CN109328064A - 肿瘤内静脉形成促进剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供：以磷脂酰胆碱为有效成分的、具有促进肿瘤血管的静脉化的作用的静脉形成促进剂、具有扩张肿瘤血管直径的作用的血管直径扩张剂、具有不借助溶血磷脂受体而使肿瘤血管连接的作用的血管连接促进剂、具有不借助溶血磷脂受体而促进白细胞向肿瘤区域整体浸润的作用的白细胞浸润促进剂及肿瘤免疫活化剂。

Description

肿瘤内静脉形成促进剂

技术领域

本发明涉及以磷脂酰胆碱为有效成分的静脉形成促进剂、血管直径扩张剂、血管连接促进剂、白细胞浸润促进剂及肿瘤免疫活化剂。

背景技术

正常组织的血管形成始于通过脉管形成的过程来构建循环网络。该脉管形成的过程包括：血管内皮细胞的产生、基于内皮细胞的管腔形成、通过壁细胞覆盖内皮细胞而实现的血管的成熟化。现有血管形成后的由于发生炎症、低氧而引起的新的血管形成受到血管新生(出芽性血管形成)过程的诱导。肿瘤内形成的血管也受到后者血管新生过程的诱导。氧、养分向肿瘤细胞的供给通过诱导肿瘤中的血管形成而成为可能。因此正在进行通过抑制肿瘤的血管新生来抑制肿瘤增大的治疗方法的开发。

1971年发现，由肿瘤分泌的因子会由现有的血管向肿瘤内诱导血管(非专利文献1)。该因子已被鉴定为血管内皮生长因子(VEGF；vascular endothelial growth factor)。VEGF活化血管内皮细胞中表达的VEGF受体(VEGFR1、2、3)，特别是活化VEGFR2，与血管内皮细胞的增殖、管腔形成有关。关于VEGF，首先开发了中和抗体并很快地在临床中作为血管新生抑制剂使用(非专利文献2)。但是，已经明确VEGF中和抗体在单独使用时并不发挥抗肿瘤效果。此外，已经明确其后开发的VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂在单独使用时也不发挥抗肿瘤效果。而另一方面，在临床上已经明确了这样的血管新生抑制剂和抗癌剂并用则发挥比抗癌剂单独时更优良的效果。通过基础医学方法对血管新生抑制剂和抗癌剂的并用所产生的治疗效果进行分析，提示了：该并用效果是由于血管新生抑制剂使肿瘤内血管的一部分正常化，结果使抗癌剂向肿瘤内的递送得到改善(非专利文献3)。

正常血管的管腔通过血管内皮细胞和壁细胞的粘附而在结构上稳定化。血管内皮细胞间通过VE-钙粘蛋白、密封蛋白5、整联蛋白、间隙连接蛋白等各种粘附因子而紧密粘附，以不使物质、细胞轻易从血管内漏出到血管外的方式受到控制。在正常血管的内皮细胞与壁细胞之间形成有粘附带，正常血管借助内皮细胞与壁细胞之间的分子交换来控制血管通透性。另外，对于正常血管而言，通常左侧和右侧的血管显示出平行的走行性。另一方面，在肿瘤的血管中观察到各种异常。具体而言，肿瘤内血管的通透性亢进，具有曲折、扩张、无序的血管分支，一部分呈囊状。在肿瘤内血管中，血管内皮细胞本身也呈异常形态。另外，内衬的壁细胞在肿瘤中心部非常稀疏，与内皮细胞的粘附也弱，壁细胞内衬在多个区域中是缺损的。这些异常大多是由于肿瘤内的VEGF分泌过度而引起的。

VEGF是血管内皮细胞的强力增殖因子，并且抑制血管内皮细胞彼此的粘附而使血管通透性亢进。当该状态持续时，在肿瘤深处，血清成分、成纤维细胞集积，肿瘤深处的间质压变得非常高。其结果是，血管内压与肿瘤深处的组织压的差异消失，药剂等无法从血管内被递送到组织内。进而，淋巴细胞等免疫细胞的肿瘤内流入也受到抑制。当免疫细胞的肿瘤内流入受到抑制时，不能对癌细胞诱导细胞死亡。当阻断来自VEGF的细胞内信号时，血管内皮细胞彼此的粘附得以恢复，血管通透性的亢进状态正常化。其结果是，血管内压高于肿瘤深处的组织压，抗癌剂、免疫细胞能够从血管内被递送到组织。认为正是因此血管新生抑制剂与抗癌剂的并用发挥比抗癌剂单独使用时更优良的效果。另外，由于免疫细胞的流入得到改善，从而还存在不使用抗癌剂也能诱导癌缩小的可能性。

因此认为，改善肿瘤内的血管通透性而诱导药剂向肿瘤内的递送的手段是癌症的有效治疗方法。另一方面，提示了：血管新生抑制药抑制血管内皮细胞的生存、诱导血管内皮细胞和与其有相互作用的血管壁细胞的细胞死亡，促进肿瘤内的缺血状态。肿瘤内的低氧状态可能诱导癌细胞的恶性化、促进癌的浸润和转移这一点已被指出。另外还报道了：血管新生抑制药对正常组织的血管也造成损伤，引起血压升高、肺出血、肾损伤等严重副作用(非专利文献4、5)。因此，期待开发出不使肿瘤血管萎缩、不影响正常血管、使肿瘤血管的通透性正常化的药剂。

本发明人发现了以下情况并提出了专利申请：当对在皮下形成有肿瘤的小鼠给药溶血磷脂酸(LPA)时，LPA活化LPA受体，从而诱导肿瘤血管的网络构建而使其正常化为网状结构，使血管内腔平滑化，使血管通透性正常化(专利文献1)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2015/152412号

非专利文献

非专利文献1：Folkman J,et al:Isolation of a tumor factor responsiblefor angiogenesis.J Exp Med 133:275-288,1971

非专利文献2：Gerber HP,Ferrara N.Pharmacology and pharmacodynamics ofbevacizumab as monotherapy or in combination with cytotoxic therapy inpreclinical studies.Cancer Res 65；671-680,2005

非专利文献3：Jain RK:Normalization of tumor vasculature:An emergingconcept in antiangiogenic therapy.Science 307:58-62,2005

非专利文献4：Ebos JML et al.Accelerated metastasis after short-termtreatment with a potent inhibitor of tumor angiogenesis.Cancer Cell 15:232-239,2009

非专利文献5：Paez-Ribes M et al.Antiangiogenic therapy elicitsmalignant progression of tumors to increased local invasion and distantmetastasis.Cancer Cell 12:220-231,2009.

发明内容

发明所要解决的问题

本发明的课题在于，发现不影响正常血管、使肿瘤内部的断开的血管连接且促进静脉形成、从而诱导免疫细胞向肿瘤内的浸润的物质，并提供该物质的新用途。

用于解决问题的方法

本发明为了解决上述问题而包含以下的各发明。

[1]一种静脉形成促进剂，其特征在于，以磷脂酰胆碱为有效成分，具有促进肿瘤血管的静脉化的作用。

[2]根据上述[1]所述的静脉形成促进剂，其特征在于，具有扩张肿瘤血管直径的作用和/或使肿瘤血管连接的作用。

[3]根据上述[1]或[2]所述的静脉形成促进剂，其中，磷脂酰胆碱为1种磷脂酰胆碱或2种以上磷脂酰胆碱的混合物。

[4]根据上述[1]～[3]中任一项所述的静脉形成促进剂，与癌症免疫疗法组合使用。

[5]根据上述[4]所述的静脉形成促进剂，其中，癌症免疫疗法为免疫抑制解除疗法和/或免疫细胞输注疗法。

[6]根据上述[5]所述的静脉形成促进剂，其中，免疫抑制解除疗法中使用的免疫检查点抑制剂为抗CTLA-4抗体、PD-1阻断药、抗PD-1抗体、PD-L1阻断药或抗PD-L1抗体。

[7]一种血管直径扩张剂，其特征在于，以磷脂酰胆碱为有效成分，具有扩张肿瘤血管直径的作用。

[7-2]根据上述[7]所述的血管直径扩张剂，其中，磷脂酰胆碱为1种磷脂酰胆碱或2种以上磷脂酰胆碱的混合物。

[7-3]根据上述[7]或[7-2]所述的血管直径扩张剂，其与癌症免疫疗法组合使用。

[7-4]根据上述[7-3]所述的血管直径扩张剂，其中，癌症免疫疗法为免疫抑制解除疗法和/或免疫细胞输注疗法。

[7-5]根据上述[7-4]所述的血管直径扩张剂，其中，免疫抑制解除疗法中使用的免疫检查点抑制剂为抗CTLA-4抗体、PD-1阻断药、抗PD-1抗体、PD-L1阻断药或抗PD-L1抗体。

