CN114845716A - 使用生物标记物预测对2-(4-氯苯基)-n-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺的临床敏感性 - Google Patents

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Abstract

一种鉴定可能对包含化合物的治疗有反应的患有癌症的受试者，或者预测患有或被怀疑患有癌症的受试者对包含所述化合物的治疗的反应性的方法，所述方法包括：提供来自所述受试者的样品；测量所述样品中一种或多种基因的基因表达水平；以及如果所述基因的表达水平不同于参考水平，则鉴定所述受试者为可能对包含所述化合物的治疗有反应，并且其中所述基因是参与mTOR信号传导的基因，或所述基因是ILF2或ILF3。

Description

使用生物标记物预测对2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌 啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺的 临床敏感性
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年10月28日提交的美国临时专利申请号62/926,878的权益，将其通过引用以其整体并入本文。
1.技术领域
在一些实施方案中，本文提供了在预测和监测患有各种疾病和障碍如癌症(例如，淋巴瘤、多发性骨髓瘤(MM)和白血病，如急性骨髓性白血病(AML))的患者对某些化合物的临床敏感性和治疗反应中使用某些生物标记物的方法。在某些实施方案中，本文还提供了使用治疗化合物治疗疾病的方法。
2.背景技术
癌症的主要特征在于源自给定正常组织的异常细胞的数量的增加、这些异常细胞侵入邻近组织、或恶性细胞通过淋巴或血液传播到区域淋巴结和远端部位(转移)。一般来说，癌症分为实体癌和血液癌。实体癌的例子包括但不限于黑色素瘤、肾上腺癌、乳腺癌、肾细胞癌、胰腺癌和小细胞肺癌(SCLC)等。
血癌一般包括三种主要类型：淋巴瘤、白血病和骨髓瘤。淋巴瘤是指起源于淋巴系统的癌症。淋巴瘤包括但不限于霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和外周T细胞淋巴瘤(PTCL)等。白血病是指造血组织的恶性肿瘤。急性白血病主要涉及未分化的细胞群，而慢性白血病涉及更成熟的细胞形式。急性白血病分为急性淋巴母细胞白血病(ALL)和急性粒细胞白血病(AML)类型。慢性白血病分为慢性淋巴细胞白血病(CLL)或慢性粒细胞白血病(CML)。骨髓瘤是骨髓中浆细胞的癌症。因为骨髓瘤经常发生在骨髓的许多部位，所以它通常被称为多发性骨髓瘤(MM)。
因此，存在对于可用于治疗患有癌症的患者的新方法、治疗和组合物的巨大需求，所述癌症包括但不限于淋巴瘤(例如，NHL)、MM、白血病(例如，AML)和实体癌。已经进行了许多针对提供可以安全且有效地用于治疗癌症的化合物的研究。例如，我们最近已经鉴定了可用于治疗包括但不限于白血病(例如，AML)的癌症的某些化合物(例如，化合物D)。然而，需要开发有效、灵敏且准确的方法来检测、量化和表征这些化合物的药效学活性。本发明满足这些和其他需要。
3.发明内容
在一个方面，本文提供了一种鉴定可能对包含化合物的治疗有反应的患有癌症的受试者，或者预测患有或被怀疑患有癌症的受试者对包含所述化合物的治疗的反应性的方法，所述方法包括：
i.提供来自所述受试者的样品；
ii.测量所述样品中一种或多种基因的基因表达水平；以及
iii.如果所述基因的表达水平不同于参考水平，则鉴定所述受试者为可能对包含所述化合物的治疗有反应，
其中所述化合物是2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺(化合物D)，其具有如下结构：
Figure BDA0003710765600000021
或者其立体异构体或者其立体异构体、同位素体、药学上可接受的盐、互变异构体、溶剂化物、水合物、共晶、包合物或多晶型物的混合物，并且
其中所述基因是参与mTOR信号传导的基因，或所述基因是ILF2或ILF3。
在一个方面，本文提供了一种用化合物治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括：
(a)鉴定可能对包含所述化合物的治疗有反应的患有癌症的受试者，其包括：
i.提供来自所述受试者的样品；
ii.测量所述样品中一种或多种基因的基因表达水平；以及
iii.如果所述基因的表达水平不同于参考水平，则鉴定所述受试者为可能对包含所述化合物的治疗有反应，
(b)如果所述受试者被鉴定为可能对包含所述化合物的治疗有反应，则向所述受试者施用治疗有效量的所述化合物，
其中所述化合物是化合物D，或者其立体异构体或者其立体异构体、同位素体、药学上可接受的盐、互变异构体、溶剂化物、水合物、共晶、包合物或多晶型物的混合物，并且
其中所述基因是参与mTOR信号传导的基因，或所述基因是ILF2或ILF3。
在一些实施方案中，所述基因参与mTOR信号传导。在一些实施方案中，所述基因是mTOR的正调节物。在一些实施方案中，所述基因是mTOR。在其他实施方案中，所述基因是Raptor。在其他实施方案中，所述基因是Rictor。
在本文提供的各种方法的一些实施方案中，所述方法包括如果所述基因的表达水平低于参考水平，则鉴定所述受试者为可能对包含所述化合物的治疗有反应。
在一些实施方案中，所述参考水平是所述基因在对化合物D有抗性的受试者中的表达水平。在其他实施方案中，所述参考水平是所述基因在没有所述癌症的受试者中的表达水平。在其他实施方案中，所述参考水平是预先确定的水平。
在另一个方面，所述基因是mTOR信号传导的负调节物。在一些实施方案中，所述基因是TSC1。在其他实施方案中，所述基因是TSC2。在其他实施方案中，所述基因是GCN1。在其他实施方案中，所述基因是GCN2。在其他实施方案中，所述基因是DDIT4。在其他实施方案中，所述基因是ATF4。
在本文提供的各种方法的一些实施方案中，所述方法包括如果所述基因的表达水平高于参考水平，则鉴定所述受试者为可能对包含所述化合物的治疗有反应。
在一些实施方案中，所述参考水平是所述基因在对化合物D有反应的受试者中的表达水平。在其他实施方案中，所述参考水平是所述基因在没有所述癌症的受试者中的表达水平。在其他实施方案中，所述参考水平是预先确定的水平。
在一些实施方案中，所述基因是ILF2。在其他实施方案中，所述基因是ILF3。
在本文提供的各种方法的一些实施方案中，所述方法包括如果所述基因的表达水平高于参考水平，则鉴定所述受试者为可能对包含所述化合物的治疗有反应。
在一些实施方案中，所述参考水平是所述基因在对化合物D有反应的受试者中的表达水平。在其他实施方案中，所述参考水平是所述基因在没有所述癌症的受试者中的表达水平。在其他实施方案中，所述参考水平是预先确定的水平。
在本文提供的各种方法的一些实施方案中，所述癌症是血液癌。在另一个实施方案中，所述癌症是淋巴瘤。在其他实施方案中，所述癌症是白血病。在其他实施方案中，所述癌症是AML。
在另一个方面，本文提供了鉴定可能对包含化合物的治疗有反应的患有癌症的受试者，或预测患有或被怀疑患有癌症的受试者对包含所述化合物的治疗的反应性的方法，所述方法包括i.提供来自所述受试者的样品；ii.测定所述样品中生物标记物的序列；以及iii.如果在所述生物标记物中鉴定出突变，则鉴定所述受试者不太可能对包含所述化合物的治疗有反应，和/或如果在所述生物标记物中未鉴定出所述突变，则鉴定所述受试者为可能对包含所述化合物的治疗有反应；其中所述化合物是化合物D，或者其立体异构体或者其立体异构体、同位素体、药学上可接受的盐、互变异构体、溶剂化物、水合物、共晶、包合物或多晶型物的混合物，并且其中所述生物标记物是CRBN或GSPT1。
在一些实施方案中，所述生物标记物是GSPT1，并且其中所述突变是GSPT1的氨基酸残基C568、L569、V570、D571、K572、K573、S574、G575或E576的突变。在一些实施方案中，所述突变选自K572、K573、S574、G575及其组合。在一些实施方案中，所述突变包含G575N。
在其他实施方案中，所述生物标记物是CRBN，并且其中所述突变是氨基酸残基N351、H357、W380、Y384、W386或W400的突变。在一些实施方案中，所述突变是Y384A或W386A。
在另一个方面，本文提供了治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用化合物，其中所述受试者已经根据包括以下的方法被确定为可能对所述化合物有反应：i.提供来自所述受试者的样品；ii.确定所述样品中生物标记物的序列；以及iii.如果在所述生物标记物中未鉴定出突变，则鉴定所述受试者为可能对所述化合物有反应；其中所述化合物是化合物D，或者其立体异构体或者其立体异构体、同位素体、药学上可接受的盐、互变异构体、溶剂化物、水合物、共晶、包合物或多晶型物的混合物，并且其中所述生物标记物是CRBN或GSPT1。
在又另一个方面，本文提供了治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用第二化合物，其中所述受试者已经根据包括以下的方法被确定为不太可能对第一化合物有反应：i.提供来自所述受试者的样品；ii.确定所述样品中生物标记物的序列；以及iii.如果在所述生物标记中鉴定出突变，则鉴定所述受试者为不太可能对所述化合物有反应；其中所述第一化合物是化合物D，或者其立体异构体或者其立体异构体、同位素体、药学上可接受的盐、互变异构体、溶剂化物、水合物、共晶、包合物或多晶型物的混合物，其中所述第二化合物不是化合物D，或者其立体异构体或者其立体异构体、同位素体、药学上可接受的盐、互变异构体、溶剂化物、水合物、共晶、包合物或多晶型物的混合物，并且其中所述生物标记物是CRBN或GSPT1。
在一些实施方案中，所述生物标记物是GSPT1，并且其中所述突变是GSPT1的氨基酸残基C568、L569、V570、D571、K572、K573、S574、G575或E576的突变。在一些实施方案中，所述突变选自K572、K573、S574、G575及其组合。在一些实施方案中，所述突变包含G575N。
在其他实施方案中，所述生物标记物是CRBN，并且其中所述突变是氨基酸残基N351、H357、W380、Y384、W386或W400的突变。在一些实施方案中，所述突变是Y384A或W386A。
在本文提供的各种方法的一些实施方案中，所述癌症是血液癌。在另一个实施方案中，所述癌症是淋巴瘤。在其他实施方案中，所述癌症是白血病。在其他实施方案中，所述癌症是AML。
4.附图说明
图1A示出了化合物D、对照化合物和来那度胺(LEN)的化学结构，其中戊二酰亚胺环以红色显示。图1B显示了化合物D在AML细胞系中的抗增殖作用。将细胞与所示浓度的DMSO或化合物D一起孵育。在第3天，通过Cell-Titer Glo(CTG)测定评估细胞增殖。
图2A示出了响应于化合物D处理相对于DMSO对照的不同丰度的蛋白质的火山图。将KG1细胞用DMSO或100nM化合物D处理4小时并进行TMT蛋白质组学分析。X轴表示对于每种蛋白质，化合物D相比于DMSO对照的log2倍数变化。使用Benjamini-Hoschberg方法对多个假设检验的P值进行校正，以获得调整后P值(adj-P，也称为错误发现率)。y轴表示-log10(adj-P)值，指示统计显著性，使得位于红色虚线上方的蛋白质是统计上显著的发现且调整后P值<0.05。图2B示出了用DMSO或化合物D处理4小时的KG1和U937细胞的免疫印迹分析。在指示的情况下，将细胞用硼替佐米或MLN4924预处理30分钟。图2C和图2D示出了U937-Cas9亲本细胞或用表达非靶向sgRNA(sgNT-1)、靶向非编码区的sgRNA(sgNC-8)或靶向CRBN的sgRNA(sgCRBN-8)的慢病毒载体稳定转导的细胞的免疫印迹分析(图2C)和细胞增殖(图2D)。将细胞用所示浓度的DMSO或化合物D处理。图2E和图2F示出了MOLM-13(图2E)和OCI-AML2(图2F)亲本和CRBN-/-细胞的免疫印迹分析(左图)和细胞增殖(右图)。将细胞用所示浓度的DMSO或化合物D处理。所有附图的小图中显示的结果代表三个生物重复样品。图2D、图2E(右图)和图2F(右图)显示为平均值±SD，n＝3个技术重复样品。
图3A示出了使用在293FT CRBN-/-细胞中产生的FLAG-HA标记的赛拉隆蛋白野生型(FLAG-HA-CRBN)或Y384A/W386A突变体(FLAG-HA-YWAA)捕获在293FT CRBN-/-细胞中瞬时表达的V5标记的GSPT1(GSPT1-V5)和V5标记的IKZF1(IKZF1-V5)。将DMSO、来那度胺(LEN)或化合物D添加至结合测定中。左图显示了抗HA免疫沉淀物的免疫印迹分析，并且右图显示了瞬时转染以产生FLAG-HA标记的赛拉隆蛋白(野生型或YWAA突变体)或V5标记的GSPT1或IKZF1的293FT CRBN-/-细胞的免疫印迹分析。图3B示出了与赛拉隆蛋白、DDB1和化合物D复合的GSPT1的表面表示，其中DDB1以紫色显示，赛拉隆蛋白以蓝色显示，并且GSPT1以橙色显示。化合物D的位置用白色箭头显示。图3C示出了边界阈值为3.0σ的化合物D(黄色条)的Fo-Fc省略电子密度(绿色网格)。图3D示出了GSPT1与赛拉隆蛋白的相互作用是由β-发夹环介导的。赛拉隆蛋白和GPST1β-发夹之间的氢键相互作用显示为黄色虚线。图3E示出了赛拉隆蛋白与GSPT1之间的结合界面的细节。化合物D表示为黄色条。预测的在化合物D与赛拉隆蛋白之间的极性相互作用显示为黄色虚线。图3F示出了U937亲本细胞或稳定表达HA-GSPT1-G575N的细胞的免疫印迹分析。将细胞用所示浓度的DMSO或化合物D处理。图3G和图3H示出了MOLM-13(图3G)和OCI-AML2(图3H)亲本细胞和稳定表达HA标记的GSPT1-G575N的细胞的免疫印迹分析(左图)和细胞增殖(右图)。将细胞用所示浓度的DMSO或化合物D处理。图3I示出了DDB1-赛拉隆蛋白-GSPT1-化合物D和DDB1-赛拉隆蛋白-GSPT1-对照化合物结构的叠加。对于对照化合物复合物结构，GSPT1以浅橙色显示，赛拉隆蛋白以浅蓝色显示，并且对照化合物以浅黄色显示。图3J和图3K示出了U937亲本细胞或用表达对照shRNA(shCNTL)或GSPT1特异性shRNA(shGSPT1-1至4)的慢病毒载体瞬时转导的细胞的生长曲线(图3J)和免疫印迹分析(图3K)。在转导后第4、6和8天用CTG对细胞增殖进行量化。所有附图的小图中显示的结果代表三个生物重复样品。图3J中的数据显示为平均值±SD，n＝3个技术重复样品。
图4A示出了显示用于鉴定化合物D反应的分子决定因素的全基因组CRISPR筛选的设计的示意图。图4B示出了用慢病毒sgRNA文库转导并用DMSO或化合物D处理的U937-Cas9细胞的细胞增殖曲线。转导后三天，将细胞用DMSO或10μM化合物D处理9天。图4C示出了在慢病毒sgRNA文库转导后第3天和第12天不同处理条件和技术重复样品的归一化sgRNA读段计数比较。散点图中使用了150k sgRNA。右上角框中的数字指示样品之间的皮尔逊相关系数。“***”指示相关p值<0.001。靶向UBE2G1或CRBN的sgRNA分别以绿色和红色显示。图4D示出了通过化合物D处理富集的基因的途径富集分析，其中相对于DMSO对照，log2倍数变化(log2FC)>2且错误发现率(FDR)<0.05。斑点的颜色和大小分别代表调整后的显著性水平和基因比率。基因比率是指针对单独途径注释的输入基因的数量与针对任何Reactome途径注释的所有输入基因的数量的比率。图4E示出了通过化合物D显著富集的78个基因(log2FC>2且FDR<0.05)的散点图。X轴表示显示为log2FC的化合物D富集得分；Y轴表示显示为log2FC(T12_DMSO相比于T3_DMSO)的基因必要性得分。这些基因中的一些被分组至10个具有不同颜色编码的功能模块。图4F显示了在U937细胞中通过化合物D处理富集的78个排名靠前的基因中富集途径的网络图。使用Fisher精确检验鉴定来自Reactome数据库的富集途径，并通过调整后的p值(FDR)<0.05进行选择。途径节点根据其统计显著性用不同深浅的红色进行颜色编码。图中的灰色节点描绘了通过化合物D处理富集的途径基因。调节对化合物D的反应的核心富集途径以绿色圆圈突出显示。图4G和图4H显示了靶向所示功能模块中化合物D富集的基因的sgRNA的log2FC值。以深蓝色显示的背景代表文库中所有sgRNA的log2FC值。代表功能模块的每个带颜色的实线指示单独sgRNA的log2FC值。图4G显示了已知对于赛拉隆蛋白E3连接酶复合物的活性必需的已充分表征的基因；图4H显示了调节对化合物D的反应的新基因，但对其潜在机制没有清楚的了解。
图5A示出了用于鉴定赋予对化合物D处理的敏感性和抗性的基因的全基因组CRISPR筛选方法。图5B显示了在全基因组CRISPR筛选中用化合物D处理后去掉或富集的基因。
图6A示出了CRISPR竞争测定。图6B描绘了在U937细胞中敲除mTOR、Raptor或Rictor基因的结果。图6C描绘了在mTOR敲除细胞中进行的CRISPR竞争测定的结果。图6D描绘了在Raptor敲除细胞中进行的CRISPR竞争测定的结果。图6E描绘了在Rictor敲除细胞中进行的CRISPR竞争测定的结果。
图7A显示了在U937细胞中敲除TSC1或TSC2基因的结果。图7B显示了在OCI-AML2细胞中敲除TSC1或TSC2基因的结果。图7C显示了在TSC1敲除或TSC2敲除U937细胞中的细胞增殖测定的结果。图7D显示了在TSC1敲除或TSC2敲除OCI-AML2细胞中的细胞增殖测定的结果。图7E显示了U937细胞中TSC1或TSC2基因敲除的结果。图7F描绘了在TSC1敲除或TSC2敲除U937细胞中进行的CRISPR竞争测定的结果。图7G描绘了在TSC1敲除或TSC2敲除OCI-AML2细胞中进行的CRISPR竞争测定的结果。图7H和图7I显示了将在每个所示时间点处与共表达GFP和sgNT-1的细胞混合的共表达RFP和sgNT-1、sgNC-8或靶向TSC1(图7H)或TSC2(图7I)的三种sgRNA之一的U937-Cas9细胞的RFP+/GFP+比率针对“第0天”的细胞混合物的RFP+/GFP+比率进行归一化。图7J显示了使用基于流式细胞术的CRISPR竞争测定评价TSC1或TSC2敲除对OCI-AML2细胞中的化合物D反应的影响。将在每个所示时间点处与共表达GFP和sgNT-1的细胞混合的共表达RFP和所示sgRNA的OCI-AML2-Cas9细胞的RFP+/GFP+比率针对“第0天”的细胞混合物的RFP+/GFP+比率进行归一化。图7K显示了DEU分析的结果，其揭示了敲除ILF3的单独CRBN外显子(红色条)的显著差异剪接。相对于NT对照，在ILF3敲除的情况下，针对截短的转录物注释的外显子CRBN.213(外显子箱元号13)显著升高(FDR＝0.02)。相反，与亲本相比，在ILF3敲除细胞中该同种型下游的外显子显著不足(FDR＝0.05；外显子箱元号14)。
图8A显示了TSC1敲除或TSC2敲除对U937细胞中化合物D诱导的GSPT1降解的影响。图8B显示了TSC1敲除或TSC2敲除对OCI-AML2细胞中化合物D诱导的GSPT1降解的影响。图8C显示了U937-Cas9亲本细胞或如所示稳定表达sgRNA的细胞的免疫印迹分析。在放线菌酮的存在下用DMSO或化合物D处理细胞。图8D和图8E显示了稳定表达HA标记的GSPT1和所示sgRNA的U937-Cas9细胞的免疫印迹分析。将细胞用所示浓度的DMSO、化合物D(图8D)或泊马度胺(POM；图8E)处理18小时。图8F显示了U937-Cas9亲本细胞或稳定表达所示sgRNA的细胞的抗HA免疫沉淀物(顶部)或全细胞提取物(底部)的免疫印迹分析。用MLN4924和DMSO或化合物D处理细胞。所有图中显示的结果代表三个生物重复样品。
图9A显示了GCN2的敲除的结果。图9B描绘了在GCN2敲除U937细胞中进行的CRISPR竞争测定的结果。图9C显示了在U937细胞中TSC1、TSC2、GCN1、GCN2、DDIT4、ATF4或CRBN的敲除的结果。图9D描绘了在GCN2敲除、ATF4敲除、GCN1敲除和CRBN敲除U937细胞中进行的细胞增殖测定的结果。图9E描绘了在DDIT4敲除、TSC1敲除、TSC2敲除和CRBN敲除U937细胞中进行的细胞增殖测定的结果。
图10A显示了在U937细胞中ILF3敲除的结果。图10B显示了在ILF3敲除U937细胞中的CRISPR竞争测定的结果。图10C显示了ILF2或ILF3敲除对化合物D诱导的U937细胞中GSPT1降解和这些细胞中CRBN的表达的结果。图10D显示了在ILF2敲除U937细胞中的CRISPR竞争测定的结果。图10E显示了在OCI-AML2细胞中ILF2或ILF3敲除的结果以及这些细胞中CRBN的表达。图10F显示了在ILF2敲除或ILF3敲除OCI-AML2细胞中的CRISPR竞争测定的结果。图10G显示了ILF3敲除对U937细胞中化合物D诱导的GSPT1降解和这些细胞中CRBN表达的影响。图10H显示了在ILF3敲除U937细胞中全长和交替剪接的CRBN mRNA转录物的qPCR定量的结果。图10I显示了基于流式细胞术的CRISPR竞争测定的示意性设计。图10J显示了诱导性表达sgNT-1、sgNC-1、sgILF3-2或sgILF3-4的U937-Cas9细胞的免疫印迹分析。将细胞用多西环素(DOX)处理6天。图10K显示了U937-Cas9亲本细胞或表达对照sgRNA(sgNT-1或sgNC-8)或ILF2特异性sgRNA(sgILF2-1或sgILF2-6)的细胞的免疫印迹分析。
图11A和图11B显示了具有持续7天的诱导性表达sgNT-1或sgILF3-2的U937-Cas9细胞的RNAseq分析。通过在U937细胞中用ILF3敲除上调和/或下调外显子使用，在总共967个独特基因中观察到差异剪接的证据，达到了校正的显著性水平(FDR)<0.05。在基因水平下，发现791个基因在ILF3敲除的情况下显著上调或下调(FDR<0.05)。图11A显示了维恩图，其示出了具有显著差异外显子使用(DEU；LHS)的基因与具有基因水平下的差异表达(DEG；RHS)的基因的重叠。图11B显示了DEU和DEG基因的途径富集分析。斑点的颜色和大小分别代表调整后的显著性水平和基因比率。基因比率是指针对单独途径注释的输入基因的数量与针对任何Reactome途径注释的所有输入基因的数量的比率。图11C显示了改编自Ensembl的示意图，其示出了CRBN的基因座和15个CRBN mRNA转录物的基因结构。框表示外显子；实线表示内含子；每个框中的阴影区域表示蛋白质编码区；并且每个框中的未填充区域表示非翻译区。CRBN转录物201和203编码在N末端具有一个氨基酸差异的两种全长赛拉隆蛋白。含有具有提前终止密码子的隐藏外显子5的CRBN转录物213编码缺乏其大部分功能结构域的截短的赛拉隆蛋白。
