骨髓细胞、骨髓祖细胞或造血干细胞中，
以及
(ii)对患者进行PET成像，以可视化患者体内的骨髓、血液和/或脾脏中的稳定的药物-试剂螯合物的生物分布。
在一个非限制性优选实施例中，该放射性药物成像方法包括一个额外的步骤，该步骤为同时或在纳米生物组合物之后的特定时间段对所述患者给予检查点抑制剂，以此促进由训练免疫引起的高反应性先天免疫反应，提高检查点抑制剂疗法的效果。
使用89Zr示例性方案在实施例5中提出。
此外，使用伽马计数或放射自显影，体外方法可以被用于量化89Zr标记的纳米颗粒的组织摄取，以验证成像结果。这也提供了一种基于放射自显影的组织学新方法，其允许通过对比放射自显影获得的放射性沉积模式与相同或相邻切片上的组织学和/或免疫组织化学染色，评估在感兴趣的组织内的纳米材料的区域分布。
目前，评估纳米疗法体内行为的最常用的方法依赖于荧光染料。然而，由于自发荧光、猝灭、FRET、以及荧光基团对环境的高度敏感性(例如，pH或溶剂极性)，这些技术不是定量的。作为纳米颗粒标记的磁共振成像成像药物的集合已进行了试验，但要求高有效载荷和剂量，从而损害了纳米颗粒制剂的完整性。核显像剂没有这些缺点，特别适合使用89Zr，因为它发射PET成像所需的正电子，以及它相对较长的物理半衰期(78.4小时)，其允许缓慢清除物质的纵向研究以及消除对于附近的回旋加速器的需求。
本文所描述的方法提供了一种使用89Zr来功能化纳米生物的极好方法。DSPE-DFO作为一种将DFO螯合剂锚定到脂质单或双层中的稳定方法。此外，由于DFO存在于纳米颗粒平台的外部，因此纳米颗粒可以在配制后被标记。这消除了在无线电屏蔽条件下进行它们的配方设计的需求，并减少了需要使用的活性的量。最后，并入DSPE-DFO和引入89Zr的温和条件与多种纳米颗粒类型和配制方法兼容。
在本发明的另一个优选实施例中，在配方中需要进一步稳定性的情况下，一种亲脂性DFO衍生物，名为C34-DFO6，可以按照相同的方案被并入本发明。
在本发明的又一非限制性优选实施例中，本发明包括，通过首先配制颗粒，然后用市面上有售的p-NCS-Bz-DFO功能化蛋白质组分，并最后使用我们的一般程序引入89Zr，来制备放射性标记蛋白覆盖的纳米颗粒。
训练免疫
图14是在在表观遗传、细胞和系统水平上，控制训练免疫过程的最新原理图说明。最初识别的“训练剂包括真菌的PAMPβ-葡聚糖和细菌的PAMP肽聚糖/BCG。训练免疫是表观遗传调节的，导致在再刺激时有更强的反应。骨髓祖细胞可以受到刺激，以在很长时间段里产生“训练的”骨髓细胞，以此为持久治疗干预提供强力框架。
在体外模型中，人类单核细胞暴露于白色念珠菌(C.albicans)或β-葡聚糖，显示了全基因组在表观遗传标记中的变化，包括H3K4me1、H3K4me和H3K27Ac(图14，上)。其他研究确定了BCG和肽聚糖作为这些训练免疫相关表观遗传修饰的诱导物，虽然是通过NOD2依赖途径。除了这些表观遗传修饰外，细胞代谢途径也被同时上调。事实上，这些代谢变化增强了细胞调节某些表观遗传酶功能的能力。β-葡聚糖训练时，dectin-1/Akt/mTOR/HIF-1α途径将细胞代谢从氧化磷酸化切换到糖酵解，其与基础呼吸频率降低、葡萄糖消耗增加以及乳酸产生增高有关。
虽然这些表观遗传和代谢变化很好地描述了个体骨髓细胞对刺激损伤的反应增强，但这种先天免疫记忆是如何被保存很长一段时间直到最近才清楚。单核细胞的寿命只有几天，而训练免疫的保护功能在患者中保持更长，长达几个月或几乎一年。最新的见解揭示，在系统水平上，训练免疫是一种功能程序，其也可以在特定的造血干细胞和祖细胞被诱导(图14，下)。在小鼠体内给药β-葡聚糖，更多的髓样多能祖细胞(myeloid-biasedmultipotent progenitors，MPPs)以及长期造血干细胞(long-term hematopoietic stemcells，LT-HSCs)在骨髓中被发现。多种细胞增殖相关途径，包括细胞周期基因、胆固醇生物合成以及糖酵解被上调，且这些增长被确定为IL-1β以及粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte/macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)依赖性的。这些效应的寿命被发现持续了长达一个月，而从β-葡聚糖训练的小鼠移植造血干细胞在未训练的接受者中引入骨髓生成。在BCG给药后产生类似的观察结果。
由于训练免疫是髓样多能祖细胞的一种特性，因此说明了旨在在骨髓祖细胞中积聚，用于引起针对训练免疫的长期治疗效果的纳米材料。
图15是一个细胞的说明，其显示了训练免疫是通过细菌、真菌和新陈代谢途径在细胞水平上调节的，导致了在细胞因子分泌的基础上的表观遗传修饰。
免疫信号事件导致训练免疫表型。
通过特定的受体信号通路促进微生物配体训练免疫的诱导，随后激活代谢、表观遗传和转录事件。目前确定的最重要的途径的概述被呈现在图中。
Dectin-1依赖性真菌途径
在识别β-葡聚糖后，天然免疫细胞引起对外源性病原体的非特异性免疫应答。β-葡聚糖存在于真菌细胞壁中，是葡萄糖聚合物，被巨噬细胞通过C型凝集素受体Dectin-151识别为PAMPs。通过Dectin-1的巨噬细胞激活诱导特定的表观遗传标记，其导致了训练免疫(图15，红色路径)。这种激活途径对于真菌感染是典型的，其可以被用于治疗干预；白色念珠菌的非致命性感染是一个实例。正如在介绍中提到的，白色念珠菌已被表明通过单核细胞依赖性训练免疫来保护小鼠抵抗致命的念珠菌病。
NOD2依赖性细菌途径