[8]一种血管连接促进剂，其特征在于，以磷脂酰胆碱为有效成分，具有不借助溶血磷脂受体而使肿瘤血管连接的作用。

[8-2]根据上述[8]所述的血管连接促进剂，其中，磷脂酰胆碱为1种磷脂酰胆碱或2种以上磷脂酰胆碱的混合物。

[8-3]根据上述[8]或[8-2]所述的血管连接促进剂，其与癌症免疫疗法组合使用。

[8-4]根据上述[8-3]所述的血管连接促进剂，其中，癌症免疫疗法为免疫抑制解除疗法和/或免疫细胞输注疗法。

[8-5]根据上述[8-4]所述的血管连接促进剂，其中，免疫抑制解除疗法中使用的免疫检查点抑制剂为抗CTLA-4抗体、PD-1阻断药、抗PD-1抗体、PD-L1阻断药或抗PD-L1抗体。

[9]一种白细胞浸润促进剂，其特征在于，以磷脂酰胆碱为有效成分，具有不借助溶血磷脂受体而促进白细胞向肿瘤区域整体浸润的作用。

[9-2]根据上述[9]所述的白细胞浸润促进剂，其中，磷脂酰胆碱为1种磷脂酰胆碱或2种以上磷脂酰胆碱的混合物。

[9-3]根据上述[9]或[9-2]所述的白细胞浸润促进剂，其与癌症免疫疗法组合使用。

[9-4]根据上述[9-3]所述的白细胞浸润促进剂，其中，癌症免疫疗法为免疫抑制解除疗法和/或免疫细胞输注疗法。

[9-5]根据上述[9-4]所述的白细胞浸润促进剂，其中，免疫抑制解除疗法中使用的免疫检查点抑制剂为抗CTLA-4抗体、PD-1阻断药、抗PD-1抗体、PD-L1阻断药或抗PD-L1抗体。

[10]根据上述[9]所述的白细胞浸润促进剂，其中，白细胞为CD4阳性细胞和/或CD8阳性细胞。

[11]一种肿瘤免疫活化剂，其特征在于，以磷脂酰胆碱为有效成分，具有不借助溶血磷脂受体而促进白细胞向肿瘤区域整体浸润的作用。

[11-2]根据上述[11]所述的白细胞浸润促进剂，其中，磷脂酰胆碱为1种磷脂酰胆碱或2种以上磷脂酰胆碱的混合物。

[11-3]根据上述[11]或[11-2]所述的白细胞浸润促进剂，其与癌症免疫疗法组合使用。

[11-4]根据上述[11-3]所述的白细胞浸润促进剂，其中，癌症免疫疗法为免疫抑制解除疗法和/或免疫细胞输注疗法。

[11-5]根据上述[11-4]所述的白细胞浸润促进剂，其中，免疫抑制解除疗法中使用的免疫检查点抑制剂为抗CTLA-4抗体、PD-1阻断药、抗PD-1抗体、PD-L1阻断药或抗PD-L1抗体。

[12]根据上述[11]所述的肿瘤免疫活化剂，其中，白细胞为CD4阳性细胞和/或CD8阳性细胞。

发明效果

作为本发明的有效成分的磷脂酰胆碱不影响正常血管且能够使肿瘤内部的异常断开的血管连接，并且能够扩张肿瘤血管的直径、促进静脉形成。已知白细胞等炎症细胞不仅从毛细血管、还从静脉侵入组织，因此磷脂酰胆碱能够改善肿瘤内的血流状态、促进白细胞向肿瘤区域整体的浸润、活化肿瘤内部的肿瘤免疫、抑制肿瘤增大。本发明的静脉形成促进剂、血管直径扩张剂、血管连接促进剂、白细胞浸润促进剂及肿瘤免疫活化剂发挥如下优良效果：不使肿瘤血管破裂，减少肿瘤内部的低氧区域，因此不会诱导癌细胞的恶性化。进一步地，本发明的静脉形成促进剂、血管直径扩张剂、血管连接促进剂、白细胞浸润促进剂及肿瘤免疫活化剂发挥能够将并用的药剂高效地递送到肿瘤内部的优良效果。

附图说明

图1是示出对皮下接种小鼠Lewis肺癌细胞株(以下记作“LLC细胞”)而形成了肿瘤的小鼠给药大豆磷脂酰胆碱或Intralipos Injection(力基注射液)20％(商品名、大塚制药、每100μL中含有1.2mg纯化蛋黄卵磷脂)9天并研究肿瘤增大抑制效果的结果的图。

图2是示出对皮下接种LLC细胞而形成了肿瘤的小鼠给药大豆磷脂酰胆碱或Intralipos Injection 20％(商品名、大塚制药)9天并评价肿瘤血管的结构变化的结果的图。

图3是示出对皮下接种LLC细胞而形成了肿瘤的小鼠给药大豆磷脂酰胆碱或Intralipos Injection 20％(商品名、大塚制药)9天并评价CD4阳性细胞的肿瘤内浸润的结果的图。

图4是示出对皮下接种LLC细胞而形成了肿瘤的小鼠给药大豆磷脂酰胆碱或Intralipos Injection 20％(商品名、大塚制药)9天并评价CD8阳性细胞的肿瘤内浸润的结果的图。

图5是示出对皮下接种LLC细胞而形成了肿瘤的小鼠给药大豆磷脂酰胆碱或溶血磷脂酰胆碱9天并评价肿瘤血管的结构变化的结果的图。

图6是示出对皮下接种作为小鼠大肠癌细胞株的colon26细胞而形成了肿瘤的小鼠给药大豆磷脂酰胆碱7天并评价肿瘤血管的结构变化的结果的图。

图7是示出对皮下接种作为小鼠大肠癌细胞株的colon26细胞而形成了肿瘤的小鼠给药大豆磷脂酰胆碱7天并评价CD4阳性细胞及CD8阳性细胞的肿瘤内浸润的结果的图。

图8是示出对皮下接种作为小鼠黑素瘤细胞株的B16细胞而形成了肿瘤的小鼠给药大豆磷脂酰胆碱7天并评价肿瘤血管的结构变化的结果的图。

图9是示出对皮下接种作为小鼠黑素瘤细胞株的B16细胞而形成了肿瘤的小鼠给药大豆磷脂酰胆碱7天并评价CD4阳性细胞及CD8阳性细胞的肿瘤内浸润的结果的图。

图10是示出对皮下接种LLC细胞而形成了肿瘤的小鼠联合给药大豆磷脂酰胆碱和抗PD-1抗体并研究肿瘤增大抑制效果的结果的图。

图11是示出对皮下接种colon26细胞而形成了肿瘤的小鼠联合给药大豆磷脂酰胆碱和抗PD-1抗体并研究肿瘤增大抑制效果的结果的图。

图12是示出对皮下接种colon26细胞而形成了肿瘤的小鼠给药大豆磷脂酰胆碱7天、在末次给药的次日将收集自其它小鼠的淋巴细胞进行静脉内给药并评价所给药的淋巴细胞的肿瘤内浸润的结果的图。

图13是示出对皮下接种B16细胞而形成了肿瘤的小鼠给药大豆磷脂酰胆碱7天、在末次给药的次日将收集自其它小鼠的淋巴细胞进行静脉内给药并评价所给药的淋巴细胞的肿瘤内浸润的结果的图。

图14是示出对皮下接种LLC细胞而形成了肿瘤的小鼠给药大豆磷脂酰胆碱7天、在末次给药的次日将收集自其它小鼠的淋巴细胞进行静脉内给药并评价所给药的淋巴细胞的肿瘤内浸润的结果的图。

图15是示出对皮下接种LLC细胞而形成了肿瘤的小鼠给药二硬脂酰基磷脂酰胆碱7天并评价CD4阳性细胞及CD8阳性细胞的肿瘤内浸润的结果的图。

图16是示出对皮下接种LLC细胞而形成了肿瘤的小鼠给药大豆磷脂酰胆碱或Intralipos Injection 20％(商品名、大塚制药)7天并观察肿瘤内的低氧区域的结果的图。

图17是示出对皮下接种LLC细胞而形成了肿瘤的小鼠给药大豆磷脂酰胆碱或Intralipos Injection 20％(商品名、大塚制药)7天、在其次日给药阿霉素并观察阿霉素的肿瘤内迁移的结果的图。

图18是示出对皮下接种LLC细胞而形成了肿瘤的小鼠联合给药大豆磷脂酰胆碱和5-FU进行并研究肿瘤增大抑制效果的结果的图。

图19是示出研究大豆磷脂酰胆碱对培养人脐带静脉血管内皮细胞(HUVEC)的管腔形成的效果的结果的图。

图20是示出研究各种磷脂酰胆碱对培养人脐带静脉血管内皮细胞(HUVEC)的管腔形成的效果的结果的图。

具体实施方式

磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine)是磷脂的一种，也被称为卵磷脂。磷脂与其它脂质不同，不仅是能量来源，还作为脂质介质参与细胞的信号转导。磷脂酰胆碱是人体内存在的最多的磷脂，作为构成细胞膜的主要成分而发挥作用。对于磷脂酰胆碱而言，还已知其作为神经递质乙酰胆碱的材料的功能，传递副交感神经的刺激而参与学习、记忆、睡眠。另外，也参与脂质代谢，已知有肝脏保护作用。磷脂酰胆碱的物质特征是兼具水和油两者的性质。磷脂酰胆碱由磷酸、胆碱、甘油、脂肪酸这四要素构成，由于磷酸和胆碱为亲水性、甘油和脂肪酸为亲油性，因此具有使水和油混合的乳化作用。通过该乳化作用而能够使细胞内的水溶性物质和脂溶性物质融合，能够参与养分向细胞内的吸收、废弃物等向细胞外的排出。另外认为，通过乳化作用来活化脂质代谢，由此具有改善高脂血症、预防动脉硬化的效果。但是，磷脂酰胆碱对于肿瘤内的血管有怎样的影响则完全是未知的。