图12A-图12D显示了使用基于流式细胞术的CRISPR竞争测定对GCN2(图12A)、GCN1(图12B)、ATF4(图12C)和DDIT4(图12D)在介导化合物D反应中的作用的表征。用组成性共表达GFP和sgNT-1的慢病毒载体或用组成性共表达RFP和sgNT-1、sgNC-8或所示基因特异性sgRNA之一的慢病毒载体感染稳定表达Cas9的U937细胞。在感染之后三天，将RFP和GFP细胞以1:1比率混合，并用DMSO或10μM化合物D处理。此后每2天通过流式细胞术监测RFP+/GFP+比率的变化。将在每个所示时间点与共表达GFP和sgNT-1的细胞混合的共表达RFP和sgNT-1、sgNC-8或靶向GCN2(图12A)、GCN1(图12B)、ATF4(图12C)或DDIT4(图12D)的三种sgRNA之一的U937-Cas9细胞的RFP+/GFP+比率针对“第0天”的细胞混合物的RFP+/GFP+比率进行归一化。图12E显示了示出如图12A-图12D所示的基于流式细胞术的CRISPR竞争测定的设计的示意图。图12F显示了U937-Cas9亲本细胞或表达用于如图12A-图12D所示的CRISPR竞争测定中的所示sgRNA的细胞的免疫印迹分析。图12F-图12K使用基于流式细胞术的CRISPR竞争测定对GCN1、GCN2、ATF4或DDIT4敲除对OCI-AML2细胞中的化合物D反应的影响的评价。图12G显示了示出CRISPR竞争测定的设计的示意图。图12H和图12J显示了OCI-AML2-Cas9亲本细胞或稳定表达所示sgRNA的细胞的免疫印迹分析。图12I和图12K显示了将在每个所示时间点处与共表达GFP和sgNT-1的细胞混合的共表达RFP和所示sgRNA的OCI-AML2-Cas9细胞的RFP+/GFP+比率针对“第0天”的细胞混合物的RFP+/GFP+比率进行归一化。
图13A显示了所示浓度的DMSO或化合物D处理24小时的U937亲本和GCN2-/-细胞的免疫印迹分析。U937 GCN2-/-细胞系源自用靶向GCN2的慢病毒CRISPR载体稳定感染的U937亲本细胞的单一克隆。图13B显示了KG-1细胞的全细胞提取物的免疫印迹分析。将细胞与DMSO或200nM化合物D一起孵育，并在所示时间点裂解。在右侧指向印迹中的条带的箭头表示胱天蛋白酶-3的切割形式。图13C显示了所示浓度的DMSO或化合物D处理24小时的U937亲本和GCN2-/-细胞的定量RT-PCR分析。U937 GCN2-/-细胞系源自用靶向GCN2的慢病毒CRISPR载体稳定感染的U937亲本细胞的单一克隆。图13D显示了与DMSO或200nM化合物D一起孵育2、4或6小时的KG-1细胞中所示mRNA转录物的定量RT-PCR分析。图13E显示了U937亲本细胞和在有或没有稳定转导的表达如所示的HA标记的GCN2野生型或突变体的慢病毒载体的情况下的GCN2-/-细胞的免疫印迹分析。将细胞用DMSO或化合物D处理24小时。图13F显示了化合物D对图13E中所示的细胞增殖的影响。在化合物D处理后第3天，通过CTG评估细胞增殖。所有附图的小图中显示的结果代表至少三个生物重复样品。图13C、图13D和图13E中的数据显示为平均值±SD，n＝3个技术重复样品。
5.具体实施方式
本公开文本部分基于以下惊人的发现：对用本文提供的化合物(例如，2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺(化合物D)治疗的反应性或抗性与某些基因的表达水平相关。例如，如下文第6节所示，本公开文本发现参与mTOR信号传导的基因与化合物D反应性或抗性相关。本公开文本还鉴定其他标记物如ILF2和ILF3为对用化合物D治疗的反应的预测物。
5.1.定义
如本文所用，术语“癌症”包括但不限于实体癌和血液癌。术语“癌症”是指组织或器官的疾病，包括但不限于膀胱癌、骨癌、血液癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、胸部癌症、结肠癌、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、头癌、肾癌、肝癌、淋巴结癌症、肺癌、口腔癌、颈癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直肠癌、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、喉咙癌和子宫癌。具体的癌症包括但不限于晚期恶性肿瘤、淀粉样变性、神经母细胞瘤、脑膜瘤、血管外皮细胞瘤、多发性脑转移瘤、多形性成胶质细胞瘤、成胶质细胞瘤、脑干胶质瘤、预后不良的恶性脑肿瘤、恶性胶质瘤、复发性恶性胶质瘤、间变性星形细胞瘤、间变性少突胶质细胞瘤、神经内分泌肿瘤、直肠腺癌、不可切除的结直肠癌、转移性肝细胞癌、卡波西肉瘤、核型急性粒细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、皮肤B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、低级别滤泡性淋巴瘤、恶性黑色素瘤、恶性间皮瘤、恶性胸腔积液间皮瘤综合征、腹膜癌、乳头状浆液性癌、妇科肉瘤、软组织肉瘤、硬皮病、皮肤血管炎、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、平滑肌肉瘤、进行性骨化性纤维组织发育异常、激素难治性前列腺癌、切除的高危软组织肉瘤、不可切除的肝细胞癌、华氏巨球蛋白血症、冒烟型骨髓瘤、惰性骨髓瘤、输卵管癌、雄激素非依赖性前列腺癌、雄激素依赖性IV期非转移性前列腺癌、激素非敏感性前列腺癌、化疗非敏感性前列腺癌、乳头状甲状腺癌、滤泡状甲状腺癌、甲状腺髓样癌和平滑肌瘤。
如本文所用，“血液癌”包括骨髓瘤、淋巴瘤和白血病。在一个实施方案中，所述骨髓瘤是多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，所述白血病是例如急性髓细胞性白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、成人T细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病、骨髓增生异常、骨髓增生性障碍、慢性髓细胞性白血病(CML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、人嗜淋巴细胞病毒1型(HTLV-1)白血病、肥大细胞增多症或B细胞急性淋巴母细胞白血病。在一些实施方案中，所述淋巴瘤是例如弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、B细胞免疫母细胞淋巴瘤、小型非裂解细胞淋巴瘤、人嗜淋巴细胞病毒1型(HTLV-1)白血病/淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤、周围T细胞淋巴瘤(PTCL)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、AIDS相关淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤、转化型淋巴瘤、原发性纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、里克特转化型、结节性边缘区淋巴瘤或ALK阳性大B细胞淋巴瘤。在一个实施方案中，所述血液癌是惰性淋巴瘤，包括例如DLBCL、滤泡性淋巴瘤或边缘区淋巴瘤。
当与癌症结合使用时，术语“预后风险”是指癌症的可能的结果，包括对某些治疗的反应、缓解的持续时间或程度、潜在的存活率、复发的可能性等。影响患者的预后风险的因素包括但不限于人口统计学(例如，年龄、种族、性别等)、疾病特异性(例如，癌症分期)、遗传(例如，风险基因)、共病(例如，伴随癌症的其他病症)等。良好的“预后风险”意味着患者可能对某些治疗有反应，可能存活和/或不太可能复发等。较差的“预后风险”意味着患者不太可能对某些治疗有反应，不太可能存活和/或可能复发等。
如本文所用，除非另有说明，否则术语“治疗”(“treat”、“treating”和“treatment”)是指患者患有指定的癌症时发生的动作，所述动作降低了癌症的严重程度或阻碍或减缓了癌症的进展。
当与用化合物治疗联系时，术语“敏感性”或“敏感”是一个相对术语，其是指所述化合物在降低或减少肿瘤进展或正在治疗的疾病方面的有效性程度。例如，当关于细胞或肿瘤的治疗使用时，与化合物有关的术语“增加的敏感性”是指肿瘤治疗的有效性的至少约5％或更多的增加。
如本文所述，术语“化合物”和“治疗化合物”可互换使用，并且包括以下第5.5节中公开的化合物的非限制例子。
如本文所用，除非另有说明，否则术语化合物的“治疗有效量”是足以在癌症的治疗或管理中提供治疗益处，或者足以延迟或最小化与癌症的存在相关的一种或多种症状的量。化合物的治疗有效量意味着单独的或与其他疗法组合的治疗剂的量，其在癌症的治疗或管理方面提供治疗益处。术语“治疗有效量”可以涵盖改善癌症的整体疗法、减轻或避免癌症的症状或原因、或增强另一种治疗剂的治疗功效的量。所述术语还指足以引起生物分子(例如，蛋白质、酶、RNA或DNA)、细胞、组织、系统、动物或人的生物或医学反应的化合物的量，其是研究人员、兽医、医生或临床医生正在寻求的。
当关于治疗使用时，术语“反应性”或“有反应”是指治疗在减轻或减少正在治疗的疾病(例如，癌症，如MM或AML)的症状方面的有效性程度。例如，当关于细胞或受试者的治疗使用时，术语“增加的反应性”是指当使用本领域已知的任何方法测量时，与参考治疗(例如，相同细胞或受试者或者不同细胞或受试者的)相比，在减轻或减少疾病的症状方面的有效性的增加。在某些实施方案中，有效性的增加是至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％或至少约50％。
癌症或癌症相关疾病的改善可以表征为完全或部分反应。“完全反应”是指不存在临床上可检测的疾病，其中任何先前异常的放射摄影术研究、骨髓和脑脊液(CSF)或异常的单克隆蛋白测量正常化。“部分反应”是指在没有新病变的情况下所有可测量的肿瘤负荷(即，受试者中存在的恶性细胞数量，或所测量的肿瘤块体积或异常单克隆蛋白的量)降低至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％。术语“治疗”既考虑了完全反应也考虑了部分反应。
术语“可能性”通常是指事件发生概率的增加。当关于患者肿瘤反应的有效性使用时，术语“可能性”通常考虑了肿瘤进展或肿瘤细胞生长的速率将降低的增加的可能性。当关于患者肿瘤反应的有效性使用时，术语“可能性”通常也可以意指指示物(如mRNA或蛋白质表达)的增加，其可以证明治疗肿瘤的进展的增加。
术语“预测”一般意指预先确定或判断。例如，当用于“预测”癌症治疗的有效性时，术语“预测”可以意指可以在治疗开始时、在治疗开始之前或在治疗期取得实质性进展之前确定癌症治疗的结局的可能性。
如本文所用，术语“监测器”通常是指对活动的监督、监管、管理、监视、追踪或监视。例如，术语“监测化合物的有效性”是指追踪在患者或肿瘤细胞培养物中治疗癌症的有效性。同样，当与患者依从性结合使用时，无论是单独地还是在临床试验中，术语“监测”是指追踪或确认患者是否实际上正在按照规定服用正在测试的药物。例如，可以通过跟踪mRNA或蛋白质生物标记物的表达来进行监测。
如本文所用，术语“调节”是指控制分子的活性或生物功能，如增强或降低活性或功能。
术语“难治性”或“抗性”是指如下情况，其中患者即使经过强化治疗在例如其淋巴系统、血液和/或造血组织(例如，骨髓)中仍有残留癌细胞(例如，血液癌细胞，例如白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤细胞)。
“生物标记物(biological marker)”或“生物标记物(biomarker)”是如下物质，所述物质的检测指示特定的生物状态，例如像癌症的存在。在一些实施方案中，可以单独地确定生物标记物。在其他实施方案中，可以同时测量若干种生物标记物。在一些实施方案中，“生物标记物”指示可能与疾病的风险或进展相关或与所述疾病对给定治疗的易感性相关的mRNA表达水平的变化。在一些实施方案中，所述生物标记物是核酸，如mRNA或cDNA。在另外的实施方案中，“生物标记物”指示可能与疾病的风险或进展或患者对治疗的易感性相关的多肽或蛋白质表达的水平的变化。在一些实施方案中，所述生物标记物可以是多肽或蛋白质或其片段。特定蛋白质的相对水平可以通过本领域已知的方法确定。例如，可以使用基于抗体的方法，如免疫印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)或其他方法。
如本文可互换使用的术语“多肽”和“蛋白质”是指通过肽键连接的在连续阵列中的三个或更多个氨基酸的聚合物。术语“多肽”包括蛋白质、蛋白质片段、蛋白质类似物、寡肽等。如本文所用，术语“多肽”也可以指肽。构成多肽的氨基酸可以是天然衍生的，或可以是合成的。可以从生物样品纯化所述多肽。所述多肽、蛋白质或肽还包括经修饰的多肽、蛋白质和肽，例如糖多肽、糖蛋白或糖肽；或脂多肽、脂蛋白或脂肽。
如本文所用，术语“表达的”或“表达”是指从基因转录以产生与所述基因的两条核酸链之一的区域至少部分互补的RNA核酸分子。如本文所用，术语“表达的”或“表达”也指从RNA分子翻译以产生蛋白质、多肽或其部分。
术语“表达水平”是指生物标记物分子或基因组的量、积累或速率。表达水平可以例如由以下来表示：由基因编码的信使RNA(mRNA)的量或合成速率、由基因编码的多肽或蛋白质的量或合成速率、或在细胞或生物流体中积累的生物分子的量或合成速率。术语“表达水平”是指在稳态或非稳态条件下确定的在样品中分子的绝对量或者所述分子的相对量。
“上调”的mRNA一般是在给定的治疗或条件后或特定患者组中增加的。“下调”的mRNA一般是指响应于给定治疗或条件或在特定患者组中的mRNA表达水平的降低。在一些情况下，在给定治疗或条件下，mRNA水平可能保持不变。与未治疗的对照相比，当用药物治疗时，来自患者样品的mRNA可以“上调”。例如，这种上调可以是约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约200％、约300％、约500％、约1,000％、约5,000％或更多的比较性对照mRNA水平的增加。可替代地，mRNA可以响应于某些化合物或其他药剂的施用而“下调”或在较低水平下表达。例如，下调的mRNA可以以约99％、约95％、约90％、约80％、约70％、约70％、约60％、约50％、约40％、约40％、约30％、约20％、约10％、约1％或更低水平的比较性对照mRNA水平存在。
同样，与未治疗的对照相比，当用药物治疗时可以增加来自患者样品的多肽或蛋白质生物标记物的水平。这种增加可以是约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约200％、约300％、约500％、约1,000％、约5,000％或更多的比较性对照蛋白质水平的增加。可替代地，蛋白质生物标记物的水平可以响应于某些化合物或其他药剂的施用而降低。例如，这种降低可以以约99％、约95％、约90％、约80％、约70％、约70％、约60％、约50％、约40％、约40％、约30％、约20％、约10％、约1％或更低水平的比较性对照蛋白质水平存在。
如本文所用，术语“确定”、“测量”、“评价”、“评估”和“测定”的术语通常是指任何形式的测量，并且包括确定是否存在元素。这些术语包括定量和/或定性测定。评估可以是相对的或绝对的。“评估……的存在”可以包括确定存在的事物的数量，以及确定它是否存在。
在本文中可互换使用术语“核酸”和“多核苷酸”以描述由核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成的任何长度的聚合物，其可以与天然存在的核酸以序列特异性的方式杂交，这类似于两个天然存在的核酸的杂交方式，例如可以参与Watson-Crick碱基配对相互作用。如本文在多核苷酸序列的上下文中所用，术语“多个碱基”(或“一个碱基”)与“多个核苷酸”(或“一个核苷酸”)的同义，即多核苷酸的单体亚基。术语“核苷”和“核苷酸”旨在包括那些不仅含有已知嘌呤和嘧啶碱基，还含有已经被修饰的其他杂环碱基的部分。这些修饰包括甲基化嘌呤或嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶、烷基化核糖或其他杂环。另外，术语“核苷”和“核苷酸”包括那些不仅含有常规核糖和脱氧核糖糖还含有其他糖的部分。经修饰的核苷或核苷酸还包括对糖部分的修饰，例如，其中一个或多个羟基被卤素原子或脂族基团替代，或者被官能化为醚、胺等。“类似物”是指如下具有结构特征的分子，其在文献中被识别为具有类似结构的模拟物、衍生物或其他类似术语，并且包括例如掺入了非天然核苷酸、核苷酸模拟物如2'-经修饰的核苷酸的多核苷酸、肽核酸、寡聚体核苷磷酸盐和任何添加了取代基(如保护基团或连接部分)的多核苷酸。
术语“互补”是指基于多核苷酸序列的在多核苷酸之间的特异性结合。如本文所用，如果第一多核苷酸和第二多核苷酸在杂交测定中在严格条件下彼此结合，例如如果在杂交测定中它们产生给定或可检测的信号水平，则第一多核苷酸和第二多核苷酸是互补的。如果多核苷酸的部分遵循常规碱基配对规则，例如A与T(或U)配对且G与C配对，则所述多核苷酸的部分彼此互补，但可能存在小区域(例如，少于约3个碱基)的不匹配、插入或缺失的序列。
术语“分离”和“纯化”是指物质(如mRNA、DNA或蛋白质)的分离，使得所述物质构成所述物质所存在于其中的样品的实质部分，即大于所述物质以其天然或未分离状态被发现时的部分。通常，样品的实质部分构成样品的大于1％、大于2％、大于5％、大于10％、大于20％、大于50％或更多，通常多达90％-100％。例如，分离的mRNA的样品通常可以构成总mRNA的至少约1％。纯化多核苷酸的技术在本领域中是熟知的，包括凝胶电泳、离子交换色谱法、亲和色谱法、流式分选和根据密度的沉降。
如本文所用，术语“结合”指示直接或间接附接。在化学结构的上下文中，“结合”(或“键合”)可以指直接连接两个部分或间接连接两个部分(例如，经由连接基团或分子的任何其他中间部分)的化学键的存在。化学键可以是共价键、离子键、配位复合物、氢键合、范德华相互作用或疏水堆积，或者可以展现出多种类型的化学键的特征。在某些情况下，“结合”包括其中附接是直接的实施方案和其中附接是间接的实施方案。
如本文所用的术语“样品”涉及含有一种或多种目标组分的材料或材料的混合物，其通常是但不一定是流体形式。
如本文所用，“生物样品”是指从生物受试者获得的样品，包括生物组织或流体来源的、在体内或原位获得、得到或收集的样品。生物样品还包括来自含有癌前或癌细胞或组织的生物受试者的区域的样品。此类样品可以是但不限于从哺乳动物分离的器官、组织和细胞。示例性生物样品包括但不限于细胞裂解物、细胞、组织、器官、细胞器、生物流体、血液样品、尿液样品、皮肤样品等。优选的生物样品包括但不限于全血、部分纯化的血液、PBMC、组织活检(包括肿瘤活检)、循环肿瘤细胞等。
如本文所用，术语“聚合酶链式反应”或“PCR”通常是指如下程序，其中如例如美国专利号4,683,195中所述扩增少量的核酸、RNA和/或DNA。通常，需要提供来自目标区域的末端或之外的序列信息，使得可以设计寡核苷酸引物；这些引物在序列上与要扩增的模板的相反链相同或相似。两个引物的5'末端核苷酸可以与所扩增的材料的末端重合。PCR可以用于扩增特定RNA序列、来自全基因组DNA的特定DNA序列以及从总细胞RNA、噬菌体或质粒序列转录的cDNA等。一般参见Mullis等人,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.1987,51:263-273；PCR Technology(Stockton Press,NY,Erlich,编辑,1989)。
如本文所用，“互变异构体”是指彼此平衡的化合物的异构体形式。异构体形式的浓度将取决于化合物被发现的环境，并且可以根据例如化合物是固体还是在有机溶液或水溶液中而有所不同。例如，在水溶液中，吡唑可以展现出以下异构体形式，它们被称为彼此的互变异构体：
Figure BDA0003710765600000111
如本文所用且除非另有说明，否则术语“药学上可接受的盐”包括所述术语所指的化合物的无毒酸和碱加成盐。可接受的无毒酸加成盐包括衍生自本领域已知的有机酸和无机酸的那些，所述无机酸和有机酸包括例如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、甲磺酸、乙酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、马来酸、山梨酸、乌头酸、水杨酸、邻苯二甲酸、扑酸、庚酸等。在性质上为酸性的化合物能够与各种药学上可接受的碱形成盐。可用于制备此类酸性化合物的药学上可接受的碱加成盐的碱是形成无毒碱加成盐(即含有药学上可接受的阳离子的盐，如但不限于碱金属或碱土金属盐(特别是钙、镁、钠或钾盐))的那些。合适的有机碱包括但不限于N,N-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡糖胺)、赖氨酸和普鲁卡因。
如本文所用且除非另有说明，否则术语“溶剂化物”意指还包括通过非共价分子间力结合的化学计量或非化学计量量的溶剂的本文提供的化合物或其盐。在所述溶剂是水的情况下，所述溶剂化物是水合物。
如本文所用且除非另有说明，否则术语“共晶”意指在晶格中含有多于一种化合物的结晶形式。共晶包括通过非离子型相互作用在晶格中结合的两种或更多种非挥发性化合物的结晶分子复合物。如本文所用，共晶包括药物共晶，其中所述结晶分子复合物含有治疗性化合物和一种或多种另外的非挥发性化合物(本文称为一种或多种抗衡分子)。药物共晶中的抗衡分子通常是无毒的药学上可接受的分子，例如像食品添加剂、防腐剂、药物赋形剂或其他活性药物成分(API)。在一些实施方案中，药物共晶增强药物产品的某些物理化学特性(例如，溶解度、溶出速率、生物利用度和/或稳定性)而不损害API的化学结构完整性。参见例如，Jones等人,MRS Bulletin 2006,31,875-879；Trask,Mol.Pharmaceutics 2007,4(3):301-309；Schultheiss&Newman,Crystal Growth&Design 2009,9(6):2950-2967；Shan&Zaworotko,Drug Discovery Today 2008,13(9/10):440-446；以及Vishweshwar等人,J.Pharm.Sci.2006,95(3):499–516。
如本文所用且除非另有说明，否则术语“立体异构体”包括本发明的所有对映体/立体异构体纯的和对映体/立体异构体富集的化合物。