肽聚糖是一种PAMP，其与内毒素起增效作用，以引起炎性细胞因子的释放。所有细菌共有的肽聚糖最小生物活性基序是胞壁酰二肽(MDP)。先天免疫细胞通过MDP激活，使胞质PRR核苷酸结合寡聚结构域2(nucleotide-binding oligomerization domain 2，NOD2)参与。通过NF-Kβ的NOD2激活和信号，刺激巨噬细胞的表观遗传重排以及诱导训练免疫(图15，绿色路径)。这种训练免疫激活途径是细菌感染的特征，如BCG疫苗，其导致促炎细胞因子的产生。BCG的非特异性保护作用被用于非浸润性膀胱癌的免疫疗法。
氧化低密度脂蛋白
脂质代谢也可能导致训练免疫的诱导。氧化低密度脂蛋白(oxLDL)是一种DAMP，其结合细胞表面受体CD36。一旦其被内化并释放到细胞质中，oxLDL可以导致胆固醇晶体的形成，从而激活NLRP3炎症小体。最近的一份报告强调了激活NRLP3的关键作用，因为LdIr-/-小鼠的西方饮食的摄入，而通过炎症小体的激活，建立了oxLDL诱导的训练免疫和心血管疾病之间的机制联系。当oxLDL在单核细胞中诱导持久的促炎表型，并加速动脉粥样硬化时，组蛋白甲基转移酶抑制剂甲硫腺苷完全破坏oxLDL诱导的训练。
在训练免疫诱导中的代谢和表观遗传重排
在训练免疫的效果中，最重要的过程之一重排先天免疫细胞的新陈代谢。重排的关键部分是代谢从氧化磷酸化到有氧糖酵解的转换，其导致了天然免疫细胞激活和促炎细胞因子的分泌。白色念珠菌和β-葡聚糖通过AKT/mTOR/Hif-1α途径诱导这一特定的代谢过程。此外，BCG疫苗接种诱导免疫代谢激活和表观遗传重构，在BCG训练中通过2-脱氧葡萄糖(2-DG)抑制糖酵解，破坏增加的细胞因子产生(图15，紫色路径)。限速糖酵解酶的药理调节阻碍了以β-葡聚糖和BCG诱导的训练免疫为基础的组蛋白标记H3K4me3和H3K9me3。
在训练单核细胞中的另一个重要代谢事件是，由柠檬酸和乙酰CoA合成胆固醇和磷脂的Krebs循环的合成代谢再利用。β-葡聚糖训练后，胆固醇合成途径被上调，通过氟伐他汀限制胆固醇合成，下调H3K4me3以及防止促炎细胞因子的产生和训练免疫。合成胆固醇代谢物甲羟戊酸在这个过程中是非常重要的，因为训练免疫防止了酶抑制剂下游的3-羟基-3-甲基-戊二酰-辅酶A(HMG-CoA)-还原酶61(图15，黄色路径)。用2-DG抑制糖酵解，用雷帕霉素抑制mTOR通路，以及用甲硫腺苷(MTA，一种甲基转移酶抑制剂)抑制组蛋白甲基化，防止甲羟戊酸诱导的训练免疫，表明了训练巨噬细胞的分子、代谢和表观遗传控制之间的微妙平衡。
Krebs循环由谷氨酰胺分解重新补充。有趣的是，这导致了积累的琥珀酸，并特别是富马酸，富马酸是重要的表观遗传酶家族的辅助因子。在这方面，琥珀酸抑制JMJD3，导致增强特定基因(例如，与M2表型相关的)的H3K27三甲基化。然而，JMJD酶的表达在训练单核细胞中没有差异。相反，富马酸抑制KDM5组蛋白去甲基化酶：在训练的单核细胞60中，KDM5的表达和功能已显示被阻断/阻碍。因为KDM5是H3K4甲基化的去甲基化酶，它的抑制允许开放染色质的重要标志的长期稳定，并以此促进基因转录。
促进训练免疫
BCG通过NOD2依赖性细菌途径诱导训练免疫。NOD2是一种由肽聚糖激活的细胞内PRR，其是构成细菌细胞壁的糖和氨基酸的聚合物结构。能够诱导NOD2依赖性免疫反应的最小分子结构是胞壁酰二肽(MDP)。MDP是一种合成肽结合物，其包括N-乙酰胞壁酸和L-丙氨酸-D-异谷氨酰胺二肽的短氨基酸链。
或者，训练免疫可以通过Dectin-1途径由真菌病原体诱导。Dectin-1是一种C型凝集素跨膜信号受体，其可被富含β1,3-或同时含β1,3-和β1,6-连接的葡萄糖的多糖(称为β-葡聚糖)激活。其他激活dectin-1的多糖，包括脂质体制剂，被Palma及其同事进行了广泛的研究，他们发现dectin-1结合需要具有10-或11-聚体的最小长度的1,3-连接的葡萄糖低聚物。因此，与NOD2结合不同的是，小分子配体不能用于dectin-1依赖性训练免疫诱导。
除了PAMP的相关机制外，代谢“训练剂”，如尿酸和oxLDL，已显示出通过mTOR信号和蛋白激酶B磷酸化(AKT)来诱导训练免疫。这意味了尿酸本身可以用来诱导训练免疫。虽然oxLDL诱导训练的确切机制仍然一个研究课题，Christ及其同事们在NLRP3炎症小体以及下游IL-1R信号通路的重要性上获得了令人信服的证据，以此强调了IL-1β的关键作用。他们还对最近发现的oxLDL是胆固醇合成中间体甲羟戊酸的情况感兴趣。Bekkering及其同事发现甲羟戊酸通过IGF-1受体(IGF-1R)和mTOR和随后的组蛋白修饰61的激活来诱导训练。甲羟戊酸，附加地加上6-氟甲戊酸(6-fluoromevalonate)，可以因此在药理上用于诱导训练免疫。随着研究的继续，目前促进训练免疫的未知途径和分子结构-包括其他细菌和真菌的衍生物以及PAMPs-将可能会被确认。
图16是过程的概述的图示，并显示了抑制(绿色)或促进(红色)训练免疫的骨髓亲和纳米材料(bone marrow-avid nanomaterial)可用于启动免疫系统并治疗各种病症，范围从心血管疾病及其临床后果、自身免疫紊乱、到脓毒症和感染，以及癌症。
纳米颗粒递送载体可以提高药物达到预期目标的百分比，并改善治疗药物毒性情况。此外，纳米颗粒递送载体可以促进药物的细胞内化，其与核苷酸疗法特别相关。此外，纳米颗粒可以保护药物不会过早代谢或分解。
图17是通过促进训练免疫，实现启动对免疫检查点阻断疗法的免疫系统敏感性的图示。
例如，越来越明显的是，对于特定的肿瘤类型，检查点阻断免疫疗法只对一部分患者有利。Keynote-001127试验的汇总分析发现，大约34％的晚期黑色素瘤患者有客观应答，而6％的患者是完全应答者(full responder)。此外，在多种其他恶性肿瘤中，包括前列腺癌和卵巢癌，检查点抑制剂药物发挥非常小的治疗益处。
