KR20190019121A - 종양 내 정맥 형성 촉진제 - Google Patents

Abstract

포스파티딜콜린을 유효 성분으로 하고, 종양 혈관의 정맥화를 촉진하는 작용을 가지는 정맥 형성 촉진제, 종양 혈관 직경을 확장하는 작용을 가지는 혈관 직경 확장제, 리소인지질 수용체를 통하지 않고 종양 혈관을 연결시키는 작용을 가지는 혈관 연결 촉진제, 리소인지질 수용체를 통하지 않고 종양 영역 전체에의 백혈구의 침윤을 촉진시키는 작용을 가지는 백혈구 침윤 촉진제 및 종양 면역 활성화제를 제공한다.

Description

종양 내 정맥 형성 촉진제

본 발명은, 포스파티딜콜린을 유효 성분으로 하는 정맥 형성 촉진제, 혈관 직경 확장제, 혈관 연결 촉진제, 백혈구 침윤 촉진제 및 종양 면역 활성화제에 관한 것이다.

정상 조직의 혈관 형성은, 맥관 형성의 과정에 따라 순환망이 구축되는 것에서부터 시작된다. 이 맥관 형성의 과정은, 혈관내피세포의 발생, 내피세포에 의한 관강(管腔) 형성, 벽세포의 내피세포에의 피복화에 의한 혈관의 성숙화로 이루어진다. 기존 혈관이 형성된 후에 있어서의 염증이나 저산소의 발생에 따른 새로운 혈관의 형성은, 혈관 신생(발아적 혈관 형성)의 과정에 따라 유도된다. 종양 내에 형성되는 혈관도, 후자의 혈관 신생의 과정에 따라 유도된다. 종양 세포에의 산소나 양분의 공급은, 종양에 있어서의 혈관 형성의 유도에 따라 가능해진다. 그러므로, 종양의 혈관 신생을 억제함으로써 종양의 증대를 억제하는 치료법의 개발이 이루어져 왔다.

1971년에, 종양으로부터 분비되는 인자가, 기존 혈관으로부터 종양 내에 혈관을 유도하는 것이 발견되었다(비특허문헌 1). 이 인자는, 혈관 내피 성장 인자(VEGF; vascular endothelial growth factor)로서 동정되었다. VEGF는, 혈관내피세포에서 발현하는 VEGF 수용체(VEGFR1, 2, 3), 특히 VEGFR2를 활성화하고, 혈관내피세포의 증식이나 관강 형성과 관련된다. VEGF에 관해서는, 우선 중화 항체가 개발되어, 혈관 신생 저해제로서 빠르게 임상으로 이용되어 왔다(비특허문헌 2). 그러나, VEGF 중화 항체는, 단독으로는 항종양 효과가 발휘되지 않는 것이 밝혀졌다. 또한, 그 후 개발된 VEGF 수용체 티로신 키나아제 저해제도, 단독으로는 항종양 효과가 발휘되지 않는 것이 밝혀졌다. 한편, 이러한 혈관 신생 억제제와 항암제의 병용은, 항암제 단독보다도 우수한 효과가 있다는 것이 임상적으로 밝혀져 왔다. 혈관 신생 억제제와 항암제의 병용에 의한 치료 효과가 기초 의학적으로 해석되며, 이 병용 효과는, 혈관 신생 억제제가 종양 내 혈관의 일부를 정상화한 결과, 항암제의 종양 내에의 송달이 개선됨에 따른 것임을 시사하게 되었다(비특허문헌 3).

정상 혈관의 관강은, 혈관내피세포와 벽세포의 접착에 의해 구조적으로 안정화된다. 혈관내피세포간은, VE-카드헤린, 클라우딘5, 인테그린, 코넥신 등 여러 가지 접착 인자에 의해 밀착하고 있어, 혈관 내로부터 용이하게 물질이나 세포가 혈관 외로 누출하지 않게 제어된다. 정상 혈관내피세포와 벽세포 사이에는 접착밴드가 형성되며, 정상 혈관은, 내피세포와 벽세포 사이의 분자 교환을 통해 혈관 투과성을 제어한다. 또한, 정상 혈관에서는, 통상 좌우의 혈관은 패럴렐인 주행성을 나타낸다. 한편, 종양의 혈관에는 여러 가지 이상이 관찰된다. 구체적으로는, 종양 내 혈관은 투과성이 항진하고, 사행, 확장, 무질서한 혈관 분기를 가지며, 일부 낭상을 나타낸다. 종양 내 혈관에서는, 혈관내피세포 그 자체도 이상한 형태를 나타낸다. 또한, 배접하는 벽세포는, 종양 중심부에서는 매우 뜸하고, 내피세포와의 접착도 약하고, 많은 영역에서 벽세포의 배접이 결손된다. 이러한 이상의 대부분은, 종양 내의 VEGF 분비가 과잉인 것에 기인한다.

VEGF는 혈관내피세포의 강력한 증식 인자임과 동시에, 혈관내피세포끼리의 접착을 억제하고, 혈관 투과성을 항진시킨다. 이 상태가 계속되면, 종양 심부에 있어서 혈청 성분이나 섬유아세포가 집적하여, 종양 심부의 간질압은 매우 높아진다. 그 결과, 혈관 내압과 종양 심부의 조직압은 차이가 없어지고, 혈관 내로부터 조직에 약제 등이 송달되지 않게 된다. 더욱이, 림프구 등 면역 세포의 종양 내 유입도 억제된다. 면역 세포의 종양 내 유입이 억제되면, 암세포에 세포사를 유도할 수 없게 된다. VEGF로부터의 세포 내 시그널을 차단하면, 혈관내피세포끼리의 접착이 회복되어, 혈관 투과성의 항진 상태가 정상화된다. 그 결과, 혈관 내압이 종양 심부의 조직압보다 높아져, 혈관 내로부터 조직에 항암제나 면역 세포가 송달되게 된다. 그 때문에, 혈관 신생 억제제와 항암제의 병용은, 항암제 단독보다 우수한 효과가 있다고 사료된다. 또한, 면역 세포의 유입이 개선됨으로써, 항암제를 사용하지 않고, 암의 축소를 유도할 가능성도 있다.

그러므로, 종양 내의 혈관 투과성을 개선시켜 종양 내에의 약제의 송달을 유도하는 수단이, 암의 유효한 치료법이라고 사료되었다. 한편, 혈관 신생 저해약은, 혈관내피세포의 생존을 억제하고, 혈관내피세포나 그것과 상호작용 하는 혈관벽세포의 세포사를 유도하여, 종양 내의 허혈 상태를 촉진하는 것이 제안되었다. 종양 내의 저산소 상태는, 암세포의 악성화를 유도하고, 암의 침윤이나 전이를 촉진할 가능성이 있다고 지적되고 있다. 또한, 혈관 신생 저해약은 정상 조직의 혈관에도 장해를 주어, 혈압의 항진이나, 폐 출혈, 신장 장해 등의 위중한 부작용을 일으키는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 4, 5). 따라서, 종양 혈관을 퇴축시키지 않고, 정상 혈관에 영향을 주지 않고, 종양 혈관의 투과성을 정상화시키는 약제의 개발이 기대되고 있다.

본 발명자들은, 피하에 종양을 형성한 마우스에 리소포스파티딘산(LPA)을 투여하면, LPA가 LPA 수용체를 활성화함으로써, 종양 혈관의 네트워크 구축을 유도해 망상 구조로 정상화시켜, 혈관내강을 평활화하고, 혈관 투과성을 정상화하는 것을 발견하여, 특허 출원하였다(특허문헌 1).

특허문헌 1: 국제공개 제2015/152412호

비특허문헌 1: Folkman J, et al: Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis. J Exp Med 133: 275-288, 1971 비특허문헌 2: Gerber HP, Ferrara N. Pharmacology and pharmacodynamics of bevacizumab as monotherapy or in combination with cytotoxic therapy in preclinical studies. Cancer Res 65; 671-680, 2005 비특허문헌 3: Jain RK: Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy. Science 307: 58-62, 2005 비특허문헌 4: Ebos JML et al. Accelerated metastasis after short-term treatment with a potent inhibitor of tumor angiogenesis. Cancer Cell 15: 232-239, 2009 비특허문헌 5: Paez-Ribes M et al. Antiangiogenic therapy elicits malignant progression of tumors to increased local invasion and distant metastasis. Cancer Cell 12: 220-231, 2009.

본 발명은, 정상 혈관에 영향을 주지 않고 종양 내부의 분단된 혈관을 연결시킴과 동시에 정맥 형성을 촉진함으로써 면역 세포의 종양 내에의 침윤을 유도하는 물질을 발견하여, 해당 물질의 신규 용도를 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명은, 상기 과제를 해결하기 위해 이하의 각 발명을 포함한다.

[1] 포스파티딜콜린을 유효 성분으로 하고, 종양 혈관의 정맥화를 촉진하는 작용을 가지는 것을 특징으로 하는 정맥 형성 촉진제.

[2] 종양 혈관 직경을 확장하는 작용 및/또는 종양 혈관을 연결시키는 작용을 가지는 것을 특징으로 하는 상기 [1]에 기재된 정맥 형성 촉진제.

[3] 포스파티딜콜린이, 1종류의 포스파티딜콜린 또는 2종류 이상의 포스파티딜콜린의 혼합물인 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 정맥 형성 촉진제.

[4] 암 면역요법과 조합해 사용하는 상기 [1]~[3] 중 어느 하나에 기재된 정맥 형성 촉진제.

[5] 암 면역요법이, 면역 억제 해제 요법 및/또는 면역 세포 수주 요법인 상기 [4]에 기재된 정맥 형성 촉진제.

[6] 면역 억제 해제 요법에 이용하는 면역 체크 포인트 저해제가, 항CTLA-4 항체, PD-1 차단약, 항PD-1 항체, PD-L1 차단약 또는 항PD-L1 항체인 상기 [5]에 기재된 정맥 형성 촉진제.

[7] 포스파티딜콜린을 유효 성분으로 하고, 종양 혈관 직경을 확장하는 작용을 가지는 것을 특징으로 하는 혈관 직경 확장제.

[7-2] 포스파티딜콜린이, 1종류의 포스파티딜콜린 또는 2종류 이상의 포스파티딜콜린의 혼합물인 상기 [7]에 기재된 혈관 직경 확장제.

[7-3] 암 면역요법과 조합해 사용하는 상기 [7] 또는 [7-2]에 기재된 혈관 직경 확장제.

[7-4] 암 면역요법이, 면역 억제 해제 요법 및/또는 면역 세포 수주 요법인 상기 [7-3]에 기재된 혈관 직경 확장제.

[7-5] 면역 억제 해제 요법에 이용하는 면역 체크 포인트 저해제가, 항CTLA-4 항체, PD-1 차단약, 항PD-1 항체, PD-L1 차단약 또는 항PD-L1 항체인 상기 [7-4]에 기재된 혈관 직경 확장제.

[8] 포스파티딜콜린을 유효 성분으로 하고, 리소인지질 수용체를 통하지 않고 종양 혈관을 연결시키는 작용을 가지는 것을 특징으로 하는 혈관 연결 촉진제.

[8-2] 포스파티딜콜린이, 1종류의 포스파티딜콜린 또는 2종류 이상의 포스파티딜콜린의 혼합물인 상기 [8]에 기재된 혈관 연결 촉진제.

[8-3] 암 면역요법과 조합해 사용하는 상기 [8] 또는 [8-2]에 기재된 혈관 연결 촉진제.

[8-4] 암 면역요법이, 면역 억제 해제 요법 및/또는 면역 세포 수주 요법인 상기 [8-3]에 기재된 혈관 연결 촉진제.