如本文所用且除非另有说明，否则术语“立体异构体纯的”意指包含化合物的一种立体异构体并且基本上不含该化合物的其他立体异构体的组合物。例如，具有一个手性中心的化合物的立体异构体纯的组合物将基本上不含所述化合物的相对的对映体。具有两个手性中心的化合物的立体异构体纯的组合物将基本上不含所述化合物的其他非对映体。典型的立体异构体纯的化合物包含按重量计大于约80％的所述化合物的一种立体异构体和按重量计小于约20％的所述化合物的其他立体异构体，更优选按重量计大于约90％的所述化合物的一种立体异构体和按重量计小于约10％的所述化合物的其他立体异构体，甚至更优选按重量计大于约95％的所述化合物的一种立体异构体和按重量计小于约5％的所述化合物的其他立体异构体，以及最优选按重量计大于约97％的所述化合物的一种立体异构体和按重量计小于约3％的所述化合物的其他立体异构体。
如本文所用且除非另有说明，否则术语“立体异构体富集的”意指包含按重量计大于约60％的化合物的一种立体异构体、优选按重量计大于约70％、更优选按重量计大于约80％的化合物的一种立体异构体的组合物。如本文所用且除非另有说明，否则术语“对映体纯的”意指具有一个手性中心的化合物的立体异构体纯的组合物。类似地，术语“立体异构体富集的”意指具有一个手性中心的化合物的立体异构体富集的组合物。
如本文所用且除非另有说明，否则术语“前药”意指化合物的衍生物，其可以在生物条件(在体外或在体内)下水解、氧化或以其他方式反应以提供所述化合物。前药的例子包括但不限于本文所述化合物(例如，化合物1)的衍生物，其包括生物可水解部分，如生物可水解酰胺、生物可水解酯、生物可水解氨基甲酸酯、生物可水解碳酸盐、生物可水解酰脲和生物可水解磷酸盐类似物。
还应注意，化合物可以在一个或多个原子上含有非自然比例的原子同位素。例如，化合物可以用放射性同位素进行放射性标记，例如像氚(3H)、碘-125(125I)、硫-35(35S)或碳-14(14C)，或者可以是同位素富集的，如用氘(2H)、碳-13(13C)或氮-15(15N)富集的。如本文所用，“同位素体”是同位素富集的化合物。术语“同位素富集的”是指具有不同于该原子的天然同位素组成的同位素组成的原子。“同位素富集的”还可以指含有如下至少一个原子的化合物，所述至少一个原子的同位素组成不同于该原子的天然同位素组成。术语“同位素组成”是指对于给定原子存在的每种同位素的量。放射性标记的和同位素富集的化合物可用作治疗剂(例如癌症和炎症治疗剂)、研究试剂(例如，结合测定试剂)和诊断剂(例如，体内成像剂)。如本文所述的化合物的所有同位素变体，无论是否具有放射性，都旨在涵盖在本文提供的实施方案的范围内。在一些实施方案中，提供了化合物的同位素体，例如，所述同位素体是氘、碳-13或氮-15富集的化合物。在一些实施方案中，本文提供的同位素体是氘富集的化合物。在一些实施方案中，本文提供的同位素体是氘富集的化合物，其中氘化发生在手性中心。在一些实施方案中，本文提供了本文提供的化合物的同位素体，其中氘化发生在手性中心。在一些实施方案中，本文提供了化合物D的同位素体，其中氘化发生在手性中心。
术语“约”或“大约”意指由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差，这部分地取决于如何测量或确定所述值。在某些实施方案中，术语“约”或“大约”意指在1、2、3或4个标准偏差内。在某些实施方案中，术语“约”或“大约”意指在给定值或范围的50％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.05％内。
应当注意，如果所描绘的结构与该结构被给予的名称之间存在矛盾，则所描绘的结构将被赋予更大的权重。另外，如果结构或结构的一部分的立体化学未用例如粗线或虚线指示，则所述结构或所述结构的一部分将被解释为包括它的所有立体异构体。
除非另有说明，否则本文提供的实施方案的实践将采用分子生物学、微生物学和免疫学的常规技术，其在本领域技术人员的技术范围内。此类技术在文献中得到充分解释。特别适合于查阅的文本的例子包括以下：Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2014年第4版)；Glover编辑,DNA Cloning,卷I和卷II(1995年第2版)；Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Academic Press,London)；Scopes,Protein Purification:Principles and Practice(Springer Verlag,N.Y.,1993年第3版)；以及Weir和Blackwell编辑,Handbook of Experimental Immunology,卷I-IV(1996年第5版)。
5.2.生物标记物及其使用方法
5.2.1基因(生物标记物)
在一个方面，本文提供了一种鉴定可能对包含化合物的治疗有反应的患有癌症的受试者，或者预测患有或被怀疑患有癌症的受试者对包含所述化合物的治疗的反应性的方法，所述方法包括：i.提供来自所述受试者的样品；ii.测量所述样品中一种或多种基因的基因表达水平；以及iii.果所述基因的表达水平不同于参考水平，则鉴定所述受试者为可能对包含所述化合物的治疗有反应，其中所述化合物是2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺(化合物D)，或者其立体异构体或者其立体异构体、同位素体、药学上可接受的盐、互变异构体、溶剂化物、水合物，共晶、包合物或多晶型物的混合物，并且其中所述基因是参与mTOR信号传导的基因。
在另一个方面，本文提供了一种用化合物治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括鉴定可能对包含如上所述的化合物的治疗有反应的患有癌症的受试者，并且如果所述受试者被鉴定为可能对包含所述化合物的治疗有反应，则向所述受试者施用治疗有效量的所述化合物，其中所述化合物是化合物D，或者其立体异构体或者其立体异构体、同位素体、药学上可接受的盐、互变异构体、溶剂化物、水合物、共晶、包合物或多晶型物的混合物并且其中所述基因是参与mTOR信号传导的基因。
雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR)也称为雷帕霉素的机制性靶标，其是具有丝氨酸-苏氨酸激酶活性的蛋白质。mTOR属于磷酸肌醇磷脂3-激酶(PI3K)相关激酶家族。mTOR存在于两种在功能上不同的复合物中：mTOR复合物1(mTORC1)和mTOR复合物2(mTORC2)。
mTORC1由五种蛋白质组成。除mTOR外，复合物1还包括mTOR的调节相关蛋白(Raptor)、哺乳动物致死含Sec13蛋白8(mLST8，也称为GβL)、富含脯氨酸的AKT底物40kDa(PRAS40)和含DEP结构域的mTOR相互作用蛋白(Deptor)。Raptor是mTORC1的主要区别蛋白。Raptor是正调节mTOR活性的衔接蛋白。mLST8是支架蛋白，其结合并稳定mTOR的激酶结构域。与Raptor和mLST8不同，PRAS40和Deptor是mTOR的负调节物。因此，在mTOR激活和信号传导期间，PRAS40和Deptor与mTORC1没有物理关联。当mTOR激活和信号传导减少时，PRAS40和Deptor被招募到复合物中。
mTORC2由六种蛋白质组成。除mTOR外，复合物2还包括mTOR的雷帕霉素不敏感伴侣(Rictor)、哺乳动物应激激活蛋白激酶相互作用蛋白(mSIN1)、与Rictor-1一起观察到的蛋白质(Protor-1)、mLST8和Deptor。Rictor和mSIN1二者均是稳定彼此与mTOR相互作用的支架蛋白。结合Rictor的Protor-1的功能尚不清楚。与mTORC1类似，mLST8稳定并促进mTOR的激酶活性，并且Deptor负调节mTORC2活性。
mTOR信号传导是指通常在mTOR上游开始从而导致其激活的的一系列或一连串事件(例如，磷酸化)。mTOR激活是mTOR复合物的形成或mTOR及其在mTOR复合物中的相关蛋白的磷酸化的结果。例如，mTORC1可以通过Raptor的磷酸化来激活，所述磷酸化促进mTORC1组装，或者mTOR可以在已知的丝氨酸和苏氨酸残基处被磷酸化。一旦mTOR复合物通过组装和磷酸化被激活，mTOR将磷酸化下游蛋白质和其他细胞组分，以促进细胞内的代谢变化或生长。具体地，mTORC1信号传导激活对于经由核糖体生物发生和mRNA翻译的脂质和核苷酸合成以及蛋白质合成而言重要的下游蛋白质和组分。mTORC2信号传导激活对于脂质和葡萄糖代谢以及细胞存活而言重要的下游蛋白质。
许多细胞内和细胞外信号集中在mTOR上以调节mTOR信号传导。这些信号包括生长因子、能量状态、氧气和氨基酸。
mTOR信号传导的调节可以发生在mTOR的上游，其可以是mTOR复合物所固有的，或者调节可以发生在mTOR信号传导的下游，例如经由反馈回路。在正常细胞中，这些信号可以正调节或负调节mTOR活性。mTOR的正调节物和负调节物可以以多种方式影响mTOR活性。mTORC1的示例性正调节物包括Raptor、mLST8和在脑中富集的Ras同源物(Rheb)。Raptor和mLST8是对于mTOR活性所需的重要支架蛋白。敲除研究已经证实，Raptor或mLST8的缺失损害mTORC1的形成和激酶活性。Rheb是GTP酶，其已被证明通过直接结合mTOR和mLST8或通过使mTORC1磷酸化来促进mTORC1活性。应注意，虽然上述正调节物紧邻mTOR，但存在多个上游细胞信号，包括与这些调节物直接或间接相互作用的那些。例如，当生长因子结合其相应受体时，由PI3K引发的一系列磷酸化事件将使AKT磷酸化，然后这导致TSC1/TSC2(mTOR活性的负调节物)的磷酸化和失活。
mTORC1的示例性负调节物包括Deptor、PRAS40、结节性硬化症复合物(TSC1/TSC2)、DNA损伤诱导转录物4(DDIT4)、激活转录因子4(ATF4)、一般性调控阻遏蛋白激酶2(GCN2)和5'腺苷一磷酸激活蛋白激酶(AMPK)。Deptor结合mTOR以抑制其激酶活性，而PRAS40通过结合Raptor抑制mTOR活性。TSC1/TSC2是异二聚体复合物，其通过将Rheb-GTP水解至其非活性GDP状态来抑制mTORC1活性。处于其GDP状态的Rheb无法结合或磷酸化mTOR。DDIT4是在细胞中响应于应激而上调的蛋白质。DDIT4可以通过增加TSC1和TSC2蛋白的活性来负调节mTOR。一种理解是DDIT4可以竞争结合14-3-3蛋白，这是一种结合并抑制TSC2的蛋白质。一旦DDIT4结合14-3-3蛋白，TSC1/TSC2复合物就可以自由地抑制mTOR活性。ATF4是转录因子，其在应激条件下将增加DDIT4的表达。GCN2是丝氨酸-苏氨酸激酶，其可以通过翻译起始因子eIF2α的磷酸化和失活来抑制mTOR，但其背后的机制尚不完全清楚。最后，AMPK可以通过两种方式抑制mTOR活性。AMPK可以磷酸化并激活TSC2或AMPK可以磷酸化Raptor，导致14-3-3蛋白将其与复合物隔离。
研究已经表明，mTORC2部分地通过Rictor组分进行调节。小鼠中Rictor的缺失显著阻碍了mTORC2活性。另外，负责核糖体生物合成和蛋白质翻译的核糖体蛋白S6激酶β-1(p70S6K)可以通过Rictor的磷酸化来抑制mTORC2。
如本文所用，术语“mTOR信号传导的正调节物”是指正调节mTOR信号传导的因子，包括但不限于通过促进或刺激mTOR激活或促进或刺激由mTOR激活引起的下游事件。如本文所用，术语“mTOR信号传导的负调节物”是指负调节mTOR信号传导的因子，包括但不限于通过抑制或降低mTOR激活或抑制或降低由mTOR激活引起的下游事件。
在一些实施方案中，本发明方法中使用的基因是mTOR信号传导的正调节物，如mTOR、Raptor和Rictor。如下文第6节所示，敲除这些mTOR信号传导的正调节物中的任一个增强了癌细胞对用化合物D治疗的敏感性，这表明这种基因的较低水平表达可以增加对化合物D治疗的反应性。因此，当所述基因是mTOR信号传导的正调节物时，所述方法包括如果所述基因的表达水平低于参考水平，则鉴定所述受试者为可能对包含所述化合物的治疗有反应。在一些实施方案中，所述参考水平是所述基因在对化合物D有抗性的受试者中的表达水平。在其他实施方案中，所述参考水平是所述基因在没有所述癌症的受试者中的表达水平。在又其他实施方案中，所述参考水平是预先确定的水平，例如基于受试者群体确定的。
在其他实施方案中，本发明方法中使用的基因是mTOR信号传导的负调节物，如TSC1、TSC2、GCN1、GCN2、DDIT4和ATF4。如下文第6节所示，敲除这些mTOR信号转导的负调节物赋予癌细胞对用化合物D治疗的抗性，这表明这种基因的存在或更高水平的表达可以增加对化合物D治疗的反应性。因此，当所述基因是mTOR信号传导的负调节物时，所述方法包括如果所述基因的表达水平高于参考水平，则鉴定所述受试者为可能对包含所述化合物的治疗有反应。在一些实施方案中，所述参考水平是所述基因在对化合物D有抗性的受试者中的表达水平。在一些实施方案中，所述参考水平是所述基因在对化合物D有反应的受试者中的表达水平。在一些实施方案中，所述参考水平是所述基因在没有所述癌症的受试者中的表达水平。在又其他实施方案中，所述参考水平是预先确定的水平，例如基于受试者群体确定的。
在一个方面，本文提供了一种鉴定可能对包含化合物的治疗有反应的患有癌症的受试者，或者预测患有或被怀疑患有癌症的受试者对包含所述化合物的治疗的反应性的方法，所述方法包括：i.提供来自所述受试者的样品；ii.测量所述样品中一种或多种基因的基因表达水平；以及iii.如果所述基因的表达水平不同于参考水平，则鉴定所述受试者为可能对包含所述化合物的治疗有反应，其中所述化合物是2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺(化合物D)，或者其立体异构体或者其立体异构体、同位素体、药学上可接受的盐、互变异构体、溶剂化物、水合物，共晶、包合物或多晶型物的混合物，并且其中所述基因是ILF2或ILF3。在一些实施方案中，所述基因是ILF2。在一些实施方案中，所述基因是ILF3。
在另一个方面，本文提供了一种用化合物治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括鉴定可能对包含如上所述的化合物的治疗有反应的患有癌症的受试者，并且如果所述受试者被鉴定为可能对包含所述化合物的治疗有反应，则向所述受试者施用治疗有效量的所述化合物，其中所述化合物是化合物D，或者其立体异构体或者其立体异构体、同位素体、药学上可接受的盐、互变异构体、溶剂化物、水合物、共晶、包合物或多晶型物的混合物并且其中所述基因是ILF2或ILF3。在一些实施方案中，所述基因是ILF2。在一些实施方案中，所述基因是ILF3。
在一些实施方案中，所述方法包括如果ILF2或ILF3的表达水平高于参考水平，则鉴定所述受试者为可能对包含所述化合物的治疗有反应。在一些实施方案中，所述参考水平是所述基因在对化合物D有抗性的受试者中的表达水平。在一些实施方案中，所述参考水平是所述基因在对化合物D有反应的受试者中的表达水平。在一些实施方案中，所述参考水平是所述基因在没有所述癌症的受试者中的表达水平。在又其他实施方案中，所述参考水平是预先确定的水平，例如基于受试者群体确定的。
在本文提供的各种方法的一些实施方案中，所述癌症是淋巴瘤。在本文提供的各种方法的其他实施方案中，所述癌症是白血病。在具体实施方案中，所述癌症是AML。
5.2.2选择性治疗
在本文提供的各种方法(包括上述那些)的一些实施方案中，将本文提供的化合物施用至已确定为可能对所述化合物有反应的患者。因此，在一个方面，本文提供了一种选择性治疗方法，包括将化合物施用至已根据本文所述的方法(包括上述那些)确定为可能对所述化合物有反应的患者。
在另一个特定实施方案中，所述化合物是化合物D，或者其立体异构体或者其立体异构体、同位素体、药学上可接受的盐、互变异构体、溶剂化物、水合物、共晶、包合物或多晶型物的混合物。
在本文提供的各种方法的一些实施方案中，将治疗化合物施用至可能对所述治疗化合物有反应的患者。本文还提供了治疗先前针对癌症进行过治疗但对标准疗法无反应的患者以及先前未治疗过的患者的方法。本发明还包括治疗患者的方法，而不管患者的年龄如何，尽管一些疾病或障碍在特定年龄组中更为常见。本发明进一步包括治疗已经进行过手术以试图治疗所讨论的疾病或病症的患者以及未进行过手术的患者的方法。由于患有癌症的患者具有不均一的临床表现和不同的临床结局，因此根据他/她的预后，给予患者的治疗可能会不同。熟练的临床医生将能够在没有过度实验的情况下容易地确定可以有效地用于治疗患有癌症的个体患者的特定二线药剂(secondary agent)、手术类型和基于非药物的标准疗法的类型。
给药和施用
在某些实施方案中，本文提供的化合物的治疗或预防有效量。在某些实施方案中，化合物D的治疗或预防有效量是从约0.005至约20mg/天、从约0.05至20mg/天、从约0.01至约10mg/天、从约0.01至约7mg/天、从约0.01至约5mg/天、从约0.01至约3mg/天、从约0.05至约10mg/天、从约0.05至约7mg/天、从约0.05至约5mg/天、从约0.05至约3mg/天、从约0.1至约15mg/天、从约0.1至约10mg/天、从约0.1至约7mg/天、从约0.1至约5mg/天、从约0.1至约3mg/天、从约0.5至约10mg/天、从约0.05至约5mg/天、从约0.5至约3mg/天、从约0.5至约2mg/天、从约0.3至约10mg/天、从约0.3至约8.5mg/天、从约0.3至约8.1mg/天、从约0.6至约10mg/天或从约0.6至约5mg/天。在一个实施方案中，化合物D的治疗或预防有效量是从约0.005至约20mg/天。在一个实施方案中，化合物D的治疗或预防有效量是从约0.05至20mg/天。在一个实施方案中，化合物D的治疗或预防有效量是从约0.01至约10mg/天。在一个实施方案中，化合物D的治疗或预防有效量是从约0.01至约7mg/天。在一个实施方案中，化合物D的治疗或预防有效量是从约0.01至约5mg/天。在一个实施方案中，化合物D的治疗或预防有效量是从约0.01至约3mg/天。在一个实施方案中，化合物D的治疗或预防有效量是从约0.05至约10mg/天。在一个实施方案中，化合物D的治疗或预防有效量是从约0.05至约7mg/天。在一个实施方案中，化合物D的治疗或预防有效量是从约0.05至约5mg/天。在一个实施方案中，化合物D的治疗或预防有效量是从约0.05至约3mg/天。在一个实施方案中，化合物D的治疗或预防有效量是从约0.1至约15mg/天。在一个实施方案中，化合物D的治疗或预防有效量是从约0.1至约10mg/天。在一个实施方案中，化合物D的治疗或预防有效量是从约0.1至约7mg/天。在一个实施方案中，化合物D的治疗或预防有效量是从约0.1至约5mg/天。在一个实施方案中，化合物D的治疗或预防有效量是从约0.1至约3mg/天。在一个实施方案中，化合物D的治疗或预防有效量是从约0.5至约10mg/天。在一个实施方案中，化合物D的治疗或预防有效量是从约0.5至约5mg/天。在一个实施方案中，化合物D的治疗或预防有效量是从约0.5至约3mg/天。在一个实施方案中，化合物D的治疗或预防有效量是从约0.5至约2mg/天。在一个实施方案中，化合物D的治疗或预防有效量是从约0.3至约10mg/天。在一个实施方案中，化合物D的治疗或预防有效量是从约0.3至约8.5mg/天。在一个实施方案中，化合物D的治疗或预防有效量是从约0.3至约8.1mg/天。在一个实施方案中，化合物D的治疗或预防有效量是从约0.6至约10mg/天或从约0.6至约5mg/天。
在某些实施方案中，所述治疗或预防有效量是约0.1、约0.2、约0.5、约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10mg/天。在一些此类实施方案中，所述治疗或预防有效量是约0.5、约0.6、约0.75、约1、约2、约3、约4、约5、约6或约7mg/天。在一些此类实施方案中，所述治疗或预防有效量是约0.6、约1.2、约1.8、约2.4或约3.6mg/天。在某些实施方案中，所述治疗或预防有效量是约0.1mg/天。在某些实施方案中，所述治疗或预防有效量是约0.2mg/天。在某些实施方案中，所述治疗或预防有效量是约0.5mg/天。在某些实施方案中，所述治疗或预防有效量是约1mg/天。在某些实施方案中，所述治疗或预防有效量是约2mg/天。在某些实施方案中，所述治疗或预防有效量是约3mg/天。在某些实施方案中，所述治疗或预防有效量是约4mg/天。在某些实施方案中，所述治疗或预防有效量是约5mg/天。在某些实施方案中，所述治疗或预防有效量是约6mg/天。在某些实施方案中，所述治疗或预防有效量是约7mg/天。在某些实施方案中，所述治疗或预防有效量是约8mg/天。在某些实施方案中，所述治疗或预防有效量是约9mg/天。在某些实施方案中，所述治疗或预防有效量是约10mg/天。
在一个实施方案中，对于本文所述的病症，化合物D的推荐日剂量范围是在从约0.01mg/天至约20mg/天的范围内，优选作为单次每天一次剂量或全天分次剂量给予。在一个实施方案中，对于本文所述的病症，化合物D的推荐日剂量范围是在从约0.01mg/天至约15mg/天的范围内，优选作为单次每天一次剂量或全天分次剂量给予。在一个实施方案中，对于本文所述的病症，化合物D的推荐日剂量范围是在从约0.01mg/天至约12mg/天的范围内，优选作为单次每天一次剂量或全天分次剂量给予。在一些实施方案中，所述剂量范围是从约0.1mg/天至约10mg/天。在其他实施方案中，所述剂量范围是从约0.5至约5mg/天。每天的具体剂量包括0.1、0.2、0.5、0.6、1、1.2、1.5、1.8、2、2.4、2.5、3、3.5、3.6、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.2、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.4、14.5或15mg/天。在其他实施方案中，所述剂量范围是从约0.5至约5mg/天。每天的具体剂量包括0.1、0.2、0.5、0.6、1、1.2、1.5、1.8、2、2.4、2.5、3、3.5、3.6、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg/天。在一个实施方案中，每天的剂量是0.1mg/天。在一个实施方案中，每天的剂量是0.2mg/天。在一个实施方案中，每天的剂量是0.5mg/天。在一个实施方案中，每天的剂量是0.6mg/天。在一个实施方案中，每天的剂量是1mg/天。在一个实施方案中，每天的剂量是1.2mg/天。
在一个实施方案中，每天的剂量是1.5mg/天。在一个实施方案中，每天的剂量是1.8mg/天。在一个实施方案中，每天的剂量是2mg/天。在一个实施方案中，每天的剂量是2.4mg/天。在一个实施方案中，每天的剂量是2.5mg/天。在一个实施方案中，每天的剂量是3mg/天。在一个实施方案中，每天的剂量是3.5mg/天。在一个实施方案中，每天的剂量是3.6mg/天。在一个实施方案中，每天的剂量是4mg/天。在一个实施方案中，每天的剂量是4.5mg/天。在一个实施方案中，每天的剂量是5mg/天。在一个实施方案中，每天的剂量是5.5mg/天。在一个实施方案中，每天的剂量是6mg/天。在一个实施方案中，每天的剂量是6.5mg/天。在一个实施方案中，每天的剂量是7mg/天。在一个实施方案中，每天的剂量是7.2mg/天。在一个实施方案中，每天的剂量是7.5mg/天。在一个实施方案中，每天的剂量是8mg/天。在一个实施方案中，每天的剂量是8.5mg/天。在一个实施方案中，每天的剂量是9mg/天。在一个实施方案中，每天的剂量是9.5mg/天。在一个实施方案中，每天的剂量是10mg/天。在一个实施方案中，每天的剂量是12mg/天。在一个实施方案中，每天的剂量是10mg/天。在一个实施方案中，每天的剂量是12mg/天。在一个实施方案中，每天的剂量是14.4mg/天。在一个实施方案中，每天的剂量是15mg/天。