最近在来自患者的外周血的研究揭示—利用高维单细胞质谱流式细胞术和生物信息学管道—其经典激活单核细胞的频率可以预测治疗反应。然而，高水平的免疫抑制骨髓细胞导致T细胞功能障碍，以及对检查点阻断免疫治疗没有反应。我们预见训练免疫促进疗法可以促进全身性以及肿瘤积聚的经典激活单核细胞，以此增强对检查点抑制剂药物的敏感性，如图17所概述。
实施例
以下包括的实施例用于演示本公开的实施例。以下实施例仅通过说明的方式被呈现并用于帮助普通技术人员使用本公开。这些实施例并不打算以任何方式限制本公开的范围。本领域普通技术人员应当理解，根据本公开，在不背离本公开的精神和范围的情况下，可以对所公开的特定实施例进行许多改变，并仍然获得类似或相似的结果。
实施例1-微流化器组装物1
本实施例展示了一种药物组合物的制备，其包括刺激物和纳米级组装物，其中在纳米级组装物/乳剂中的刺激物浓度为4-8mg/mL，且该配方是以300mL的规模制成的。刺激物(2400mg)溶解于12mL氯仿/叔丁醇中。然后，该溶液加入至288mL纳米级组装物溶液中(3％w/v)，所述纳米级组装物溶液包括POPC/PHPC磷脂、apoA-I、三聚氰胺和胆固醇的混合物。该混合物在10,000-15,000rpm均质5分钟(Vitris均质机型号Tempest I.Q.)，以便形成原油乳状液，并然后转移到高压均质机中。在20,000psi下进行乳化同时回收乳液。生成的体系被转移到Rotavap中，并在减压下(25毫米汞)在40℃快速除去溶剂。产生的分散体是半透明的。该分散体通过多个过滤器连续过滤。过滤后的制剂尺寸为8-400nm。
实施例2-微流化器组装物2
本实施例展示了一种药物组合物的制备，其包括刺激物和纳米级组装物，其中在纳米级组装物/乳剂中的刺激物浓度为4-8mg/mL。且该配方是以300mL的规模制成的。
刺激物(2400mg)溶解于12mL氯仿/叔丁醇中。然后，该溶液加入至288mL纳米级组装物溶液中(3％w/v)，所述纳米级组装物溶液包括POPC/PHPC磷脂、apoA-I的肽模拟物、C16-C20甘油三酯的混合物、胆固醇和一种或多种甾醇酯的混合物、以及疏水聚合物。该混合物在10,000-15,000rpm均质5分钟(Vitris均质机型号Tempest I.Q.)，以便形成原油乳状液，并然后转移到高压均质机中。在20,000psi下进行乳化同时回收乳液。生成的体系被转移到Rotavap中，并在减压下(25毫米汞)在40℃快速除去溶剂。产生的分散体是半透明的。该分散体通过多个过滤器连续过滤。过滤后的制剂尺寸为35-100nm。
实施例3-实施例1和2的纳米生物的冷冻干燥
以任一个上述实施例生成纳米生物。分散体进一步冷冻干燥60个小时(FTSSystems，Dura-DryμP，斯通里奇，纽约州(Stone Ridge,N.Y))。产生的冷冻干燥块状物通过无菌水或0.9％(w/v)无菌盐水容易地重构为原始分散体。重构后的颗粒尺寸与冷冻干燥前相同。
实施例4-纳米生物单独或联合检查点抑制剂在减小肿瘤尺寸和提高训练免疫中有效
如本文所述，MTP-HDL纳米生物由磷脂DMPC、胆固醇和胞壁酰三肽磷脂酰乙醇胺(MTP-DSPE)配制。
在体外实验中，其中单核细胞分别暴露于“训练剂”药物(β-葡聚糖、MDP或MTP-HDL)24小时，此后用LPS静置和再刺激，从IL-6和TNF-α的分泌增加中理解，显示了MTP-HDL在体外人单核细胞中诱导训练免疫(图1)。体内PET-CT被用于定量和非侵入性研究89Zr标记的MTP-HDL纳米生物的体内行为。观察到对骨髓有高亲和力(图2)和MTP-HDL存在于造血干细胞和骨髓祖细胞中。
一个剂量应答研究，涉及不同方案，即以低剂量(0.375mg/kg MTP)以及高剂量(1.5mg/kg MTP)以及非功能化HDL对照组的1、2或3种注射，在携带B16F10黑色素瘤的C57BL/6中执行。在没有任何不良反应的情况下，观察到了剂量和方案依赖性(图3)。如图3所示，MTP-HDL所有剂量均缩小肿瘤体积，用1.5mg/kg的更高剂量给药2-3次更有效的缩小肿瘤体积。
最有效的方案，包含1.5mg/kg(MTP)3次MTP-HDL静脉注射，被用于正常C57BL/6小鼠。在最后一次MTP-HDL注射后的几个时间点，处死小鼠，并对单核细胞数量进行量化。因为MTP-HDL治疗，观察到单核细胞数量明显增加(图4)。
在单独一组实验中，正常C57BL/6小鼠接受了1.5mg/kg(MTP)3次静脉MTP-HDL注射，之后对它们进行了骨髓FDG-PET成像。由于FDG是一种糖类似物，它的摄取与代谢活性成比例，其被发现在用MTP-HDL处理的小鼠骨髓中更高(图5)。用MTP-HDL联合不同检查点阻断免疫疗法进行了体内治疗研究。治疗组由抗CTLA-4(图6)、抗PD-1(图7)或两者的组合(图8和图9)组成，在200μg检查点抑制剂药物剂量条件下，同时或不同时通过MTP-HDL诱导训练免疫。与几个对照相比，检查点抑制和MTP-HDL诱导的训练免疫的联合显著增强了抗肿瘤活性。
流式细胞术分析血液、骨髓和脾脏中的细胞，不仅显示单独的MDP-HDL会增加所有组织中的单核细胞和CDllb+细胞，而且超过对照和抗CTLA4和抗PD1疗法的结合，而这三者的结合是最有效地增加所有组织中两种类型的细胞。参见图10-13。
实施例5-训练免疫促进剂药物的放射性药物标记
在非限制性实施例中，训练免疫促进剂药物/分子的放射性药物标记可以通过各种类型的螯合剂、去铁胺B(DFO)实现，其可以用89Zr通过3个异羟肟酸基团形成稳定的螯合物。通常，磷脂与螯合剂化合物结合，用促进剂药物或分子制备纳米生物，最后，放射性同位素与纳米生物(已经连接了螯合剂)络合。