本发明人发现：在对皮下移植癌细胞而形成了肿瘤的小鼠给药磷脂酰胆碱时，与未给药磷脂酰胆碱(无处置)的小鼠相比肿瘤的增大得到抑制；在无处置小鼠的肿瘤血管中可见曲折、无序的分支，而在磷脂酰胆碱给药小鼠的肿瘤血管中，断开的血管得以连接并变成与正常组织同样的网状结构，一部分血管扩张而呈静脉样。另外，在观察磷脂酰胆碱给药小鼠的肿瘤内部的免疫细胞的定位时，发现与无处置小鼠的肿瘤组织相比，CD4阳性细胞及CD8阳性细胞在肿瘤的包括中心部在内的肿瘤区域整体中大量存在。即，本发明人发现，磷脂酰胆碱具有促进免疫细胞向肿瘤区域整体浸润的作用。根据这些结果，认为：通过给药磷脂酰胆碱，增进CD8阳性细胞毒性T细胞、CD4阳性辅助性T细胞向肿瘤内的浸润，肿瘤免疫被活化，细胞毒性T细胞攻击肿瘤细胞，从而诱导了抗肿瘤效果。

本发明人此前发现，当对皮下形成了肿瘤的小鼠给药溶血磷脂酸(LPA)时，LPA活化LPA受体而诱导肿瘤血管的网络构建、使其正常化为网状结构，使血管内腔平滑化，使血管通透性正常化(专利文献1)。溶血磷脂酸由溶血磷脂酰胆碱利用酶合成，溶血磷脂酰胆碱通过磷脂酰胆碱的酶解生成，因此此次的见解有可能是所给药的磷脂酰胆碱在生物体内被分解为溶血磷脂酸、并活化溶血磷脂酸受体而诱导的效果。但是，通过给药磷脂酰胆碱而观察到的肿瘤内血管结构的改善、免疫细胞的浸润促进在给药溶血磷脂酰胆碱时并未观察到(参照参考例1)，并且在使用溶血磷脂酸受体4缺陷的小鼠的实验中，通过给药磷脂酰胆碱观察到肿瘤内血管结构的改善、免疫细胞的浸润促进，因此明确了磷脂酰胆碱所带来的效果并不是溶血磷脂酸受体介导的。

另外，专利文献1中，作为给药活化溶血磷脂受体的物质时的效果，公开了使可见曲折、无序的分支的肿瘤血管变成与正常组织同样的网状结构、使血管的通透性正常化，但对于使连接着的肿瘤血管扩张而静脉化以及免疫细胞向肿瘤区域整体浸润这一点既没有记载也没有启示。即，即使在认识到磷脂酰胆碱为溶血磷脂酸的前体而给药磷脂酰胆碱的情况下，给药磷脂酰胆碱所发挥的效果也是基于专利文献1的记载所无法预期的。

本发明提供一种静脉形成促进剂，以磷脂酰胆碱为有效成分，具有促进肿瘤血管的静脉化的作用。另外，本发明提供一种血管直径扩张剂，以磷脂酰胆碱为有效成分，具有扩张肿瘤血管直径的作用。另外，本发明提供一种血管连接促进剂，以磷脂酰胆碱为有效成分，具有不借助溶血磷脂受体而使肿瘤血管连接的作用。另外，本发明提供一种白细胞浸润促进剂及肿瘤免疫活化剂，以磷脂酰胆碱为有效成分，具有不借助溶血磷脂受体而促进白细胞向肿瘤区域整体浸润的作用。以下将这些发明总称为“本发明剂”。需要说明的是，作为本发明剂的有效成分的磷脂酰胆碱中，不包括包封或复合有其它治疗药或者构成以脂质体或胶体粒子的形态来给药的药剂的磷脂酰胆碱。

作为本发明剂的有效成分的磷脂酰胆碱(也称为卵磷脂)只要是具有在甘油的C1位及C2位与脂肪酸形成酯键、在C3位与磷酸胆碱形成酯键的结构的物质则没有特别限定。作为磷脂酰胆碱，可列举例如：蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、大豆磷脂酰胆碱、二辛酰基磷脂酰胆碱、二壬酰基磷脂酰胆碱、二癸酰基磷脂酰胆碱、双十一酰基磷脂酰胆碱、二月桂酰基磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈油酰基磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰胆碱、二亚油酰基磷脂酰胆碱、双二十碳五烯酰基磷脂酰胆碱、双二十二碳六烯酰基磷脂酰胆碱、二芥酰基磷脂酰胆碱、(1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基)磷脂酰胆碱、(1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基)磷脂酰胆碱、(1-油酰基-2-棕榈酰基)磷脂酰胆碱、(1-棕榈酰基-2-油酰基)磷脂酰胆碱等。

本发明剂中使用的磷脂酰胆碱可以是从天然来源提取的也可以是化学合成的。作为从天然来源提取的磷脂酰胆碱，可列举蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、大豆磷脂酰胆碱等。高品质、高纯度的纯化蛋黄卵磷脂、纯化大豆卵磷脂均有销售，可以适宜使用这些。磷脂酰胆碱既可以含有2种以上磷脂酰胆碱，也可以由1种磷脂酰胆碱构成。从天然来源提取的磷脂酰胆碱通常为多种磷脂酰胆碱的混合物。

构成磷脂酰胆碱的脂肪酸基既可以是饱和脂肪酸基也可以是不饱和脂肪酸基。对脂肪酸基的碳原子数没有特别限定，可以为2以上、4以上、6以上、8以上、10以上、15以上、20以上、30以上。另外，脂肪酸基的碳原子数可以为100以下、80以下、60以下、50以下、40以下、30以下。对不饱和脂肪酸基的双键数没有特别限定，可以为1以上、2以上、3以上、4以上、5以上。另外，不饱和脂肪酸基的双键数可以为6以下、5以下、4以下、3以下、2以下。构成磷脂酰胆碱的2个脂肪酸基既可以相同也可以不同。即，构成磷脂酰胆碱的2个脂肪酸基既可以是相同的饱和脂肪酸基，也可以是相同的不饱和脂肪酸基，还可以是不同的饱和脂肪酸基，还可以是不同的不饱和脂肪酸基，还可以是一者为饱和脂肪酸基而另一者为不饱和脂肪酸基。

在本发明中，肿瘤是指细胞异常增殖而形成块的状态，包括良性肿瘤和恶性肿瘤。通过本发明剂而促进血管的静脉化和白细胞的浸润的对象肿瘤可以为良性肿瘤也可以为恶性肿瘤，优选为恶性肿瘤。更优选为实体癌。实体癌在其内部形成具有曲折、无序的分支的血管，血管内腔的结构扭曲，血管通透性过度亢进。对实体癌没有特别限定，可列举例如肺癌、大肠癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆管癌、脾脏癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、甲状腺癌、脑瘤等。另外，癌变的血液细胞所形成的肿瘤也包含在实体癌中。

本发明中，肿瘤血管的静脉化例如可以通过制作肿瘤的组织标本、用血管内皮细胞特异性抗体进行免疫染色并测定血管直径来确认。具体而言，当血管直径超过10μm时，可以判断为已静脉化。优选为12μm以上，更优选为15μm以上。另外，肿瘤血管的静脉化可以通过静脉细胞特异性基因的表达来确认。作为静脉细胞特异性基因，可列举EphB4、COUP-TFII等。基因表达可以使用从样品提取的核酸通过PCR等公知方法来确认。也可以将血管直径和静脉细胞特异性基因的表达组合来判断。具体而言，例如在能够确认血管直径超过10μm且血管组织中表达了EphB4及COUP-TFII的情况下，可以判断肿瘤血管已静脉化。

在本发明中，白细胞包括淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)、单核细胞(巨噬细胞、树突细胞)、粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)。对通过本发明剂而促进向肿瘤区域整体的浸润的白细胞没有特别限定，白细胞中包含的任一种细胞的浸润均得到促进。优选为在肿瘤内具有活化肿瘤免疫的功能的细胞(担负肿瘤免疫的细胞)。作为这样的细胞，可列举细胞毒性T细胞、NK细胞、NKT细胞、杀伤细胞、巨噬细胞、粒细胞、辅助性T细胞、LAK细胞等。此外，通过本发明剂而促进向肿瘤中心部的浸润的白细胞优选为CD4阳性细胞和/或CD8阳性细胞。CD4阳性细胞优选为辅助性T细胞，CD8阳性细胞优选为细胞毒性T细胞。发生浸润的细胞的种类和区域例如可以通过制作肿瘤的组织标本并使用针对各细胞特异性的表面抗原的抗体进行免疫染色来确认。