[8-5] 면역 억제 해제 요법에 이용하는 면역 체크 포인트 저해제가, 항CTLA-4 항체, PD-1 차단약, 항PD-1 항체, PD-L1 차단약 또는 항PD-L1 항체인 상기 [8-4]에 기재된 혈관 연결 촉진제.

[9] 포스파티딜콜린을 유효 성분으로 하고, 리소인지질 수용체를 통하지 않고 종양 영역 전체에의 백혈구의 침윤을 촉진시키는 작용을 가지는 것을 특징으로 하는 백혈구 침윤 촉진제.

[9-2] 포스파티딜콜린이, 1종류의 포스파티딜콜린 또는 2종류 이상의 포스파티딜콜린의 혼합물인 상기 [9]에 기재된 백혈구 침윤 촉진제.

[9-3] 암 면역요법과 조합해 사용하는 상기 [9] 또는 [9-2]에 기재된 백혈구 침윤 촉진제.

[9-4] 암 면역요법이, 면역 억제 해제 요법 및/또는 면역 세포 수주 요법인 상기 [9-3]에 기재된 백혈구 침윤 촉진제.

[9-5] 면역 억제 해제 요법에 이용하는 면역 체크 포인트 저해제가, 항CTLA-4 항체, PD-1 차단약, 항PD-1 항체, PD-L1 차단약 또는 항PD-L1 항체인 상기 [9-4]에 기재된 백혈구 침윤 촉진제.

[10] 백혈구가 CD4 양성 세포 및/또는 CD8 양성 세포인 상기 [9]에 기재된 백혈구 침윤 촉진제.

[11] 포스파티딜콜린을 유효 성분으로 하고, 리소인지질 수용체를 통하지 않고 종양 영역 전체에의 백혈구의 침윤을 촉진시키는 작용을 가지는 것을 특징으로 하는 종양 면역 활성화제.

[11-2] 포스파티딜콜린이, 1종류의 포스파티딜콜린 또는 2종류 이상의 포스파티딜콜린의 혼합물인 상기 [11]에 기재된 백혈구 침윤 촉진제.

[11-3] 암 면역요법과 조합해 사용하는 상기 [11] 또는 [11-2]에 기재된 백혈구 침윤 촉진제.

[11-4] 암 면역요법이, 면역 억제 해제 요법 및/또는 면역 세포 수주 요법인 상기 [11-3]에 기재된 백혈구 침윤 촉진제.

[11-5] 면역 억제 해제 요법에 이용하는 면역 체크 포인트 저해제가, 항CTLA-4 항체, PD-1 차단약, 항PD-1 항체, PD-L1 차단약 또는 항PD-L1 항체인 상기 [11-4]에 기재된 백혈구 침윤 촉진제.

[12] 백혈구가 CD4 양성 세포 및/또는 CD8 양성 세포인 상기 [11]에 기재된 종양 면역 활성화제.

본 발명의 유효 성분인 포스파티딜콜린은, 정상 혈관에 영향을 주지 않고 종양 내부가 비정상적으로 분단된 혈관을 연결시킴과 동시에, 종양 혈관의 직경을 확장해 정맥 형성을 촉진할 수 있다. 백혈구 등의 염증 세포는, 모세혈관으로부터가 아닌, 정맥으로부터 조직에 침입하는 것이 알려져 있으므로, 포스파티딜콜린은, 종양 내의 혈류 상태를 개선하고, 종양 영역 전체에의 백혈구의 침윤을 촉진하고, 종양 내부의 종양 면역을 활성화시켜, 종양의 증대를 억제할 수 있다. 본 발명의 정맥 형성 촉진제, 혈관 직경 확장제, 혈관 연결 촉진제, 백혈구 침윤 촉진제 및 종양 면역 활성화제는, 종양 혈관을 파탄시키지 않고, 종양 내부의 저산소 영역을 감소시키기 때문에, 암세포의 악성화를 유도하지 않는다는 우수한 효과를 가진다. 더욱이, 본 발명의 정맥 형성 촉진제, 혈관 직경 확장제, 혈관 연결 촉진제, 백혈구 침윤 촉진제 및 종양 면역 활성화제는, 병용하는 약제를 종양 내부에 효율적으로 송달할 수 있다는 우수한 효과를 가진다.

도 1은 마우스 Lewis 폐암 세포주(이하 「LLC 세포」라고 적는다)를 피하에 접종하여 종양을 형성시킨 마우스에 대두 포스파티딜콜린 또는 인트라리포즈(Intralipos) 수액 20%(상품명, 오오츠카세이야쿠, 정제 노른자 레시틴을 100μL당 1.2mg 함유)를 9일간 투여하여, 종양 증대 억제 효과를 검토한 결과를 도시한 도면이다.
도 2는 LLC 세포를 피하에 접종하여 종양을 형성시킨 마우스에 대두 포스파티딜콜린 또는 인트라리포즈 수액 20%(상품명, 오오츠카세이야쿠)를 9일간 투여하여, 종양 혈관의 구조 변화를 평가한 결과를 도시한 도면이다.
도 3은 LLC 세포를 피하에 접종하여 종양을 형성시킨 마우스에 대두 포스파티딜콜린 또는 인트라리포즈 수액 20%(상품명, 오오츠카세이야쿠)를 9일간 투여하여, CD4 양성 세포의 종양 내 침윤을 평가한 결과를 도시한 도면이다.
도 4는 LLC 세포를 피하에 접종하여 종양을 형성시킨 마우스에 대두 포스파티딜콜린 또는 인트라리포즈 수액 20%(상품명, 오오츠카세이야쿠)를 9일간 투여하여, CD8 양성 세포의 종양 내 침윤을 평가한 결과를 도시한 도면이다.
도 5는 LLC 세포를 피하에 접종하여 종양을 형성시킨 마우스에 대두 포스파티딜콜린 또는 리소포스파티딜콜린을 9일간 투여하여, 종양 혈관의 구조 변화를 평가한 결과를 도시한 도면이다.
도 6은 마우스 대장암 세포주인 colon26 세포를 피하에 접종하여 종양을 형성시킨 마우스에 대두 포스파티딜콜린을 7일간 투여하여, 종양 혈관의 구조 변화를 평가한 결과를 도시한 도면이다.
도 7은 마우스 대장암 세포주인 colon26 세포를 피하에 접종하여 종양을 형성시킨 마우스에 대두 포스파티딜콜린을 7일간 투여하여, CD4 양성 세포 및 CD8 양성 세포의 종양 내 침윤을 평가한 결과를 도시한 도면이다.
도 8은 마우스 멜라노마 세포주인 B16 세포를 피하에 접종하여 종양을 형성시킨 마우스에 대두 포스파티딜콜린을 7일간 투여하여, 종양 혈관의 구조 변화를 평가한 결과를 도시한 도면이다.
도 9는 마우스 멜라노마 세포주인 B16 세포를 피하에 접종하여 종양을 형성시킨 마우스에 대두 포스파티딜콜린을 7일간 투여하여, CD4 양성 세포 및 CD8 양성 세포의 종양 내 침윤을 평가한 결과를 도시한 도면이다.
도 10은 LLC 세포를 피하에 접종하여 종양을 형성시킨 마우스에 대두 포스파티딜콜린과 항PD-1 항체를 병용 투여하여, 종양 증대 억제 효과를 검토한 결과를 도시한 도면이다.
도 11은 colon26 세포를 피하에 접종하여 종양을 형성시킨 마우스에 대두 포스파티딜콜린과 항PD-1 항체를 병용 투여하여, 종양 증대 억제 효과를 검토한 결과를 도시한 도면이다.
도 12는 colon26 세포를 피하에 접종하여 종양을 형성시킨 마우스에 대두 포스파티딜콜린을 7일간 투여하여, 최종 투여 익일에 다른 마우스로부터 채취한 림프구를 정맥 내 투여하고, 투여한 림프구의 종양 내 침윤을 평가한 결과를 도시한 도면이다.
도 13은 B16 세포를 피하에 접종하여 종양을 형성시킨 마우스에 대두 포스파티딜콜린을 7일간 투여하여, 최종 투여 익일에 다른 마우스로부터 채취한 림프구를 정맥 내 투여하고, 투여한 림프구의 종양 내 침윤을 평가한 결과를 도시한 도면이다.
도 14는 LLC 세포를 피하에 접종하여 종양을 형성시킨 마우스에 대두 포스파티딜콜린을 7일간 투여하여, 최종 투여 익일에 다른 마우스로부터 채취한 림프구를 정맥 내 투여하고, 투여한 림프구의 종양 내 침윤을 평가한 결과를 도시한 도면이다.
도 15는 LLC 세포를 피하에 접종하여 종양을 형성시킨 마우스에 디스테아로일 포스파티딜콜린을 7일간 투여하여, CD4 양성 세포 및 CD8 양성 세포의 종양 내 침윤을 평가한 결과를 도시한 도면이다.
도 16은 LLC 세포를 피하에 접종하여 종양을 형성시킨 마우스에 대두 포스파티딜콜린 또는 인트라리포즈 수액 20%(상품명, 오오츠카세이야쿠)를 7일간 투여하여, 종양 내의 저산소 영역을 관찰한 결과를 도시한 도면이다.
도 17은 LLC 세포를 피하에 접종하여 종양을 형성시킨 마우스에 대두 포스파티딜콜린 또는 인트라리포즈 수액 20%(상품명, 오오츠카세이야쿠)를 7일간 투여하고, 그 익일에 독소루비신을 투여하고, 독소루비신의 종양 내 이행을 관찰한 결과를 도시한 도면이다.
도 18은 LLC 세포를 피하에 접종하여 종양을 형성시킨 마우스에 대두 포스파티딜콜린과 5-FU를 병용 투여하여, 종양 증대 억제 효과를 검토한 결과를 도시한 도면이다.
도 19는 배양 인간 탯줄 정맥 내피 세포(HUVEC)의 관강 형성에 미치는 대두 포스파티딜콜린의 효과를 검토한 결과를 도시한 도면이다.
도 20은 배양 인간 탯줄 정맥 내피 세포(HUVEC)의 관강 형성에 미치는 각종 포스파티딜콜린의 효과를 검토한 결과를 도시한 도면이다.

포스파티딜콜린(phosphatidylcholine)은 인지질의 일종으로, 레시틴이라고도 칭한다. 인지질은 다른 지질과 달리, 에너지원이 될 뿐만 아니라, 지질 메디에이터로서 세포의 정보 전달에도 관여한다. 포스파티딜콜린은 사람의 체내에 존재하는 인지질로서는 가장 많으며, 세포막을 구성하는 주성분으로서 기능한다. 포스파티딜콜린은, 신경전달물질인 아세틸콜린의 재료로서의 기능도 알려져 있으며, 부교감 신경의 자극을 전달하여, 학습이나 기억, 수면에 관련된다고 여겨지고 있다. 또한, 지질 대사에도 관련되어, 간장 보호 작용이 알려져 있다. 포스파티딜콜린의 물질적인 특징은, 물과 기름 모두의 성질을 겸비하는 것이다. 포스파티딜콜린은 인산, 콜린, 글리세린, 지방산의 4개의 요소로 구성되어 있지만, 인산과 콜린은 친수성이고, 글리세린과 지방산은 친유성이기 때문에, 물과 기름을 혼합하는 유화 작용을 가진다. 이 유화 작용에 의해, 세포 내의 수용성 물질과 지용성 물질을 용합할 수 있어, 세포 내에의 양분의 흡수, 세포 외에의 노폐물 등의 배출과 관련될 수 있다. 또한, 유화 작용에 의한 지질 대사의 활성화로, 고지혈증의 개선이나 동맥 경화의 예방에 효과가 있다고 생각된다. 그렇지만, 포스파티딜콜린이 종양 내의 혈관에 어떠한 영향을 주는지에 대해서는 전혀 알려지지 않았다.