该方案包括DSPE-DFO的合成，通过磷脂DSPE与螯合剂DFO(p-NCS-Bz-DFO)的异硫氰酸酯衍生物的反应得到，其剂型制成纳米生物、以及纳米乳液，并随后用89Zr放射性标记这些纳米剂型。
选择放射性同位素89Zr是因为它的3.3天物理衰变半衰期，其消除了对于附近的回旋加速器的需求，并允许研究体内缓慢清除药物的研究，如抗体。虽然两者在本文中被预期为可行的，但89Zr相对低的正电子能量允许其相比于其他同位素(如124I)，具有更高的成像分辨率。
纳米治疗的89Zr标记使在患者中通过正电子放射断层造影术(PET)成像对体内行为的非侵入性研究成为可能。
该方案包括以下步骤：
螯合剂去铁胺B(DFO)与磷脂DSPE的结合，从而形成亲脂性螯合剂(DSPE-DFO)，其容易整合在不同脂质纳米颗粒平台中(～0.5wt％)；
纳米级组装物制剂的制备(使用超声波、纳米乳液使用热滴、或使用微流化)，其包含DSPE-DFO；以及
DSPE-DFO的标记包括，含89Zr的脂质纳米颗粒，通过将纳米颗粒与89Zr-草酸盐在pH～7和30-40℃的PBS中混合30-60分钟得到。
此外，纯化和表征方法也被用来获得纯净89Zr标记脂质纳米颗粒。通常使用离心过滤或PD-10脱盐柱进行纯化，并随后使用尺寸排阻放射HPLC(size exclusion radio-HPLC)进行评估。通常，放射化学产率>80％，且通常获得放射化学纯度>95％。
通常，通过PET/CT或PET/MRI，成像策略用于研究89Zr标记的纳米生物体内行为。
图19显示了使用纳米生物递送的放射性同位素的PET成像，并显示了鼠、兔子、猴子和猪模型的骨骼和脾脏中的纳米生物积累。
示例6-纳米生物(包括前药)的合成
材料和方法
所有化学品均购自西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich)、Medchem Express或赛力克化学(Selleckchem)，PES注射器过滤器购自CellTreat。世界精密仪器(World PrecisionInstruments)的NE-1002X型微流体泵联合MicroFluidic-Chipshop(#14-1038-0187-05)的Zeonor人字形混合器使用。用100kDa MWCO 20mL Vivaspin离心过滤器净化颗粒。透析袋来自赛默飞世尔(Thermo Scientific)。ApoA-I蛋白是用先前公布的程序自制纯化的。ApoA-I的光谱定量是在BioTek Cytation 3成像板阅读器上使用Bradfort法进行的。DLS和Zeta电位测量是在布鲁克海文仪器(Brookaven Instrument)公司的ZetaPals分析仪上进行的，用数量分布的平均值来确定颗粒的尺寸。1H和13C NMR样品用连接到Bruker Advance 600控制台的Bruker 600超磁磁体来分析，数据用TopSpin版本3.5pl 7处理。
所有药物的定量分析使用岛津(Shimadzu)UFLC装置(其配备有C18或CN柱)，通过HPLC进行分析。乙腈和水被用作流动相，并用SPD-M20a二极管阵列检测器检测化合物。
≈35nm纳米生物的合成
将10mg/ml氯仿、l-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC，250μL)、l-棕榈酰基-2-羟基基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(PHPC，65μL)、胆固醇(15μL)、三辛酸甘油酯(1000μL)和药物或(前体)药物(65μL)原液混合在20ml小瓶中，并在真空中干燥。产生的膜被再溶解在乙腈：甲醇混合物(95％：5％，总体积3mL)。分别在PBS溶液中制备ApoA-I蛋白溶液(0.1mg/ml)。使用微流化装置，将两种溶液被同时注入人字形混合器，以0.75ml/min的流速用于脂质溶液，以6ml/min的流速用于ApoA-I溶液。获得的溶液用100MWCO的Vivaspin管在4000rpm下通过离心过滤浓缩，以获得5mL的体积。加入PBS(5mL)，且溶液被浓缩至5mL，再加入PBS(5mL)并浓缩溶液至约3mL。剩余的溶液通过0.22μm的PES注射器过滤器过滤，以得到最终的纳米生物溶液。为了获得用于FACS测定的纳米生物，3,3’-双十八烷基氧碳花菁高氯酸盐(DIO-C18，0.25mg)被加入至乙腈溶液中。为了获得用于89Zr标记的纳米生物，DSPE-DFO(50μg)被加入至乙腈溶液(自制)中。为了扩大纳米生物合成的规模，简单地重复上述过程，直到产生足够的量。
纳米生物的合成(≈15nm)
为了合成尺寸为15nm的纳米颗粒，使用与合成尺寸为35nm的颗粒类似的微流化程序。这里，乙腈混合物包含有(同样来自10mg/ml原液)：POPC(250μL)、PHPC(15μL)、胆固醇(13μL)和药物或(前体)药物(65μL)乙腈溶液以0.75mL/min的速度注入。ApoA-I溶液(在PBS中0.1mg/mL)以3mL/min注射。为了获得用于FACS测定的纳米生物，DIO-C18(0.25mg)被加入至乙腈溶液中。为了获得用于89Zr标记的纳米生物，DSPE-DFO(50μg)被加入至乙腈溶液中。
纳米生物的合成(≈65nm)
为了合成尺寸为65nm的纳米颗粒，使用与合成尺寸为35nm的颗粒类似的微流化程序。这里，乙腈混合物包含有(同样来自10mg/ml原液)：POPC(250μL)、胆固醇(12μL)、三辛酸甘油酯(1400μL)和药物或(前体)药物(65μL)乙腈溶液以0.75mL/min的速度注入。ApoA-I溶液(在PBS中0.1mg/mL)以4mL/min注射。为了获得用于FACS测定的纳米生物，DIO-C18(0.25mg)被加入至乙腈溶液中。为了获得用于89Zr标记的纳米生物，DSPE-DFO(50μg)被加入至乙腈溶液中。