在一个具体实施方案中，推荐起始剂量可以是0.1、0.5、0.6、0.7、1、1.2、1.5、1.8、2、2.4、2.5、3、3.5、3.6、4、4.5、5、5.5、6、6.5或7mg/天。在另一个实施方案中，推荐起始剂量可以是0.1、0.5、0.6、1、1.2、1.8、2、2.4、3、3.6、4或5mg/天。在一个实施方案中，所述剂量可以升级至7、8、9、10、12或15mg/天。在一个实施方案中，所述剂量可以升级至7、8、9或10mg/天。
在具体实施方案中，化合物D可以以约0.1mg/天的量施用至患有包括AML的白血病的患者。在特定实施方案中，化合物D可以以约1mg/天的量施用至患有包括AML的白血病的患者。在特定实施方案中，化合物D可以以约3mg/天的量施用至患有包括AML的白血病的患者。在特定实施方案中，化合物D可以以约4mg/天的量施用至患有包括AML的白血病的患者。在特定实施方案中，本文提供的化合物D可以以约5mg/天的量施用至患有包括AML的白血病的患者。在特定实施方案中，本文提供的化合物D可以以约6mg/天的量施用至患有包括AML的白血病的患者。在特定实施方案中，本文提供的化合物D可以以约7mg/天的量施用至患有包括AML的白血病的患者。在特定实施方案中，本文提供的化合物D可以以约10mg/天的量施用至患有包括AML的白血病的患者。在特定实施方案中，本文提供的化合物D可以以约12mg/天的量施用至患有包括AML的白血病的患者。在特定实施方案中，本文提供的化合物D可以以约15mg/天的量施用至患有包括AML的白血病的患者。
在具体实施方案中，化合物D可以以约0.1mg/天的量施用至患有MDS的患者。在特定实施方案中，化合物D可以以约1mg/天的量施用至患有MDS的患者。在特定实施方案中，化合物D可以以约3mg/天的量施用至患有MDS的患者。在特定实施方案中，化合物D可以以约4mg/天的量施用至患有MDS的患者。在特定实施方案中，本文提供的化合物D可以以约5mg/天的量施用至患有MDS的患者。在特定实施方案中，本文提供的化合物D可以以约6mg/天的量施用至患有MDS的患者。在特定实施方案中，本文提供的化合物D可以以约7mg/天的量施用至患有MDS的患者。在特定实施方案中，本文提供的化合物D可以以约10mg/天的量施用至患有MDS的患者。在特定实施方案中，本文提供的化合物D可以以约12mg/天的量施用至患有MDS的患者。在特定实施方案中，本文提供的化合物D可以以约15mg/天的量施用至患有MDS的患者。
在某些实施方案中，所述治疗或预防有效量是从0.001至约20mg/kg/天、从约0.01至约15mg/kg/天、从约0.01至约10mg/kg/天、从约0.01至约9mg/kg/天,0.01至约8mg/kg/天、从约0.01至约7mg/kg/天、从约0.01至约6mg/kg/天、从约0.01至约5mg/kg/天、从约0.01至约4mg/kg/天、从约0.01至约3mg/kg/天、从约0.01至约2mg/kg/天、从约0.01至约1mg/kg/天、或从约0.01至约0.05mg/kg/天。在某些实施方案中，所述治疗或预防有效量是从约0.001至约20mg/kg/天。在某些实施方案中，所述治疗或预防有效量是从约0.01至约15mg/kg/天。在某些实施方案中，所述治疗或预防有效量是从约0.01至约10mg/kg/天。在某些实施方案中，所述治疗或预防有效量是从约0.01至约9mg/kg/天。在某些实施方案中，所述治疗或预防有效量是0.01至约8mg/kg/天。在某些实施方案中，所述治疗或预防有效量是从约0.01至约7mg/kg/天。在某些实施方案中，所述治疗或预防有效量是从约0.01至约6mg/kg/天。在某些实施方案中，所述治疗或预防有效量是从约0.01至约5mg/kg/天。在某些实施方案中，所述治疗或预防有效量是从约0.01至约4mg/kg/天。在某些实施方案中，所述治疗或预防有效量是从约0.01至约3mg/kg/天。在某些实施方案中，所述治疗或预防有效量是从约0.01至约2mg/kg/天。在某些实施方案中，所述治疗或预防有效量是从约0.01至约1mg/kg/天。在某些实施方案中，所述治疗或预防有效量是从约0.01至约0.05mg/kg/天。
施用的剂量也可以用除mg/kg/天以外的单位表示。例如，对于肠胃外施用的剂量可以表示为mg/m2/天。本领域普通技术人员将容易知道对于给定的受试者身高或体重或二者如何将剂量从mg/kg/天转换为mg/m2/天(参见www.fda.gov/cder/cancer/animalframe.htm)。例如，对于65kg的人来说，1mg/kg/天的剂量大约等于38mg/m2/天。
在某些实施方案中，所施用的化合物D的量足以提供如下范围内的处于稳态的所述化合物的血浆浓度：约0.001至约500μM、约0.002至约200μM、约0.005至约100μM、约0.01至约50μM、约1至约50μM、约0.02至约25μM、约0.05至约20μM、约0.1至约20μM、约0.5至约20μM、或约1至约20μM。在某些实施方案中，所施用的化合物D的量足以提供如下范围内的处于稳态的所述化合物的血浆浓度：约0.001至约500μM、约0.002至约200μM、约0.005至约100μM、约0.01至约50μM、约1至约50μM、约0.02至约25μM、约0.05至约20μM、约0.1至约20μM、约0.5至约20μM、或约1至约20μM。
在其他实施方案中，所施用的化合物D的配制品的量足以提供如下范围内的处于稳态的所述化合物的血浆浓度：约5至约100nM、约5至约50nM、约10至约100nM，约10至约50nM、或约50至约100nM。在其他实施方案中，所施用的化合物D的配制品的量足以提供在约5至约100nM范围内的处于稳态的所述化合物的血浆浓度。在其他实施方案中，所施用的化合物D的配制品的量足以提供在约5至约50nM范围内的处于稳态的所述化合物的血浆浓度。在其他实施方案中，所施用的化合物D的配制品的量足以提供在约10至约100nM范围内的处于稳态的所述化合物的血浆浓度。在其他实施方案中，所施用的化合物D的配制品的量足以提供在约10至约50nM范围内的处于稳态的所述化合物的血浆浓度。在其他实施方案中，所施用的化合物D的配制品的量足以提供在约50至约100nM范围内的处于稳态的所述化合物的血浆浓度。
如本文所用，术语“处于稳态的血浆浓度”是在本文提供的配制品的施用时间段后达到的浓度。达到稳态后，在实线形式的血浆浓度的时间依赖性曲线上出现较小的峰和谷。
在某些实施方案中，所施用的化合物D的配制品的量足以提供如下范围内的所述化合物的最大血浆浓度(峰值浓度)：约0.001至约500μM、约0.002至约200μM、约0.005至约100μM、约0.01至约50μM、约1至约50μM、约0.02至约25μM、约0.05至约20μM、约0.1至约20μM、约0.5至约20μM、或约1至约20μM。在某些实施方案中，所施用的化合物D的配制品的量足以提供在约0.001至约500μM范围内的所述化合物的最大血浆浓度(峰值浓度)。在某些实施方案中，所施用的化合物D的配制品的量足以提供在约0.002至约200μM范围内的所述化合物的最大血浆浓度(峰值浓度)。在某些实施方案中，所施用的化合物D的配制品的量足以提供在约0.005至约100μM范围内的所述化合物的最大血浆浓度(峰值浓度)。在某些实施方案中，所施用的化合物D的配制品的量足以提供在约0.01至约50μM范围内的所述化合物的最大血浆浓度(峰值浓度)。在某些实施方案中，所施用的化合物D的配制品的量足以提供在约1至约50μM范围内的所述化合物的最大血浆浓度(峰值浓度)。在某些实施方案中，所施用的化合物D的配制品的量足以提供在约0.02至约25μM范围内的所述化合物的最大血浆浓度(峰值浓度)。在某些实施方案中，所施用的化合物D的配制品的量足以提供在约0.05至约20μM范围内的所述化合物的最大血浆浓度(峰值浓度)。在某些实施方案中，所施用的化合物D的配制品的量足以提供在约0.1至约20μM范围内的所述化合物的最大血浆浓度(峰值浓度)。在某些实施方案中，所施用的化合物D的配制品的量足以提供在约0.5至约20μM范围内的所述化合物的最大血浆浓度(峰值浓度)。在某些实施方案中，所施用的化合物D的配制品的量足以提供在约1至约20μM范围内的所述化合物的最大血浆浓度(峰值浓度)。
在某些实施方案中，所施用的化合物D的配制品的量足以提供如下范围内的所述化合物的最小血浆浓度(谷值浓度)：约0.001至约500μM、约0.002至约200μM、约0.005至约100μM、约0.01至约50μM、约1至约50μM、约0.01至约25μM、约0.01至约20μM、约0.02至约20μM、约0.02至约20μM、或约0.01至约20μM。在某些实施方案中，所施用的化合物D的配制品的量足以提供在约0.001至约500μM范围内的所述化合物的最小血浆浓度(谷值浓度)。在某些实施方案中，所施用的化合物D的配制品的量足以提供在约0.002至约200μM范围内的所述化合物的最小血浆浓度(谷值浓度)。在某些实施方案中，所施用的化合物D的配制品的量足以提供在约0.005至约100μM范围内的所述化合物的最小血浆浓度(谷值浓度)。在某些实施方案中，所施用的化合物D的配制品的量足以提供在约0.01至约50μM范围内的所述化合物的最小血浆浓度(谷值浓度)。在某些实施方案中，所施用的化合物D的配制品的量足以提供在约1至约50μM、约0.01至约25μM范围内的所述化合物的最小血浆浓度(谷值浓度)。在某些实施方案中，所施用的化合物D的配制品的量足以提供在约0.01至约20μM范围内的所述化合物的最小血浆浓度(谷值浓度)。在某些实施方案中，所施用的化合物D的配制品的量足以提供在约0.02至约20μM范围内的所述化合物的最小血浆浓度(谷值浓度)。在某些实施方案中，所施用的化合物D的配制品的量足以提供在约0.02至约20μM范围内的所述化合物的最小血浆浓度(谷值浓度)。在某些实施方案中，所施用的化合物D的配制品的量足以提供在约0.01至约20μM范围内的所述化合物的最小血浆浓度(谷值浓度)。
在某些实施方案中，所施用的化合物D的配制品的量足以提供如下范围内的所述化合物的曲线下面积(AUC)：约100至约100,000ng*hr/mL、约1,000至约50,000ng*hr/mL、约5,000至约25,000ng*hr/mL、或约5,000至约10,000ng*hr/mL。在某些实施方案中，所施用的化合物D的配制品的量足以提供在约100至约100,000ng*hr/mL范围内的所述化合物的曲线下面积(AUC)。在某些实施方案中，所施用的化合物D的配制品的量足以提供在约1,000至约50,000ng*hr/mL范围内的所述化合物的曲线下面积(AUC)。在某些实施方案中，所施用的化合物D的配制品的量足以提供在约5,000至约25,000ng*hr/mL范围内的所述化合物的曲线下面积(AUC)。在某些实施方案中，所施用的化合物D的配制品的量足以提供在约5,000至约10,000ng*hr/mL范围内的所述化合物的曲线下面积(AUC)。
在某些实施方案中，待用本文提供的方法之一治疗的患者在施用本文提供的化合物D的配制品之前未用抗癌疗法治疗过。在某些实施方案中，待用本文提供的方法之一治疗的患者在施用本文提供的化合物D的配制品之前已经用抗癌疗法治疗。在某些实施方案中，待用本文提供的方法之一治疗的患者已产生对所述抗癌疗法的耐药性。
本文提供的方法包括治疗患者，而不管患者的年龄如何，尽管一些疾病或障碍在特定年龄组中更为常见。
本文提供的化合物D的配制品可以作为单一剂量递送，例如像单次推注注射；或随时间递送，例如像随时间连续输注或随时间分次推注剂量。如果需要，可以重复施用化合物D的配制品，例如直到患者经历疾病稳定或消退为止，或直到患者经历疾病进展或不可接受的毒性为止。例如，对于实体瘤的疾病稳定通常意指可测量病灶的垂直直径与上次测量相比没有增加25％或更多。实体瘤疗效评价标准(RECIST)指南，Journal of the NationalCancer Institute 92(3):205-216(2000)。疾病稳定与否通过本领域已知的方法来确定，如患者症状的评价、体检、已使用X射线、CAT、PET或MRI扫描成像的肿瘤的可视化以及其他普遍接受的评价方式。
本文提供的化合物D的配制品可以如下施用：每日一次(QD)或分成多个每日剂量，如每日两次(BID)、每日三次(TID)和每日四次(QID)。另外，所述施用可以是连续的(即，连续几天每日施用或每天施用)、间歇的，例如以周期的形式(即，包括几天、几周或几个月的休药期)。如本文所用，术语“每日”旨在意示治疗性化合物每天施用一次或多于一次，例如持续一段时间。术语“连续”意指每日施用治疗性化合物，持续至少10天至52周的不间断时间段。如本文所用，术语“间歇的”或“间歇地”旨在意指以规则或不规则的间隔停止和开始。例如，化合物D的配制品的间歇施用是每周施用一至六天，以周期的形式施用(例如，28天周期的连续一至十天每日施用，然后28天周期的其余时间是没有施用的休药期；或连续二至八周每日施用，然后长达1周是没有施用的休药期)或隔日施用。使用化合物D的周期疗法在本文别处讨论。
在一些实施方案中，施用频率在约每日剂量至约每月剂量的范围内。在某些实施方案中，施用是每天一次、每天两次、每天三次、每天四次、每隔一天一次、每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次。在一个实施方案中，化合物D每天施用一次。在另一个实施方案中，化合物D每天施用两次。在又另一个实施方案中，本文提供的化合物D每天施用三次。在仍另一个实施方案中，本文提供的化合物D每天施用四次。在仍另一个实施方案中，本文提供的化合物D每隔一天施用一次。在仍另一个实施方案中，本文提供的化合物D每周施用两次。在仍另一个实施方案中，本文提供的化合物D每周施用一次。在仍另一个实施方案中，本文提供的化合物D每两周施用一次。在仍另一个实施方案中，本文提供的化合物D每三周施用一次。在仍另一个实施方案中，本文提供的化合物D每四周施用一次。
在某些实施方案中，本文提供的化合物D的配制品从一天至六个月、从一周至三个月、从一周至四周、从一周至三周或从一周至两周每天施用一次。在某些实施方案中，本文提供的化合物D的配制品每天施用一次，持续一周、两周、三周或四周。在一个实施方案中，本文提供的化合物D的配制品每天施用一次，持续1天。在一个实施方案中，本文提供的化合物D的配制品每天施用一次，持续2天。在一个实施方案中，本文提供的化合物D的配制品每天施用一次，持续3天。在一个实施方案中，本文提供的化合物D的配制品每天施用一次，持续4天。在一个实施方案中，本文提供的化合物D的配制品每天施用一次，持续5天。在一个实施方案中，本文提供的化合物D的配制品每天施用一次，持续6天。在一个实施方案中，本文提供的化合物D的配制品每天施用一次，持续一周。在一个实施方案中，本文提供的化合物D的配制品每天施用一次，持续长达10天。在另一个实施方案中，本文提供的化合物D的配制品每天施用一次，持续两周。在又另一个实施方案中，本文提供的化合物D的配制品每天施用一次，持续三周。在仍另一个实施方案中，本文提供的化合物D的配制品每天施用一次，持续四周。
组合疗法
在一个实施方案中，本文提供了一种治疗、预防和/或管理癌症的方法，所述方法包括向患者施用化合物D与选自以下的一种或多种第二药剂的组合：JAK抑制剂、FLT3抑制剂、mTOR抑制剂、剪接体抑制剂、BET抑制剂、SMG1抑制剂、ERK抑制剂、LSD1抑制剂、BH3模拟物、拓扑异构酶抑制剂和RTK抑制剂，以及任选与放射疗法、输血或手术的组合。本文公开了第二活性剂的例子。
在一个实施方案中，本文提供了一种治疗、预防和/或控制癌症的方法，所述方法包括向患者施用本文提供的化合物D的配制品与一种或多种第二活性剂的组合，以及任选与放射疗法、输血或手术的组合。本文公开了第二活性剂的例子。
如本文所用，术语“组合”包括使用多于一种疗法(例如，一种或多种预防剂和/或治疗剂)。然而，术语“组合”的使用不限制向患有疾病或障碍的患者施用疗法(例如，预防剂和/或治疗剂)的顺序。例如，“组合”可以包括作为混合物施用、使用单独的配制品同时施用以及以任何顺序连续施用。“连续”意指在活性剂的施用之间经过了特定时间。例如，“连续”可以是在施用单独的活性剂之间经过了多于10分钟。那么所述时间段可以是多于10分钟、多于30分钟、多于1小时、多于3小时、多于6小时或多于12小时。例如，可以在向受试者施用第二疗法(例如，预防剂或治疗剂)之前(例如，之前5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)、同时或之后(例如，之后5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)施用第一疗法(例如，预防剂或治疗剂，如本文提供的化合物D)。本文还考虑了三联疗法。
在一个实施方案中，将化合物D(包括本文提供的化合物D的配制品)和一种或多种第二活性剂施用至患者可以通过相同或不同的施用途径同时或依序发生。在一个实施方案中，将化合物D(包括本文提供的化合物D的配制品)和一种或多种第二活性剂施用至患者可以通过相同或不同的施用途径同时或依序发生。用于特定活性剂的特定施用途径的适合性将取决于活性剂本身(例如，其是否可以口服施用且在进入血流之前不分解)和所治疗的癌症。
包括本文提供的化合物D的配制品在内的化合物D的施用途径独立于第二疗法的施用途径。因此，在一个实施方案中，包括本文提供的化合物D的配制品在内的化合物D通过静脉内施用，并且第二疗法可以通过口服、肠胃外、腹膜内、静脉内、动脉内、透皮、舌下、肌内、直肠、经颊、鼻内、脂质体、经由吸入、阴道、眼内、经由通过导管或支架的局部递送、皮下、脂肪内、关节内、鞘内或缓释剂型施用。在一个实施方案中，包括本文提供的化合物D的配制品在内的化合物D和第二疗法通过相同的施用方式通过IV施用。在另一个实施方案中，包括本文提供的化合物D的配制品在内的化合物D通过一种施用方式例如通过IV来施用，而第二药剂(抗癌剂)通过另一种施用方式例如通过口服来施用。
在一个实施方案中，第二活性剂以从约1至约1000mg、从约5至约500mg、从约10至约350mg或从约50mg至约200mg的量每日一次或两次静脉内或皮下施用。第二活性剂的具体量将取决于所使用的特定药剂、正在治疗和/或控制的疾病的类型、疾病的严重程度和分期以及化合物D和同时施用至患者的任何任选的另外的活性剂的量。
一种或多种第二活性成分或药剂可以与化合物D一起用于本文提供的方法和组合物中。第二活性剂可以是大分子(例如，蛋白质)或小分子(例如，合成的无机、有机金属或有机分子)。
大分子活性剂的例子包括但不限于造血生长因子、细胞因子以及单克隆和多克隆抗体，特别是针对癌症抗原的治疗性抗体。典型的大分子活性剂是生物分子，如天然存在的或合成的或重组的蛋白质。在本文提供的方法和组合物中特别有用的蛋白质包括在体外或体内刺激造血前体细胞和免疫活性造血(poietic)细胞的存活和/或增殖的蛋白质。其他有用的蛋白质在体外或体内刺激细胞中定向红系祖细胞的分裂和分化。特定的蛋白质包括但不限于：白细胞介素，如IL-2(包括重组IL-II(“rIL2”)和金丝雀痘IL-2)、IL-10、IL-12和IL-18；干扰素，如干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-n1、干扰素α-n3、干扰素β-Ia和干扰素γ-Ib；GM-CF和GM-CSF；以及EPO。
在某些实施方案中，GM-CSF、G-CSF、SCF或EPO在四或六周的周期中在约五天期间以从约1至约750mg/m2/天、从约25至约500mg/m2/天、从约50至约250mg/m2/天或从约50至约200mg/m2/天范围内的量皮下施用。在某些实施方案中，GM-CSF可以以从约60至约500mcg/m2的量经2小时静脉内施用或以从约5至约12mcg/m2/天的量皮下施用。在某些实施方案中，G-CSF最初可以以约1mcg/kg/天的量皮下施用，并且可以根据总粒细胞计数的升高进行调整。G-CSF的维持剂量可以以约300mcg(在较小的患者中)或480mcg的量皮下施用。在某些实施方案中，EPO可以以10,000单位的量每周3次皮下施用。
可用于所述方法和组合物的特定蛋白质包括但不限于：非格司亭，其在美国以商品名
Figure BDA0003710765600000221
(Amgen，加利福尼亚州千橡市)出售；沙格司亭，在美国以商品名
Figure BDA0003710765600000222
(Immunex，华盛顿州西雅图)出售；以及重组EPO，其在美国以商品名
Figure BDA0003710765600000223
(Amgen，加利福尼亚州千橡市)出售。
GM-CSF的重组和突变形式可以如美国专利号5,391,485；5,393,870；和5,229,496中所述来制备；将所有这些专利都通过引用并入本文。G-CSF的重组和突变形式可以如美国专利号4,810,643；4,999,291；5,528,823；和5,580,755中所述来制备；将这些专利的整体都通过引用并入本文。
还提供了用于与包括化合物D的配制品在内的化合物D组合使用的天然的、天然存在的和重组的蛋白质。进一步涵盖了天然存在的蛋白质的突变体和衍生物(例如，经修饰的形式)，其在体内展现出其所基于的蛋白质的至少一些药理学活性。突变体的例子包括但不限于具有如下一个或多个氨基酸残基的蛋白质，所述一个或多个氨基酸残基不同于所述蛋白质的天然存在的形式中的相应残基。术语“突变体”还包括如下蛋白质，所述蛋白质缺乏通常以其天然存在的形式(例如，非糖基化形式)存在的碳水化合物部分。衍生物的例子包括但不限于聚乙二醇化衍生物和融合蛋白，如通过使IgG1或IgG3与目标蛋白质或目标蛋白质的活性部分融合形成的蛋白质。参见例如，Penichet,M.L.和Morrison,S.L.,J.Immunol.Methods 248:91-101(2001)。
可与包括本文提供的化合物D的配制品在内的化合物D组合使用的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。抗体的例子包括但不限于曲妥珠单抗
Figure BDA0003710765600000224
利妥昔单抗
Figure BDA0003710765600000225
贝伐单抗(AvastinTM)、帕妥珠单抗(OmnitargTM)、托西莫单抗
Figure BDA0003710765600000226
依决洛单抗
Figure BDA0003710765600000227
和G250。化合物D的配制品还可以与抗TNF-α抗体和/或抗EGFR抗体(例如像
Figure BDA0003710765600000228