本发明剂可以以药物的形态来实施。即，可以以磷脂酰胆碱为有效成分，按照药物制剂的公知制造方法(例如，日本药典中记载的方法等)适当配合药学上可接受的载体或添加剂并制剂化。具体而言，可列举例如片剂(包括糖衣片、膜包衣片、舌下片、口腔内崩解片、颊部含片等)、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂(包括软胶囊剂、微囊剂)、含片、糖浆剂、液剂、乳剂、悬浮剂、控释制剂(例如速释制剂、缓释制剂、缓释性微囊剂等)、气雾剂、薄膜剂(例如口腔内崩解膜、口腔粘膜贴膜等)、注射剂(例如皮下注射剂、静脉内注射剂、肌内注射剂、腹膜内注射剂等)、点滴剂、透皮制剂、软膏剂、洗剂、贴剂、栓剂(例如肛门栓剂、阴道栓剂等)、微丸、经鼻剂、经肺剂(吸入剂)、滴眼剂等经口剂或非经口剂。关于载体或添加剂的配合比例，可以基于药物领域中通常采用的范围适当设定。可配合的载体或添加剂没有特别限制，可列举例如：水、生理盐水、其它水性溶剂、水性或油性基剂等各种载体；赋形剂、结合剂、pH调整剂、崩解剂、吸收促进剂、润滑剂、着色剂、矫味剂、香料等各种添加剂。

作为可混合于片剂、胶囊剂等中的添加剂，可以使用例如明胶、玉米淀粉、黄蓍胶、阿拉伯胶之类的结合剂，结晶性纤维素之类的赋形剂，玉米淀粉、明胶、藻酸等之类的溶胀剂，硬脂酸镁之类的润滑剂，蔗糖、乳糖或糖精之类的甜味剂，薄荷油、白株树油(gaultheriaadenothrix oil)或樱桃味之类的香味剂等。在单元剂型为胶囊时，上述类型的材料中还可以含有油脂之类的液状载体。用于注射的无菌组合物可以按照通常的制剂化步骤(例如将有效成分溶解或悬浮于注射用水、天然植物油等溶剂等)来制备。作为注射用的水性液，使用例如生理盐水、葡萄糖、含有其它辅助剂的等渗液(例如D-山梨醇、D-甘露醇、氯化钠等)等，还可以与合适的溶解助剂例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、聚乙二醇等)、非离子性表面活性剂(聚山梨酯80^TM、HCO-50等)等并用。作为油性液，可使用例如芝麻油、大豆油等，可以与作为溶解助剂的苯甲酸苄酯、苄醇等并用。此外，还可以配合缓冲剂(例如磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液等)、抚慰剂(例如苯扎氯铵、盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(例如人血清白蛋白、聚乙二醇等)、保存剂(例如苄醇、苯酚等)、抗氧化剂等。

本发明剂可以优选以含有添加了磷脂酰胆碱的植物油的脂肪乳剂形式来实施。作为植物油，可列举：大豆油、玉米油、椰子油、红花油、紫苏籽油、橄榄油、蓖麻油、棉籽油等。优选大豆油。例如，作为用于术前、术后等的营养补充的药品而纳入国民健康保险的“Intralipos Injection 10％(商品名)”及“Intralipos Injection 20％(商品名)”(均为大塚制药工场制)以纯化大豆油为有效成分，均含有1.2g/100mL的纯化蛋黄卵磷脂作为添加剂。因此，“Intralipos Injection 10％(商品名)”及“Intralipos Injection 20％(商品名)”作为本发明剂的实施方式是适宜的。

磷脂酰胆碱是存在于生物体内的成分，有作为药物的有效成分、添加剂给药于人的实践，因此对人和其它哺乳动物(例如大鼠、小鼠、兔、绵羊、猪、牛、猫、狗、猴等)的毒性低，可以安全地给药。

制剂中的有效成分的含量可根据剂型、给药方法、载体等适宜设定，相对于制剂总量，通常可以以0.01～100％(w/w)、优选0.1～95％(w/w)的比例添加磷脂酰胆碱。

磷脂酰胆碱的给药量根据给药对象、症状、给药途径等而存在差异，在经口给药时，通常，例如对于体重约60kg的人可以为每1天约0.01～1000mg，优选为约0.1～100mg，更优选为约0.5～500mg。在非经口给药时，其1次给药量也根据患者的状态、症状、给药方法等而异，例如，在注射剂的情况下，通常例如将每1kg体重约0.01～100mg、优选约0.01～50mg、更优选约0.01～20mg给药于静脉。每1天的总给药量可以为单次给药量，也可以为分次给药量。

本发明剂可以与癌症免疫疗法组合使用。认为本发明剂通过与癌症免疫疗法组合使用能够活化肿瘤免疫、增进肿瘤细胞毒性。将本发明剂与癌症免疫疗法组合使用是指：本发明剂的给药对象为接受癌症免疫疗法的癌症患者，或者将本发明剂与用于癌症免疫疗法的药剂组合使用(并用)。认为通过将本发明剂与癌症免疫疗法组合使用，由此能够减少癌症免疫疗法中使用的药剂的用量、降低副作用。进而，减少癌症免疫疗法中使用的药剂的用量也符合削减医疗费等社会性需求。需要说明的是，本说明书中，“组合使用”与“并用”含义相同。

癌症免疫疗法包括癌疫苗疗法、免疫细胞输注疗法、免疫抑制解除疗法、诱导调节性T细胞的除去的方法等。在几个实施方式中，癌症免疫疗法可以为免疫抑制解除疗法或免疫细胞输注疗法。作为免疫抑制解除疗法中使用的免疫检查点抑制剂，可列举例如抗CTLA-4抗体、PD-1阻断药、抗PD-1抗体、PD-L1阻断药、抗PD-L1抗体等。作为免疫细胞输注疗法，可列举嵌合抗原受体T细胞疗法等。调节性T细胞在免疫耐受中起作用，因此认为：如果在除去调节性T细胞后给药本发明剂，则发挥与并用本发明剂和免疫检查点抑制剂时同样的效果。作为诱导调节性T细胞的除去的药剂，可列举例如烷化剂、IL-2-白喉毒素、抗CD25抗体、抗KIR抗体、IDO抑制剂、BRAF抑制剂等。

作为癌症免疫疗法中使用的药剂，可列举例如：溶链菌、云芝多糖、西佐糖、蘑菇多糖、乌苯美司、干扰素、白介素、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、红细胞生成素、淋巴毒素、BCG疫苗、短小棒状杆菌、左旋咪唑、多糖K、苯咪唑丙酸、伊匹单抗、尼鲁单抗、雷莫芦单抗、奥法木单抗、帕尼单抗、帕母单抗、奥比妥珠单抗(obinutuzumab)、曲妥珠单抗-emtansine、托珠单抗、贝伐单抗、曲妥珠单抗、司妥昔单抗(Siltuximab)、西妥昔单抗(Cetuximab)、英夫利昔单抗、利妥昔单抗、二甲双胍、阿柏西普等。

通过将本发明剂与癌疫苗并用，由此能够使被癌疫苗活化的T细胞高效地浸润到肿瘤内。另外，在使用来自患者或非患者的T细胞等免疫细胞的免疫细胞输注疗法中，本发明剂也能够提高这些治疗的有效性。

这样，通过将本发明剂与癌症免疫疗法组合使用，由此能够增强癌症免疫疗法、增进肿瘤细胞毒性，因此以与癌症免疫疗法组合的方式使用的本发明剂可称为癌症免疫疗法增强剂。

本发明剂可以与上述以外的癌症治疗药组合使用。认为通过组合由本发明剂带来的肿瘤免疫活化作用，能够增强癌症治疗药本来的抗癌作用。另外认为，通过减少癌症治疗药的用量，能够减少副作用。进而，降低癌症治疗药的用量也符合削减医疗费等社会性需求。

对癌症治疗药没有特别限定，优选例如化学疗法剂、免疫疗法剂或激素疗法剂。这些癌症治疗药可以为脂质体制剂。另外，这些癌症治疗药可以为核酸药、抗体药。

作为化学疗法剂，没有特别限定，可列举例如：氮芥、盐酸氮芥-N-氧化物、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、塞替派、卡波醌、甲苯磺酸英丙舒凡、白消安、盐酸尼莫司汀、二溴甘露醇、抗瘤氨酸、达卡巴嗪、雷莫司汀、雌莫司汀磷酸钠、三乙烯三聚氰胺、卡莫司汀、洛莫司汀、链佐星、哌泊溴烷、依托格鲁、卡铂、顺铂、米铂、奈达铂、奥沙利铂、六甲蜜胺、氨莫司汀、二溴螺氯铵、福莫司汀、泼尼莫司汀、嘌嘧替派、立复汀、替莫唑胺、苏消安、氯乙环磷酰胺、净司他丁斯酯、阿多来新、半胱胺亚硝脲、比折来新等烷化剂；例如巯基嘌呤、6-巯基嘌呤核苷、硫代肌苷、氨甲蝶呤、培美曲塞、依诺他滨、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸钠、盐酸安西他滨、5-FU系药剂(例如氟尿嘧啶、替加氟、UFT、去氧氟尿苷、卡莫氟、加洛他滨、乙嘧替氟、卡培他滨等)、甲氨喋呤、奈拉滨、甲胺四氢叶酸钙、硫鸟嘌呤(Tabloid)、甘氨硫嘌呤、亚叶酸钙、左亚叶酸钙、克拉屈滨、乙嘧替氟、氟达拉滨、吉西他滨、硫酸羟基脲、喷司他丁、吡曲克辛、碘苷、丙双脒腙、噻唑呋林、氨莫司汀、苯达莫司汀等代谢拮抗剂；例如放线菌素D、放线菌素C、丝裂霉素C、色霉素A3、盐酸博来霉素、硫酸博来霉素、硫酸派来霉素、盐酸柔红霉素、盐酸阿霉素、盐酸阿柔比星、盐酸吡柔比星、盐酸表柔比星、新制癌菌素、光辉霉素、肉瘤霉素、嗜癌素、米托坦、盐酸佐柔比星、盐酸米托蒽醌、盐酸伊达比星等抗肿瘤抗生素等；例如依托泊苷、磷酸依托泊苷、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、硫酸长春地辛、替尼泊苷、紫杉醇、多西紫杉醇、长春瑞滨、伊立替康、盐酸伊立替康等来自植物的抗癌剂等。