纳米生物的合成(≈120nm)
为了合成尺寸为120nm的纳米颗粒，使用与合成尺寸为35nm的颗粒类似的微流化程序。这里，乙腈混合物包含有(同样来自10mg/ml原液)：POPC(100μL)、胆固醇(10μL)、三辛酸甘油酯(4000μL)和药物或(前体)药物(65μL)乙腈溶液以0.75mL/min的速度注入。ApoA-I溶液(在PBS中0.1mg/mL)以1.5mL/min注射。为了获得用于FACS测定的纳米生物，DIO-C18(0.25mg)被加入至乙腈溶液中。为了获得用于89Zr标记的纳米生物，DSPE-DFO(50μg)被加入至乙腈溶液中。
4种不同粒径纳米颗粒的尺寸稳定性
将一等份(10μL)的最终颗粒溶液溶解于PBS(1mL)中，通过0.22μm PES注射器过滤器过滤，并通过DLS确定数均尺寸分布的平均值。样品在合成颗粒时以及合成后2、4、6、8、10天直接进行分析。
参照在附图中示出并在以下描述中详细说明的非限制实施例，对本文中的实施例及其各种特征和其有利细节进行了更全面的说明。公知组分和处理技术的描述被省略了，以免非必要地使本文中的实施例难以理解。本文中所使用的实施例仅意在促进方法的理解，其文中实施例可以被实施，并进一步使本领域的技术人员能够实施本文中的的实施例。因此，该实施例不应被解释为限制本文中的实施例的范围。
相反，提供的这些实施例使得本公开将是彻底和完全的，且将向本领域技术人员充分传达本发明的范围。贯穿全文，相同的数字指的是相同的元素。如本文所用的术语“和/或”包括一个或多个相关联的列出项的任何和所有组合。
本文所使用的术语仅用于描述特定实施例，并不旨在限制本发明的全部范围。如本文中使用的，除非上下文另有明确指示，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”也意在包括复数形式。将进一步理解的是，术语“包括(comprises)”和/或“包括(comprising)”，当在本说明书中使用时，指定了所陈述的特征、整数、步骤、操作、元素和/或组分的存在，但不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元素、组分和/或其组合。
除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语的含义与本领域普通技术人员通常理解的含义相同。本公开中的任何内容都不应解释为承认本公开中描述的实施例由于先前的发明，而无权先于这样的公开。本文件中使用的术语“包括”指“包括，但不限于。”
在不背离其精神和范围的情况下作出的许多修改和变化，将对于本领域技术人员而言是显而易见的。除了本文所列举的那些方法和装置之外，从前述描述中，本公开范围内的功能等价的方法和装置对于本领域的技术人员而言将是显而易见的。这些修改和变化旨在落入所附权利要求的范围内。本公开仅受所附权利要求的条款以及这些权利要求有权获得的等价物的全部范围的限制。应当理解，本公开不限于特定的方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，当然，这些方法、试剂、化合物、组合物或生物系统可以变化。还应当理解，这里使用的术语仅用于描述特定实施例，并不打算是限制性的。关于本文中基本上任何复数和/或单数术语的使用，本领域技术人员可以根据上下文和/或应用适当地从复数翻译成单数和/或从单数翻译成复数。为了清楚起见，各种单数/复数排列可以在此明确提出。
本领域的技术人员将理解，一般而言，这里使用的术语，特别是在所附权利要求中使用的术语(例如，所附权利要求的主体)，通常意在“开放”术语(例如，术语“包括”应被解释为“包括但不限于”，术语“具有”应被解释为“至少有”，术语“包括”应被解释为“包括但不限于”等)。本领域的技术人员将会理解，无论在说明书、权利要求书或附图中，实际上任何呈现两个或更多可选术语的连接词和/或短语都应该被理解为考虑包括其中一个术语、其中一个术语或两个术语的可能性。例如，短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。
此外，在按照马库什组合描述本公开的特征或方面的情况下，本领域的技术人员将认识到，由此也按照马库什组合的任何单个成员或成员子组来描述本公开。
如本领域技术人员将理解的，对于任何和所有目的，如提供书面描述而言，这里公开的所有范围还包括任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围都可以很容易地识别为充分描述并允许将相同的范围划分为至少相等的子部分。如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。
上述和其他特征和功能中的各种特征和功能或其替代方案可以组合到许多其他不同的系统或应用中。本领域的技术人员随后可以进行对其中的各种当前未预见或未预期的替换、修改、变化或改进，其中的每一种也意在包含在所公开的实施例中。
在这里描述了本发明的实施例之后，要注意的是，本领域技术人员可以根据上述教导进行修改和改变。因此应该理解，可以在所公开的发明的特定实施例中进行改变，这些改变在所附权利要求所定义的本发明的范围和精神内。在以专利法所要求的细节和特殊性描述了本发明之后，在所附权利要求中陈述了专利证书中要求和期望保护的内容。

Claims (32)

1.一种治疗患者的方法，所述方法通过诱导训练免疫来治疗癌症或脓毒症：
给予所述患者有效促进高反应性先天免疫反应的量的纳米生物组合物，