본 발명자들은, 피하에 암세포를 이식해 종양을 형성시킨 마우스에 포스파티딜콜린을 투여한 바, 포스파티딜콜린을 투여하지 않은(무처치) 마우스와 비교해 종양의 증대가 억제되는 것, 무처치 마우스의 종양 혈관에는 사행이나 무질서한 분기가 확인되었지만, 포스파티딜콜린 투여 마우스의 종양 혈관에서는, 분단된 혈관이 연결되어 정상 조직과 동일한 망상 구조로 변화하여, 일부 혈관이 확장해 정맥처럼 되는 것을 발견했다. 또한, 포스파티딜콜린 투여 마우스의 종양 내부에 있어서의 면역 세포의 국재를 관찰한 바, 무처치 마우스의 종양 조직과 비교해, CD4 양성 세포 및 CD8 양성 세포가 종양의 중심부를 포함하는 종양 영역 전체에 다수 존재하는 것을 발견했다. 즉, 본 발명자들은, 포스파티딜콜린이 종양 영역 전체에의 면역 세포의 침윤을 촉진시키는 작용을 가지는 것을 발견했다. 이들 결과로부터, 포스파티딜콜린 투여에 의해 종양 내에의 CD8 양성의 세포 장해성 T세포나 CD4 양성의 헬퍼T세포의 침윤이 항진하고, 종양 면역이 활성화 되어, 세포 장해성 T세포가 종양 세포를 공격해 항종양 효과가 유도된 것이라고 생각되었다.

본 발명자들은, 이전에, 피하에 종양을 형성시킨 마우스에 리소포스파티딘산(LPA)을 투여하면, LPA가 LPA 수용체를 활성화함으로써, 종양 혈관의 네트워크 구축을 유도해 망상 구조로 정상화시켜, 혈관 내강을 평활화하고, 혈관 투과성을 정상화하는 것을 발견했다(특허문헌 1). 리소포스파티딘산은 리소포스파티딜콜린으로부터 효소에 의해 합성되고, 리소포스파티딜콜린은 포스파티딜콜린의 효소 분해에 의해 생성한다는 점에서, 이번 지견이, 투여한 포스파티딜콜린이 생체 내에서 리소포스파티딘산에 분해되고, 리소포스파티딘산 수용체를 활성화해 유도된 효과일 가능성이 있었다. 그러나, 포스파티딜콜린 투여에 의해 관찰된 종양 내 혈관 구조의 개선이나 면역 세포의 침윤 촉진이, 리소포스파티딜콜린 투여에서는 관찰되지 않았던 것(참고예 1 참조), 및 리소포스파티딘산 수용체 4를 결손한 마우스를 이용한 실험에 있어서, 포스파티딜콜린의 투여에 의해 종양 내 혈관 구조의 개선이나 면역 세포의 침윤 촉진이 관찰된 점에서, 포스파티딜콜린에 의한 효과는, 리소포스파티딘산 수용체를 통하는 것은 아닌 것이 판명되었다.

또한, 특허문헌 1에는, 리소인지질 수용체를 활성화하는 물질을 투여한 경우의 효과로서, 사행이나 무질서한 분기가 인정된 종양 혈관을 정상 조직과 동일한 망상 구조로 변화시켜, 혈관의 투과성을 정상화시키는 것이 개시되어 있지만, 연결된 종양 혈관이 확장해 정맥화하는 것이나, 면역 세포가 종양 영역 전체에 침윤하는 것에 대해서는 기재도 시사도 없다. 즉, 포스파티딜콜린이 리소포스파티딘산의 선구체라는 인식에서 투여된 경우에도, 포스파티딜콜린 투여에 의해 갖게 되는 효과는, 특허문헌 1의 기재로부터 예측할 수 있는 것은 아니다.

본 발명은, 포스파티딜콜린을 유효 성분으로 하고, 종양 혈관의 정맥화를 촉진하는 작용을 가지는 정맥 형성 촉진제를 제공한다. 또한, 본 발명은, 포스파티딜콜린을 유효 성분으로 하고, 종양 혈관 직경을 확장하는 작용을 가지는 혈관 직경 확장제를 제공한다. 또한, 본 발명은, 포스파티딜콜린을 유효 성분으로 하고, 리소인지질 수용체를 통하지 않고 종양 혈관을 연결시키는 작용을 가지는 혈관 연결 촉진제를 제공한다. 또한, 본 발명은, 포스파티딜콜린을 유효 성분으로 하고, 리소인지질 수용체를 통하지 않고 종양 영역 전체에의 백혈구의 침윤을 촉진시키는 작용을 가지는 백혈구 침윤 촉진제 및 종양 면역 활성화제를 제공한다. 이하 이러한 발명을 통틀어 「본 발명의 약제」라고 칭한다. 또한, 본 발명의 약제의 유효 성분인 포스파티딜콜린에는, 다른 치료약을 내포 또는 복합하거나 리포솜 또는 콜로이드 입자의 형태로 투여하는 제를 구성하는 포스파티딜콜린은 포함되지 않는다.

본 발명의 약제의 유효 성분인 포스파티딜콜린(레시틴이라고도 칭해진다)은, 글리세린의 C1위 및 C2위 지방산, 및 C3위 포스포콜린이 각각 에스테르 결합한 구조를 가지는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 포스파티딜콜린으로서는, 예를 들면, 노른자 레시틴, 대두 레시틴, 대두 포스파티딜콜린, 디옥타노일포스파티딜콜린, 디노나노일포스파티딜콜린, 디데카노일포스파티딜콜린, 디운데카노일포스파티딜콜린, 디라우로일포스파티딜콜린, 디미리스토일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 디팔미토올레오일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린, 디리놀레오일포스파티딜콜린, 디에이코사펜타에노일포스파티딜콜린, 디도코사헥사에노일포스파티딜콜린, 디에루코일포스파티딜콜린, (1-미리스토일-2-팔미토일)포스파티딜콜린, (1-팔미토일-2-미리스토일)포스파티딜콜린, (1-올레오일-2-팔미토일)포스파티딜콜린, (1-팔미토일-2-올레오일)포스파티딜콜린 등을 들 수 있다.

본 발명의 약제에 사용하는 포스파티딜콜린은, 천연원으로부터 추출된 것이어도 좋고, 화학적으로 합성된 것이어도 좋다. 천연원으로부터 추출된 포스파티딜콜린으로서는, 노른자 레시틴, 대두 레시틴, 대두 포스파티딜콜린 등을 들 수 있다. 고품질, 고순도의 정제 노른자 레시틴이나 정제 대두 레시틴이 시판되고 있으며, 이들을 바람직하게 이용할 수 있다. 포스파티딜콜린은, 2종류 이상의 포스파티딜콜린을 포함하는 것이어도 좋고, 1종류의 포스파티딜콜린으로 이루어진 것이어도 좋다. 천연원으로부터 추출된 포스파티딜콜린은, 통상, 복수 종류의 포스파티딜콜린의 혼합물이다.

포스파티딜콜린을 구성하는 지방산기는 포화 지방산기여도 좋고, 불포화 지방산기여도 좋다. 지방산기의 탄소수는 특별히 한정되지 않고, 2 이상, 4 이상, 6 이상, 8 이상, 10 이상, 15 이상, 20 이상, 30 이상이어도 좋다. 또한, 지방산기의 탄소수는, 100 이하, 80 이하, 60 이하, 50 이하, 40 이하, 30 이하여도 좋다. 불포화 지방산기의 이중 결합수는 특별히 한정되지 않고, 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상이어도 좋다. 또한, 불포화 지방산기의 이중 결합수는, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 2 이하여도 좋다. 포스파티딜콜린을 구성하는 2개의 지방산기는 동일해도 좋고, 차이가 나도 좋다. 즉, 포스파티딜콜린을 구성하는 2개의 지방산기는, 동일한 포화 지방산기여도 좋고, 동일한 불포화 지방산기여도 좋고, 다른 포화 지방산기여도 좋고, 다른 불포화 지방산기여도 좋고, 한쪽이 포화 지방산기고 다른 쪽이 불포화 지방산기여도 좋다.

본 발명에 있어서, 종양은 세포가 이상 증식하여 덩어리를 형성한 상태를 의미하며, 양성 종양 및 악성 종양이 포함된다. 본 발명의 약제에 의해, 혈관의 정맥화 및 백혈구의 침윤을 촉진시키는 대상의 종양은, 양성 종양이어도 악성 종양이어도 좋지만, 악성 종양이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 고형암이다. 고형암은, 그 내부에 사행이나 무질서한 분기를 가지는 혈관이 형성되어, 혈관내강의 구조는 일그러지고, 혈관 투과성은 과잉으로 항진한다. 고형암은 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 폐암, 대장암, 전립선암, 유방암, 췌장암, 식도암, 위암, 간장암, 담관암, 비장암, 신장암, 방광암, 자궁암, 난소암, 정소암, 갑상선암, 뇌종양 등을 들 수 있다. 또한, 암화한 혈액 세포가 종양을 형성한 것도 고형암에 포함된다.

본 발명에 있어서, 종양 혈관의 정맥화는, 예를 들면, 종양의 조직 표본을 제작하고, 혈관내피세포에 특이적인 항체를 이용해 면역 염색을 실시하고, 혈관 직경을 측정함으로써 확인할 수 있다. 구체적으로는, 혈관 직경이 10μm를 넘는 경우에 정맥화했다고 판단할 수 있다. 바람직하게는 12μm 이상, 보다 바람직하게는 15μm 이상이다. 또한, 종양 혈관의 정맥화는, 정맥 세포 특이적인 유전자 발현에 의해 확인할 수 있다. 정맥 세포 특이적인 유전자로서는, EphB4, COUP-TFII 등을 들 수 있다. 유전자 발현은, 샘플로부터 추출한 핵산을 이용하여, PCR 등 공지의 방법으로 확인할 수 있다. 혈관 직경과 정맥 세포 특이적인 유전자 발현을 조합해 판단해도 좋다. 구체적으로는, 예를 들면, 혈관 직경이 10μm를 넘고, 또한, 혈관 조직에 있어서 EphB4 및 COUP-TFII가 발현하는 것을 확인할 수 있는 경우에, 종양 혈관이 정맥화했다고 판단해도 좋다.

본 발명에 있어서, 백혈구는 림프구(T세포, B세포, NK세포), 단구(마크로파지, 수지상세포), 과립구(호중구, 호산구, 호염기구)를 포함한다. 본 발명의 약제에 의해 종양 영역 전체에의 침윤이 촉진되는 백혈구는 특별히 한정되지 않고, 백혈구에 포함되는 모든 세포도 침윤이 촉진된다. 바람직하게는, 종양 내에 있어서 종양 면역을 활성화 시키는 기능을 가지는 세포(종양 면역 담당 세포)이다. 이러한 세포로서, 세포 장해성 T세포, NK세포, NKT세포, 킬러세포, 마크로파지, 과립구, 헬퍼T세포, LAK세포 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약제에 의해 종양 중심부에의 침윤이 촉진되는 백혈구는, CD4 양성 세포 및/또는 CD8 양성 세포인 것이 바람직하다. CD4 양성 세포는 헬퍼T세포인 것이 바람직하고, CD8 양성 세포는 세포 상해성 T세포인 것이 바람직하다. 침윤하는 세포의 종류와 영역은, 예를 들면, 종양의 조직 표본을 제작하고, 각 세포에 특이적인 표면 항원에 대한 항체를 이용해 면역 염색을 실시함으로써 확인할 수 있다.