作为免疫疗法剂，没有特别限定，可列举例如：溶链菌、云芝多糖、西佐糖、蘑菇多糖、乌苯美司、干扰素、白介素、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、红细胞生成素、淋巴毒素、BCG疫苗、短小棒状杆菌、左旋咪唑、多糖K、苯咪唑丙酸、伊匹单抗、尼鲁单抗、雷莫芦单抗、奥法木单抗、帕尼单抗、帕母单抗、奥比妥珠单抗(obinutuzumab)、曲妥珠单抗-emtansine、托珠单抗、贝伐单抗、曲妥珠单抗、司妥昔单抗(Siltuximab)、西妥昔单抗(Cetuximab)、英夫利昔单抗、利妥昔单抗等。

作为激素疗法剂，没有特别限定，可列举例如：磷雌酚、二乙基己烯雌酚、泰舒、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸环丙孕酮、达那唑、烯丙雌醇、孕三烯酮、甲帕霉素、雷洛昔芬、奥美昔芬、左美洛昔芬、抗雌激素(例如柠檬酸他莫昔芬、柠檬酸托瑞米芬等)、避孕药、环戊缩环硫雄烷、睾内酯、氨鲁米特、LH-RH激动剂(例如戈舍瑞林乙酸酯、布舍瑞林、亮丙瑞林等)、屈洛昔芬、环硫雄醇、炔雌醇磺酸酯、芳香酶抑制剂(例如盐酸法倔唑、阿那曲唑、来曲唑、依西美坦、伏氯唑、福美坦等)、抗雄激素(例如氟他胺、比卡鲁胺、尼鲁米特等)、5α-还原酶抑制剂(例如非那雄胺、爱普列特等)、肾上腺皮质激素系药剂(如地塞米松、泼尼松龙、倍他米松、曲安西龙等)、雄激素合成抑制药(例如阿比特龙等)等。

在将本发明剂与免疫检查点抑制剂或其它癌症治疗药组合使用(并用)时，既可以将这些同时给药于给药对象，也可以间隔时间而给药。在本说明书中，“组合使用(并用)”是指2种以上药剂的应用时期重复，不需要为同时给药。免疫检查点抑制剂或癌症治疗药的给药量只要基于临床中使用的给药量即可，可以根据给药对象、给药对象的年龄和体重、症状、给药时间、剂型、给药方法、组合等适宜选择。

本发明中还包含以下各发明。

一种肿瘤血管的静脉化促进方法，其特征在于，对哺乳动物给药磷脂酰胆碱。

一种磷脂酰胆碱，其用于促进肿瘤血管的静脉化。

磷脂酰胆碱在制造静脉形成促进剂中的应用，所述静脉形成促进剂促进肿瘤血管的静脉化。

一种扩张肿瘤血管直径的方法，其特征在于，对哺乳动物给药磷脂酰胆碱。

一种磷脂酰胆碱，其用于扩张肿瘤血管的血管直径。

磷脂酰胆碱在制造血管直径扩张剂中的应用，所述血管直径扩张剂扩张肿瘤血管直径。

一种不借助溶血磷脂受体而使肿瘤血管连接的方法，其特征在于，对哺乳动物给药磷脂酰胆碱。

一种磷脂酰胆碱，其用于不借助溶血磷脂受体而使肿瘤血管连接。

磷脂酰胆碱在制造血管连接促进剂中的应用，所述血管连接促进剂不借助溶血磷脂受体而使肿瘤血管连接。

一种不借助溶血磷脂受体而促进白细胞向肿瘤区域整体浸润的方法，其特征在于，对哺乳动物给药磷脂酰胆碱。

一种磷脂酰胆碱，其用于不借助溶血磷脂受体而促进白细胞向肿瘤区域整体浸润。

磷脂酰胆碱在制造白细胞浸润促进剂中的应用，所述白细胞浸润促进剂不借助溶血磷脂受体而促进白细胞向肿瘤区域整体浸润。

一种肿瘤免疫活化方法，其特征在于，对哺乳动物给药磷脂酰胆碱。

一种磷脂酰胆碱，其用于不借助溶血磷脂受体而活化肿瘤免疫。

磷脂酰胆碱在制造肿瘤免疫活化剂中的应用，所述肿瘤免疫活化剂不借助溶血磷脂受体而活化肿瘤免疫。

一种癌症免疫疗法增强方法，其特征在于，对哺乳动物给药磷脂酰胆碱。

一种磷脂酰胆碱，其用于不借助溶血磷脂受体而增强癌症免疫疗法。

磷脂酰胆碱在制造癌症免疫疗法增强剂中的应用，所述癌症免疫疗法增强剂不借助溶血磷脂受体而增强癌症免疫疗法。

一种癌症治疗药，以磷脂酰胆碱为有效成分。

一种癌症治疗方法，其特征在于，对哺乳动物给药磷脂酰胆碱。

一种磷脂酰胆碱，其用于癌症治疗。

磷脂酰胆碱在制造癌症治疗药中的应用。

实施例

以下通过实施例详细说明本发明，但本发明不受这些例子限定。

〔实施例1：给药磷脂酰胆碱对肿瘤(肺癌)的效果〕

为了检验给药磷脂酰胆碱对肿瘤的效果，在将小鼠癌细胞株移植到小鼠皮下而形成了肿瘤后给药磷脂酰胆碱(以下记作“PC”)或含PC的纯化大豆油乳化剂，观察抗肿瘤效果、肿瘤血管结构、及肿瘤内淋巴细胞浸润。

(1)实验方法

(1-1)使用细胞及使用动物

作为小鼠癌细胞株，使用LLC细胞(Lewis肺癌细胞株)。向8周龄的C57BL/6NCrSlc小鼠(♀、SLC公司)的皮下注射LLC细胞(1×10 ⁶个/100μL·PBS/只)。

(1-2)给药物质

作为PC，使用大豆PC(L-α-phosphatidylcholine(95％)(Soy)(L-α-磷脂酰胆碱(95％)(大豆))、Avanti POLAR LIPIDS公司)。就大豆PC而言，将用50％乙醇调整浓度为25mM的溶液保存于-30℃，在即将给药前用PBS稀释为3mg/kg/100μL。每1次向小鼠尾静脉内给药100μL。作为含PC的纯化大豆油乳化剂，使用Intralipos Injection 20％(商品名、大塚制药)。每1次向小鼠尾静脉内给药100μL(含有纯化蛋黄卵磷脂1.2mg)。

(1-3)分组及给药日程

设置大豆PC组、Intralipos(力基)组及对照组(非给药组)这3组(4只/组)。在癌细胞移植后第5天至第13天这9天，将Intralipos 100μL或大豆PC 3mg/kg(100μL)用27G注射器向小鼠的尾静脉内1天1次地连日给药。在末次给药的次日(移植后第14天)从小鼠中摘出肿瘤。

(1-4)肿瘤体积的测定

在移植后第5、7、10及14天测定肿瘤体积。肿瘤体积以长径×短径×高度×0.5来计算。

(1-5)肿瘤组织标本的制作

将摘出的肿瘤浸渍在4％多聚甲醛(PFA)/PBS中，在4℃振荡一晚而进行固定。固定结束后，用冷PBS(4℃)清洗肿瘤。清洗进行6小时，每30分钟交换为新的PBS。然后，将肿瘤浸渍在15％蔗糖/PBS中，在4℃振荡3小时。然后，浸渍于30％蔗糖/PBS中，在4℃下振荡3小时。然后，将肿瘤包埋在O.C.T.复合物(Tissue-Tek公司)中，在-80℃冷冻3天以上。