其中所述纳米生物组合物包括(i)纳米级组装物，具有(ii)包含在所述纳米级组装物中的先天免疫反应促进剂药物，
其中所述纳米级组装物是一种多组分载体组合物，其包括：(a)磷脂，和
(b)载脂蛋白A-I(apoA-I)或apoA-I的肽模拟物，
其中所述纳米生物，在水相环境中，是直径尺寸约8nm至400nm之间的纳米盘或纳米球，
其中所述纳米生物通过一种分子结构被功能化，该分子结构激活或结合病原体识别受体Dectin-1或NOD2，以在骨髓、血液和脾脏中的骨髓细胞及其干细胞和祖细胞中诱导训练免疫，其中激活或结合Dectin-1的分子结构选自由以下项组成的组：β-葡聚糖、和β-葡聚糖衍生物，和其中激活或结合NOD2的分子结构选自由以下项组成的组：肽聚糖和肽聚糖衍生物，
其中所述纳米级组装物递送训练免疫-促进剂分子结构到患者的骨髓、血液和/或脾脏中的骨髓细胞、骨髓祖细胞或造血干细胞中；以及
以此在患者内促进由训练免疫引起的高反应性先天免疫反应，并治疗癌症或脓毒症。
2.一种治疗患者的方法，所述方法通过诱导训练免疫来提高检查点抑制剂治疗有效性：
(1)给予所述患者有效促进高反应性先天免疫反应的量的纳米生物组合物，
其中所述纳米生物组合物包括(i)纳米级组装物，具有(ii)包含在纳米级组装物中的先天免疫反应促进剂药物，
其中所述纳米级组装物是一种多组分载体组合物，其包括：(a)磷脂，和，
(b)载脂蛋白A-I(apoA-I)或apoA-I的肽模拟物，
其中所述纳米生物，在水相环境中，是直径尺寸约8nm至400nm之间的纳米盘或纳米球，
其中所述纳米生物通过一种分子结构被功能化，该分子结构激活或结合病原体识别受体Dectin-1或NOD2，以在骨髓、血液和脾脏中的骨髓细胞及其干细胞和祖细胞中诱导训练免疫，其中激活或结合Dectin-1的分子结构选自由以下项组成的组：β-葡聚糖、和β-葡聚糖衍生物，和其中激活或结合NOD2的分子结构选自由以下项组成的组：肽聚糖和肽聚糖衍生物，
其中所述纳米级组装物递送训练免疫-促进剂分子结构到患者的骨髓、血液和/或脾脏中的骨髓细胞、骨髓祖细胞或造血干细胞中，
以此在患者内促进由训练免疫引起的高反应性先天免疫反应；和
(2)给予所述患者检查点抑制剂；
以此促进由训练免疫引起的高反应性先天免疫反应，改善检查点抑制剂治疗的效果。
3.一种在已经接受肿瘤诊断的患者中促进长期肿瘤缓解的方法，包括以下步骤：
(1)给予所述患者针对患者的癌症的标准治疗方案，所述方案选自由以下项组成的组：化疗、放射疗法、免疫疗法、及其治疗有效的组合；
(2)给予所述患者有效促进高反应性先天免疫反应的量的纳米生物组合物，
其中所述纳米生物组合物包括(i)纳米级组装物，具有(ii)包含在纳米级组装物中的先天免疫反应促进剂药物，
其中所述纳米级组装物是一种多组分载体组合物，其包括：(a)磷脂，和，
(b)载脂蛋白A-I(apoA-I)或apoA-I的肽模拟物，
其中所述纳米生物是一种分子结构，该分子结构激活或结合病原体识别受体Dectin-1或NOD2，其中激活或结合Dectin-1的分子结构选自由以下项组成的组：β-葡聚糖、和β-葡聚糖衍生物，和其中激活或结合NOD2的分子结构选自由以下项组成的组：肽聚糖和肽聚糖衍生物，
其中所述纳米生物，在水相环境中，是直径尺寸约8nm至400nm之间的纳米盘或纳米球，
其中所述纳米级组装物递送训练免疫-促进剂药物到患者的骨髓、血液和/或脾脏中的骨髓细胞、骨髓祖细胞或造血干细胞中，
以此在患者内促进由训练免疫引起的高反应性先天免疫反应；以及可选择地，
(3)给予所述患者检查点抑制剂；
以此促进由训练免疫引起的高反应性先天免疫反应，改善检查点抑制剂治疗的效果。
4.一种治疗受到有缺陷的训练免疫影响的患者的方法，以促进所述患者中长期高反应性先天免疫反应，所述方法包括：
(1)给予所述患者有效促进高反应性先天免疫反应的量的纳米生物组合物，
其中所述纳米生物组合物包括(i)纳米级组装物，具有(ii)包含在纳米级组装物中的先天免疫反应促进剂药物，
其中所述纳米级组装物是一种多组分载体组合物，其包括：(a)磷脂，和，
(b)apoA-I或apoA-I的肽模拟物，
其中，所述促进剂药物是一种分子结构，该分子结构激活或结合病原体识别受体Dectin-1或NOD2，以在骨髓、血液和脾脏中的骨髓细胞及其干细胞和祖细胞中诱导训练免疫，其中激活或结合Dectin-1的分子结构选自由以下项组成的组：β-葡聚糖、和β-葡聚糖衍生物，和其中激活或结合NOD2的分子结构选自由以下项组成的组：肽聚糖和肽聚糖衍生物，
其中所述纳米生物，在水相环境中，自组装进入直径尺寸约8nm至400nm之间的纳米盘或纳米球中，
其中所述纳米级组装物递送所述药物到患者的骨髓、血液和/或脾脏中的骨髓细胞、骨髓祖细胞或造血干细胞中，
并以此在患者内促进高反应性先天免疫反应；和，可选择地，
(2)在给予纳米生物组合物后，给予所述患者检查点抑制剂；
以此促进由训练免疫引起的高反应性先天免疫反应，改善检查点抑制剂治疗的效果。
5.一种对受到训练免疫影响的患者的骨髓、血液和/或脾脏中的促进剂药物积聚的放射性药物成像的方法，包括：
(1)给予所述患者有效促进高反应性先天免疫反应的量的纳米生物组合物，
其中所述纳米生物组合物包括(i)纳米级组装物，具有(ii)包含在纳米级组装物中的促进剂药物，以及(iii)包含在纳米级组装物中的正电子放射断层造影术(PET)成像试剂，
其中所述纳米级组装物是一种多组分载体组合物，其包括：(a)磷脂，和，
(b)apoA-I或apoA-I的肽模拟物，
其中，所述促进剂药物是一种分子结构，该分子结构激活或结合病原体识别受体Dectin-1或NOD2，以在骨髓、血液和脾脏中的骨髓细胞及其干细胞和祖细胞中诱导训练免疫，其中激活或结合Dectin-1的分子结构选自由以下项组成的组：β-葡聚糖、和β-葡聚糖衍生物，和其中激活或结合NOD2的分子结构选自由以下项组成的组：肽聚糖和肽聚糖衍生物，