본 발명의 약제는, 의약의 형태로 실시할 수 있다. 즉, 포스파티딜콜린을 유효 성분으로 하고, 의약 제제의 공지의 제조 방법(예를 들면, 일본약국방에 기재된 방법 등)에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 또는 첨가제를 적절하게 배합해 제제화할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 정제(당의정, 필름코팅정, 설하정, 구강내붕괴정, 바칼정 등을 포함한다), 환제, 산제, 과립제,캡슐제(소프트캡슐제, 마이크로캡슐제를 포함한다), 트로키제, 시럽제, 액제, 유제, 현탁제, 방출제어제제(예를 들면 속방성제제, 서방성제제, 서방성마이크로캡슐제 등), 에어로졸제, 필름제(예를 들면 구강내붕괴필름, 구강점막첨부필름 등), 주사제(예를 들면 피하주사제, 정맥내주사제, 근육내주사제, 복강 내주사제 등), 점적제, 경피흡수형제제, 연고제, 로션제, 첨부제, 좌제(예를 들면 항문좌제, 질좌제 등), 펠릿, 경비제, 경폐제(흡입제), 점안제 등 경구제 또는 비경구제를 들 수 있다. 담체 또는 첨가제의 배합 비율에 대해서는, 의약 분야에 있어서 통상 채용되는 범위에 근거해 적절하게 설정할 수 있다. 배합할 수 있는 담체 또는 첨가제는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면 물, 생리식염수, 그 외의 수성용매, 수성 또는 유성기제 등의 각종 담체; 부형제, 결합제, pH조정제, 붕괴제, 흡수촉진제, 활택제, 착색제, 교미제, 향료 등 각종 첨가제를 들 수 있다.

정제, 캡슐제 등에 혼화할 수 있는 첨가제로서는, 예를 들면 젤라틴, 옥수수 전분, 트라간트, 아라비아고무와 같은 결합제, 결정성 셀룰로오스와 같은 부형제, 옥수수 전분, 젤라틴, 알긴산 등과 같은 팽화제, 스테아린산마그네슘과 같은 윤활제, 자당, 유당 또는 사카린과 같은 감미제, 페퍼민트, 아카모노유 또는 체리와 같은 향미제 등이 이용된다. 조제 단위 형태가 캡슐인 경우에는, 상기 타입의 재료에 한층 더 유지와 같은 액상 담체를 함유할 수 있다. 주사를 위한 무균 조성물은 통상의 제제화 순서(예를 들면 유효 성분을 주사용수, 천연 식물유 등의 용매에 용해 또는 현탁시키는 등)에 따라 조제할 수 있다. 주사용 수성액으로서는, 예를 들면 생리식염수, 포도당이나 그 외의 보조약을 포함하는 등장액(예를 들면 D-소르비톨, D-만니톨, 염화나트륨 등) 등이 이용되며, 적당한 용해 보조제, 예를 들면 알코올(에탄올 등), 폴리알코올(프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등), 비이온성 계면활성제(폴리소르베이트80TM, HCO-50 등) 등과 병용해도 좋다. 유성액으로서는, 예를 들면, 참기름, 대두유 등이 이용되며, 용해 보조제인 벤조산벤질, 벤질알코올 등과 병용해도 좋다. 또한, 완충제(예를 들면 인산염 완충액, 아세트산나트륨 완충액 등), 무통화제(예를 들면 염화벤잘코늄, 염산프로카인 등), 안정제(예를 들면 사람혈청알부민, 폴리에틸렌글리콜 등), 보존제(예를 들면 벤질알코올, 페놀 등), 산화방지제 등과 배합해도 좋다.

본 발명의 약제는, 포스파티딜콜린이 첨가된 식물유를 함유하는 지방 유제로서 바람직하게 실시할 수 있다. 식물유로서는, 대두유, 옥수수유, 야자유, 새플라워유, 들기름, 올리브유, 피마자유, 면실유 등을 들 수 있다. 바람직하게는 대두유다. 예를 들면, 수술 전·수술 후 등의 영양 보급을 위한 의약품으로서 약가 수재되는 「인트라리포즈 수액 10%(상품명)」 및 「인트라리포즈 수액 20%(상품명)」(모두 오오츠카세이야쿠코죠제)은, 정제 대두유를 유효 성분으로 하는 것이지만, 모두 첨가제로서 1.2g/100mL의 정제 노른자 레시틴을 함유한다. 따라서, 「인트라리포즈 수액 10%(상품명)」 및 「인트라리포즈 수액 20%(상품명)」는, 본 발명의 약제의 실시형태로서 바람직하다.

포스파티딜콜린은 생체에 존재하는 성분으로, 의약의 유효 성분이나 첨가제로서 사람에의 투여 실적이 있다는 점에서, 사람이나 다른 포유동물(예를 들면, 래트, 마우스, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이 등)에 대해서 독성이 낮고, 안전하게 투여할 수 있다.

제제 중 유효 성분의 함량은, 제형, 투여 방법, 담체 등에 따라 적절하게 설정되지만, 포스파티딜콜린을 제제 전량에 대해서 통상 0.01~100%(w/w), 바람직하게는 0.1~95%(w/w)의 비율로 첨가할 수 있다.

포스파티딜콜린의 투여량은, 투여 대상, 증상, 투여 경로 등에 따라 차이는 있지만, 경구투여의 경우, 일반적으로 예를 들면, 체중 약 60kg의 사람에 있어서는, 1일당 약 0.01~1000mg, 바람직하게는 약 0.1~100mg, 보다 바람직하게는 약 0.5~500mg이다. 비경구투여의 합은, 그 1회 투여량은 환자 상태, 증상, 투여 방법 등에 따라 다르지만, 예를 들면 주사제에서는, 통상 예를 들면 체중 1kg당 약 0.01~100mg, 바람직하게는 약 0.01~50mg, 보다 바람직하게는 약 0.01~20mg를 정맥에 투여한다. 1일당 총 투여량은, 단일 투여량이어도 분할 투여량이어도 좋다.

본 발명의 약제는, 암 면역요법과 조합해 사용해도 좋다. 본 발명의 약제는, 암 면역요법과 조합해 사용함으로써 종양 면역을 활성화시켜, 종양 세포 장해성을 항진시킬 수 있다고 생각된다. 본 발명의 약제를 암 면역요법과 조합해 사용한다는 것은, 본 발명의 약제의 투여 대상이 암 면역요법을 받고 있는 암 환자인 것, 또는, 본 발명의 약제를 암 면역요법에 사용하는 약제와 조합해 사용(병용)하는 것을 의미한다. 본 발명의 약제를 암 면역요법과 조합해 사용함으로써, 암 면역요법에 사용하는 약제의 사용량을 줄일 수 있어, 부작용을 저감할 수 있다고 생각된다. 한층 더 암 면역요법에 사용하는 약제의 사용량 저감은 의료비 삭감 등 사회적 요청에도 필적하는 것이다. 또한, 본 명세서에 있어서, 「조합해 사용」과 「병용」은 동의이다.

암 면역요법에는, 암 백신 요법, 면역 세포 수주 요법, 면역 억제 해제 요법, 제어성 T세포의 제거를 유도하는 방법 등이 포함된다. 몇 개의 실시형태에 있어서, 암 면역요법은, 면역 억제 해제 요법 또는 면역 세포 수주 요법이어도 좋다. 면역 억제 해제 요법에 이용하는 면역 체크 포인트 저해제로서는, 예를 들면 항CTLA-4 항체, PD-1 차단약, 항PD-1 항체, PD-L1 차단약, 항PD-L1 항체 등을 들 수 있다. 면역 세포 수주 요법으로서는, 키메라 항원 수용체 T세포 요법 등을 들 수 있다. 제어성 T세포는 면역 관용에 기능하므로, 제어성 T세포 제거 후에 본 발명의 약제를 투여하면, 본 발명의 약제와 면역 체크 포인트 저해제를 병용한 경우와 동일한 효과를 가진다고 생각된다. 제어성 T세포의 제거를 유도하는 약제로서는, 예를 들면, 알킬화제, IL-2-디프테리아 독소, 항CD25 항체, 항KIR 항체, IDO 저해제, BRAF 저해제 등을 들 수 있다.

암 면역요법에 이용하는 약제로서는, 예를 들면 피시바닐, 크레스틴, 시조피란, 렌치난, 우베니멕스, 인터페론, 인터류킨, 마크로파지 자극 인자, 과립구 자극 인자, 에리스로포이에틴, 림포톡신, BCG 백신, 코리네박테리움파붐, 레바미졸, 폴리사카라이드K, 프로코다졸, 이필리무맙, 니볼맙, 라무시루맙, 오파투무맙, 파니투무맙, 펨브롤리주맙, 오비누츠주맙, 트라스투주맙 엠탄신, 토실리주맙, 베바시주맙, 트라스트주맙, 실툭시맙, 세툭시맙, 인플릭시맙, 리툭시맙, 메트포르민, 애플리버셉트 등을 들 수 있다.

본 발명의 약제를 암 백신과 병용함으로써, 암 백신에 의해서 활성화된 T세포를 종양 내에 효율적으로 침윤시킬 수 있다. 또한, 환자 혹은 비환자 유래의 T세포 등의 면역 세포를 이용한 면역 세포 수주 요법에 있어서도, 본 발명의 약제는 이들 치료의 유효성을 높일 수 있다.

이와 같이, 본 발명의 약제를 암 면역요법과 조합해 사용함으로써, 암 면역요법이 증강하고, 종양 세포 장해성을 항진시킬 수 있으므로, 암 면역요법과 조합하는 양태로 사용하는 본 발명의 약제는, 암 면역요법 증강제라고 칭할 수 있다.

본 발명의 약제는, 상기 이외의 암치료약과 조합해 사용할 수 있다. 본 발명의 약제에 의한 종양 면역 활성화 작용을 조합함으로써, 암치료약 본래의 항암 작용이 증강할 수 있다고 생각된다. 또한, 암치료약의 사용량을 줄임으로써, 부작용이 저감될 수 있다고 생각된다. 더욱이, 암치료약의 사용량 저감은 의료비 삭감 등의 사회적 요청에도 필적하는 것이다.

암치료약은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 화학 요법제, 면역 요법제 또는 호르몬 요법제가 바람직하다. 이들 암치료약은 리포솜 제제여도 좋다. 또한, 이들 암치료약은 핵산 의약, 항체 의약이어도 좋다. 화학 요법제로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 나이트로젠머스터드, 염산나이트로젠머스터드-N-옥시드, 클로람부틸, 시클로포스파미드, 이포스파미드, 티오테파, 카르보퀀, 토실산임프로설판, 부설판, 염산니무스틴, 미토브로니톨, 멜파란, 다카바진, 라니무스틴, 인산에스트라무스틴나트륨, 트리에틸렌멜라민, 카르무스틴, 로무스틴, 스트렙토조신, 피포브로만, 에토글루시드, 카르보플라틴, 시스플라틴, 미보플라틴, 네다플라틴, 옥살리플라틴, 알트레타민, 암바무스틴, 염산디브로스피듐, 포테무스틴, 프레드니무스틴, 푸미테파, 리보무스틴, 테모졸로미드, 트레오설판, 트로포스파미드, 지노스타틴스티마라마, 아도젤레신, 시스템스틴, 비제레신 등의 알킬화제; 예를 들면, 메르캅토푸린, 6-메르캅토푸린리보시드, 티오이노신, 메토트렉세이트, 페메트렉시드, 에노시타빈, 시타라빈, 시타라빈옥포스페이트, 염산안시타빈, 5-FU계 약제(예, 플루오로우라실, 테가푸르, UFT, 독시플루리딘, 카르모푸르, 가로시타빈, 에미테플루, 카페시타빈 등), 아미노프테린, 넬자라빈, 류코보린칼슘, 타블로이드, 부토신, 폴리네이트칼슘, 레보폴리네이트칼슘, 클라드리빈, 에미테플루, 플루다라빈, 겜시타빈, 히드록시카르바미드, 펜토스타틴, 피리트렉심, 이독수리딘, 미토구아존, 티아조푸린, 암바무스틴, 벤담스틴 등의 대사 대항제; 예를 들면, 아크티노마이신D, 아크티노마이신C, 마이토마이신C, 크로모마이신A3, 염산블레오마이신, 황산블레오마이신, 황산페플로마이신, 염산다우노루비신, 염산독소루비신, 염산아클라루비신, 염산피라루비신, 염산에피루비신, 네오칼티노스타틴, 미스라마이신, 사르코마이신, 카르티노피린, 미토테인, 염산조루비신, 염산미톡산트론, 염산아이다루비신 등의 항암성 항생 물질; 예를 들면, 에토포시드, 인산에토포시드, 황산빈블라스틴, 황산빈크리스틴, 황산빈데신, 테니포시드, 파클리탁셀, 도세탁셀, 비노렐빈, 이리노테칸, 염산이리노테칸 등의 식물 유래 항암제 등을 들 수 있다.