(1-6)肿瘤血管结构的观察

将用O.C.T.复合物包埋的肿瘤在低温恒温器(LEICA公司)中切成厚度40μm的切片。将切片放在载玻片上，在干燥器中风干约2小时。将切片的周围用LIQUID BLOCKER包围，将载玻片设置于载玻片染色缸中，用PBS在室温下清洗10分钟，从而将O.C.T.复合物洗掉。用4％PFA/PBS在室温下进行10分钟的后固定，用PBS在室温下进行10分钟清洗。将封闭液(5％正常山羊血清/1％BSA/2％脱脂乳/PBS)滴加到切片上，在室温下封闭20分钟。一抗使用作为抗小鼠CD31抗体的纯化仓鼠抗PECAM-1(MILLIPORE公司：MAB1398Z)。将该一抗用封闭液稀释200倍后滴加到切片上，在4℃下反应一晚。用含有Tween20的PBS(PBST)清洗10分钟，进行5次该清洗，进一步用PBS清洗10分钟。二抗使用Alexa Fluor 488山羊抗仓鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Labolatories公司)。将该二抗用封闭液稀释400倍后滴加到切片上，遮光反应2小时。用PBST清洗10分钟，进行5次该清洗，滴加数滴Vectashild(VectorLaboratories Inc.公司)，用盖玻片封片。用共聚焦激光显微镜(LEICA公司)观察并拍照。

(1-7)肿瘤内淋巴细胞浸润的观察

将用O.C.T.复合物包埋的肿瘤在低温恒温器(LEICA公司)中切成厚度20μm的切片，按照与上述相同的步骤进行后固定及封闭。一抗使用纯化大鼠抗小鼠CD8(BioLegend公司：100801)，用封闭溶液稀释200倍后滴加到切片上，在4℃反应一晚。二抗使用山羊抗大鼠IgG(H+L)二抗,Alexa Fluor 488偶联物(Thermo Fisher Sxientific公司：A11006)，用封闭溶液稀释400倍后滴加到切片上，遮光反应2小时。用PBST清洗一晚。将作为三抗的抗小鼠CD4PE(eBioscience公司：12-0042-83)、APC标记大鼠抗小鼠CD31(BD Pharmingen公司：551262)分别用封闭溶液稀释至400倍后滴加到切片上，遮光反应2小时。用PBST清洗一晚后，将封片剂(DAKO mounting medium、DAKO公司)滴加到切片上，用盖玻片封片。对于封片后的切片，用共聚焦激光显微镜(LEICA公司)以倍率400倍的视野、以厚度10μm进行拍摄。通过分为肿瘤中心部和肿瘤周边部进行拍摄，从而考察肿瘤中心部和周边部的淋巴细胞浸润的差异。从所拍摄的图像中分别测定CD4阳性细胞及CD8阳性细胞的个数，计算出单位面积的淋巴细胞数。

(2)结果

(2-1)肿瘤体积

将结果示于图1。由图1可明确，大豆PC组及Intralipos组与对照组相比显示出抑制肿瘤增大。

(2-2)肿瘤血管结构

将结果示于图2。血管内皮细胞被染色成绿色荧光，在照片中描绘为白色。显示对照组中形成了连接性差的血管。另一方面，显示大豆PC组及Intralipos组中形成了连接性良好的血管。另外可知，多条血管的血管直径扩张，诱导出血管直径超过10μm的静脉样形态。

(2-3)肿瘤内淋巴细胞浸润

将CD4阳性细胞的结果示于图3，将CD8阳性细胞的结果示于图4。由图3及图4可明确，对照组相比，大豆PC组及Intralipos组中，CD4阳性细胞及CD8阳性细胞均在肿瘤内呈弥漫性浸润，观察到肿瘤免疫的改善效果。大豆PC组及Intralipos组的肿瘤周边部的CD4阳性细胞数分别增加至对照组的1.5倍及1.2倍，肿瘤中心部的CD4阳性细胞数分别增加至对照组的3倍及4倍。另外，大豆PC组及Intralipos组的CD8阳性细胞数在肿瘤周边部及中心部均分别增加了对照组的2倍以上。

(2-4)小结

已知当淋巴细胞等炎症细胞从血管内侵入组织时，是从比毛细血管粗的细静脉漏出到血管外的。根据实施例1的结果认为：PC使血管网连接、改善肿瘤内的血流并且使血管变成静脉样，从而促进淋巴细胞向肿瘤组织内的浸润、抑制肿瘤增大。

〔参考例1：与给药溶血磷脂酰胆碱的比较〕

对于给药作为PC的分解产物的溶血磷脂酰胆碱(以下记作“LPC”)是否会使肿瘤内血管结构与给药PC同样地变成静脉样形态这一点进行了确认。

(1)实验方法

作为给药物质使用LPC(Avanti POLAR LIPIDS公司制；1-oleoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine，1-油酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)及大豆PC(与实施例1相同)，除此以外，通过与实施例1相同的方法进行实验。需要说明的是，LPC通过与实施例1的大豆PC同样的步骤来制备3mg/kg/100μL溶液，每1次向小鼠尾静脉内给药100μL。

(2)结果

将结果示于图5。LPC组与大豆PC组不同，对于肿瘤内血管并未诱导结构变化。由该结果明确：PC并不是被分解为LPC后诱导肿瘤内血管的结构变化的，而是以PC的状态来诱导肿瘤内血管的结构变化。即，明确了与借助溶血磷脂受体来活化肿瘤免疫的在先发明的机制并不相同。

磷脂酰胆碱是已确认了可安全给药于生物体的物质。并且，通过上述见解已明确：磷脂酰胆碱促进免疫细胞向肿瘤区域整体的浸润，能够增强细胞毒性T细胞等免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效果，另外，由于CD4阳性细胞浸润到肿瘤内部，因此成为能够基于肿瘤细胞所表达的分子进行抗原提呈的状态。进一步地，磷脂酰胆碱对正常组织的血管没有损伤，因此副作用的风险非常低。认为磷脂酰胆碱的这种功能并不会根据癌症种类而产生不同，因此磷脂酰胆碱能够用于任意的癌症种类，特别是对于缺乏血流的癌症(胰腺癌等)可期待显著的效果。

〔实施例2：给药磷脂酰胆碱对大肠癌的效果〕

(1)实验方法

(1-1)使用细胞及使用动物

作为小鼠癌细胞株，使用colon26细胞(小鼠大肠癌细胞株)。向8周龄的Balb/c小鼠(♀、SLC公司)的皮下注射colon26细胞(1×10⁶个/100μL·PBS/只)。

(1-2)给药物质

与实施例1同样地，使用大豆PC。与实施例1同样地，在即将给药前用PBS稀释成3mg/kg/100μL，每1次向小鼠尾静脉内给药100μL。

(1-3)分组及给药日程

设置大豆PC组及对照组(溶剂给药组)这2组(3只/组)。在癌细胞移植后第7天至第13天这7天，将大豆PC3mg/kg(100μL)向小鼠的尾静脉内1天1次地连日给药。在末次给药的次日(移植后第14天)从小鼠中摘出肿瘤。

(1-4)肿瘤组织标本制作、肿瘤血管结构的观察及肿瘤内淋巴细胞浸润的观察

通过与实施例1同样的方法制作肿瘤组织标本，观察肿瘤血管结构，观察肿瘤内淋巴细胞浸润。

(2)结果

(2-1)肿瘤血管结构

将结果示于图6。与实施例1的结果同样地显示出大豆PC组中连接性良好、诱导出血管直径粗的静脉样形态的血管。

(2-2)肿瘤内淋巴细胞浸润

将结果示于图7。左侧为CD4阳性细胞的结果，右侧为CD8阳性细胞的结果。与实施例1的结果同样地显示出大豆PC组诱导了CD4阳性细胞及CD8阳性细胞向肿瘤内的浸润。

〔实施例3：给药磷脂酰胆碱对黑素瘤的效果〕

(1)实验方法

(1-1)使用细胞及使用动物

作为小鼠癌细胞株，使用B16细胞(小鼠黑素瘤细胞株)。向8周龄的C57BL/6NCrSlc小鼠(♀、SLC公司)的皮下注射B16细胞(1×10⁶个/100μL·PBS/只)。

(1-2)给药物质

与实施例1同样地使用大豆PC。与实施例1同样地，在即将给药前用PBS稀释成3mg/kg/100μL，每1次向小鼠尾静脉内给药100μL。

(1-3)分组及给药日程

设置大豆PC组及对照组(溶剂给药组)这2组(3只/组)。在癌细胞移植后第5天至第11天这7天，将大豆PC3mg/kg(100μL)向小鼠的尾静脉内1天1次地连日给药。在末次给药的次日(移植后第12天)从小鼠中摘出肿瘤。

(1-4)肿瘤组织标本制作、肿瘤血管结构的观察及肿瘤内淋巴细胞浸润的观察

通过与实施例1同样的方法制作肿瘤组织标本，观察肿瘤血管结构，观察肿瘤内淋巴细胞浸润。

(2)结果

(2-1)肿瘤血管结构

将结果示于图8。与实施例1及2的结果同样地显示出大豆PC组中连接性良好、诱导出血管直径粗的静脉样形态的血管。

(2-2)肿瘤内淋巴细胞浸润

将结果示于图9。左侧为CD4阳性细胞的结果，右侧为CD8阳性细胞的结果。与实施例1及2的结果同样地显示出大豆PC组诱导了CD4阳性细胞及CD8阳性细胞向肿瘤内的浸润。

实施例2及3的结果显示：PC在不同的癌症种类、不同的小鼠品系中均显示出与实施例1同样的效果。因此得到如下结论：在任何癌症种类中，PC均会显示出对肿瘤内血管的效果和诱导淋巴细胞浸润的效果。