或帕尼单抗)组合或组合使用。
大分子活性剂可以以抗癌疫苗的形式施用。例如，分泌或导致分泌细胞因子如IL-2、G-CSF和GM-CSF的疫苗可以用于所提供的方法和药物组合物中。参见例如，Emens,L.A.等人,Curr.Opinion Mol.Ther.3(1):77-84(2001)。
作为小分子的第二活性剂也可以用于减轻与施用本文提供的化合物D的配制品相关的副作用。然而，与一些大分子一样，许多小分子被认为在与包括本文提供的化合物D的配制品在内的化合物D一起(例如，之前、之后或同时)施用时能够提供协同作用。小分子第二活性剂的例子包括但不限于抗癌剂、抗生素、免疫抑制剂和类固醇。
在某些实施方案中，第二药剂是HSP抑制剂、蛋白酶体抑制剂、FLT3抑制剂或mTOR抑制剂。在一些实施方案中，mTOR抑制剂是mTOR激酶抑制剂。
在本文所述的方法或组合物中使用的抗癌剂的例子包括但不限于：阿西维辛；阿柔比星；盐酸阿考达唑；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；六甲蜜胺；安波霉素；醋酸阿美坦醌；安吖啶；阿那曲唑；蒽霉素；天冬酰胺酶；曲林菌素；阿扎胞苷；阿扎替派；含氮霉素；巴马司他；苯佐替派；比卡鲁胺；盐酸比生群；二甲磺酸双奈法德；比折来新；硫酸博来霉素；布喹那钠；溴匹立明；白消安；放线菌素；卡鲁睾酮；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡莫司汀；盐酸卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；塞来昔布(COX-2抑制剂)；苯丁酸氮芥；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；氯法拉滨；甲磺酸克立那托；环磷酰胺；阿糖胞苷；达卡巴嗪；更生霉素；盐酸道诺霉素；地西他滨；右奥马铂；地扎呱宁；甲磺酸地扎呱宁；地吖醌；多西紫杉醇；多柔比星；盐酸多柔比星；屈洛昔芬；柠檬酸屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；达佐霉素；依达曲沙；盐酸依氟鸟氨酸；依沙芦星；恩洛铂；恩普氨酯；依匹哌啶；盐酸表柔比星；厄布洛唑；盐酸依索比星；雌莫司汀；雌莫司汀磷酸钠；依他硝唑；依托泊苷；磷酸依托泊苷；埃托啉(etoprine)；盐酸法倔唑；法扎拉滨；芬维A胺；氟尿苷；磷酸氟达拉滨；氟尿嘧啶；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星钠；吉西他滨；盐酸吉西他滨；羟基脲；盐酸伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；异丙铂；伊立替康；盐酸伊立替康；醋酸兰瑞肽；来曲唑；醋酸亮丙瑞林；盐酸利阿唑；洛美曲索钠；洛莫司汀；盐酸洛索蒽醌；马索罗酚；美登素；盐酸氮芥；醋酸甲地孕酮；醋酸美仑孕酮；美法仑；美诺立尔；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；甲氨蝶呤钠；氯苯氨啶；美妥替哌；米丁度胺；米托卡星(mitocarcin)；丝裂红素；米托洁林；米托马星；丝裂霉素；米托司培；米托坦；盐酸米托蒽醌；霉酚酸；诺考达唑；诺加霉素；奥西他辛(omacetaxine)；奥马铂；奥昔舒仑；紫杉醇；培门冬酶；培利霉素；戊氮芥；硫酸培洛霉素；培磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；盐酸吡罗蒽醌；普卡霉素；普洛美坦；卟吩姆钠；紫菜霉素；泼尼莫司汀；盐酸丙卡巴肼；嘌呤霉素；盐酸嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素；利波腺苷；沙芬戈；盐酸沙芬戈；司莫司汀；辛曲秦；索拉非尼；磷乙酰天冬氨酸钠；司帕霉素；盐酸螺旋锗；螺莫司汀；螺铂；链黑菌素；链脲菌素；磺氯苯脲；他利霉素；替可加兰钠；泰素帝；替加氟；盐酸替洛蒽醌；替莫泊芬；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酯；硫咪嘌呤；硫鸟嘌呤；噻替哌；噻唑呋啉；替拉扎明；柠檬酸托瑞米芬；醋酸曲托龙；磷酸曲西立滨；三甲曲沙；葡糖醛酸三甲曲沙；曲普瑞林；盐酸妥布氯唑；乌拉莫司汀；乌瑞替派；伐普肽；维替泊芬；硫酸长春碱；硫酸长春新碱；长春地辛；硫酸长春地辛；硫酸长春匹定；硫酸长春甘酯；硫酸长春罗新；酒石酸长春瑞滨；硫酸长春罗定；硫酸长春利定；伏氯唑；折尼铂；净司他丁；和盐酸佐柔比星。
本文方法中包括的其他抗癌药物包括但不限于：20-epi-1,25二羟基维生素D3；5-乙炔尿嘧啶；阿比特龙；阿柔比星；酰基富烯；腺环戊醇；阿多来新；阿地白介素；ALL-TK拮抗剂；六甲蜜胺；氨莫司汀；amidox；氨磷汀；氨基乙酰丙酸；氨柔比星；安吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；穿心莲内酯；血管生成抑制剂；拮抗剂D；拮抗剂G；antarelix；抗背部化形成蛋白-1；抗雄激素，前列腺癌；抗雌激素；抗肿瘤物质；反义寡核苷酸；甘氨酸阿非迪霉素；凋亡基因调节剂；凋亡调节物；脱嘌呤酸；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶；asulacrine；阿他美坦；阿莫司汀；阿司他汀(axinastatin)1；阿司他汀2；阿司他汀3；阿扎西隆；阿扎毒素；重氮酪氨酸；浆果赤霉素III衍生物；巴览醇；巴马司他；BCR/ABL拮抗剂；苯并二氢卟吩(benzochlorin)；苯甲酰基星形孢菌素；β内酰胺衍生物；β-丙酰胺(beta-alethine)；β克拉霉素B；白桦脂酸；bFGF抑制剂；比卡鲁胺；比生群；双吖丙啶基精胺；双萘法德；bistrateneA；比折来新；breflate；溴匹立明；布多替钛；丁硫氨酸亚砜亚胺；卡泊三醇；钙磷酸蛋白C；喜树碱衍生物；卡培他滨；甲酰胺-氨基-三唑；羧基氨基三唑；CaRest M3；CARN 700；软骨源抑制剂；卡折来新；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；栗精胺；天蚕素B；西曲瑞克；绿素类(chlorlns)；氯代喹喔啉磺胺；西卡前列素；顺式卟啉；克拉屈滨；氯米芬类似物；克霉唑；克里霉素(collismycin)A；克里霉素B；康普立停A4；康普立停类似物；conagenin；crambescidin 816；克立那托；念珠藻素8；念珠藻素A衍生物；curacin A；环戊蒽醌；环铂；赛普霉素(cypemycin)；阿糖胞苷烷磷脂(Ara-C ocfosfate)；溶细胞因子；细胞抑制素(cytostatin)；达昔单抗；地西他滨；脱氢膜海鞘素B；德舍瑞林；地塞米松；右异环磷酰胺；右雷佐生；右维拉帕米；地吖醌；膜海鞘素B；didox；二乙基降精胺；二氢-5-氮杂胞苷；二氢紫杉醇，9-；二噁霉素；二苯基螺莫司汀；多西紫杉醇；二十二烷醇；多拉司琼；去氧氟尿苷；多柔比星；屈洛昔芬；屈大麻酚；倍癌霉素SA；依布硒啉；依考莫司汀；依地福辛；依决洛单抗；依氟鸟氨酸；榄香烯；乙嘧替氟；表柔比星；依立雄胺；雌莫司汀类似物；雌性激素激动剂；雌性激素拮抗剂；依他硝唑；磷酸依托泊苷；依西美坦；法倔唑；法扎拉滨；芬维A胺；非格司亭；非那雄胺；黄酮吡醇(flavopiridol)；氟卓斯汀；fluasterone；氟达拉滨；盐酸氟道诺霉素；福酚美克；福美司坦；福司曲星；福莫司汀；特沙弗林钆(gadolinium texaphyrin)；硝酸镓；加洛他滨；加尼瑞克；白明胶酶抑制剂；吉西他滨；谷胱甘肽抑制剂；hepsulfam；神经调节蛋白(heregulin)；六亚甲基双乙酰胺；金丝桃素；伊班膦酸；伊达比星；艾多昔芬；伊决孟酮；伊莫福新；伊洛马司他；伊马替尼(例如，
Figure BDA0003710765600000241
)；咪喹莫特；免疫刺激肽；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；白细胞介素；碘苄胍；碘多柔比星；甘薯苦醇，4-；伊罗普拉；伊索拉定；异苯唑(isobengazole)；isohomohalicondrin B；伊他司琼；jasplakinolide；kahalalide F；片螺素-N三乙酸酯；兰瑞肽；莱那霉素；来格司亭；硫酸香菇多糖；leptolstatin；来曲唑；白血病抑制因子；白细胞α干扰素；亮丙瑞林+雌性激素+孕酮；亮丙瑞林；左旋咪唑；利阿唑；线性多胺类似物；亲脂性二糖肽；亲脂性铂化合物；lissoclinamide 7；洛铂；蚯蚓磷脂；洛美曲索；氯尼达明；洛索蒽醌；洛索立滨；勒托替康；特沙弗林镥；利索茶碱(lysofylline)；裂解肽；美坦新；mannostatin A；马立马司他；马索罗酚；乳腺丝抑蛋白(maspin)；基质溶解因子抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；美诺立尔；美巴龙(merbarone)；美替瑞林；蛋氨酸酶；胃复安；MIF抑制剂；米非司酮；米替福新；米立司亭；米托胍腙；二溴卫矛醇；丝裂霉素类似物；米托萘胺；mitotoxin成纤维细胞生长因子-皂草素；米托蒽醌；莫法罗汀；莫格莫司亭(molgramostim)；爱必妥，人绒毛膜促性腺激素；单磷酰脂A+分枝杆菌细胞壁sk；莫哌达醇；芥末抗癌剂；mycaperoxide B；分枝杆菌细胞壁提取物；myriaporone；N-acetyldinaline；N-取代的苯甲酰胺；那法瑞林；nagrestip；纳洛酮+镇痛新；纳帕维(napavin)；naphterpin；那托司亭；奈达铂；奈莫柔比星；奈立膦酸；尼鲁米特；尼沙霉素(nisamycin)；一氧化氮调节剂；氮氧化物抗氧化剂；nitrullyn；奥利莫森
Figure BDA0003710765600000242
O6-苄基鸟嘌呤；奥曲肽；okicenone；寡核苷酸；奥那司酮；昂丹司琼；昂丹司琼；oracin；口服细胞因子诱导剂；奥马铂；奥沙特隆；奥沙利铂；oxaunomycin；紫杉醇；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；帕劳胺；棕榈酰根霉素；帕米膦酸；人参三醇；帕诺米芬；副球菌素(parabactin)；帕折普汀；培门冬酶；培得星(peldesine)；戊聚糖多硫酸钠；喷司他丁；pentrozole；全氟溴烷；培磷酰胺；紫苏醇；吩嗪霉素；乙酸苯酯；磷酸酶抑制剂；毕西巴尼；盐酸毛果芸香碱；吡柔比星；吡曲克辛；胎盘素A；胎盘素B；纤溶酶原激活物抑制剂；铂复合物；铂化合物；铂-三胺复合物；卟吩姆钠；紫菜霉素；泼尼松；丙基双吖啶酮；前列腺素J2；蛋白酶体抑制剂；基于蛋白A的免疫调节剂；蛋白激酶C抑制剂；蛋白激酶C抑制剂，微藻；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；红紫素；吡唑并吖啶；吡氧基化血红蛋白聚氧乙烯缀合物；raf拮抗剂；雷替曲塞；雷莫司琼；ras法呢基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；脱甲基化瑞替普汀；依替膦酸铼Re 186；根霉素；核糖酶；RII维甲酰酚胺；罗希吐碱；罗莫肽；罗喹美克；rubiginone B1；ruboxyl；沙芬戈；saintopin；SarCNU；肌肉叶绿醇A；沙格司亭；Sdi 1模拟物；司莫司汀；衰老衍生抑制剂1；有义寡核苷酸；信号转导抑制剂；西佐喃；索布唑烷；硼卡钠；苯乙酸钠；索尔醇(solverol)；生长调节素结合蛋白；索纳明；斯帕磷酸；穗霉素D；螺莫司汀；脾脏五肽；海绵抑制素1；角鲨胺；stipiamide；溶基质素抑制剂；sulfinosine；强效血管活性肠肽拮抗剂；suradista；苏拉明；苦马豆素；塔利莫司汀(tallimustine)；他莫昔芬甲碘化物；牛磺莫司汀；他扎罗汀；替可加兰钠；替加氟；tellurapyrylium；端粒酶抑制剂；替莫泊芬；替尼泊苷；四氯十氧化物；tetrazomine；菌体胚素(thaliblastine)；噻可拉林(thiocoraline)；促血小板生成素；促血小板生成素模拟物；胸腺法新；促胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南；促甲状腺激素；乙基初卟啉锡；替拉扎明；环戊二烯钛二氯化物；topsentin；托瑞米芬；翻译抑制剂；维甲酸；三乙酰尿苷；曲西立滨；三甲曲沙；曲普瑞林；托烷司琼；妥罗雄脲；酪氨酸激酶抑制剂；tyrphostin；UBC抑制剂；乌苯美司；泌尿生殖窦源性生长抑制因子；尿激酶受体拮抗剂；伐普肽；variolin B；维拉雷琐；藜芦明；维尔丁；维替泊芬；长春瑞滨；长春磷汀(vinxaltine)；vitaxin；伏氯唑；扎诺特隆；折尼铂；亚苄维C；以及净司他丁斯酯。
在某些实施方案中，第二药剂选自一种或多种检查点抑制剂。在一个实施方案中，一种检查点抑制剂与化合物D或化合物D的配制品在本文提供的方法中组合使用。在另一个实施方案中，结合本文提供的方法，两种检查点抑制剂与化合物D或化合物D的配制品组合使用。在又另一个实施方案中，结合本文提供的方法，三种或更多种检查点抑制剂与化合物D或化合物D的配制品组合使用。
如本文所用，术语“免疫检查点抑制剂”或“检查点抑制剂”是指完全或部分降低、抑制、干扰或调节一种或多种检查点蛋白的分子。不受特定理论限制，检查点蛋白调节T细胞激活或功能。许多检查点蛋白是已知的，如CTLA-4及其配体CD80和CD86；和PD-1与其配体PD-L1和PD-L2(Pardoll,Nature Reviews Cancer,2012,12,252-264)。这些蛋白质显现出负责T细胞应答的共刺激或抑制性相互作用。免疫检查点蛋白显现出调节和维持自身耐受性和生理免疫应答的持续时间和幅度。免疫检查点抑制剂包括抗体或源自抗体。
在一个实施方案中，检查点抑制剂是CTLA-4抑制剂。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂是抗CTLA-4抗体。抗CTLA-4抗体的例子包括但不限于美国专利号：5,811,097；5,811,097；5,855,887；6,051,227；6,207,157；6,682,736；6,984,720；和7,605,238中描述的那些，将所有这些专利以其整体并入本文。在一个实施方案中，抗CTLA-4抗体是曲美木单抗(也称为替西木单抗或CP-675,206)。在另一个实施方案中，抗CTLA-4抗体是伊匹单抗(也称为MDX-010或MDX-101)。伊匹单抗是与CTLA-4结合的全人源单克隆IgG抗体。伊匹单抗以商品名YervoyTM销售。
在一个实施方案中，检查点抑制剂是PD-1/PD-L1抑制剂。PD-1/PD-L1抑制剂的例子包括但不限于美国专利号7,488,802、7,943,743、8,008,449、8,168,757、8,217,149以及PCT专利申请公开号WO 2003042402、WO 2008156712、WO 2010089411、WO2010036959、WO2011066342、WO 2011159877、WO 2011082400和WO 2011161699中描述的那些，将所有这些专利和申请以其整体并入本文。
在一个实施方案中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在一个实施方案中，PD-1抑制剂是抗PD-1抗体。在一个实施方案中，抗PD-1抗体是BGB-A317、纳武单抗(也称为ONO-4538、BMS-936558或MDX1106)或派姆单抗(也称为MK-3475、SCH 900475或兰博利珠单抗)。在一个实施方案中，抗PD-1抗体是纳武单抗。纳武单抗是人IgG4抗PD-1单克隆抗体，并且以商品名OpdivoTM销售。在另一个实施方案中，抗PD-1抗体是派姆单抗。派姆单抗是人源化单克隆IgG4抗体，并且以商品名KeytrudaTM销售。在又另一个实施方案中，抗PD-1抗体是人源化抗体CT-011。单独施用的CT-011在治疗复发时的急性骨髓性白血病(AML)中未能显示出响应。在又另一个实施方案中，抗PD-1抗体是融合蛋白AMP-224。在另一个实施方案中，PD-1抗体是BGB-A317。BGB-A317是单克隆抗体，其中结合Fcγ受体I的能力是经过专门设计的，并且其因高亲和力和优越的靶标特异性而具有对PD-1的独特结合特征。
在一个实施方案中，检查点抑制剂是PD-L1抑制剂。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂是抗PD-L1抗体。在一个实施方案中，抗PD-L1抗体是MEDI4736(度伐单抗)。在另一个实施方案中，抗PD-L1抗体是BMS-936559(也称为MDX-1105-01)。在又另一个实施方案中，PD-L1抑制剂是阿特珠单抗(也称为MPDL3280A和
Figure BDA0003710765600000261
)。
在一个实施方案中，检查点抑制剂是PD-L2抑制剂。在一个实施方案中，PD-L2抑制剂是抗PD-L2抗体。在一个实施方案中，抗PD-L2抗体是rHIgM12B7A。
在一个实施方案中，检查点抑制剂是淋巴细胞激活基因-3(LAG-3)抑制剂。在一个实施方案中，LAG-3抑制剂是可溶性Ig融合蛋白IMP321(Brignone等人,J.Immunol.,2007,179,4202-4211)。在另一个实施方案中，LAG-3抑制剂是BMS-986016。
在一个实施方案中，检查点抑制剂是B7抑制剂。在一个实施方案中，B7抑制剂是B7-H3抑制剂或B7-H4抑制剂。在一个实施方案中，B7-H3抑制剂是抗B7-H3抗体MGA271(Loo等人,Clin.Cancer Res.,2012,3834)。
在一个实施方案中，检查点抑制剂是TIM3(T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3)抑制剂(Fourcade等人,J.Exp.Med.,2010,207,2175-86；Sakuishi等人,J.Exp.Med.,2010,207,2187-94)。
在一个实施方案中，检查点抑制剂是OX40(CD134)激动剂。在一个实施方案中，检查点抑制剂是抗OX40抗体。在一个实施方案中，抗OX40抗体是抗OX-40。在另一个实施方案中，抗OX40抗体是MEDI6469。
在一个实施方案中，检查点抑制剂是GITR激动剂。在一个实施方案中，检查点抑制剂是抗GITR抗体。在一个实施方案中，抗GITR抗体是TRX518。
在一个实施方案中，检查点抑制剂是CD137激动剂。在一个实施方案中，检查点抑制剂是抗CD137抗体。在一个实施方案中，抗CD137抗体是乌瑞鲁单抗。在另一个实施方案中，抗CD137抗体是PF-05082566。
在一个实施方案中，检查点抑制剂是CD40激动剂。在一个实施方案中，检查点抑制剂是抗CD40抗体。在一个实施方案中，抗CD40抗体是CF-870,893。
在一个实施方案中，检查点抑制剂是重组人白细胞介素-15(rhIL-15)。
在一个实施方案中，检查点抑制剂是IDO抑制剂。在一个实施方案中，IDO抑制剂是INCB024360。在另一个实施方案中，IDO抑制剂是吲哚莫德。
在某些实施方案中，本文提供的组合疗法包括本文所述的两种或更多种检查点抑制剂(包括相同或不同类别的检查点抑制剂)。此外，在适当的情况下，本文所述的组合疗法可以与本文所述的第二活性剂组合使用，以用于治疗本文所述和本领域中理解的疾病。
在某些实施方案中，化合物D可以与在其表面上表达一种或多种嵌合抗原受体(CAR)的一种或多种免疫细胞(例如，经修饰的免疫细胞)组合使用。通常，CAR包含来自第一蛋白质(例如，抗原结合蛋白)的细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在某些实施方案中，一旦细胞外结构域与靶蛋白如肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)结合，就会经由细胞内信号传导结构域产生信号，从而激活免疫细胞例如以靶向并杀伤表达所述靶蛋白的细胞。
细胞外结构域：CAR的细胞外结构域与目标抗原结合。在某些实施方案中，CAR的细胞外结构域包含与所述抗原结合的受体或受体的一部分。在某些实施方案中，细胞外结构域包含或者是抗体或其抗原结合部分。在具体实施方案中，细胞外结构域包含或者是单链Fv(scFv)结构域。单链Fv结构域可以包含例如通过柔性接头与VH连接的VL，其中所述VL和VH来自结合所述抗原的抗体。
在某些实施方案中，由本文所述多肽的细胞外结构域识别的抗原是肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)。在各种具体实施方案中，肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原是但不限于Her2、前列腺干细胞抗原(PSCA)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原-125(CA-125)、CA19-9、钙网膜蛋白、MUC-1、B细胞成熟抗原(BCMA)、上皮膜蛋白(EMA)、上皮肿瘤抗原(ETA)、酪氨酸酶、黑色素瘤-24相关抗原(MAGE)、CD19、CD22、CD27、CD30、CD34、CD45、CD70、CD99、CD117、EGFRvIII(表皮生长因子变体III)、间皮素、PAP(前列腺酸性磷酸酶)、前列腺特异性蛋白(prostein)、TARP(T细胞受体γ交替读框蛋白)、Trp-p8、STEAPI(前列腺六跨膜上皮抗原1)、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、肌间线蛋白、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、巨大囊肿病液体蛋白(GCDFP-15)、HMB-45抗原、蛋白质melan-A(由T淋巴细胞识别的黑色素瘤抗原；MART-I)、myo-D1、肌肉特异性肌动蛋白(MSA)、神经丝、神经元特异性烯醇酶(NSE)、胎盘碱性磷酸酶、突触体素(synaptophysis)、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1、二聚体形式的丙酮酸激酶同工酶M2型(肿瘤M2-PK)、异常ras蛋白或异常p53蛋白。在某些其他实施方案中，由CAR的细胞外结构域识别的TAA或TSA是整联蛋白αvβ3(CD61)、泌乳激素或Ral-B。
在某些实施方案中，由CAR的细胞外结构域识别的TAA或TSA是癌症/睾丸(CT)抗原，例如BAGE、CAGE、CTAGE、FATE、GAGE、HCA661、HOM-TES-85、MAGEA、MAGEB、MAGEC、NA88、NY-ES0-1、NY-SAR-35、OY-TES-1、SPANXBI、SPA17、SSX、SYCPI或TPTE。
在某些其他实施方案中，由CAR的细胞外结构域识别的TAA或TSA是碳水化合物或神经节苷脂，例如fuc-GMI、GM2(癌胚抗原-免疫原性-1；OFA-I-1)；GD2(OFA-I-2)、GM3、GD3等。