면역 요법제로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 피시바닐, 크레스틴, 시조피란, 렌치난, 우베니멕스, 인터페론, 인터류킨, 마크로파지 자극 인자, 과립구 자극 인자, 에리스로포이에틴, 림포톡신, BCG 백신, 코리네박테리움파붐, 레바미졸, 폴리사카라이드K, 프로코다졸, 이필리무맙, 니볼맙, 라무시루맙, 오파투무맙, 파니투무맙, 펨브롤리주맙, 오비누츠주맙, 트라스투주맙 엠탄신, 토실리주맙, 베바시주맙, 트라스트주맙, 실툭시맙, 세툭시맙, 인플릭시맙, 리툭시맙 등을 들 수 있다.

호르몬 요법제로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 포스페스트롤, 디에틸스틸베스트롤, 클로로트리아니센, 아세트산메드록시프로게스테론, 아세트산메게스트롤, 아세트산클로르마디논, 아세트산시프로테론, 다나졸, 아릴에스트레놀, 게스트리논, 메파트리신, 라록시펜, 오르멜록시펜, 레보르멜록시펜, 항에스트로겐(예를 들면 구연산타목시펜, 구연산토레미펜 등), 필제제, 메피티오스탄, 테스트로락톤, 아미노글루테티미드, LH-RH아고니스트(예를 들면 아세트산고세레린, 브세레린, 류프로레린 등), 드롤록시펜, 에피티오스타놀, 설폰산에티닐에스트라디올, 아로마타제 저해약(예를 들면 염산파드로졸, 아나스트로졸, 레트로졸, 엑세메스탄, 보로졸, 포르메스탄 등), 항안드로겐(예를 들면 플루타미드, 비카르타미드, 니루타미드 등), 5α-리덕타제 저해약(예를 들면 피나스테리드, 에프리스테리드 등), 부신피질 호르몬계 약제(예를 들면 덱사메타존, 프레드니조론, 베타메타존, 트리암시놀론 등), 안드로겐 합성 저해약(예를 들면 아비라테론 등) 등을 들 수 있다.

본 발명의 약제와 면역 체크 포인트 저해제 또는 다른 암치료약을 조합해 사용(병용)하는 경우, 이들을 투여 대상에 대해서 동시에 투여해도 좋고, 시간차를 두고 투여해도 좋다. 본 명세서에 있어서 「조합해 사용(병용)한다」란, 2개 이상의 약제의 적용 시기가 중복하는 것을 의미하며, 동시에 투여하는 것을 필요로 하는 것은 아니다. 면역 체크 포인트 저해제 또는 암치료약의 투여량은, 임상 상 이용되는 투여량에 준하면 좋고, 투여 대상, 투여 대상의 연령 및 체중, 증상, 투여 시간, 제형, 투여 방법, 조합 등에 의해 적절하게 선택할 수 있다.

본 발명에는, 이하의 각 발명도 포함된다.

포유동물에 대해서 포스파티딜콜린을 투여하는 것을 특징으로 하는 종양 혈관의 정맥화 촉진 방법.

종양 혈관의 정맥화 촉진에 이용하기 위한 포스파티딜콜린.

종양 혈관의 정맥화를 촉진시키는 정맥 형성 촉진제를 제조하기 위한 포스파티딜콜린의 사용.

포유동물에 대해서 포스파티딜콜린을 투여하는 것을 특징으로 하는 종양 혈관 직경을 확장하는 방법.

종양 혈관의 혈관 직경 확장에 이용하기 위한 포스파티딜콜린.

종양 혈관 직경을 확장시키는 혈관 직경 확장제를 제조하기 위한 포스파티딜콜린의 사용.

포유동물에 대해서 포스파티딜콜린을 투여하는 것을 특징으로 하는 리소인지질 수용체를 통하지 않고 종양 혈관을 연결시키는 방법.

리소인지질 수용체를 통하지 않고 종양 혈관을 연결시키기 위해 이용하는 포스파티딜콜린.

리소인지질 수용체를 통하지 않고 종양 혈관을 연결시키는 혈관 연결 촉진제를 제조하기 위한 포스파티딜콜린의 사용.

포유동물에 대해서 포스파티딜콜린을 투여하는 것을 특징으로 하는 리소인지질 수용체를 통하지 않고 종양 영역 전체에의 백혈구의 침윤을 촉진시키는 방법.

리소인지질 수용체를 통하지 않고 종양 영역 전체에의 백혈구의 침윤을 촉진시키기 위해 이용하는 포스파티딜콜린.

리소인지질 수용체를 통하지 않고 종양 영역 전체에의 백혈구의 침윤을 촉진시키는 백혈구 침윤 촉진제를 제조하기 위한 포스파티딜콜린의 사용.

포유동물에 대해서 포스파티딜콜린을 투여하는 것을 특징으로 하는 종양 면역 활성화 방법.

리소인지질 수용체를 통하지 않고 종양 면역을 활성화 시키기 위해 이용하는 포스파티딜콜린.

리소인지질 수용체를 통하지 않고 종양 면역을 활성화 시키는 종양 면역 활성화제를 제조하기 위한 포스파티딜콜린의 사용.

포유동물에 대해서 포스파티딜콜린을 투여하는 것을 특징으로 하는 암 면역 요법 증강 방법.

리소인지질 수용체를 통하지 않고 암 면역요법을 증강시키기 위해 이용하는 포스파티딜콜린.

리소인지질 수용체를 통하지 않고 암 면역요법을 증강시키지만 면역 요법 증강제를 제조하기 위한 포스파티딜콜린의 사용.

포스파티딜콜린을 유효 성분으로 하는 암치료약.

포유동물에 대해서 포스파티딜콜린을 투여하는 것을 특징으로 하는 암치료 방법.

암치료에 이용하기 위한 포스파티딜콜린.

암치료약을 제조하기 위한 포스파티딜콜린의 사용.

[ 실시예 ]

이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들로 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1: 종양(폐암)에 대한 포스파티딜콜린 투여의 효과]

종양에 대한 포스파티딜콜린 투여의 효과를 검증하기 위해, 마우스 암세포주를 마우스 피하에 이식해 종양을 형성시킨 후에 포스파티딜콜린(이하 「PC」라 한다) 또는 PC함유 정제 대두유 유화제를 투여하여, 항종양 효과, 종양 혈관 구조, 및 종양 내 림프구 침윤을 관찰했다.

(1) 실험 방법

(1-1) 사용 세포 및 사용 동물

마우스 암세포주로서 LLC 세포(Lewis 폐암 세포주)를 이용했다. 8주령의 C57BL/6NCrSlc 마우스(♀SLC사)의 피하에, LLC 세포(1×10⁶개/100μL·PBS/마리)를 주사했다.

(1-2) 투여 물질

PC에는 다이즈 PC(L-α-phosphatidylcholine(95%)(Soy), Avanti POLAR LIPIDS사)를 이용했다. 다이즈 PC는, 50%에탄올로 농도를 25mM로 조정한 것을 -30℃에서 보존하고, 투여 직전에 PBS로 3mg/kg/100μL가 되도록 희석했다. 1회당 100μL를 마우스 꼬리 정맥 내에 투여했다. PC함유 정제 대두유 유화제로서 인트라리포즈 수액 20%(상품명, 오오츠카세이야쿠)를 이용했다. 1회당 100μL(정제 노른자 레시틴을 1.2mg 함유)를 마우스 꼬리 정맥 내에 투여했다.

(1-3) 군분류 및 투여 스케줄

다이즈 PC군, 인트라리포즈군 및 대조군(비투여군)의 3군으로 분류하였다(4마리/군). 암세포 이식 후 5일째부터 13일째까지 9일간, 인트라리포즈 100μL 또는 다이즈 PC 3mg/kg(100μL)를, 27G 시린지를 이용해 마우스의 꼬리 정맥 내에 1일 1회 연일 투여했다. 최종 투여 익일(이식 후 14일째)에 마우스로부터 종양을 적출했다.

(1-4) 종양 체적의 측정

이식 후 5, 7, 10 및 14일째에 종양 체적을 측정했다. 종양 체적은, 긴지름×짧은지름×높이×0.5로 계산했다.

(1-5) 종양 조직 표본의 제작

추출한 종양을 4% 파라포름알데히드(PFA)/PBS에 침지하고, 4℃에서 하룻밤 진탕하여 고정했다. 고정 종료 후, 냉PBS(4℃)로 종양을 세정했다. 세정은 6시간 실시하고, 30분마다 새로운 PBS로 교환했다. 그 후, 종양을 15% 수크로오스/PBS에 침지하고, 4℃에서 3시간 진탕했다. 계속해서, 30% 수크로오스/PBS에 침지하고, 4℃에서 3시간 진탕했다. 계속해서, 종양을 O.C.T.컴파운트(Tissue-Tek사)에 포매하고, -80℃에서 3일 이상 냉동했다.

(1-6) 종양 혈관 구조의 관찰

O.C.T.컴파운트로 포매한 종양을, 크라이오스탯(LEICA사)으로 두께 40μm의 절편으로 슬라이스했다. 슬라이드 글라스 상에 절편을 놓고, 드라이어로 약 2시간 공기 건조했다. 절편의 주위를 리퀴드 블로커로 둘러싸고, 슬라이드 염색 배트에 슬라이드 글라스를 세트하고, PBS를 이용해 실온에서 10분간 세정함으로써 O.C.T.컴파운트를 씻어냈다. 4% PFA/PBS를 이용해 실온에서 10분간 후고정을 실시하고, PBS를 이용해 실온에서 10분간 세정을 실시했다. 블로킹 용액(5% normal goat serum/1% BSA/2% skim milk/PBS)을 절편 상에 적가하고, 실온에서 20분간 블로킹을 실시했다. 1차 항체에는, 항마우스 CD31 항체인 Purified Hamster Anti-PECAM-1(MILLIPORE사: MAB1398Z)를 이용했다. 이 1차 항체를 블로킹 용액으로 200배 희석해 절편 상에 적가하고, 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. Tween20를 포함하는 PBS(PBST)로 10분간 세정을 5회 실시하고, 다시 PBS로 10분간 세정을 실시했다. 2차 항체에는, Alexa Fluor 488 Goat Anti-Hamster IgG(Jackson ImmunoResearch Labolatories사)를 이용했다. 이 2차 항체를 블로킹 용액으로 400배 희석해 절편으로 적가하고, 2시간 차광으로 반응시켰다. PBST로 10분간 세정을 5회 실시하고, Vectashild(Vector Laboratories Inc.사)를 몇 번 적가하고, 커버 유리로 봉입했다. 공초점 레이저 현미경(LEICA사)으로 관찰하고, 사진 촬영을 실시했다.