〔实施例4：对于Lewis肺癌的磷脂酰胆碱和免疫检查点抑制剂的并用效果〕

(1)实验方法

(1-1)使用细胞及使用动物

使用LLC细胞(Lewis肺癌细胞株)。向8周龄的C57BL/6NCrSlc小鼠(♀、SLC公司)的皮下注射LLC细胞(1×10⁶个/100μL·PBS/只)。

(1-2)给药物质

与实施例1同样地使用大豆PC。与实施例1同样地，在即将给药前用PBS稀释成3mg/kg/100μL，每1次向小鼠尾静脉内给药100μL。作为免疫检查点抑制剂，使用抗PD-1抗体(BioXcell公司)。

(1-3)分组及给药日程

设置大豆PC组、抗PD-1抗体组、大豆PC/抗PD-1抗体并用组及对照组(溶剂给药组)这4组(3只/组)。在癌细胞移植后第7天至第20天这13天，将大豆PC3mg/kg(100μL)向小鼠的尾静脉内1天1次地连日给药。以200μg/小鼠的用量在癌细胞移植后第7天、第9天、第11天、第14天、第16天、第18天腹腔内给药抗PD-1抗体。

(1-4)肿瘤体积的测定

在癌细胞移植后第7、14及21天测定肿瘤体积。肿瘤体积通过长径×短径×高度×0.5来计算。

(2)结果

将肿瘤体积的测定结果示于图10。已知抗PD-1抗体单独使用时对Lewis肺癌没有效果，在本实验中，抗PD-1抗体组也未抑制肿瘤增大。虽然大豆PC组抑制了肿瘤增大，但大豆PC/抗PD-1抗体并用组显著地抑制肿瘤增大，可确认到协同效应。

〔实施例5：对于大肠癌的磷脂酰胆碱和免疫检查点抑制剂的并用效果〕

(1)实验方法

(1-1)使用细胞及使用动物

使用colon26细胞(小鼠大肠癌细胞株)。向8周龄的Balb/c小鼠(♀、SLC公司)的皮下注射colon26细胞(1×10 ⁶个/100μL·PBS/只)。

(1-2)给药物质

与实施例1同样地使用大豆PC。与实施例1同样地，在即将给药前用PBS稀释成3mg/kg/100μL，每1次向小鼠尾静脉内给药100μL。作为免疫检查点抑制剂，使用抗PD-1抗体(BioXcell公司)。

(1-3)分组及给药日程

设置大豆PC组、抗PD-1抗体组、大豆PC/抗PD-1抗体并用组及对照组(溶剂给药组)这4组(3只/组)。在癌细胞移植后第7天至第20天这13天，将大豆PC3mg/kg(100μL)向小鼠的尾静脉内1天1次地连日给药。以200μg/小鼠的用量在癌细胞移植后第7天、第9天、第11天、第14天、第16天、第18天腹腔内给药抗PD-1抗体。

(1-4)肿瘤体积的测定

在癌细胞移植后第7、14及21天测定肿瘤体积。肿瘤体积通过长径×短径×高度×0.5来计算。

(2)结果

将肿瘤体积的测定结果示于图11。与实施例4同样地，大豆PC组及抗PD-1抗体组抑制肿瘤增大，大豆PC/抗PD-1抗体并用组则显著抑制肿瘤增大。

由实施例4及5的结果可知：在任意的癌症种类中，PC均诱导淋巴细胞向肿瘤内的浸润，免疫检查点抑制剂均活化淋巴细胞，从而抗肿瘤效果变显著。

〔实施例6：对于大肠癌的磷脂酰胆碱和免疫细胞输注疗法的并用效果〕

目前，作为肿瘤免疫疗法，除了免疫检查点抑制剂以外临床中还实施免疫疗法(免疫细胞输注疗法)，所述免疫疗法是将收集自癌症患者的淋巴细胞等免疫细胞在试管中增殖后或活化后给药于癌症患者，从而提高肿瘤免疫效果。但是，由于淋巴细胞向肿瘤内的浸润受到抑制，因此为了有效实施免疫细胞输注疗法，首先需要控制肿瘤内的血管，使淋巴细胞能够向肿瘤内浸润。因此，对于荷瘤小鼠，给药PC后静脉内给药淋巴细胞，研究淋巴细胞向肿瘤内的浸润是否得到促进。

(1)实验方法

(1-1)使用细胞及使用动物

使用colon26细胞(小鼠大肠癌细胞株)。向8周龄的Balb/c小鼠(♀、SLC公司)的皮下注射colon26细胞(1×10⁶个/100μL·PBS/只)。

(1-2)给药物质

与实施例1同样地使用大豆PC。与实施例1同样地，在即将给药前用PBS稀释成3mg/kg/100μL，每1次向小鼠尾静脉内给药100μL。

(1-3)淋巴细胞的制备

从几乎全身的组织细胞中均表达绿色荧光的转基因小鼠(C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)、SLC公司)的脾脏回收淋巴细胞，制备淋巴细胞悬浮液。

(1-4)分组及给药日程

设置大豆PC组及对照组(溶剂给药组)这2组(3只/组)。在癌细胞移植后第7天至第13天这7天，将大豆PC3mg/kg(100μL)向小鼠的尾静脉内1天1次地连日给药。在末次给药的次日(移植后第14天)，向尾静脉内给药淋巴细胞悬浮液(5×10⁶个)。在给药淋巴细胞1小时后从小鼠中摘出肿瘤。

(1-5)肿瘤组织标本制作及肿瘤内淋巴细胞浸润的观察

通过与实施例1同样的方法制作肿瘤组织标本，使用抗EGFP抗体(MBL LifeScience公司)作为抗体，除此以外，通过与实施例1相同的方法观察肿瘤内淋巴细胞浸润。

(2)结果

将结果示于图12。对照组中，静脉内给药的淋巴细胞基本没有浸润到肿瘤内。另一方面，大豆PC组中，观察到静脉内给药的淋巴细胞的肿瘤内浸润。

〔实施例7：对于黑素瘤的磷脂酰胆碱和免疫细胞输注疗法的并用效果〕

使用B16细胞(小鼠黑素瘤细胞株)及C57BL/6NCrSlc小鼠，除此以外，通过与实施例6相同的方法观察静脉内给药的淋巴细胞的肿瘤内浸润。

将结果示于图13。与实施例6的结果同样地，对照组中，静脉内给药的淋巴细胞基本没有浸润到肿瘤内，而大豆PC组中则观察到静脉内给药的淋巴细胞的肿瘤内浸润。

〔实施例8：对于Lewis肺癌的磷脂酰胆碱和免疫细胞输注疗法的并用效果〕

使用LLC细胞(Lewis肺癌细胞株)及C57BL/6NCrSlc小鼠，除此以外，通过与实施例6相同的方法观察静脉内给药的淋巴细胞的肿瘤内浸润。

将结果示于图14。与实施例6的结果同样地，对照组中，静脉内给药的淋巴细胞基本没有浸润到肿瘤内，而大豆PC组则观察到静脉内给药的淋巴细胞的肿瘤内浸润。

根据实施例6、7及8的结果，认为：通过PC而使肿瘤内的血管呈淋巴细胞能够浸润的状态，从而能够促进从静脉给药的淋巴细胞的抗肿瘤效果。在不同的癌症种类、不同的小鼠品系中都观察到该效果，因此认为：在遗传背景不同的人种中、此外在免疫状态不同的人种中，PC都能够提高肿瘤免疫治疗的效果。近年设计了通过给药由iPS细胞、ES细胞、造血干细胞分化诱导得到的淋巴细胞来提高肿瘤免疫的治疗方法。认为在这样的使用由未分化细胞诱导得到的淋巴细胞的治疗中，通过PC预先控制肿瘤血管的方法也有用。

〔实施例9：各种磷脂酰胆碱的效果的研究〕

已知大豆PC是脂肪酸的长度、不饱和度各异的磷脂酰胆碱的异质群。因此，为了确认是否任何PC都发挥与大豆PC同样的效果，使用各种PC研究了对荷瘤小鼠的效果。

将PC分成以下2组(参照表1)。

A组：2条脂肪酸为相同脂肪酸的PC

B组：2条脂肪酸为不同脂肪酸的PC

作为A组的PC，使用二辛酰基磷脂酰胆碱(AVANTI公司)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(日本精化公司)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(日本精化公司)、二油酰基磷脂酰胆碱(日本精化公司)及二亚油酰基磷脂酰胆碱(AVANTI公司)。作为B组的PC，使用(1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基)磷脂酰胆碱(AVANTI公司)及(1-棕榈酰基-2-油酰基)磷脂酰胆碱(AVANTI公司)。

与实施例1同样地，向8周龄的C57BL/6NCrSlc小鼠(♀、SLC公司)的皮下注射LLC细胞(1×10⁶个/100μL·PBS/只)而制作荷瘤小鼠。在癌细胞移植后第7天至第13天这7天，将各种PC 3mg/kg(100μL)向小鼠的尾静脉内1天1次地连日给药。对于对照组的小鼠，给药溶剂。在末次给药的次日(移植后第14天)从小鼠摘出肿瘤，通过与实施例1相同的方法制作肿瘤的组织切片，观察肿瘤血管结构，观察肿瘤内淋巴细胞浸润。