在某些其他实施方案中，由CAR的细胞外结构域识别的TAA或TSA是α-肌动蛋白-4，Bage-1，BCR-ABL，Bcr-Abl融合蛋白，β-连环蛋白，CA 125，CA 15-3(CA 27.29\BCAA)，CA195，CA 242，CA-50，CAM43，Casp-8，cdc27，cdk4，cdkn2a，CEA，coa-1，dek-can融合蛋白，EBNA，EF2，爱泼斯坦巴尔病毒抗原，ETV6-AML1融合蛋白，HLA-A2，HLA-All，hsp70-2，KIAA0205，Mart2，Mum-1，2和3，neo-PAP，肌球蛋白I类，OS-9，pml-RARα融合蛋白，PTPRK，K-ras，N-ras，磷酸丙糖异构酶，Gage3、4、5、6、7，GnTV，Herv-K-mel，Lage-1，NA-88，NY-Eso-1/Lage-2，SP17，SSX-2，TRP2-Int2，gp100(Pmel17)，酪氨酸酶，TRP-1，TRP-2，MAGE-1，MAGE-3，RAGE，GAGE-1，GAGE-2，p15(58)，RAGE，SCP-1，Hom/Mel-40，PRAME，p53，HRas，HER-2/neu，E2A-PRL，H4-RET，IGH-IGK，MYL-RAR，人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7，TSP-180，MAGE-4，MAGE-5，MAGE-6，p185erbB2，p180erbB-3，c-met，nm-23H1，PSA，TAG-72-4，CA 19-9，CA 72-4，CAM 17.1，NuMa，K-ras，13-连环蛋白，Mum-1，p16，TAGE，PSMA，CT7，端粒酶，43-9F，5T4，791Tgp72，13HCG，BCA225，BTAA，CD68\KP1，C0-029，FGF-5，G250，Ga733(EpCAM)，HTgp-175，M344，MA-50，MG7-Ag，MOV18，NB\70K，NY-C0-1，RCAS1，SDCCAG16，TA-90，TAAL6，TAG72，TLP或TPS。
在各种具体实施方案中，肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原是AML相关肿瘤抗原，如S.Anguille等人,Leukemia(2012),26,2186-2196中所述。
其他肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原是本领域技术人员已知的。
受体、抗体以及可用于构建嵌合抗原受体的与TSA和TAA结合的scFv在本领域中是已知的，编码它们的核苷酸序列也是如此。
在某些具体实施方案中，由嵌合抗原受体的细胞外结构域识别的抗原是如下抗原，其通常不被认为是TSA或TAA但仍与肿瘤细胞或由肿瘤引起的损伤相关。在某些实施方案中，例如抗原是例如生长因子、细胞因子或白细胞介素，例如与血管生成或血管发生相关的生长因子、细胞因子或白细胞介素。此类生长因子、细胞因子或白细胞介素可以包括例如血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)或白细胞介素8(IL-8)。肿瘤还可以在肿瘤局部产生低氧环境。因此，在其他具体实施方案中，抗原是低氧相关因子，例如HIF-1α、HIF-1β、HIF-2α、HIF-2β、HIF-3α或HIF-3β。肿瘤还可以对正常组织造成局部损伤，导致释放称为损伤相关分子模式分子(DAMP；也称为警报素)的分子。因此，在某些其他具体实施方案中，抗原是DAMP，例如热休克蛋白、染色质相关蛋白高迁移率族蛋白1(HMGB 1)、S100A8(MRP8、钙粒蛋白A)、S100A9(MRP14、钙粒蛋白B)、血清淀粉样蛋白A(SAA)，或者可以是脱氧核糖核酸、三磷酸腺苷、尿酸或硫酸肝素。
跨膜结构域：在某些实施方案中，通过接头、间隔子或铰链多肽序列，例如来自CD28的序列或来自CTLA4的序列，将CAR的细胞外结构域与多肽的跨膜结构域连接。所述跨膜结构域可以获得自或源自任何跨膜蛋白的跨膜结构域，并且可以包括这种跨膜结构域的全部或一部分。在具体实施方案中，所述跨膜结构域可以获得自或源自例如CD8、CD16、细胞因子受体和白细胞介素受体或生长因子受体等。
细胞内信号传导结构域：在某些实施方案中，CAR的细胞内结构域是或包括在T细胞表面表达并触发所述T细胞的激活和/或增殖的蛋白质的细胞内结构域或基序。这种结构域或基序能够传输初级抗原结合信号，其是对于响应于抗原与CAR的细胞外部分的结合而激活T淋巴细胞所必需的。通常，结构域或基序包括或是ITAM(免疫受体酪氨酸激活基序)。适合于CAR的含ITAM的多肽包括例如ζCD3链(CD3ζ)或其含ITAM的部分。在具体实施方案中，细胞内结构域是CD3ζ细胞内信号传导结构域。在其他具体实施方案中，细胞内结构域来自淋巴细胞受体链、TCR/CD3复合蛋白、Fe受体亚基或IL-2受体亚基。在某些实施方案中，CAR还包含一个或多个共刺激结构域或基序，例如作为所述多肽的细胞内结构域的一部分。所述一个或多个共刺激结构域或基序可以是或可以包含共刺激CD27多肽序列、共刺激CD28多肽序列、共刺激OX40(CD134)多肽序列、共刺激4-1BB(CD137)多肽序列或共刺激诱导性T细胞共刺激(ICOS)多肽序列或其他共刺激结构域或基序中的一个或多个或其任何组合。
CAR还可以包含T细胞存活基序。T细胞存活基序可以是促进抗原刺激后T淋巴细胞的存活的任何多肽序列或基序。在某些实施方案中，T细胞存活基序是或源自CD3、CD28、IL-7受体(IL-7R)的细胞内信号传导结构域、IL-12受体的细胞内信号传导结构域、IL-15受体的细胞内信号传导结构域、IL-21受体的细胞内信号传导结构域或转化生长因子β(TGFβ)受体的细胞内信号传导结构域。
表达CAR的经修饰的免疫细胞可以是例如T淋巴细胞(T细胞，例如CD4+T细胞或CD8+T细胞)、细胞毒性淋巴细胞(CTL)或天然杀伤(NK)细胞。本文提供的组合物和方法中使用的T淋巴细胞可以是幼稚T淋巴细胞或MHC限制性T淋巴细胞。在某些实施方案中，T淋巴细胞是肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在某些实施方案中，T淋巴细胞已从肿瘤活检分离，或已从分离自肿瘤活检的T淋巴细胞扩增。在某些其他实施方案中，T细胞已从分离自外周血、脐带血或淋巴的T淋巴细胞分离或扩增。用于产生表达CAR的经修饰的免疫细胞的免疫细胞可以使用本领域公认的常规方法进行分离，例如血液采集，接着进行单采术和任选的抗体介导的细胞分离或分选。
经修饰的免疫细胞优选地对于待施用经修饰的免疫细胞的个体是自体的。在某些其他实施方案中，经修饰的免疫细胞对于待施用经修饰的免疫细胞的个体是同种异体的。在使用同种异体T淋巴细胞或NK细胞制备经修饰的T淋巴细胞时，优选选择降低在个体中发生移植物抗宿主病(GVHD)的可能性的T淋巴细胞或NK细胞。例如，在某些实施方案中，选择病毒特异性T淋巴细胞来制备经修饰的T淋巴细胞；预计此类淋巴细胞与任何接受者抗原结合并因此被其激活的天然能力将大大降低。在某些实施方案中，接受者介导的对同种异体T淋巴细胞的排斥可以通过向宿主共同施用一种或多种免疫抑制剂(例如，环孢菌素、他克莫司、西罗莫司、环磷酰胺等)来减少。
T淋巴细胞(例如未修饰的T淋巴细胞)或者表达CD3和CD28或包含含有CD3ζ信号传导结构域和CD28共刺激结构域的多肽的T淋巴细胞可以使用针对CD3和CD28的抗体(例如附接至珠粒的抗体)来扩增；参见例如，美国专利号5,948,893；6,534,055；6,352,694；6,692,964；6,887,466；6,905,681。
经修饰的免疫细胞(例如经修饰的T淋巴细胞)可以任选地包含“自杀基因”或“安全开关”，当需要时，其能够杀死基本上所有经修饰的免疫细胞。例如，在某些实施方案中，经修饰的T淋巴细胞可以包含HSV胸苷激酶基因(HSV-TK)，其导致经修饰的T淋巴细胞在与更昔洛韦接触时死亡。在另一个实施方案中，经修饰的T淋巴细胞包含诱导性胱天蛋白酶，例如诱导性胱天蛋白酶9(icaspase9)，例如在胱天蛋白酶9与人FK506结合蛋白之间的融合蛋白，以允许使用特异性小分子药物进行二聚化。参见Straathof等人,Blood 105(11):4247-4254(2005)。
可用于所述方法或组合物的具体第二活性剂包括但不限于利妥昔单抗、奥利莫森
Figure BDA0003710765600000291
类克(remicade)、多西紫杉醇、塞来昔布、美法仑、地塞米松
Figure BDA0003710765600000292
类固醇、吉西他滨、顺铂、替莫唑胺、依托泊苷、环磷酰胺、特莫达(temodar)、卡铂、丙卡巴肼、格立得(gliadel)、他莫昔芬、拓扑替康、甲氨蝶呤、
Figure BDA0003710765600000293
泰素、泰素帝、氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸、伊立替康、希罗达(xeloda)、干扰素α、聚乙二醇化干扰素α(例如，PEG INTRON-A)、卡培他滨、顺铂(cisplatin)、噻替哌、氟达拉滨、卡铂、脂质体道诺霉素、阿糖胞苷、多西紫杉醇(doxetaxol)、紫杉醇、长春碱、IL-2、GM-CSF、达卡巴嗪、长春瑞滨、唑来膦酸、棕榈酸酯(palmitronate)、克拉霉素(biaxin)、白消安、泼尼松、二膦酸盐、三氧化二砷、长春新碱、多柔比星
Figure BDA0003710765600000294
紫杉醇、更昔洛韦、阿霉素、雌莫司汀磷酸钠
Figure BDA0003710765600000295
舒林酸和依托泊苷。
在本文提供的方法的某些实施方案中，与化合物D(包括本文提供的化合物D的配制品)组合的第二活性剂的使用可以在化合物D(包括本文提供的化合物D的配制品)的施用期间或之后不久改变或延迟，如本领域技术人员认为合适的。在某些实施方案中，单独或与其他疗法组合施用化合物D(包括本文提供的化合物D的配制品)的受试者可以在适当时接受支持性护理，包括止吐剂、骨髓生长因子和血小板输注。在一些实施方案中，根据本领域技术人员的判断，施用化合物D(包括本文提供的化合物D的配制品)的受试者可以被施用作为第二活性剂的生长因子。在一些实施方案中，提供了化合物D(包括本文提供的化合物D的配制品)与促红细胞生成素或达贝泊汀(Aranesp)的组合施用。
在一个方面，本文提供了一种治疗、预防、管理和/或改善局部晚期或转移性移行性细胞膀胱癌的方法，所述方法包括施用化合物D的配制品与吉西他滨、顺铂、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素、甲氨蝶呤、长春碱、多柔比星、卡铂、噻替哌、紫杉醇、多西紫杉醇、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、可瑞达(派姆单抗)和/或纳武单抗。
在一个方面，本文提供的治疗、预防、管理和/或改善癌症的方法包括向患者施用化合物D的配制品与如下第二活性成分的组合：对于患有复发性或进行性脑肿瘤或复发性神经母细胞瘤的儿科患者，替莫唑胺；对于复发性或进行性CNS癌症，塞来昔布、依托泊苷和环磷酰胺；对于患有复发性或进行性脑膜瘤、恶性脑膜瘤、血管外皮细胞瘤、多发性脑转移瘤、复发性脑瘤或新诊断的多形性胶质母细胞瘤，替莫唑胺；对于患有复发性胶质母细胞瘤的患者，伊立替康；对于患有脑干胶质瘤的儿科患者，卡铂；对于患有进行性恶性胶质瘤的儿科患者，丙卡巴肼；对于患有预后不良的恶性脑肿瘤、新诊断或复发性多形性胶质母细胞瘤的患者，环磷酰胺；对于高级别复发性恶性胶质瘤，
Figure BDA0003710765600000296
对于间变性星形细胞瘤，替莫唑胺和他莫昔芬；或对于胶质瘤、胶质母细胞瘤、间变性星形细胞瘤或间变性少突胶质细胞瘤，拓扑替康。
在一个方面，本文提供的治疗、预防、管理和/或改善转移性乳腺癌的方法包括向患有转移性乳腺癌的患者施用化合物D的配制品与甲氨蝶呤、环磷酰胺、卡培他滨、5-氟尿嘧啶、紫杉烷、替西罗莫司、
Figure BDA0003710765600000297
(用于可注射混悬液的紫杉醇蛋白结合的粒子)(白蛋白结合的)、拉帕替尼、赫赛汀、帕米膦酸二钠、甲磺酸艾日布林、依维莫司、吉西他滨、帕博西尼、伊沙匹隆、赫赛莱、帕妥珠单抗、噻替哌(theotepa)、阿那曲唑、多西紫杉醇、盐酸多柔比星、盐酸表柔比星、托瑞米芬、氟维司群、醋酸戈舍瑞林、瑞博西尼、醋酸甲地孕酮、长春碱、芳香化酶抑制剂(如来曲唑、依西美坦)、选择性雌激素调节剂、雌激素受体拮抗剂、蒽环类、美坦辛和/或培西达替尼。
在一个方面，本文提供的治疗、预防、管理和/或改善神经内分泌肿瘤的方法包括向患有神经内分泌肿瘤的患者施用化合物D的配制品与以下中的至少一种：依维莫司、阿维鲁单抗、舒尼替尼、多吉美、甲酰四氢叶酸、奥沙利铂、替莫唑胺、卡培他滨、贝伐单抗、多柔比星(阿霉素)、氟尿嘧啶(Adrucil、5-氟尿嘧啶)、链脲菌素(Zanosar)、达卡巴嗪、善宁、兰瑞肽和/或帕瑞肽。
在一个方面，本文提供的治疗、预防、管理和/或改善转移性乳腺癌的方法包括向患有复发性或转移性头癌或颈癌的患者施用化合物D的配制品与甲氨蝶呤、吉西他滨、顺铂、西妥昔单抗、5-氟尿嘧啶、博来霉素、多西紫杉醇、卡铂、羟基脲、派姆单抗和/或纳武单抗。
在一个方面，本文提供的治疗、预防、控制和/或改善胰腺癌的方法包括向患有胰腺癌的患者施用化合物D的配制品与吉西他滨、
Figure BDA0003710765600000301
5-氟尿嘧啶、依维莫司、伊立替康、丝裂霉素C、舒尼替尼、苹果酸舒尼替尼和/或特罗凯。
在一个方面，本文提供的治疗、预防、管理和/或改善结肠癌或直肠癌的方法包括施用化合物D的配制品与
Figure BDA0003710765600000302
安维汀(avastatin)、奥沙利铂、5-氟尿嘧啶、伊立替康、卡培他滨、西妥昔单抗、雷莫芦单抗、帕尼单抗、贝伐单抗、甲酰四氢叶酸钙、朗斯弗(lonsurf)、瑞戈非尼、ziv-阿柏西普、泰素和/或泰素帝。
在一个方面，本文提供的治疗、预防、管理和/或改善难治性结直肠癌的方法包括向患有难治性结直肠癌的患者或在结肠腺癌或直肠腺癌中第一线疗法失败或表现不佳的患者施用化合物D的配制品与卡培他滨和/或维罗非尼。
在一个方面，本文提供的治疗、预防、管理和/或改善结直肠癌的方法包括向患有结直肠癌(包括3期和4期)的患者或先前已针对转移性结直肠癌治疗过的患者施用化合物D的配制品与氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸和/或伊立替康。
在某些实施方案中，将本文提供的化合物D的配制品与卡培他滨、希罗达和/或伊立替康组合施用至患有难治性结直肠癌的患者。
在某些实施方案中，将本文提供的化合物D的配制品与卡培他滨和伊立替康一起施用至患有难治性结直肠癌的患者或患有不可切除或转移性结直肠癌的患者。
在一个方面，本文提供的方法包括向患有不可切除或转移性肝细胞癌的患者施用化合物D的配制品与干扰素α或卡培他滨；或向患有原发性或转移性肝癌的患者施用化合物D的配制品与顺铂和噻替哌或与甲苯酸索拉非尼。
在一个方面，本文提供的方法包括向患有卡波西肉瘤的患者施用化合物D的配制品与多柔比星、紫杉醇、长春碱、聚乙二醇化干扰素α和/或重组干扰素α-2b。
在一个方面，本文提供的方法包括向患有急性骨髓性白血病(包括难治性或复发性或高风险急性骨髓性白血病)的患者施用化合物D的配制品与以下中的至少一种：恩西地平、三氧化二砷、氟达拉滨、卡铂、道诺霉素、环磷酰胺、阿糖胞苷、多柔比星、伊达比星、盐酸米托蒽醌、硫鸟嘌呤、长春新碱、米哚妥林和/或拓扑替康。
在一个方面，本文提供的方法包括向患有不利核型急性粒细胞白血病的患者施用化合物D的配制品与以下中的至少一种：恩西地平、脂质体道诺霉素、拓扑替康和/或阿糖胞苷。
在一个方面，本文提供的方法包括向患有白血病的患者施用化合物D与IDH2抑制剂，其中所述白血病的特征在于IDH2的突变体等位基因的存在。示例性IDH2抑制剂公开于美国专利号9,732,062、9,724,350、9,738,625和9,579,324；以及美国公开号2016-0159771和US 2016-0158230 A1。在一个方面，本文提供的方法包括向患有白血病的患者施用化合物D与恩西地平，其中所述白血病的特征在于IDH2的突变体等位基因的存在。在某些实施方案中，化合物D和IDH2抑制剂的组合增加了在患有急性骨髓性白血病的患者中的分化细胞(CD34-/CD38)和成红细胞，其中所述急性骨髓性白血病的特征在于IDH2 R140Q的存在。在某些实施方案中，化合物D和IDH2抑制剂的组合减少了在患有急性骨髓性白血病的患者中的祖细胞(CD34+/CD38+)和HSC，其中所述急性骨髓性白血病的特征在于IDH2 R140Q的存在。
在一个方面，本文提供的方法包括向患有急性骨髓性白血病的患者施用化合物D与恩西地平，其中所述急性骨髓性白血病的特征在于IDH2的突变体等位基因的存在。在一个实施方案中，IDH2的突变体等位基因是IDH2 R140Q或R172K。
在一个方面，本文提供的方法包括向患有白血病的患者施用化合物D的配制品与恩西地平，其中所述白血病的特征在于IDH2的突变体等位基因的存在。在一个方面，本文提供的方法包括向患有急性骨髓性白血病的患者施用化合物D的配制品与恩西地平，其中所述急性骨髓性白血病的特征在于IDH2的突变体等位基因的存在。在一个实施方案中，IDH2的突变体等位基因是IDH2 R140Q或R172K。
在一个方面，本文提供的方法包括向患有白血病的患者施用化合物D与6-(6-(三氟甲基)吡啶-2-基)-N2-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)-1,3,5-三嗪-2,4-二胺(化合物2)，其中所述白血病的特征在于IDH2的突变体等位基因的存在。在一个方面，本文提供的方法包括向患有急性骨髓性白血病的患者施用化合物D与化合物2，其中所述急性骨髓性白血病的特征在于存在IDH2的突变体等位基因。在一个实施方案中，IDH2的突变体等位基因是IDH2R140Q或R172K。
在一个方面，本文提供的方法包括向患有白血病的患者施用化合物D的配制品与化合物2，其中所述白血病的特征在于IDH2的突变体等位基因的存在。在一个方面，本文提供的方法包括向患有急性骨髓性白血病的患者施用化合物D的配制品与化合物2，其中所述急性骨髓性白血病的特征在于存在IDH2的突变体等位基因。在一个实施方案中，IDH2的突变体等位基因是IDH2 R140Q或R172K。
在一个方面，本文提供的方法包括向患有非小细胞肺癌的患者施用化合物D的配制品与甲氨蝶呤、盐酸氮芥、二马来酸阿法替尼、培美曲塞、贝伐单抗、卡铂、顺铂、色瑞替尼、克唑替尼、雷莫芦单抗、派姆单抗、多西紫杉醇、酒石酸长春瑞滨、吉西他滨、
Figure BDA0003710765600000312
埃罗替尼、吉夫替尼、伊立替康、依维莫司、艾乐替尼、布加替尼、纳武单抗、奥希替尼、阿特珠单抗和/或耐昔妥珠单抗。
在一个方面，本文提供的方法包括向患有非小细胞肺癌的患者施用化合物D的配制品与卡铂和伊立替康。
在一个方面，本文提供的方法包括向先前用卡铂/依托泊苷和放射疗法治疗过的患有非小细胞肺癌的患者施用化合物D的配制品与多西紫杉醇。
在一个方面，本文提供的方法包括向患有非小细胞肺癌的患者施用化合物D的配制品与卡铂和/或泰素帝或与卡铂、紫杉醇和/或胸部放射疗法的组合。
在一个方面，本文提供的方法包括向患有IIIB或IV期非小细胞肺癌的患者施用化合物D的配制品与泰素帝。
在一个方面，本文提供的方法包括向患有小细胞肺癌的患者施用化合物D的配制品与奥利莫森
Figure BDA0003710765600000311
甲氨蝶呤、盐酸氮芥、依托泊苷、拓扑替康和/或多柔比星。
在一个方面，本文提供的方法包括向患有淋巴瘤和其他血癌的患者施用化合物D的配制品与维奈托克、ABT-737(Abbott Laboratories)和/或obatoclax(GX15-070)。
在一个方面，本文提供的方法包括向患有包括但不限于霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、皮肤B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤或复发性或难治性低级别滤泡性淋巴瘤的各种类型淋巴瘤的患者施用化合物D的配制品与第二活性成分，如长春碱或氟达拉滨安适利、ambochlorin、becenum、博来霉素、维汀-本妥昔单抗、苯丁酸氮芥卡莫司汀、环磷酰胺、达卡巴嗪、多柔比星、洛莫司汀、matulane、盐酸氮芥、泼尼松、盐酸丙卡巴肼，长春新碱，甲氨蝶呤、奈拉滨、贝利司他，盐酸苯达莫司汀，托西莫单抗和碘131托西莫单抗，地尼白介素、地塞米松、普拉曲沙、prelixafor、阿托珠单抗、替伊莫单抗、tiuxefan、伊布替尼、艾德拉尼(idelasib)、intron A、罗米地辛、来那度胺、利妥昔单抗和/或伏立诺他。
在一个方面，本文提供的方法包括向患有各种类型或分期的黑色素瘤的患者施用化合物D的配制品与泰素帝、达拉非尼、imlygic、伊匹单抗、派姆单抗、纳武单抗、曲美替尼、维罗非尼、拉赫-他利莫近(talimogene laherparepvec)、IL-2、IFN、GM-CSF和/或达卡巴嗪、阿地白介素、考比替尼、
Figure BDA0003710765600000321
聚乙二醇干扰素α-2b和/或曲美替尼。
在一个方面，本文提供的方法包括向患有恶性间皮瘤或伴有胸膜植入物或恶性胸腔积液间皮瘤综合征的IIIB期非小细胞肺癌的患者施用化合物D的配制品与长春瑞滨或培美曲塞二钠。
在一个方面，本文提供的治疗患有各种类型或分期的多发性骨髓瘤的患者的方法包括施用化合物D的配制品与地塞米松、唑来膦酸、棕榈酸酯(palmitronate)、GM-CSF、克拉霉素(biaxin)、长春碱、美法仑、白消安、环磷酰胺、IFN、泼尼松、二膦酸盐、塞来昔布、三氧化二砷、PEG INTRON-A、长春新碱、becenum、硼替佐米、卡非佐米、多柔比星、帕比司他、来那度胺、泊马度胺、沙利度胺、释倍灵(mozobil)、卡莫司汀、达雷木单抗、艾洛珠单抗、柠檬酸伊沙佐米、普乐沙福或其组合。
在某些实施方案中，将本文提供的化合物D的配制品与嵌合抗原受体(CAR)T细胞组合施用至患有各种类型或分期的多发性骨髓瘤的患者。在某些实施方案中，所述组合中的CAR T细胞靶向B细胞成熟抗原(BCMA)，并且在更具体的实施方案中，CAR T细胞是bb2121或bb21217。在一些实施方案中，CAR T细胞是JCARH125。
在某些实施方案中，将本文提供的化合物D的配制品与多柔比星
Figure BDA0003710765600000322
长春新碱和/或地塞米松
Figure BDA0003710765600000323
组合施用至患有复发性或难治性多发性骨髓瘤的患者。
在某些实施方案中，本文提供的方法包括将化合物D的配制品与以下项组合施用至患有各种类型或分期的卵巢癌(如腹膜癌、乳头状浆液性癌、难治性卵巢癌或复发性卵巢癌)的患者：泰素、卡铂、多柔比星、吉西他滨、顺铂、希罗达、紫杉醇、地塞米松、安维汀、环磷酰胺、拓扑替康、奥拉帕尼、噻替哌、美法仑、甲苯磺酸尼拉帕尼一水合物、卢卡帕尼/雷卡帕尼(rubraca)或其组合。