其中，所述PET成像试剂选自由以下项组成的组：89Zr、124I、64Cu和86Y，和，其中，所述PET成像试剂通过合适的螯合剂与促进剂药物结合，以形成稳定的药物-试剂螯合物，
其中所述纳米生物，在水相环境中，自组装进入直径尺寸约8nm至400nm之间的纳米盘或纳米球中，
其中所述纳米级组装物递送稳定的药物-试剂螯合物到患者的骨髓、血液和/或脾脏中的骨髓细胞、骨髓祖细胞或造血干细胞中，
和
(2)对患者进行PET成像，以可视化患者体内的骨髓、血液和/或脾脏中的稳定的药物-试剂螯合物的生物分布。
6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述纳米级组装物还包括(c)疏水基质，其包括一种或多种甘油三酯、脂肪酸酯、疏水聚合物、或甾醇酯、或其组合。
7.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述纳米级组装物还包括(c)疏水基质，其包括一种或多种甘油三酯、脂肪酸酯、疏水聚合物、或甾醇酯、或其组合、以及(d)胆固醇。
8.权利要求5所述的方法，所述放射性药物成像方法还包括，在给予纳米生物组合物后，给予所述患者检查点抑制剂的附加步骤，以此促进由训练免疫引起的高反应性先天免疫反应，改善检查点抑制剂疗法的效果。
9.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述高反应性先天免疫反应被促进至少7至30天。
10.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述高反应性先天免疫反应被促进至少30天到100天。
11.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述高反应性先天免疫反应被促进多于100天并长达3年。
12.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述受到训练免疫影响的患者患有膀胱、血管、骨、脑、乳腺、宫颈、胸、结肠、子宫内膜、食道、眼、头、肾、肝、淋巴结、肺、口、颈、卵巢、胰腺、前列腺、直肠、皮肤、胃、睾丸、喉咙、甲状腺、尿路上皮或子宫的癌症。
13.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中给予所述纳米生物组合物一次，和，其中，高反应性先天免疫反应被促进至少30天。
14.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在多次给药方案的每一天中，至少给予一次纳米生物组合物，和其中高反应性先天免疫反应被促进至少30天。
15.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述促进剂药物是胞壁酰二肽(MDP)、胞壁酰三肽(MTP)、β-葡聚糖、11-13葡萄糖低聚物、糖的聚合物、ox-LDL、BCG、细菌肽聚糖、病毒肽、激活或结合Dectin-1或NOD2的药物或化合物或聚合物、炎症体促进剂、代谢途径促进剂、和/或造血干细胞(HSC)、共同骨髓祖(CMP)、或骨髓细胞中的表观遗传通路促进剂。
16.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述训练免疫被定义为一种次级长期高反应，表现为代谢和表观遗传重排引起的细胞因子分泌增加，在纳米生物给药后进行再刺激，以在骨髓中产生骨髓细胞及其祖细胞和干细胞的原发性损伤。
17.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述训练免疫被定义为通过纳米生物给药后，高细胞因子产生的长期增长反应，以产生骨髓先天免疫细胞的二次刺激，骨髓先天免疫细胞在纳米生物给药后，被诱导产生原发性损伤，刺激在骨髓的这些细胞或其祖细胞及干细胞，并通过表观遗传、代谢和转录重排介导。
18.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述促进剂药物是NOD2受体促进剂、mTOR促进剂、核糖体蛋白S6激酶β-1(S6K1)促进剂、组蛋白H3K27脱甲基酶促进剂、BET溴区结构域阻断促进剂、组蛋白甲基转移酶和乙酰基转移酶促进剂、DNA甲基转移酶和乙酰基转移酶促进剂、炎症小体促进剂、丝氨酸/苏氨酸激酶Akt促进剂、缺氧诱导因子1-α促进剂，也称为HIF-l-α，以及其混合物。
19.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述患者患有严重脓毒症或处于感染性休克中。
20.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述患者患有与肺部、腹部、肾脏或血液循环系统的细菌性、病毒性或真菌性感染相关的脓毒症。
21.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中治疗方案包括给予患者所述纳米生物组合物两次或更多次剂量，以在骨髓、血液和/或脾脏中的骨髓细胞、骨髓祖细胞和造血干细胞中产生药物积聚。
22.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述方法还包括与纳米生物组合物一起共同给予癌症药物而作为联合疗法。
23.一种用于促进训练免疫的纳米生物组合物，包括：
(i)纳米级组装物，具有(ii)包含在纳米级组装物中的促进剂药物，