将肿瘤内淋巴细胞浸润的结果示于表1。在使用的所有PC给药组中，均观察到CD4阳性细胞及CD8阳性细胞两者向肿瘤内的浸润得到促进。作为代表例，将给药A组的二硬脂酰基磷脂酰胆碱的结果示于图15。对于给药其它PC的标本，也得到了同样的观察图像。关于肿瘤血管结构的观察，在使用的所有PC给药组中，均观察到静脉样的血管的增生。另外，关于给药PC 7天后的肿瘤体积，所有PC给药组与对照组相比，肿瘤的增大均得到抑制。

表1

〔实施例10：磷脂酰胆碱的改善肿瘤内低氧的效果〕

向8周龄的C57BL/6NCrSlc小鼠(♀、SLC公司)的皮下注射LLC细胞(1×10⁶个/100μL·PBS/只)而制作荷瘤小鼠。与实施例1同样地，在癌细胞移植后7天至第13天这7天，将大豆PC或Intralipos向小鼠的尾静脉内1天1次地连日给药。对于对照组的小鼠，给药溶剂。在肿瘤细胞移植后第14天，腹腔内给药哌莫硝唑(Hypoxyprobe(低氧探针),Burlington,MA,USA)60mg/kg(100μL)，2小时后从小鼠回收肿瘤。通过与实施例1相同的方法制作肿瘤组织切片，用抗哌莫硝唑抗体使低氧区域可视化并观察低氧区域。

将结果示于图16。由图16可明确，显示出大豆PC组及Intralipos组与对照组相比低氧区域显著减少，表明通过给药PC改善了肿瘤内的血流。已知癌组织的低氧状态会引起癌细胞的染色体DNA的变异，诱导癌细胞的恶性化，因此认为：通过利用PC改善血流，能够抑制癌细胞的恶性化。

〔实施例11：磷脂酰胆碱的促进向肿瘤内的药剂递送的效果〕

向8周龄的C57BL/6NCrSlc小鼠(♀、SLC公司)的皮下注射LLC细胞(1×10⁶个/100μL·PBS/只)而制作荷瘤小鼠。与实施例1同样地，在癌细胞移植后第7天至第13天这7天，将大豆PC或Intralipos向小鼠的尾静脉内1天1次地连日给药。对于对照组的小鼠，不给药任何物质。在肿瘤细胞移植后第14天，静脉内给药发出红色荧光的作为抗癌剂的阿霉素(日本化药)3mg/100μL，20分钟后从小鼠回收肿瘤。通过与实施例1相同的方法制作肿瘤组织切片，观察肿瘤内的红色荧光物质(阿霉素)。

将结果示于图17。由图17可明确，对照组中几乎观察不到阿霉素的肿瘤内迁移，而大豆PC组及Intralipos组则观察到阿霉素被递送到肿瘤中心部。

〔实施例12：磷脂酰胆碱和5-FU的并用的抗肿瘤效果〕

已经明确了通过给药PC能够改善肿瘤内的血流、有效地将药剂递送到肿瘤深处，因此对PC和抗癌剂的并用的抗肿瘤效果进行了研究。

向8周龄的C57BL/6NCrSlc小鼠(♀、SLC公司)的皮下注射LLC细胞(1×10⁶个/100μL·PBS/只)而制作荷瘤小鼠。设置大豆PC组、5-FU组、大豆PC/5-FU并用组及对照组(溶剂给药组)这4组(3只/组)。对于大豆PC组及大豆PC/5-FU并用组，与实施例1同样地在癌细胞移植后第7天至第20天这13天，将大豆PC3mg/kg(100μL)向小鼠的尾静脉内1天1次地连日给药。对于5-FU组及大豆PC/5-FU并用组，以20mg/kg的用量在癌细胞移植后第7天和第14天将5-FU(协和发酵)给药至腹腔内。在癌细胞移植后第7、14及21天测定肿瘤体积。肿瘤体积通过长径×短径×高度×0.5来计算。

将结果示于图18。大豆PC组及5-FU组与对照组相比抑制了肿瘤增大，而大豆PC/5-FU并用组与各单独给药组相比显著抑制肿瘤增大。

由以上的结果可明确：PC扩大了肿瘤内的血管、促进静脉样血管的形成，同时还诱导血管的连接、改善血流，与此相伴地，药剂向肿瘤组织的递送性提高，使抗癌剂的效果显著增强。

〔实施例13：大豆磷脂酰胆碱对HUVEC的效果〕

至此为止分析的是使用小鼠荷瘤模型时PC对血管的效果，这里将分析PC对人的血管内皮细胞的效果。

(1)实验方法

在48孔板上以200μL/孔包被基质胶(BD biosciences公司)，接种人脐带静脉血管内皮细胞(HUVEC；KURABO公司)5×10⁴个/200μL/孔并进行培养。培养中使用在HuMedia-EB2(KURABO公司)中添加有1％浓度的FCS的培养基。向培养基中添加VEGF(重组人VEGF165、Peprotec公司)并使最终浓度达到10ng/mL，诱导基于血管内皮细胞的管腔形成。在添加VEGF的同时，以10μM添加大豆PC，从开始培养起的12～16小时后在显微镜下拍摄照片。进一步添加Hoechst(Boehringer公司)对细胞核进行染色，观察所形成的血管。将未添加大豆PC的孔作为对照。

(2)结果

将结果示于图19。对照组及大豆PC组均诱导了管腔形成，但是在大豆PC组中观察到一部分管腔直径粗的血管(箭头)。在小鼠荷瘤模型的实施例中，观察到通过给药PC而肿瘤内血管的血管直径变粗、促进静脉化，由本实施例的结果可明确，对于人的血管而言也同样促进静脉化。

〔实施例14：各种磷脂酰胆碱对HUVEC的效果〕

除了大豆PC以外还使用8种PC，实施与实施例12相同的实验。PC的分类与实施例8同样，设为A组及B组。使用的PC如下所述(参照表2)。

A组：

(1)二辛酰基磷脂酰胆碱(AVANTI公司)

(2)二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(日本精化公司)

(3)二硬脂酰基磷脂酰胆碱(日本精化公司)

(4)二油酰基磷脂酰胆碱(日本精化公司)

(5)二亚油酰基磷脂酰胆碱(AVANTI公司)

(6)双二十二碳六烯酰基磷脂酰胆碱(AVANTI公司)

B组：

(7)(1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基)磷脂酰胆碱(AVANTI公司)

(8)(1-棕榈酰基-2-油酰基)磷脂酰胆碱(AVANTI公司)

将结果示于表2及图20。对照组、大豆PC组、各种PC组(1～8)中都诱导了管腔形成，在大豆PC组及各种PC组(1～8)中观察到了一部分管腔直径粗的血管(箭头)。即，可知不仅大豆PC具有促进静脉化的作用，各种PC均具有促进静脉化的作用。

表2

需要说明的是，本发明不受上述各实施方式及实施例限定，可以在权利要求书所示的范围内进行各种变更，将在不同实施方式中分别公开的技术手段适当组合而得到的实施方式也包含在本发明的技术范围内。另外，本说明书中记载的学术文献及专利文献全部通过参考方式援引到本说明书中。

Claims (12)

1.一种静脉形成促进剂，其特征在于，以磷脂酰胆碱为有效成分，具有促进肿瘤血管的静脉化的作用。

2.根据权利要求1所述的静脉形成促进剂，其特征在于，具有扩张肿瘤血管直径的作用和/或使肿瘤血管连接的作用。

3.根据权利要求1或2所述的静脉形成促进剂，其中，磷脂酰胆碱为1种磷脂酰胆碱或2种以上磷脂酰胆碱的混合物。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的静脉形成促进剂，其与癌症免疫疗法组合使用。

5.根据权利要求4所述的静脉形成促进剂，其中，癌症免疫疗法为免疫抑制解除疗法和/或免疫细胞输注疗法。

6.根据权利要求5所述的静脉形成促进剂，其中，免疫抑制解除疗法中使用的免疫检查点抑制剂为抗CTLA-4抗体、PD-1阻断药、抗PD-1抗体、PD-L1阻断药或抗PD-L1抗体。

7.一种血管直径扩张剂，其特征在于，以磷脂酰胆碱为有效成分，具有扩张肿瘤血管直径的作用。

8.一种血管连接促进剂，其特征在于，以磷脂酰胆碱为有效成分，具有不借助溶血磷脂受体而使肿瘤血管连接的作用。

9.一种白细胞浸润促进剂，其特征在于，以磷脂酰胆碱为有效成分，具有不借助溶血磷脂受体而促进白细胞向肿瘤区域整体浸润的作用。

10.根据权利要求9所述的白细胞浸润促进剂，其中，白细胞为CD4阳性细胞和/或CD8阳性细胞。

11.一种肿瘤免疫活化剂，其特征在于，以磷脂酰胆碱为有效成分，具有不借助溶血磷脂受体而促进白细胞向肿瘤区域整体浸润的作用。

12.根据权利要求11所述的肿瘤免疫活化剂，其中，白细胞为CD4阳性细胞和/或CD8阳性细胞。