在某些实施方案中，本文提供的方法包括将化合物D的配制品与以下项组合施用至患有各种类型或分期的前列腺癌的患者：希罗达、5FU/LV、吉西他滨、伊立替康加吉西他滨、环磷酰胺、长春新碱、地塞米松、GM-CSF、塞来昔布、泰素帝、更昔洛韦、紫杉醇、阿霉素、多西紫杉醇、雌莫司汀、Emcyt、denderon、阿比特龙、比卡鲁胺、卡巴他赛、地加瑞克、恩杂鲁胺、诺雷得、醋酸亮丙瑞林、盐酸米托蒽醌、泼尼松、sipuleucel-T、二氯化镭223或其组合。
在某些实施方案中，本文提供的方法包括将化合物D的配制品与以下项组合施用至患有各种类型或分期的肾细胞癌的患者：卡培他滨、IFN、他莫昔芬、IL-2、GM-CSF、
Figure BDA0003710765600000324
氟他胺、醋酸戈舍瑞林、尼鲁米特或其组合。
在某些实施方案中，本文提供的方法包括将化合物D的配制品与以下项组合施用至患有各种类型或分期的妇科、子宫或软组织肉瘤癌的患者：IFN、更生霉素、多柔比星、甲磺酸伊马替尼、帕唑帕尼、盐酸盐、曲贝替定、甲磺酸艾日布林、奥拉单抗、COX-2抑制剂(如塞来昔布)和/或舒林酸。
在一个方面，本文提供的方法包括将化合物D的配制品与以下项组合施用至患有各种类型或分期的实体瘤的患者：塞来昔布、依托泊苷、环磷酰胺、多西紫杉醇、卡培他滨(apecitabine)、IFN、他莫昔芬、IL-2、GM-CSF或其组合。
在一个方面，本文提供的方法包括将化合物D的配制品与以下项组合施用至患有硬皮病或皮肤血管炎的患者：西乐葆、依托泊苷、环磷酰胺、多西紫杉醇、卡培他滨、IFN、他莫昔芬、IL-2、GM-CSF或其组合。
在一个方面，本文提供的方法包括将化合物D的配制品与以下项组合施用至患有MDS的患者：阿扎胞苷、阿糖胞苷、道诺霉素、地西他滨、伊达比星、来那度胺、恩西地平或其组合。
在一个方面，本文提供的方法包括将化合物D与选自以下的一种或多种第二药剂组合施用至患有血液癌的患者：JAK抑制剂、FLT3抑制剂、mTOR抑制剂、剪接体抑制剂、BET抑制剂、SMG1抑制剂、ERK抑制剂、LSD1抑制剂、BH3模拟物、拓扑异构酶抑制剂和RTK抑制剂。在一个方面，本文提供的方法包括将化合物D的配制品与选自以下的一种或多种第二药剂组合施用至患有血液癌的患者：JAK抑制剂、FLT3抑制剂、mTOR抑制剂、剪接体抑制剂、BET抑制剂、SMG1抑制剂、ERK抑制剂、LSD1抑制剂、BH3模拟物、拓扑异构酶抑制剂和RTK抑制剂。
在一个方面，本文提供的方法包括将化合物D与选自以下的一种或多种第二药剂组合施用至患有白血病的患者：JAK抑制剂、FLT3抑制剂、mTOR抑制剂、剪接体抑制剂、BET抑制剂、SMG1抑制剂、ERK抑制剂、LSD1抑制剂、BH3模拟物、拓扑异构酶抑制剂和RTK抑制剂。在某些实施方案中，将本文提供的化合物D的配制品与选自以下的一种或多种第二药剂组合施用至患有白血病的患者：JAK抑制剂、FLT3抑制剂、mTOR抑制剂、剪接体抑制剂、BET抑制剂、SMG1抑制剂、ERK抑制剂、LSD1抑制剂、BH3模拟物、拓扑异构酶抑制剂和RTK抑制剂。
在一个方面，本文提供的方法包括将化合物D与选自以下的一种或多种第二药剂组合施用至患有AML的患者：JAK抑制剂、FLT3抑制剂、mTOR抑制剂、剪接体抑制剂、BET抑制剂、SMG1抑制剂、ERK抑制剂、LSD1抑制剂、BH3模拟物、拓扑异构酶抑制剂和RTK抑制剂。在某些实施方案中，将本文提供的化合物D的配制品与选自以下的一种或多种第二药剂组合施用至患有AML的患者：JAK抑制剂、FLT3抑制剂、mTOR抑制剂、剪接体抑制剂、BET抑制剂、SMG1抑制剂、ERK抑制剂、LSD1抑制剂、BH3模拟物、拓扑异构酶抑制剂和RTK抑制剂。
在一个方面，本文提供的方法包括将化合物D与mTOR抑制剂组合施用至患有白血病的患者。在某些实施方案中，将本文提供的化合物D的配制品与mTOR抑制剂组合施用至患有白血病的患者。在某些实施方案中，mTOR抑制剂选自依维莫司、MLN-0128和AZD8055。在一些实施方案中，mTOR抑制剂是mTOR激酶抑制剂。在某些实施方案中，mTOR激酶抑制剂选自7-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-3-基)-1-((反式)-4-甲氧基环己基)-3,4-二氢吡嗪并[2,3-b]吡嗪-2(1H)-酮(CC-223)和1-乙基-7-(2-甲基-6-(1H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-3-基)-3,4-二氢吡嗪并[2,3-b]吡嗪-2(1H)-酮(CC-115)。在某些实施方案中，将化合物D与7-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-3-基)-1-((反式)-4-甲氧基环己基)-3,4-二氢吡嗪并[2,3-b]吡嗪-2(1H)-酮(CC-223)组合施用至患有白血病的患者。在某些实施方案中，将化合物D与1-乙基-7-(2-甲基-6-(1H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-3-基)-3,4-二氢吡嗪并[2,3-b]吡嗪-2(1H)-酮(CC-115)组合施用至患有白血病的患者。在某些实施方案中，将化合物D与依维莫司组合施用至患有白血病的患者。在某些实施方案中，将化合物D与MLN-0128组合施用至患有白血病的患者。在某些实施方案中，将化合物D与AZD8055组合施用至患有白血病的患者。
在一个方面，本文提供的方法包括将化合物D与mTOR抑制剂组合施用至患有AML的患者。在某些实施方案中，将本文提供的化合物D的配制品与mTOR抑制剂组合施用至患有AML的患者。在某些实施方案中，mTOR抑制剂选自依维莫司、MLN-0128和AZD8055。在一些实施方案中，mTOR抑制剂是mTOR激酶抑制剂。在某些实施方案中，mTOR激酶抑制剂选自7-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-3-基)-1-((反式)-4-甲氧基环己基)-3,4-二氢吡嗪并[2,3-b]吡嗪-2(1H)-酮(CC-223)和1-乙基-7-(2-甲基-6-(1H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-3-基)-3,4-二氢吡嗪并[2,3-b]吡嗪-2(1H)-酮(CC-115)。在某些实施方案中，将化合物D与1-乙基-7-(2-甲基-6-(1H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-3-基)-3,4-二氢吡嗪并[2,3-b]吡嗪-2(1H)-酮组合施用至患有AML的患者。在某些实施方案中，将化合物D与依维莫司组合施用至患有AML的患者。在某些实施方案中，在施用化合物D之前将依维莫司施用至患有AML的患者。在某些实施方案中，将化合物D与MLN-0128组合施用至患有AML的患者。在某些实施方案中，将化合物D与AZD8055组合施用至患有AML的患者。
在一个方面，本文提供的方法包括将化合物D与JAK抑制剂组合施用至患有MPN的患者。在某些实施方案中，将本文提供的化合物D的配制品与JAK抑制剂组合施用至患有MPN的患者。在一个方面，JAK抑制剂选自JAK1抑制剂、JAK2抑制剂和JAK3抑制剂。在某些实施方案中，JAK抑制剂选自托法替尼、莫洛替尼、非戈替尼、德塞替尼(decernotinib)、巴瑞克替尼、鲁索替尼、菲卓替尼、NS-018和帕克替尼。在某些实施方案中，JAK抑制剂选自托法替尼、莫洛替尼、鲁索替尼、菲卓替尼、NS-018和帕克替尼。在某些实施方案中，将化合物D与托法替尼组合施用至患有MPN的患者。在某些实施方案中，将化合物D与莫洛替尼组合施用至患有MPN的患者。在某些实施方案中，将化合物D与非戈替尼组合施用至患有MPN的患者。在某些实施方案中，将化合物D与德塞替尼组合施用至患有MPN的患者。在某些实施方案中，将化合物D与巴瑞克替尼组合施用至患有MPN的患者。在某些实施方案中，将化合物D与鲁索替尼组合施用至患有MPN的患者。在某些实施方案中，将化合物D与菲卓替尼组合施用至患有MPN的患者。在某些实施方案中，将化合物D与NS-018组合施用至患有MPN的患者。在某些实施方案中，将化合物D与帕克替尼组合施用至患有MPN的患者。在某些实施方案中，MPN与IL-3无关。在某些实施方案中，MPN的特征在于JAK 2突变，例如JAK2V617F突变。
在一个方面，本文提供的方法包括将化合物D与JAK抑制剂组合施用至患有骨髓纤维化的患者。在某些实施方案中，将本文提供的化合物D的配制品与JAK抑制剂组合施用至患有骨髓纤维化的患者。在一个方面，JAK抑制剂选自JAK1抑制剂、JAK2抑制剂和JAK3抑制剂。在某些实施方案中，JAK抑制剂选自托法替尼、莫洛替尼、鲁索替尼、菲卓替尼、NS-018和帕克替尼。在某些实施方案中，将化合物D与托法替尼组合施用至患有骨髓纤维化的患者。在某些实施方案中，将化合物D与莫洛替尼组合施用至患有骨髓纤维化的患者。在某些实施方案中，将化合物D与鲁索替尼组合施用至患有骨髓纤维化的患者。在某些实施方案中，将化合物D与菲卓替尼组合施用至患有骨髓纤维化的患者。在某些实施方案中，将化合物D与NS-018组合施用至患有骨髓纤维化的患者。在某些实施方案中，将化合物D与帕克替尼组合施用至患有骨髓纤维化的患者。在某些实施方案中，骨髓纤维化的特征在于JAK 2突变，例如JAK2V617F突变。在一些实施方案中，骨髓纤维化是原发性骨髓纤维化。在其他实施方案中，骨髓纤维化是继发性骨髓纤维化。在一些此类实施方案中，继发性骨髓纤维化是真性红细胞增多症继发骨髓纤维化。在其他实施方案中，继发性骨髓纤维化是原发性血小板增多症后骨髓纤维化。
在一个方面，本文提供的方法包括将化合物D与JAK抑制剂组合施用至患有白血病的患者。在某些实施方案中，将本文提供的化合物D的配制品与JAK抑制剂组合施用至患有白血病的患者。在一个方面，JAK抑制剂选自JAK1抑制剂、JAK2抑制剂和JAK3抑制剂。在某些实施方案中，JAK抑制剂选自托法替尼、莫洛替尼、非戈替尼、德塞替尼(decernotinib)、巴瑞克替尼、鲁索替尼、菲卓替尼、NS-018和帕克替尼。在某些实施方案JAK抑制剂选自莫洛替尼、鲁索替尼、菲卓替尼、NS-018和帕克替尼。在某些实施方案中，将化合物D与托法替尼组合施用至患有白血病的患者。在某些实施方案中，将化合物D与莫洛替尼组合施用至患有白血病的患者。在某些实施方案中，将化合物D与非戈替尼组合施用至患有白血病的患者。在某些实施方案中，将化合物D与德塞替尼组合施用至患有白血病的患者。在某些实施方案中，将化合物D与巴瑞克替尼组合施用至患有白血病的患者。在某些实施方案中，将化合物D与鲁索替尼组合施用至患有白血病的患者。在某些实施方案中，将化合物D与菲卓替尼组合施用至患有白血病的患者。在某些实施方案中，将化合物D与NS-018组合施用至患有白血病的患者。在某些实施方案中，将化合物D与帕克替尼组合施用至患有白血病的患者。在某些实施方案中，MPN的特征在于JAK2突变，例如JAK2V617F突变。
在一个方面，本文提供的方法包括将化合物D与JAK抑制剂组合施用至患有AML的患者。在某些实施方案中，将本文提供的化合物D的配制品与JAK抑制剂组合施用至患有AML的患者。在一个方面，JAK抑制剂选自JAK1抑制剂、JAK2抑制剂和JAK3抑制剂。在某些实施方案中，JAK抑制剂选自托法替尼、莫洛替尼、非戈替尼、德塞替尼(decernotinib)、巴瑞克替尼、鲁索替尼、菲卓替尼、NS-018和帕克替尼。在某些实施方案JAK抑制剂选自莫洛替尼、鲁索替尼、菲卓替尼、NS-018和帕克替尼。在某些实施方案中，将化合物D与托法替尼组合施用至患有AML的患者。在某些实施方案中，将化合物D与莫洛替尼组合施用至患有AML的患者。在某些实施方案中，将化合物D与非戈替尼组合施用至患有AML的患者。在某些实施方案中，将化合物D与德塞替尼组合施用至患有AML的患者。在某些实施方案中，将化合物D与巴瑞克替尼组合施用至患有AML的患者。在某些实施方案中，将化合物D与鲁索替尼组合施用至患有AML的患者。在某些实施方案中，将化合物D与菲卓替尼组合施用至患有AML的患者。在某些实施方案中，将化合物D与NS-018组合施用至患有AML的患者。在某些实施方案中，将化合物D与帕克替尼组合施用至患有AML的患者。在某些实施方案中，MPN的特征在于JAK 2突变，例如JAK2V617F突变。
在一个方面，本文提供的方法包括将化合物D与FLT3激酶抑制剂组合施用至患有白血病的患者。在某些实施方案中，将本文提供的化合物D的配制品与FLT3激酶抑制剂组合施用至患有白血病的患者。在某些实施方案中，FLT3激酶抑制剂选自奎扎替尼、舒尼替尼、苹果酸舒尼替尼、米哚妥林、培西达替尼、来他替尼、坦度替尼和克莱拉尼(crenolanib)。在某些实施方案中，将化合物D与奎扎替尼组合施用至患有白血病的患者。在某些实施方案中，将化合物D与舒尼替尼组合施用至患有白血病的患者。在某些实施方案中，将化合物D与米哚妥林组合施用至患有白血病的患者。在某些实施方案中，将化合物D与培西达替尼组合施用至患有白血病的患者。在某些实施方案中，将化合物D与来他替尼组合施用至患有白血病的患者。在某些实施方案中，将化合物D与坦度替尼组合施用至患有白血病的患者。在某些实施方案中，将化合物D与克莱拉尼组合施用至患有白血病的患者。在某些实施方案中，患者携带FLT3-ITD突变。
在一个方面，本文提供的方法包括将化合物D与FLT3激酶抑制剂组合施用至患有AML的患者。在某些实施方案中，将本文提供的化合物D的配制品与FLT3激酶抑制剂组合施用至患有AML的患者。在某些实施方案中，FLT3激酶抑制剂选自奎扎替尼、舒尼替尼、苹果酸舒尼替尼、米哚妥林、培西达替尼、来他替尼、坦度替尼、奎扎替尼和克莱拉尼(crenolanib)。在某些实施方案中，将化合物D与奎扎替尼组合施用至患有AML的患者。在某些实施方案中，将化合物D与舒尼替尼组合施用至患有AML的患者。在某些实施方案中，将化合物D与米哚妥林组合施用至患有AML的患者。在某些实施方案中，将化合物D与培西达替尼组合施用至患有AML的患者。在某些实施方案中，将化合物D与来他替尼组合施用至患有AML的患者。在某些实施方案中，将化合物D与坦度替尼组合施用至患有AML的患者。在某些实施方案中，将化合物D与克莱拉尼组合施用至患有AML的患者。在某些实施方案中，患者携带FLT3-ITD突变。
在某些实施方案中，将化合物D与剪接体抑制剂组合施用至患有白血病的患者。在某些实施方案中，将化合物D与剪接体抑制剂组合施用至患有AML的患者。在某些实施方案中，剪接体抑制剂是普拉地内酯B、6-脱氧普拉地内酯D或H3B-8800。
在一个方面，本文提供的方法包括将化合物D与SMG1激酶抑制剂组合施用至患有白血病的患者。在某些实施方案中，将本文提供的化合物D的配制品与SMG1激酶抑制剂组合施用至患有白血病的患者。在一个方面，本文提供的方法包括将化合物D与SMG1激酶抑制剂组合施用至患有AML的患者。在某些实施方案中，将本文提供的化合物D的配制品与SMG1激酶抑制剂组合施用至患有AML的患者。在某些实施方案中，SMG1抑制剂是1-乙基-7-(2-甲基-6-(1H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-3-基)-3,4-二氢吡嗪并[2,3-b]吡嗪-2(1H)-酮、氯-N,N-二乙基-5-((4-(2-(4-(3-甲基脲基)苯基)吡啶-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯磺酰胺(化合物Ii)或在A.Gopalsamy等人,Bioorg.Med Chem Lett.2012,22:6636-66412中公开的化合物(例如，氯-N,N-二乙基-5-((4-(2-(4-(3-甲基脲基)苯基)吡啶-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯磺酰胺。
在一个方面，本文提供的方法包括将化合物D与BCL2抑制剂组合施用至患有白血病的患者。在某些实施方案中，将本文提供的化合物D的配制品与BCL2抑制剂组合施用至患有白血病的患者。在某些实施方案中，将化合物D与BCL2抑制剂组合施用至患有AML的患者。在某些实施方案中，将本文提供的化合物D的配制品与BCL2抑制剂(例如，维奈托克或纳维托克)组合施用至患有AML的患者。在某些实施方案中，BCL2抑制剂是维奈托克。
在一个实施方案中，本文提供了一种用于治疗对用BCL2抑制剂治疗有抗性的AML的方法，所述方法包括施用化合物D。在一个实施方案中，本文提供了一种用于治疗对维奈托克治疗具有获得性抗性的AML的方法，所述方法包括施用化合物D。在一个实施方案中，本文提供了一种用于治疗对维奈托克治疗具有获得性抗性的AML的方法，所述方法包括施用化合物D和BCL2抑制剂的组合。在一个实施方案中，本文提供了一种用于治疗对维奈托克治疗具有获得性抗性的AML的方法，所述方法包括施用化合物D和维奈托克的组合。
在一个方面，本文提供的方法包括将化合物D与拓扑异构酶抑制剂组合施用至患有白血病的患者。在某些实施方案中，将本文提供的化合物D的配制品与拓扑异构酶抑制剂组合施用至患有白血病的患者。在某些实施方案中，将化合物D与拓扑异构酶抑制剂组合施用至患有AML的患者。在某些实施方案中，将本文提供的化合物D的配制品与拓扑异构酶抑制剂组合施用至患有AML的患者，所述拓扑异构酶抑制剂例如伊立替康、拓扑替康、喜树碱、片螺素D、依托泊苷、替尼泊苷、多柔比星、道诺霉素、米托蒽醌、安吖啶、玫瑰树碱、金精三羧酸或HU-331。在某些实施方案中，拓扑异构酶抑制剂是拓扑替康。
在某些实施方案中，将化合物D与BET抑制剂组合施用至患有白血病的患者。在某些实施方案中，将化合物D与BET抑制剂组合施用至患有AML的患者。在某些实施方案中，BET抑制剂选自GSK525762A、OTX015、BMS-986158、TEN-010、CPI-0610、INCB54329、BAY1238097、FT-1101、C90010、ABBV-075、BI 894999、GS-5829、GSK1210151A(I-BET-151)、CPI-203、RVX208、XD46、MS436、PFI-1、RVX2135、ZEN3365、XD14、ARV-771、MZ-1、PLX5117、4-[2-(环丙基甲氧基)-5-(甲磺酰基)苯基]-2-甲基异喹啉-1(2H)-酮(化合物A)、EP11313和EP11336。
在某些实施方案中，将化合物D与LSD1抑制剂组合施用至患有白血病的患者。在某些实施方案中，将化合物D与LSD1抑制剂组合施用至患有AML的患者。在某些实施方案中，LSD1抑制剂选自ORY-1001、ORY-2001、INCB-59872、IMG-7289、TAK 418、GSK-2879552和4-[2-(4-氨基-哌啶-1-基)-5-(3-氟-4-甲氧基-苯基)-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-4-基]-2-氟-苄腈或其盐(例如苯磺酸盐、化合物B)。
在一个方面，本文提供的方法包括将化合物D与以下项组合施用至患有白血病的患者：雷公藤甲素、瑞他霉素、阿螺旋霉素、7-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-3-基)-1-((反式)-4-甲氧基环己基)-3,4-二氢吡嗪并[2,3-b]吡嗪-2(1H)-酮(CC-223)、1-乙基-7-(2-甲基-6-(1H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-3-基)-3,4-二氢吡嗪并[2,3-b]吡嗪-2(1H)-酮(CC-115)、雷帕霉素、MLN-0128、依维莫司、AZD8055、普拉地内酯B、拓扑替康、硫鸟嘌呤、米托蒽醌、依托泊苷、地西他滨、道诺霉素、氯法拉滨、克拉屈滨、6-巯基嘌呤、氯-N,N-二乙基-5-((4-(2-(4-(3-甲基脲基)苯基)吡啶-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯磺酰胺(化合物Ii)、菲卓替尼、舒尼替尼、培西达替尼、米哚妥林、来他替尼、莫洛替尼、奎扎替尼和克莱拉尼。
在一个方面，本文提供的方法包括将化合物D与以下项组合施用至患有AML的患者：雷公藤甲素、瑞他霉素、阿螺旋霉素、7-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-3-基)-1-((反式)-4-甲氧基环己基)-3,4-二氢吡嗪并[2,3-b]吡嗪-2(1H)-酮(CC-223)、1-乙基-7-(2-甲基-6-(1H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-3-基)-3,4-二氢吡嗪并[2,3-b]吡嗪-2(1H)-酮(CC-115)、雷帕霉素、MLN-0128、依维莫司、AZD8055、普拉地内酯B、拓扑替康、硫鸟嘌呤、米托蒽醌、依托泊苷、地西他滨、道诺霉素、氯法拉滨、克拉屈滨、6-巯基嘌呤、氯-N,N-二乙基-5-((4-(2-(4-(3-甲基脲基)苯基)吡啶-4-基)嘧啶-2-基)氨基)苯磺酰胺(化合物Ii)、菲卓替尼、舒尼替尼、培西达替尼、米哚妥林、来他替尼、莫洛替尼、奎扎替尼和克莱拉尼。
在一个方面，本文提供的方法包括将化合物D与mTOR抑制剂组合施用至患有癌症的患者，其中所述癌症选自乳腺癌、肾癌、胰腺癌、胃肠癌、肺癌、神经内分泌肿瘤(NET)和肾细胞癌(RCC)。在某些实施方案中，将本文提供的化合物D的配制品与拓扑异构酶抑制剂组合施用至患有癌症的患者。在某些实施方案中，将本文提供的化合物D的配制品与mTOR抑制剂组合施用至癌症患者，其中所述癌症选自乳腺癌、肾癌、胰腺癌、胃肠癌、肺癌、神经内分泌肿瘤(NET)和肾细胞癌。在某些实施方案中，mTOR抑制剂选自依维莫司、MLN-0128和AZD8055。在一些实施方案中，mTOR抑制剂是mTOR激酶抑制剂。在某些实施方案中，mTOR激酶抑制剂选自7-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-3-基)-1-((反式)-4-甲氧基环己基)-3,4-二氢吡嗪并[2,3-b]吡嗪-2(1H)-酮(CC-223)和1-乙基-7-(2-甲基-6-(1H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-3-基)-3,4-二氢吡嗪并[2,3-b]吡嗪-2(1H)-酮(CC-115)。在一个实施方案中，mTOR激酶抑制剂是7-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-3-基)-1-((反式)-4-甲氧基环己基)-3,4-二氢吡嗪并[2,3-b]吡嗪-2(1H)-酮(CC-223)。在一个实施方案中，mTOR激酶抑制剂是1-乙基-7-(2-甲基-6-(1H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-3-基)-3,4-二氢吡嗪并[2,3-b]吡嗪-2(1H)-酮(CC-115)。在一个实施方案中，mTOR抑制剂是依维莫司。在一个实施方案中，mTOR抑制剂是替西罗莫司。在一个实施方案中，mTOR抑制剂是MLN-0128。在一个实施方案中，mTOR抑制剂是AZD8055。