其中，所述纳米级组装物是一种多组分载体组合物，其包括：
(a)磷脂，和
(b)apoA-I或apoA-I的肽模拟物，和
可选地，(c)疏水基质，其包括一种或多种甘油三酯、脂肪酸酯、疏水聚合物、或甾醇酯、或其组合物，以及
可选地，(d)胆固醇
其中，所述促进剂药物是一种分子结构，该分子结构激活或结合病原体识别受体Dectin-1或NOD2，以在骨髓、血液和脾脏中的骨髓细胞及其干细胞和祖细胞中诱导训练免疫，其中激活或结合Dectin-1的分子结构选自由以下项组成的组：β-葡聚糖、和β-葡聚糖衍生物，和其中激活或结合NOD2的分子结构选由以下项组成的组：肽聚糖和肽聚糖衍生物，
其中所述纳米生物，在水相环境中，自组装进入直径尺寸约8nm至400nm之间的纳米盘或纳米球中，
其中所述纳米级组装物递送药物到患者的骨髓、血液和/或脾脏中的骨髓细胞、骨髓祖细胞或造血干细胞中，
并以此在患者内促进高反应性先天免疫反应。
24.权利要求23所述的方法，其中所述促进剂药物是胞壁酰二肽(MDP)、胞壁酰三肽(MTP)、β-葡聚糖、11-13葡萄糖低聚物、糖的聚合物、ox-LDL、BCG、细菌肽聚糖、病毒肽、激活或结合Dectin-1或NOD2的药物或化合物或聚合物、炎症小体促进剂、代谢途径促进剂、和/或造血干细胞(HSC)、共同骨髓祖(CMP)、或骨髓细胞中的表观遗传途径促进剂。
25.权利要求23所述的方法，其中所述促进剂药物是NOD2受体促进剂、mTOR促进剂、核糖体蛋白S6激酶β-1(S6K1)促进剂、组蛋白H3K27脱甲基酶促进剂、BET溴区结构域阻断促进剂、组蛋白甲基转移酶和乙酰基转移酶促进剂、DNA甲基转移酶和乙酰基转移酶促进剂、炎症小体促进剂、丝氨酸/苏氨酸激酶Akt促进剂、缺氧诱导因子1-α促进剂，也称为HIF-l-α，以及其混合物。
26.一种用于在骨髓、血液和脾脏中成像积累的纳米生物放射性药物组合物，包括：
(i)纳米级组装物，具有(ii)包含在纳米级组装物中的促进剂药物，以及(iii)包含在纳米级组装物中的正电子放射断层造影术(PET)成像试剂，
其中所述纳米级组装物是一种多组分载体组合物，其包括：(a)磷脂，和，
(b)apoA-I或apoA-I的肽模拟物，和
可选地，(c)疏水基质，其包括一种或多种甘油三酯、脂肪酸酯、疏水聚合物、或甾醇酯、或其组合物，以及
可选地，(d)胆固醇
其中，所述促进剂药物是一种分子结构，该分子结构激活或结合病原体识别受体Dectin-1或NOD2，以在骨髓、血液和脾脏中的骨髓细胞及其干细胞和祖细胞中诱导训练免疫，其中激活或结合Dectin-1的分子结构选自由以下项组成的组：β-葡聚糖、和β-葡聚糖衍生物，和其中激活或结合NOD2的分子结构选自由以下项组成的组：肽聚糖和肽聚糖衍生物，
其中所述PET成像试剂选自由以下项组成的组：89Zr、124I、64Cu和86Y，和，其中，所述PET成像试剂通过合适的螯合剂与促进剂药物结合，以形成稳定的药物-试剂螯合物，
其中所述纳米生物，在水相环境中，自组装进入直径尺寸约8nm至400nm之间的纳米盘或纳米球中，
其中所述纳米级组装物递送稳定的药物-试剂螯合物到患者的骨髓、血液和/或脾脏中的骨髓细胞、骨髓祖细胞或造血干细胞中。
27.权利要求26所述的纳米生物组合物，其中所述促进剂药物是胞壁酰二肽(MDP)、胞壁酰三肽(MTP)、β-葡聚糖、11-13葡萄糖低聚物、糖的聚合物、ox-LDL、BCG、细菌肽聚糖、病毒肽、激活或结合Dectin-1或NOD2的药物或化合物或聚合物、炎症小体促进剂、代谢途径促进剂、和/或造血干细胞(HSC)、共同骨髓祖(CMP)、或骨髓细胞中的表观遗传途径促进剂。
28.权利要求26所述的纳米生物组合物，其中所述促进剂药物是NOD2受体促进剂、mTOR促进剂、核糖体蛋白S6激酶β-1(S6K1)促进剂、组蛋白H3K27脱甲基酶促进剂、BET溴区结构域阻断促进剂、组蛋白甲基转移酶和乙酰基转移酶促进剂、DNA甲基转移酶和乙酰基转移酶促进剂、炎症小体促进剂、丝氨酸/苏氨酸激酶Akt促进剂、缺氧诱导因子1-α促进剂，也称为HIF-l-α，以及其混合物。
29.一种用于制备抑制训练免疫的纳米生物组合物的方法，包括以下步骤：
将促进剂药物包含进纳米级组装物中；
其中所述纳米级组装物是一种多组分载体组合物，其包括：(a)磷脂，和，
(b)apoA-I或apoA-I的肽模拟物，和
可选地，(c)疏水基质，所述疏水基质包括一种或多种甘油三酯、脂肪酸酯、疏水聚合物、或甾醇酯、或其组合物，以及
可选地，(d)胆固醇
其中，所述促进剂药物是一种分子结构，该分子结构激活或结合病原体识别受体Dectin-1或NOD2，以在骨髓中的骨髓细胞及其干细胞和祖细胞中诱导训练免疫，
其中所述纳米生物，在水相环境中，自组装进入直径尺寸约8nm至400nm之间的纳米盘或纳米球中，
其中所述纳米级组装物递送药物到患者的骨髓、血液和/或脾脏中的骨髓细胞、骨髓祖细胞或造血干细胞中，
并以此在患者内的高反应性先天免疫反应。
30.权利要求29所述的用于制备纳米生物组合物的方法，其中所述促进剂药物是MDP、MTP、β-葡聚糖、糖的聚合物、ox-LDL、BCG、细菌肽聚糖、病毒肽、Dectin-1、炎症体促进剂、代谢途径促进剂、和/或造血干细胞(HSC)、共同骨髓祖(CMP)、或骨髓细胞中的表观遗传通路促进剂。
31.权利要求29所述的用于制备纳米生物组合物的方法，其中使用微流体、放大微流化技术、超声处理、有机相到水相的输注或脂质膜水化来组合所述组装物。
32.权利要求29所述的用于制备纳米生物组合物的方法，其中所述纳米级组装物还包括结合到放射性同位素螯合剂的磷脂。
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