(1-7) 종양 내 림프구 침윤의 관찰

O.C.T.컴파운트로 포매한 종양을, 크라이오스탯(LEICA사)으로 두께 20μm의 절편으로 슬라이스하고, 상기와 동일한 순서로 후고정 및 블로킹을 실시했다. 1차 항체에는, Purified Rat Anti-Mouse CD8(BioLegend사: 100801)을 이용해, 블로킹 용액으로 200배 희석해 절편 상에 적가하고, 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 2차 항체에는, Goat anti-Rat IgG(H＋L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate(Thermo Fisher Sxientific사: A11006)를 이용해, 블로킹 용액으로 400배 희석해 절편으로 적가하고, 2시간 차광으로 반응시켰다. 하룻밤 걸쳐 PBST로 세정을 실시했다. 3차 항체로서 Anti-Mouse CD4 PE(eBioscience사: 12-0042-83), APC 표지 Rat Anti-Mouse CD31(BD Pharmingen사: 551262)를, 각각 블로킹 용액으로 400배에 희석해 절편으로 적가하고, 2시간 차광으로 반응시켰다. 하룻밤 걸쳐 PBST로 세정한 후에 봉입제(DAKO mounting medium, DAKO사)를 절편으로 적가하고 커버 유리로 봉입했다. 봉입한 절편은 공초점 레이저 현미경(LEICA사)을 이용해 배율 400배의 시야에서 두께 10μm로 촬영했다. 종양 중심부와 종양 주변부로 나누어 촬영함으로써, 종양 중심부와 주변부의 림프구 침윤의 차이를 조사했다. 촬영한 화상으로부터 CD4 양성 세포 및 CD8 양성 세포의 수를 각각 측정해, 면적당 림프구 수를 산출했다.

(2) 결과

(2-1) 종양 체적

결과를 도 1에 나타낸다. 도 1로부터 밝혀진 바와 같이, 다이즈 PC군 및 인트라리포즈군은 대조군과 비교해 종양의 증대를 억제하는 것이 나타났다.

(2-2) 종양 혈관 구조

결과를 도 2에 나타낸다. 혈관내피세포가 녹색 형광으로 염색되어, 사진에서는 희게 묘출된다. 대조군에서는, 연결성이 나쁜 혈관이 형성되는 것이 나타났다. 한편, 다이즈 PC군 및 인트라리포즈군에서는, 연결성이 양호한 혈관이 형성되는 것이 나타났다. 또한, 많은 혈관에서 혈관 직경이 확장하고, 혈관 직경이 10μm를 넘는 정맥 모양의 형태가 유도되는 것이 판명되었다.

(2-3) 종양 내 림프구 침윤

CD4 양성 세포의 결과를 도 3에, CD8 양성 세포의 결과를 도 4에 각각 나타낸다. 도 3 및 도 4로부터 밝혀진 바와 같이, 대조군과 비교해, 다이즈 PC군 및 인트라리포즈군에서는, CD4 양성 세포 및 CD8 양성 세포 모두 종양 내에 미만성으로 침윤하여, 종양 면역의 개선 효과가 관찰되었다. 다이즈 PC군 및 인트라리포즈군의 종양 주변부의 CD4 양성 세포 수는, 각각 대조군의 1.5배 및 1.2배로 증가하고, 종양 중심부의 CD4 양성 세포 수는, 각각 대조군의 3배 및 4배로 증가했다. 또한, 다이즈 PC군 및 인트라리포즈군의 CD8 양성 세포 수는, 종양 주변부 및 중심부 모두에서, 각각 대조군의 2배 이상 증가했다.

(2-4) 소결

림프구 등의 염증 세포는, 혈관 내에서 조직에 침입할 때, 모세혈관보다 굵은 세정맥으로부터 혈관 외에 누출하는 것이 알려져 있다. 실시예 1의 결과로부터, PC는 혈관망을 연결시켜 종양 내의 혈류를 개선시킴과 동시에, 혈관을 정맥 모양으로 변화시킴으로써, 림프구의 종양 조직 내에의 침윤을 촉진하여, 종양의 증대를 억제하는 것이라고 생각되었다.

[ 참고예 1: 리소포스파티딜콜린 투여와의 비교]

PC의 분해 산물인 리소포스파티딜콜린(이하 「LPC」라고 한다) 투여에 의해, 종양 내 혈관 구조가 PC투여와 마찬가지로 정맥 모양의 형태로 변화하는지를 확인했다.

(1) 실험 방법

투여 물질로서 LPC(Avanti POLAR LIPIDS사제; 1-oleoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine) 및 다이즈 PC(실시예 1과 같다)를 이용한 이외는, 실시예 1과 동일한 방법으로 실험을 실시했다. 또한, LPC는, 실시예 1의 다이즈 PC와 동일한 순서로 3mg/kg/100μL용액을 조제하여, 1회당 100μL를 마우스 꼬리 정맥 내에 투여했다.

(2) 결과

결과를 도 5에 도시했다. LPC군은 다이즈 PC군과 달리, 종양 내 혈관에 대해서 구조적 변화를 유도하지 않았다. 이 결과로부터, PC는 LPC로 분해된 후에 종양 내 혈관의 구조적 변화를 유도하는 것이 아니라, PC인 채로 종양 내 혈관의 구조적 변화를 유도하는 것이 밝혀졌다. 즉, 리소인지질 수용체를 통해 종양 면역을 활성화하는 선원 발명과는 메커니즘이 다른 것이 밝혀졌다.

포스파티딜콜린은, 생체에 대해서 안전하게 투여될 수 있음이 확인된 물질이다. 그리고, 상기 지견에 의해, 포스파티딜콜린은 종양 영역 전체에의 면역 세포의 침윤을 촉진하여, 세포 장해성 T세포등의 면역 세포에 의한 종양 세포에 대한 살세포 효과를 증강시킬 수 있는 것, 또한, 종양 내부에 CD4 양성 세포가 침윤함으로써, 종양 세포가 발현하는 분자에 의한 항원 제시가 가능한 상태로 되는 것이 밝혀졌다. 더욱이, 포스파티딜콜린은 정상 조직의 혈관에 장해를 주지 않기 때문에, 부작용의 리스크는 매우 낮다. 이러한 포스파티딜콜린의 기능은 암종에 따라서 다르지 않게 생긴다고 생각할 수 있기 때문에, 포스파티딜콜린은 어떠한 암종에도 적용 가능하고, 특히, 혈류가 부족한 암(췌장암 등)에 대해서 현저한 효과를 기대할 수 있다.

[ 실시예 2: 대장암에 대한 포스파티딜콜린 투여의 효과]

(1) 실험 방법

(1-1) 사용 세포 및 사용 동물

마우스 암세포주로서 colon26 세포(마우스 대장암 세포주)를 이용했다. 8주령의 Balb/c 마우스(♀SLC사)의 피하에, colon26 세포(1×10⁶개/100μL·PBS/마리)를 주사했다.

(1-2) 투여 물질

실시예 1과 동일한 다이즈 PC를 이용했다. 실시예 1과 마찬가지로, 투여 직전에 PBS로 3mg/kg/100μL가 되도록 희석하여, 1회당 100μL를 마우스 꼬리 정맥 내에 투여했다.

(1-3) 군분류 및 투여 스케줄

다이즈 PC군 및 대조군(용매투여군)의 2군으로 분류하였다(3마리/군). 암세포 이식 후 7일째부터 13일째까지 7일간, 다이즈 PC 3mg/kg(100μL)를, 마우스의 꼬리 정맥 내에 1일 1회 연일 투여했다. 최종 투여 익일(이식 후 14일째)에 마우스로부터 종양을 적출했다.

(1-4) 종양 조직 표본의 제작, 종양 혈관 구조의 관찰 및 종양 내 림프구 침윤의 관찰

실시예 1과 동일한 방법으로, 종양 조직 표본을 제작하고, 종양 혈관 구조의 관찰을 실시하고, 종양 내 림프구 침윤의 관찰을 실시했다.

(2) 결과

(2-1) 종양 혈관 구조

결과를 도 6에 도시했다. 실시예 1의 결과와 마찬가지로, 다이즈 PC군에서는, 연결성이 양호하고 혈관 직경이 굵은 정맥 모양의 형태의 혈관이 유도되는 것이 나타났다.

(2-2) 종양 내 림프구 침윤

결과를 도 7에 도시했다. 왼쪽이 CD4 양성 세포의 결과, 오른쪽이 CD8 양성 세포의 결과이다. 실시예 1의 결과와 마찬가지로, 다이즈 PC군에서는, CD4 양성 세포 및 CD8 양성 세포 모두 종양 내에의 침윤이 유도되는 것이 나타났다.

[ 실시예 3: 멜라노마에 대한 포스파티딜콜린 투여의 효과]

(1) 실험 방법

(1-1) 사용 세포 및 사용 동물

마우스 암세포주로서 B16 세포(마우스 멜라노마 세포주)를 이용했다. 8주령의 C57BL/6NCrSlc 마우스(♀SLC사)의 피하에, B16 세포(1×10⁶개/100μL·PBS/마리)를 주사했다.

(1-2) 투여 물질

실시예 1과 동일한 다이즈 PC를 이용했다. 실시예 1과 마찬가지로, 투여 직전에 PBS로 3mg/kg/100μL가 되도록 희석하여, 1회당 100μL를 마우스 꼬리 정맥 내에 투여했다.

(1-3) 군분류 및 투여 스케줄

다이즈 PC군 및 대조군(용매투여군)의 2군으로 분류하였다(3마리/군). 암세포 이식 후 5일째부터 11일째까지 7일간, 다이즈 PC 3mg/kg(100μL)를, 마우스의 꼬리 정맥 내에 1일 1회 연일 투여했다. 최종 투여 익일(이식 후 12일째)에 마우스로부터 종양을 적출했다.

(1-4) 종양 조직 표본의 제작, 종양 혈관 구조의 관찰 및 종양 내 림프구 침윤의 관찰

실시예 1과 동일한 방법으로, 종양 조직 표본을 제작하고, 종양 혈관 구조의 관찰을 실시하고, 종양 내 림프구 침윤의 관찰을 실시했다.

(2) 결과

(2-1) 종양 혈관 구조

결과를 도 8에 도시했다. 실시예 1 및 2의 결과와 마찬가지로, 다이즈 PC군에서는, 연결성이 양호하고 혈관 직경이 굵은 정맥 모양의 형태의 혈관이 유도되는 것이 나타났다.

(2-2) 종양 내 림프구 침윤

결과를 도 9에 도시했다. 왼쪽이 CD4 양성 세포의 결과, 오른쪽이 CD8 양성 세포의 결과이다. 실시예 1 및 2의 결과와 마찬가지로, 다이즈 PC군에서는, CD4 양성 세포 및 CD8 양성 세포 모두 종양 내에의 침윤이 유도되는 것이 나타났다.

실시예 2 및 3의 결과로부터, PC는 다른 암종, 다른 마우스 계통에 있어서도, 실시예 1과 동일한 효과를 발현하는 것이 나타났다. 따라서, PC의 종양 내 혈관에 대한 효과와, 림프구 침윤을 유도하는 효과는, 어떠한 암종에 있어서도 발현되는 것으로 결론된다.

[ 실시예 4: 루이스 폐암에 대한 포스파티딜콜린과 면역 체크 포인트 저해제의 병용 효과]

(1) 실험 방법

(1-1) 사용 세포 및 사용 동물

LLC 세포(Lewis 폐암 세포주)를 이용했다. 8주령의 C57BL/6NCrSlc 마우스(♀SLC사)의 피하에, LLC 세포(1×10⁶개/100μL·PBS/마리)를 주사했다.

(1-2) 투여 물질

실시예 1과 동일한 다이즈 PC를 이용했다. 실시예 1과 마찬가지로, 투여 직전에 PBS로 3mg/kg/100μL가 되도록 희석하여, 1회당 100μL를 마우스 꼬리 정맥 내에 투여했다. 면역 체크 포인트 저해제로서, 항PD-1 항체(BioXcell사)를 이용했다.

(1-3) 군분류 및 투여 스케줄

다이즈 PC군, 항PD-1 항체군, 다이즈 PC/항PD-1 항체 병용군 및 대조군(용매투여군)의 4군으로 분류하였다(3마리/군). 암세포 이식 후 7일째부터 20일째까지 13일간, 다이즈 PC 3mg/kg(100μL)를, 마우스의 꼬리 정맥 내에 1일 1회 연일 투여했다. 항PD-1 항체는, 200μg/mouse의 용량으로, 암세포 이식 후 7일째, 9일째, 11일째, 14일째, 16일째, 18일째에 복강 내 투여했다.

(1-4) 종양 체적의 측정

암세포 이식 후 7, 14 및 21일째에 종양 체적을 측정했다. 종양 체적은, 긴지름×짧은지름×높이×0.5로 계산했다.

(2) 결과

종양 체적의 측정 결과를 도 10에 도시했다. 루이스 폐암은 항PD-1 항체 단독으로는 효과가 없는 것이 알려져 있지만, 본 실험에 있어서도 항PD-1 항체군은 종양의 증대를 억제하지 않았다. 다이즈 PC군은 종양의 증대를 억제했지만, 다이즈 PC/항PD-1 항체 병용군은 종양의 증대를 현저하게 억제하여, 상승효과가 인정되었다.

[ 실시예 5: 대장암에 대한 포스파티딜콜린과 면역 체크 포인트 저해제의 병용 효과]

(1) 실험 방법

(1-1) 사용 세포 및 사용 동물

colon26 세포(마우스 대장암 세포주)를 이용했다. 8주령의 Balb/c마우스(♀SLC사)의 피하에, colon26 세포(1×10⁶개/100μL·PBS/마리)를 주사했다.

(1-2) 투여 물질

실시예 1과 동일한 다이즈 PC를 이용했다. 실시예 1과 마찬가지로, 투여 직전에 PBS로 3mg/kg/100μL가 되도록 희석하여, 1회당 100μL를 마우스 꼬리 정맥 내에 투여했다. 면역 체크 포인트 저해제로서, 항PD-1 항체(BioXcell사)를 이용했다.

(1-3) 군분류 및 투여 스케줄

다이즈 PC군, 항PD-1 항체군, 다이즈 PC/항PD-1 항체 병용군 및 대조군(용매투여군)의 4군으로 분류하였다(3마리/군). 암세포 이식 후 7일째부터 20일째까지 13일간, 다이즈 PC 3mg/kg(100μL)를, 마우스의 꼬리 정맥 내에 1일 1회 연일 투여했다. 항PD-1 항체는, 200μg/mouse의 용량으로, 암세포 이식 후 7일째, 9일째, 11일째, 14일째, 16일째, 18일째에 복강 내 투여했다.

(1-4) 종양 체적의 측정

암세포 이식 후 7, 14 및 21일째에 종양 체적을 측정했다. 종양 체적은, 긴지름×짧은지름×높이×0.5로 계산했다.

(2) 결과

종양 체적의 측정 결과를 도 11에 도시했다. 실시예 4와 마찬가지로, 다이즈 PC군 및 항PD-1 항체군은 종양의 증대를 억제했지만, 다이즈 PC/항PD-1 항체 병용군은 종양의 증대를 현저하게 억제했다.

실시예 4 및 5의 결과로부터, 어떠한 암종에 있어서도, PC가 종양 내에 림프구의 침윤을 유도하여, 면역 체크 포인트 저해제 림프구를 활성화시킴으로써, 항종양 효과가 현저해지는 것이 판명되었다.

[ 실시예 6: 대장암에 대한 포스파티딜콜린과 면역 세포 수주 요법의 병용 효과]

현재, 종양 면역 요법으로서는, 면역 체크 포인트 저해제 외, 암환자로부터 채취한 림프구 등의 면역 세포를 시험관 내에서 증식시킨 후, 또는 활성화시킨 후, 암환자에게 투여함으로써, 종양 면역 효과를 높이는 면역 요법(면역 세포 수주 요법)이 임상으로 실시되고 있다. 그러나, 종양 내에의 림프구의 침윤은 억제된다는 점에서, 면역 세포 수주 요법을 효율적으로 실시하기 위해서는, 우선 종양 내의 혈관을 제어하고, 림프구가 종양 내에 침윤하는 것을 가능하게 해 두는 것이 필요하다. 거기서, 담암 마우스에 있어서, PC의 투여 후 림프구를 정맥 내 투여하여, 림프구의 종양 내에의 침윤이 촉진하는지를 검토했다.

(1) 실험 방법

(1-1) 사용 세포 및 사용 동물

colon26 세포(마우스 대장암 세포주)를 이용했다. 8주령의 Balb/c마우스(♀SLC사)의 피하에, colon26 세포(1×10⁶개/100μL·PBS/마리)를 주사했다.

(1-2) 투여 물질

실시예 1과 동일한 다이즈 PC를 이용했다. 실시예 1과 마찬가지로, 투여 직전에 PBS로 3mg/kg/100μL가 되도록 희석하여, 1회당 100μL를 마우스 꼬리 정맥 내에 투여했다.

(1-3) 림프구의 조제

거의 전신 조직 세포에 있어서 녹색 형광을 발현하는 트랜스제닉 마우스(C57BL/6-Tg(CAG-EGFP), SLC사)의 비장으로부터 림프구를 회수하여, 림프구 현탁액을 조제했다.

(1-4) 군분류 및 투여 스케줄

다이즈 PC군 및 대조군(용매투여군)의 2군으로 분류하였다(3마리/군). 암세포 이식 후 7일째부터 13일째까지 7일간, 다이즈 PC 3mg/kg(100μL)를, 마우스의 꼬리 정맥 내에 1일 1회 연일 투여했다. 최종 투여 익일(이식 후 14일째)에, 림프구 현탁액(5×10⁶개)을 꼬리 정맥 내에 투여했다. 림프구 투여 1시간 후에 마우스로부터 종양을 적출했다.

(1-5) 종양 조직 표본의 제작 및 종양 내 림프구 침윤의 관찰

실시예 1과 동일한 방법으로 종양 조직 표본을 제작하고, 항체로서 항EGFP 항체(MBL 생명과학사)를 이용한 이외는 실시예 1과 동일한 방법으로 종양 내 림프구 침윤의 관찰을 실시했다.

(2) 결과

결과를 도 12에 도시했다. 대조군에서는 정맥 내 투여한 림프구가 거의 종양 내에 침윤하지 않았다. 한편, 다이즈 PC군에서는 정맥 내 투여한 림프구의 종양 내 침윤이 관찰되었다.

[ 실시예 7: 멜라노마에 대한 포스파티딜콜린과 면역 세포 수주 요법의 병용 효과]

B16 세포(마우스 멜라노마 세포주) 및 C57BL/6NCrSlc 마우스를 이용한 이외는, 실시예 6과 동일한 방법으로, 정맥 내 투여한 림프구의 종양 내 침윤을 관찰했다.

결과를 도 13에 도시했다. 실시예 6의 결과와 마찬가지로, 대조군에서는 정맥 내 투여한 림프구가 거의 종양 내에 침윤하지 않았지만, 다이즈 PC군에서는 정맥 내 투여한 림프구의 종양 내 침윤이 관찰되었다.

[ 실시예 8: 루이스 폐암에 대한 포스파티딜콜린과 면역 세포 수주 요법의 병용 효과]

LLC 세포(Lewis 폐암 세포주) 및 C57BL/6NCrSlc 마우스를 이용한 이외는, 실시예 6과 동일한 방법으로, 정맥 내 투여한 림프구의 종양 내 침윤을 관찰했다.

결과를 도 14에 도시했다. 실시예 6의 결과와 마찬가지로, 대조군에서는 정맥 내 투여한 림프구가 거의 종양 내에 침윤하지 않았지만, 다이즈 PC군에서는 정맥 내 투여한 림프구의 종양 내 침윤이 관찰되었다.

실시예 6, 7 및 8의 결과로부터, PC에 의해 종양 내의 혈관을 림프구를 침윤할 수 있는 상태로 해 둠으로써, 정맥으로부터 투여된 림프구에 의한 항종양 효과를 촉진할 수 있다고 생각되었다. 이 효과는 다른 암종, 다른 마우스 계통에 있어서도 관찰된다는 점에서, 유전 배경이 다른 인종에 있어서도, 또한 면역 상태가 다른 인종에 있어서도, PC는 공통되어 종양 면역 치료의 효과를 높일 수 있다고 생각된다. 최근, iPS 세포나 ES 세포, 조혈간세포로부터 분화 유도한 림프구의 투여에 의해, 종양 면역을 높이는 치료법이 고안되고 있다. 이러한 미분화 세포로부터 유도된 림프구를 이용한 치료에 있어서도, PC에 의해 종양 혈관을 미리 제어해 두는 것이 유용하다고 생각된다.

[ 실시예 9: 각종 포스파티딜콜린에 의한 효과의 검토]

다이즈PC는 지방산의 길이나, 불포화도가 다른 포스파티딜콜린의 헤테로인 집단인 것이 알려져 있다. 거기서, 어떠한 PC에서도 다이즈 PC와 같은 효과를 가지는지를 확인하기 위해, 각종 PC를 이용해 담암 마우스에 대한 효과를 검토했다.

PC를, 이하의 2군으로 분류했다(표 1 참조).

A군: 2개의 지방산이 같은 지방산인 PC

B군: 2개의 지방산이 다른 지방산인 PC

A군의 PC로서, 디옥타노일포스파티딜콜린(AVANTI사), 디미리스토일포스파티딜콜린(닛폰세이카사), 디스테아로일포스파티딜콜린(닛폰세이카사), 디올레오일포스파티딜콜린(닛폰세이카사) 및 디리놀레오일포스파티딜콜린(AVANTI사)을 사용했다. B군의 PC로서, (1-팔미토일-2-미리스토일)포스파티딜콜린(AVANTI사) 및 (1-팔미토일-2-올레오일)포스파티딜콜린(AVANTI사)을 사용했다.

실시예 1과 마찬가지로, 8주령의 C57BL/6NCrSlc 마우스(♀SLC사)의 피하에, LLC 세포(1×10⁶개/100μL·PBS/마리)를 주사해 담암 마우스를 제작했다. 암세포 이식 후 7일째부터 13일째까지 7일간, 각종 PC 3mg/kg(100μL)를, 마우스의 꼬리 정맥 내에 1일 1회 연일 투여했다. 대조군의 마우스에는 용매를 투여했다. 최종 투여 익일(이식 후 14일째)에 마우스로부터 종양을 적출하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 종양의 조직 절편을 제작하고, 종양 혈관 구조의 관찰을 실시하고, 종양 내 림프구 침윤의 관찰을 실시했다.

종양 내 림프구 침윤의 결과를 표 1에 나타냈다. 사용한 모든 PC투여군에 있어서, CD4 양성 세포 및 CD8 양성 세포 모두 종양 내에의 침윤이 촉진되는 것이 관찰되었다. 대표예로서, A군의 디스테아로일포스파티딜콜린을 투여한 결과를 도 15에 도시했다. 다른 PC를 투여한 표본에 있어서도, 동일한 관찰상을 얻을 수 있었다. 종양 혈관 구조의 관찰에 대해서도, 사용한 모든 PC투여군으로 정맥 모양의 혈관이 증생하는 것이 관찰되었다. 또한, 7일간 PC투여 후의 종양 체적은, 모든 PC투여군에 있어서 대조군에 비해 종양의 증대가 억제되었다.

군	포스파티딜콜린 명칭	림프구 침윤효과
A군	디옥탄오일 포스파티딜콜린	있음
	디미리스토일 포스파티딜콜린	있음
	디스테아로일 포스파티딜콜린	있음
	디올레오일 포스파티딜콜린	있음
	디리놀레오일 포스파티딜콜린	있음
B군	(1-팔미토일-2-미리스토일)포스파티딜콜린	있음
	(1-팔미토일-2-올레오일)포스파티딜콜린	있음

[ 실시예 10: 포스파티딜콜린에 의한 종양 내저산소의 개선 효과]

8주령의 C57BL/6NCrSlc 마우스(♀SLC사)의 피하에, LLC 세포(1×10⁶개/100μL·PBS/마리)를 주사해 담암 마우스를 제작했다. 실시예 1과 마찬가지로, 암세포 이식 후 7일째부터 13일째까지 7일간, 다이즈 PC 또는 인트라리포즈를 마우스의 꼬리 정맥 내에 1일 1회 연일 투여했다. 대조군의 마우스에는 용매를 투여했다. 종양 세포의 이식 후 14일째에 Pimonidazole(Hypoxyprobe, Burlington, MA, USA)를 60mg/kg(100μL) 복강 내 투여하여, 2시간 후에 마우스로부터 종양을 회수했다. 실시예 1과 동일한 방법으로 종양 조직 절편을 제작하고, 항Pimonidazole 항체를 이용해 저산소 영역을 가시화해 관찰했다.

결과를 도 16에 도시했다. 도 16으로부터 밝혀진 바와 같이, 다이즈 PC군 및 인트라리포즈군은 대조군과 비교해 유의하게 저산소 영역이 감소하는 것이 나타나, PC투여에 의해 종양 내의 혈류가 개선되는 것이 밝혀졌다. 암조직의 저산소 상태는 암세포의 염색체 DNA의 변이를 가져와, 암세포의 악성화를 유도하는 것이 판명되어 있으므로, PC에 의한 혈류개선에 의해 암세포의 악성화의 억제가 가능하다고 생각된다.

[ 실시예 11: 포스파티딜콜린에 의한 종양 내에의 약제 송달 촉진 효과]

8주령의 C57BL/6NCrSlc 마우스(♀SLC사)의 피하에, LLC 세포(1×10⁶개/100μL·PBS/마리)를 주사해 담암 마우스를 제작했다. 실시예 1과 마찬가지로, 암세포 이식 후 7일째부터 13일째까지 7일간, 다이즈 PC 또는 인트라리포즈를 마우스의 꼬리 정맥 내에 1일 1회 연일 투여했다. 대조군의 마우스에는 아무것도 투여하지 않았다. 종양 세포의 이식 후 14일째에 적색 형광을 발하는 항암제인 독소루비신(닛폰카야쿠) 3mg/100μL를 정맥 내 투여하여, 20분후에 마우스로부터 종양을 회수했다. 실시예 1과 동일한 방법으로 종양 조직 절편을 제작하고, 종양 내의 적색 형광 물질(독소루비신)을 관찰했다.

결과를 도 17에 도시했다. 도 17로부터 밝혀진 바와 같이, 대조군에서는 독소루비신의 종양 내 이행은 거의 관찰되지 않았지만, 다이즈 PC군 및 인트라리포즈군에서는, 독소루비신이 종양 중심부에 송달되는 것이 관찰되었다.

[ 실시예 12: 포스파티딜콜린과 5-FU의 병용에 의한 항종양 효과]

PC투여에 의해, 종양 내의 혈류가 개선되고, 약제를 종양 심부까지 효율적으로 송달할 수 있는 것이 나타났으므로, PC와 항암제의 병용에 의한 항종양 효과를 검토했다.

8주령의 C57BL/6NCrSlc 마우스(♀SLC사)의 피하에, LLC 세포(1×10⁶개/100μL·PBS/마리)를 주사해 담암 마우스를 제작했다. 다이즈 PC군, 5-FU군, 다이즈 PC/5-FU병용군 및 대조군(용매투여군)의 4군으로 분류하였다(3마리/군). 다이즈 PC군 및 다이즈 PC/5-FU병용군에는, 실시예 1과 마찬가지로, 암세포 이식 후 7일째부터 20일째까지 13일간, 다이즈 PC 3mg/kg(100μL)를, 마우스의 꼬리 정맥 내에 1일 1회 연일 투여했다. 5-FU군 및 다이즈 PC/5-FU병용군에는, 5-FU(쿄와하코)를 20mg/kg의 용량으로 암세포 이식 후 7일째와 14일째에 복강 내에 투여했다. 암세포 이식 후 7, 14 및 21일째에 종양 체적을 측정했다. 종양 체적은, 긴지름×짧은지름×높이×0.5로 계산했다.

결과를 도 18에 도시했다. 다이즈 PC군 및 5-FU군은 대조군과 비교해 종양의 증대를 억제했지만, 다이즈 PC/5-FU병용군은 각 단독 투여군보다 현저하게 종양의 증대를 억제했다.

이상의 결과로부터, PC는 종양 내의 혈관을 확대해 정맥 모양 혈관의 형성을 촉진하지만, 동시에 혈관의 연결도 유도해 혈류가 개선되고, 그에 따라 종양 조직에의 약제의 송달성이 향상되고, 항암제의 효과를 현저하게 항진시키는 것이 밝혀졌다.

[ 실시예 13: HUVEC에 대한 대두 포스파티딜콜린의 효과]

지금까지는 마우스 담암 모델을 이용한 PC의 혈관에 대한 효과를 해석했지만, 여기에서는 사람의 혈관내피세포에 대한 PC의 효과를 해석했다.

(1) 실험 방법

48 웰 플레이트에 마트리겔(BD biosciences사)을 200μL/웰 코팅하고, 인간 탯줄 정맥 내피 세포(HUVEC; 쿠라보우사)를 5×10⁴개/200μL/웰 파종해 배양했다. 배양에는 HuMedia-EB2(쿠라보우사)에 FCS를 1%농도를 더한 배지를 이용했다. 배지에 VEGF(recombinant human VEGF165, Peprotec사)를 최종 농도가 10ng/mL가 되도록 첨가하여, 혈관내피세포에 의한 관강 형성을 유도했다. VEGF 첨가와 동시에 다이즈 PC를 10μM로 첨가하고, 배양 개시부터 12~16시간 후에 현미경 하에서 사진 촬영했다. 더욱이 Hoechst(베링거사)를 첨가해 세포핵을 염색하고, 형성된 혈관을 관찰했다. 다이즈 PC를 첨가하지 않은 웰을 대조군으로 했다.

(2) 결과

결과를 도 19에 도시했다. 대조군 및 다이즈 PC군 모두 관강 형성이 유도되었지만, 다이즈 PC군에서는, 일부 관광 직경이 굵은 혈관(화살표)이 관찰되었다. 마우스 담암 모델의 실시예에 있어서, PC투여에 의해 종양 내 혈관의 혈관 직경이 굵어져 정맥화가 촉진되는 것이 관찰되었지만, 본 실시예의 결과로부터, 사람의 혈관에 있어서도 동일하게 정맥화가 촉진되는 것이 판명되었다.

[ 실시예 14: HUVEC에 대한 각종 포스파티딜콜린의 효과]

다이즈 PC 외에 8종류의 PC를 이용하여 실시예 12와 동일한 실험을 실시했다. PC의 분류는 실시예 8과 동일한 A군 및 B군으로 했다. 사용한 PC는 이하와 같다(표 2 참조).

A군:

(1) 디옥탄오일포스파티딜콜린(AVANTI사)

(2) 디미리스토일포스파티딜콜린(닛폰세이카사)

(3) 디스테아로일포스파티딜콜린(닛폰세이카사)

(4) 디올레오일포스파티딜콜린(닛폰세이카사)

(5) 디리놀레오일포스파티딜콜린(AVANTI사)

(6) 디도코사헥사에노일포스파티딜콜린(AVANTI사)

B군:

(7) (1-팔미토일-2-미리스토일)포스파티딜콜린(AVANTI사)

(8) (1-팔미토일-2-올레오일)포스파티딜콜린(AVANTI사)

결과를 표 2 및 도 20에 도시했다. 대조군, 다이즈 PC군, 각종 PC군(1~8)의 모두에 있어서 관강 형성이 유도되었지만, 다이즈 PC군 및 각종 PC군(1~8)에서는, 일부 관광 직경이 굵은 혈관(화살표)이 관찰되었다. 즉, 다이즈 PC뿐만 아니라 각종 PC도 정맥화의 촉진 작용을 가지는 것이 판명되었다.

군	포스파티딜콜린 명칭	정맥 혈관 유도 효과
A군	디옥탄오일 포스파티딜콜린	있음
	디미리스토일 포스파티딜콜린	있음
	디스테아로일포스파티딜콜린	있음
	디올레오일포스파티딜콜린	있음
	디리놀레오일포스파티딜콜린	있음
	디도코사헥사에노일포스파티딜콜린	있음
B군	(1-팔미토일-2-미리스토일)포스파티딜콜린	있음
	(1-팔미토일-2-올레오일)포스파티딜콜린	있음

또한 본 발명은 상술한 각 실시형태 및 실시예로 한정되는 것이 아니고, 청구항에 나타낸 범위에서 여러 가지 변경이 가능하고, 다른 실시형태에 각각 개시된 기술적 수단을 적절하게 조합해 얻을 수 있는 실시형태에 대해서도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다. 또한, 본 명세서에 기재된 학술 문헌 및 특허문헌 모두가, 본 명세서에 있어서 참고로서 원용된다.

Claims (12)

1. 포스파티딜콜린을 유효 성분으로 하고, 종양 혈관의 정맥화를 촉진하는 작용을 가지는 것을 특징으로 하는 정맥 형성 촉진제.
   
2. 청구항 1에 있어서, 종양 혈관 직경을 확장하는 작용 및/또는 종양 혈관을 연결시키는 작용을 가지는 것을 특징으로 하는 정맥 형성 촉진제.
   
3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 포스파티딜콜린이, 1종류의 포스파티딜콜린 또는 2종류 이상의 포스파티딜콜린의 혼합물인 정맥 형성 촉진제.
   
4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 암 면역요법과 조합해 사용하는 정맥 형성 촉진제.
   
5. 청구항 4에 있어서, 암 면역요법이, 면역 억제 해제 요법 및/또는 면역 세포 수주 요법인 정맥 형성 촉진제.
   
6. 청구항 5에 있어서, 면역 억제 해제 요법에 이용하는 면역 체크 포인트 저해제가, 항CTLA-4 항체, PD-1 차단약, 항PD-1 항체, PD-L1 차단약 또는 항PD-L1 항체인 정맥 형성 촉진제.
   
7. 포스파티딜콜린을 유효 성분으로 하고, 종양 혈관 직경을 확장하는 작용을 가지는 것을 특징으로 하는 혈관 직경 확장제.
   
8. 포스파티딜콜린을 유효 성분으로 하고, 리소인지질 수용체를 통하지 않고 종양 혈관을 연결시키는 작용을 가지는 것을 특징으로 하는 혈관 연결 촉진제.
   
9. 포스파티딜콜린을 유효 성분으로 하고, 리소인지질 수용체를 통하지 않고 종양 영역 전체에의 백혈구의 침윤을 촉진시키는 작용을 가지는 것을 특징으로 하는 백혈구 침윤 촉진제.
   
10. 청구항 9에 있어서, 백혈구가 CD4 양성 세포 및/또는 CD8 양성 세포인 백혈구 침윤 촉진제.
    
11. 포스파티딜콜린을 유효 성분으로 하고, 리소인지질 수용체를 통하지 않고 종양 영역 전체에의 백혈구의 침윤을 촉진시키는 작용을 가지는 것을 특징으로 하는 종양 면역 활성화제.
    
12. 청구항 11에 있어서, 백혈구가 CD4 양성 세포 및/또는 CD8 양성 세포인 종양 면역 활성화제.

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