在某些实施方案中，将化合物D与依维莫司组合施用至乳腺癌患者。在某些实施方案中，将本文提供的化合物D的配制品与依维莫司组合施用至乳腺癌患者。
在某些实施方案中，将化合物D与依维莫司组合施用至肾癌患者。在某些实施方案中，将本文提供的化合物D的配制品与依维莫司组合施用至肾癌患者。
在某些实施方案中，将化合物D与依维莫司组合施用至胰腺癌患者。在某些实施方案中，将本文提供的化合物D的配制品与依维莫司组合施用至胰腺癌患者。
在某些实施方案中，将化合物D与依维莫司组合施用至胃肠癌患者。在某些实施方案中，将本文提供的化合物D的配制品与依维莫司组合施用至胃肠癌患者。
在某些实施方案中，将化合物D与依维莫司组合施用至肺癌患者。在某些实施方案中，将本文提供的化合物D的配制品与依维莫司组合施用至肺癌患者。
在某些实施方案中，将化合物D与依维莫司组合施用至神经内分泌肿瘤患者。在某些实施方案中，将本文提供的化合物D的配制品与依维莫司组合施用至神经内分泌肿瘤患者。
在某些实施方案中，将化合物D与依维莫司组合施用至肾细胞癌。在某些实施方案中，将本文提供的化合物D的配制品与依维莫司组合施用至肾细胞癌患者。
本文还包括一种增加可安全且有效地施用至患者的抗癌药物或药剂的剂量的方法，所述方法包括向所述患者(例如，人)施用化合物D，例如与所述第二抗癌药物组合的本文提供的化合物D的配制品。可以通过这种方法受益的患者是可能遭受与用于治疗以下癌症的抗癌药物有关的副作用的那些：皮肤、皮下组织、淋巴结、脑、肺、肝、骨、肠、结肠、心脏、胰腺、肾上腺、肾脏、前列腺、乳腺、结直肠或其组合的特定癌症。化合物D(例如，本文提供的化合物D的配制品)的施用减轻或减少了具有如下严重程度的副作用，所述严重程度将原本限制抗癌药物的量。
本文还包括一种减少可安全且有效地施用至患者的抗癌药物或药剂的剂量的方法，所述方法包括向所述患者(例如，人)施用化合物D，例如与所述第二抗癌药物组合的本文提供的化合物D的配制品。可以通过这种方法受益的患者是可能遭受与用于治疗以下癌症的抗癌药物有关的副作用的那些：皮肤、皮下组织、淋巴结、脑、肺、肝、骨、肠、结肠、心脏、胰腺、肾上腺、肾脏、前列腺、乳腺、结直肠或其组合的特定癌症。化合物D(例如，本文提供的化合物D的配制品)增强了抗癌药物的活性，其允许降低抗癌药物的剂量同时保持功效，这反过来可以减轻或降低具有如下严重程度的副作用，所述严重程度限制抗癌药物的量。
在一个实施方案中，在发生与向患者施用抗癌药物相关的副作用之前、期间或之后，化合物D以从约0.1至约20mg、从约1至约15mg、从约1至约10mg或从约1至约15mg范围内的量每日施用。在某些实施方案中，加工化合物D与特定药剂(如肝素、阿司匹林、香豆素或G-CSF)组合施用以避免与抗癌药物相关的副作用，如但不限于中性粒细胞减少症或血小板减少症。
在一个实施方案中，将化合物D(例如，本文提供的化合物D的配制品)与另外的活性成分(包括但不限于抗癌药物、抗炎药、抗组胺药、抗生素和类固醇)组合施用至患有与不希望的血管生成相关或以不希望的血管生成为特征的疾病和障碍的患者。
在另一个实施方案中，本文包括一种治疗、预防和/或管理癌症的方法，所述方法包括将化合物D与包括但不限于以下的至少一种抗癌疗法联合(例如在其之前、期间或之后)施用：手术、免疫疗法、生物疗法、放射疗法或目前用于治疗、预防和/或管理癌症的其他基于非药物的疗法。本文提供的化合物与其他抗癌疗法的组合使用可以提供一种独特的治疗方案，其在某些患者中出乎意料地有效。不受理论限制，认为化合物D在与至少一种抗癌疗法同时给予时可以提供累加或协同作用。
如本文别处所讨论的，本文包括一种减少、治疗和/或预防与其他抗癌疗法相关的不利或不希望的影响的方法，所述其他抗癌疗法包括但不限于手术、化学疗法、放射疗法、激素疗法、生物疗法和免疫疗法。可以在与其他抗癌疗法相关的副作用发生之前、期间或之后将化合物D(例如，本文提供的化合物D的配制品)和其他活性成分施用至患者。
在某些实施方案中，本文提供的方法包括与化合物D一起施用钙、骨化三醇或维生素D补充物中的一种或多种。在某些实施方案中，本文提供的方法包括在用化合物D治疗之前施用钙、骨化三醇和维生素D补充物。在某些实施方案中，本文提供的方法包括在每个周期中施用化合物D的第一个剂量之前施用钙、骨化三醇和维生素D补充物。在某些实施方案中，本文提供的方法包括在用化合物D治疗之前至少多达3天施用钙、骨化三醇或维生素D补充物。在某些实施方案中，本文提供的方法包括在每个周期中施用化合物D的第一个剂量之前施用钙、骨化三醇和维生素D补充物。在某些实施方案中，本文提供的方法包括在每个周期中施用化合物D的第一个剂量之前至少多达3天施用钙、骨化三醇和维生素D补充物。在某些实施方案中，本文提供的方法包括在每个周期中施用化合物D的第一个剂量之前施用钙、骨化三醇和维生素D补充物并且在每个周期中施用化合物D的最后一个剂量之后继续施用钙、骨化三醇和维生素D补充物。在某些实施方案中，本文提供的方法包括在每个周期中施用化合物D的第一个剂量之前至少多达3天施用钙、骨化三醇和维生素D补充物并且继续施用钙、骨化三醇和维生素D补充物直到在每个周期中施用化合物D的最后一个剂量之后至少多达3天(例如，当在第1-5天施用化合物D时，至少多达8天)。在一个实施方案中，本文提供的方法包括在每个周期的第1天施用之前至少多达3天施用钙、骨化三醇和维生素D补充物并且继续施用钙、骨化三醇和维生素D补充物直到在每个周期中施用化合物D的最后一个剂量之后≥3天(例如，当在第1-5天施用化合物D时，≥第8天；当在第1-3天和第8-10天施用化合物D时，≥第13天)。
在某些实施方案中，施用钙补充物以每天递送至少1200mg元素钙，以分次剂量给予。在某些实施方案中，钙补充物以碳酸钙的形式以500mg的剂量施用，每天口服(PO)施用三次。
在某些实施方案中，施用骨化三醇补充物以每日一次(PO)递送0.25μg骨化三醇。
在某些实施方案中，施用维生素D补充物以每日一次递送约500IU至约50,000IU维生素D。在某些实施方案中，施用维生素D补充物以每日一次递送约1000IU维生素D。在某些实施方案中，施用维生素D补充物以每周递送约50,000IU维生素D。在某些实施方案中，施用维生素D补充物以每日一次递送约1000IU维生素D2或D3。在某些实施方案中，施用维生素D补充物以每日一次递送约500IU维生素D。在某些实施方案中，施用维生素D补充物以每周递送约50,000IU维生素D。在某些实施方案中，施用维生素D补充物以每周递送约20,000IU维生素D。在某些实施方案中，施用维生素D补充物以每日一次递送约1000IU维生素D2或D3。在某些实施方案中，施用维生素D补充物以每周递送约50,000IU维生素D2或D3。在某些实施方案中，施用维生素D补充物以每周递送约20,000IU维生素D2或D3。
在某些实施方案中，将本文提供的化合物D的配制品和多西紫杉醇施用至先前用卡铂/VP 16和放射疗法治疗过的患有非小细胞肺癌的患者。
与移植疗法一起使用
化合物D(例如，本文提供的化合物D的配制品)可以用于降低移植物抗宿主病(GVHD)的风险。因此，本文包括一种治疗、预防和/或管理癌症的方法，所述方法包括将化合物D(例如，本文提供的化合物D的配制品)与移植疗法联合施用。
如本领域普通技术人员所知，癌症的治疗通常基于疾病的分期和机制。例如，由于在癌症的某些阶段发生不可避免的白血病转化，因此可能需要外周血干细胞、造血干细胞制剂或骨髓的移植。化合物D(例如，本文提供的化合物D的配制品)与移植疗法的组合使用提供了独特且出乎意料的协同作用。特别地，本文提供的化合物D的配制品展现出免疫调节活性，当在患有癌症的患者中与移植疗法同时给予时，其可以提供累加或协同作用。
化合物D(例如，本文提供的化合物D的配制品)可以与移植疗法组合起作用，从而降低与移植的侵入性程序相关的并发症和GVHD的风险。本文包括一种治疗、预防和/或管理癌症的方法，所述方法包括在脐带血、胎盘血、外周血干细胞、造血干细胞制剂或骨髓的移植之前、期间或之后向患者(例如，人)施用本文提供的化合物D的配制品。适用于本文提供的方法的干细胞的一些例子公开于美国专利号7,498,171中，将其公开内容通过引用以其整体并入本文。
在一个实施方案中，在移植之前、期间或之后将化合物D(例如，本文提供的化合物D的配制品)施用至患有急性骨髓性白血病的患者。
在一个实施方案中，在自体外周血祖细胞的移植之前、期间或之后将化合物D(例如，本文提供的化合物D的配制品)施用至患有多发性骨髓瘤的患者。
在一个实施方案中，在自体外周血祖细胞的移植之前、期间或之后，将化合物D(例如，本文提供的化合物D的配制品)施用至患有NHL(例如，DLBCL)的患者。
周期性疗法
在某些实施方案中，将化合物D(例如，本文提供的化合物D的配制品)周期性地施用至患者，而与所治疗的癌症无关。周期性疗法涉及施用一段时间的活性剂，接着休息一段时间，并且重复这种依序施用。周期性疗法可以减少对这些疗法中的一种或多种的抗性的发展，避免或减少这些疗法之一的副作用，和/或改善治疗的功效。
在某些实施方案中，化合物D(例如，本文提供的化合物D的配制品)在四至六周的周期中以单次或分次剂量每日施用，其中休药期为约一周或两周。在某些实施方案中，化合物D(例如，本文提供的化合物D的配制品)在28天周期的连续一至十天以单次或分次剂量每日施用，然后在28天周期的其余时间为不施用的休药期。周期性方法还允许增加给药周期的频率、数量和长度。因此，在某些实施方案中，本文包括与其单独施用时的典型周期数相比施用化合物D(例如，本文提供的化合物D的配制品)更多的周期数。在某些实施方案中，施用化合物D(例如，本文提供的化合物D的配制品)更多的周期数，这通常会在也未施用第二活性成分的患者中引起剂量限制性毒性。
在一个实施方案中，将化合物D(例如，本文提供的化合物D的配制品)每日且连续施用三周或四周以施用从约0.1至约20mg/d的剂量的化合物D，接着中断一周或两周。
在另一个实施方案中，在四至六周的周期内，化合物D(例如，本文提供的化合物D的配制品)通过静脉内施用，并且第二活性成分通过口服施用，且化合物D(例如，本文提供的化合物D的配制品)的施用在第二活性成分之前30至60分钟发生。在某些实施方案中，化合物D(例如，本文提供的化合物D的配制品)和第二活性成分的组合通过静脉内输注在每个周期经约90分钟施用。在某些实施方案中，一个周期包括每日施用从约0.1至约150mg/天的化合物D(例如，本文提供的化合物D的配制品)和从约50至约200mg/m2/天的第二活性成分，持续三至四周，然后休息一周或两周。在某些实施方案中，向患者施用的组合治疗的周期数在从约一至约24个周期、从约二至约16个周期或从约四至约三个周期的范围内。
在一个实施方案中，本文提供的周期性疗法包括在治疗周期中施用化合物D(例如，本文提供的化合物D的配制品)，所述治疗周期包括长达5天的施用期，接着是休药期。在一个实施方案中，治疗周期包括5天的施用期，接着是休药期。在一个实施方案中，治疗周期包括长达10天的施用期，接着是休药期。在一个实施方案中，休药期是从约10天至约40天。在一个实施方案中，治疗周期包括长达10天的施用期，接着是从约10天直至约40天的休药期。在一个实施方案中，治疗周期包括长达10天的施用期，接着是从约23天直至约37天的休药期。在一个实施方案中，休药期是从约23天至约37天。在一个实施方案中，休药期是23天。在一个实施方案中，治疗周期包括长达10天的施用期，接着是23天的休药期。在一个实施方案中，休药期是37天。在一个实施方案中，治疗周期包括长达10天的施用期，接着是37天的休药期。
在一个实施方案中，治疗周期包括在28天周期的第1至5天施用化合物D，例如本文提供的化合物D的配制品。在另一个实施方案中，治疗周期包括在28天周期的第1-10天施用化合物D，例如本文提供的化合物D的配制品。在一个实施方案中，治疗周期包括在42天周期的第1至5天施用。在另一个实施方案中，治疗周期包括在42天周期的第1-10天施用。在另一个实施方案中，治疗周期包括在28天周期的第1-5天和第15-19天施用。在另一个实施方案中，治疗周期包括在28天周期的第1-3天和第8-10天施用。
在一个实施方案中，治疗周期包括在28天周期的第1至21天施用化合物D，例如本文提供的化合物D的配制品。在另一个实施方案中，治疗周期包括在7天周期的第1至5天施用。在另一个实施方案中，治疗周期包括在7天周期的第1至7天施用。
本文所述的任何治疗周期可以重复至少2、3、4、5、6、7、8或更多个周期。在某些情况下，如本文所述的治疗周期包括从1至约24个周期、从约2至约16个周期或从约2至约4个周期。在某些情况下，如本文所述的治疗周期包括从1至约4个周期。在某些实施方案中，第1至第4周期都是28天周期。在某些实施方案中，第1周期是42天周期并且第2至第4周期是28天周期。在一些实施方案中，施用化合物D(例如，本文提供的化合物D的配制品)持续28天的1至13个周期(例如约1年)。在某些情况下，周期性疗法不限于周期数，并且疗法持续直到疾病进展。在某些情况下，周期可以包括改变本文所述的施用期和/或休药期的持续时间。
在一个实施方案中，治疗周期包括以约0.3mg/天、0.6mg/天、1.2mg/天、1.8mg/天、2.4mg/天、3.6mg/天、5.4mg/天、7.2mg/天、8.1mg/天、9.0mg/天、10.0mg/天、10.8mg/天或12.2mg/天的剂量量施用化合物D，每天施用一次。在一个实施方案中，治疗周期包括以约0.3mg/天、0.6mg/天、1.2mg/天、1.8mg/天、2.4mg/天、3.6mg/天、5.4mg/天、7.2mg/天、8.1mg/天、9.0mg/天、10.0mg/天、10.8mg/天、12.2mg/天或20mg/天的剂量量施用化合物D，每天施用一次。在一个实施方案中，治疗周期包括以约0.6mg/天、1.2mg/天、1.8mg/天、2.4mg/天或3.6mg/天的剂量量施用化合物D，每天施用一次。在一些此类实施方案中，治疗周期包括在28天周期的第1至3天以约0.6mg、1.2mg、1.8mg、2.4mg或3.6mg的剂量量施用化合物D。在其他实施方案中，治疗周期包括在28天周期的第1至5天和第15至19天以约0.6mg、1.2mg、1.8mg、2.4mg或3.6mg的剂量量施用化合物D。在其他实施方案中，治疗周期包括在28天周期的第1至5天和第15至19天以约0.6mg、1.2mg、1.8mg、2.4mg、3.6mg、5.4mg/天、7.2mg/天、8.1mg/天、9.0mg/天或10.0mg/天的剂量量施用化合物D。
可以在治疗周期中的所有施用期以相同的量施用化合物D(例如，本文提供的化合物D的配制品)。可替代地，在一个实施方案中，在施用期内以不同的剂量施用所述化合物。
在一个实施方案中，将本文提供的化合物D的配制品在一个周期中施用至受试者，其中所述周期包括在一个28天周期中施用所述配制品至少5天。在一个实施方案中，将本文提供的化合物D的配制品在一个周期中施用至受试者，其中所述周期包括在28天周期的第1至5天施用所述配制品。在一个实施方案中，施用所述配制品以在28天周期的第1至5天以约0.1mg至约20mg的剂量递送化合物D。在一个实施方案中，施用所述配制品以在28天周期的第1至5天以约0.5mg至约5mg的剂量递送化合物D。在一个实施方案中，施用所述配制品以在28天周期的第1至5天以约0.5mg至约10mg的剂量递送化合物D。在一个实施方案中，将本文提供的化合物D的配制品在一个周期中施用至受试者，其中所述周期包括在28天周期的第1至5天和第15至19天施用所述配制品。在一个实施方案中，施用所述配制品以在28天周期的第1至5天和第15至19天以约0.1mg至约20mg的剂量递送化合物D。在一个实施方案中，施用所述配制品以在28天周期的第1至5天和第15至19天以约0.5mg至约5mg的剂量递送化合物D。在一个实施方案中，施用所述配制品以在28天周期的第1至5天和第15至19天以约0.5mg至约10mg的剂量递送化合物D。
在一个实施方案中，本文提供了一种通过在周期中向受试者施用本文提供的化合物D的配制品治疗AML的方法，其中所述周期包括施用所述配制品以在28天周期中至少5天以约0.1mg至约20mg的剂量递送化合物D。在一个实施方案中，本文提供了一种通过在周期中向受试者施用本文提供的化合物D的配制品治疗AML的方法，其中所述周期包括施用所述配制品以在28天周期的第1至5天以约0.1mg至约20mg的剂量递送化合物D。在一个实施方案中，本文提供了一种通过在周期中向受试者施用本文提供的化合物D的配制品治疗AML的方法，其中所述周期包括施用所述配制品以在28天周期的第1至5天以约0.1mg至约5mg的剂量递送化合物D。在一个实施方案中，本文提供了一种通过在周期中向受试者施用本文提供的化合物D的配制品治疗AML的方法，其中所述周期包括施用所述配制品以在28天周期的第1至5天以约0.5mg至约5mg的剂量递送化合物D。在另一个实施方案中，本文提供了一种通过在周期中向受试者施用本文提供的化合物D的配制品治疗AML的方法，其中所述周期包括施用所述配制品以在28天周期的第1至5天和第15至19天以约0.1mg至约20mg的剂量递送化合物D。在一个实施方案中，本文提供了一种通过在周期中向受试者施用本文提供的化合物D的配制品治疗AML的方法，其中所述周期包括施用所述配制品以在28天周期的第1至5天和第15至19天以约0.1mg至约5mg的剂量递送化合物D。在一个实施方案中，本文提供了一种通过在周期中向受试者施用本文提供的化合物D的配制品治疗AML的方法，其中所述周期包括施用所述配制品以在28天周期的第1至5天和第15至19天以约0.5mg至约5mg的剂量递送化合物D。
在一个实施方案中，本文提供了一种通过在周期中向受试者施用本文提供的化合物D的配制品治疗MDS的方法，其中所述周期包括施用所述配制品以在28天周期中至少5天以约0.1mg至约20mg的剂量递送化合物D。在一个实施方案中，本文提供了一种通过在周期中向受试者施用本文提供的化合物D的配制品治疗MDS的方法，其中所述周期包括施用所述配制品以在28天周期的第1至5天以约0.1mg至约20mg的剂量递送化合物D。在一个实施方案中，本文提供了一种通过在周期中向受试者施用本文提供的化合物D的配制品治疗MDS的方法，其中所述周期包括施用所述配制品以在28天周期的第1至5天以约0.1mg至约5mg的剂量递送化合物D。在一个实施方案中，本文提供了一种通过在周期中向受试者施用本文提供的化合物D的配制品治疗MDS的方法，其中所述周期包括施用所述配制品以在28天周期的第1至5天以约0.5mg至约5mg的剂量递送化合物D。在另一个实施方案中，本文提供了一种通过在周期中向受试者施用本文提供的化合物D的配制品治疗MDS的方法，其中所述周期包括施用所述配制品以在28天周期的第1至5天和第15至19天以约0.1mg至约20mg的剂量递送化合物D。在一个实施方案中，本文提供了一种通过在周期中向受试者施用本文提供的化合物D的配制品治疗MDS的方法，其中所述周期包括施用所述配制品以在28天周期的第1至5天和第15至19天以约0.1mg至约5mg的剂量递送化合物D。在一个实施方案中，本文提供了一种通过在周期中向受试者施用本文提供的化合物D的配制品治疗MDS的方法，其中所述周期包括施用所述配制品以在28天周期的第1至5天和第15至19天以约0.5mg至约5mg的剂量递送化合物D。
5.3.检测和量化生物标记物的方法
在某些实施方案中，本文提供的生物标记物可以通过生物标记物的蛋白质水平、RNA水平、DNA水平或cDNA水平来测量。在本文提供的各种方法的某些实施方案中，两个或更多个步骤依序进行。在本文提供的方法的其他实施方案中，两个或更多个步骤并行(例如，同时)进行。
若干种蛋白质检测和量化方法可以用于测量生物标记物的水平。可以使用任何合适的蛋白质量化方法。在一些实施方案中，使用基于抗体的方法。可以使用的示例性方法包括但不限于免疫印迹(蛋白质印迹)、ELISA、免疫组织化学、流式细胞术、流式细胞术珠阵列、质谱法等。常用几种类型的ELISA，包括直接ELISA、间接ELISA和夹心ELISA。
在某些实施方案中，本文提供了检测和量化来自生物样品的生物标记物(例如，基因产物)的蛋白质水平的方法，包括使样品中的蛋白质与第一抗体接触，所述第一抗体与生物标记物蛋白免疫特异性地结合。在一些实施方案中，本文提供的方法进一步包括(i)使与所述第一抗体结合的生物标记物蛋白与具有可检测标记的第二抗体接触，其中所述第二抗体与所述生物标记物蛋白免疫特异性地结合，并且其中所述第二抗体与所述第一抗体结合所述生物标记物蛋白上的不同表位；(ii)检测与所述生物标记物蛋白结合的第二抗体的存在；以及(iii)基于所述第二抗体中可检测标记的量确定所述生物标记物蛋白的量。在其他实施方案中，本文提供的方法进一步包括(i)使与所述第一抗体结合的生物标记物蛋白与具有可检测标记的第二抗体接触，其中所述第二抗体与所述第一抗体免疫特异性地结合；(ii)检测与所述第一抗体结合的第二抗体的存在；以及(iii)基于所述第二抗体中可检测标记的量确定所述生物标记物蛋白的量。
在本文提供的各种方法的一些实施方案中，所述方法包括使用双重染色免疫组织化学来测定生物标记物的水平。在双重染色免疫组织化学测定中，使用靶向本文提供的生物标记物的第一标记抗体和靶向另一种癌症生物标记物的第二标记抗体同时检测本文提供的生物标记物和癌症生物标记物。这种测定可以改善对于检测和测量本文提供的生物标记物的特异性、准确性和敏感性。在一些实施方案中，癌症生物标记物是淋巴瘤生物标记物。在其他实施方案中，癌症生物标记物是NHL生物标记物。在某些实施方案中，癌症生物标记物是DLBCL生物标记物。在一些实施方案中，癌症生物标记物是MM生物标记物。在其他实施方案中，癌症生物标记物是白血病生物标记物。在其他实施方案中，癌症生物标记物是AML生物标记物。
因此，在一些实施方案中，本文提供的方法包括(i)使样品中的蛋白质与第一抗体接触，所述第一抗体与本文提供的生物标记物结合，所述第一抗体与第一可检测标记偶联；(ii)使样品中的蛋白质与第二抗体接触，所述第二抗体与癌症生物标记物免疫特异性地结合，所述第二抗体与第二可检测标记偶联；(iii)检测与所述蛋白质结合的第一抗体和第二抗体的存在；以及(iv)基于所述第一抗体中可检测标记的量确定本文提供的生物标记物的水平，并且基于所述第二抗体中可检测标记的量确定所述癌症生物标记物的水平。在一些实施方案中，癌症生物标记物是淋巴瘤生物标记物。在其他实施方案中，癌症生物标记物是NHL生物标记物。在某些实施方案中，癌症生物标记物是DLBCL生物标记物。在一些实施方案中，癌症生物标记物是MM生物标记物。在其他实施方案中，癌症生物标记物是白血病生物标记物。在其他实施方案中，癌症生物标记物是AML生物标记物。
本领域中已知若干种检测或量化mRNA水平的方法。示例性方法包括但不限于northern印迹、核糖核酸酶保护测定、基于PCR的方法等。生物标记物的mRNA序列可以用于制备与mRNA序列至少部分互补的探针。然后，可以使用任何合适的测定(如基于PCR的方法、northern印迹、浸量尺测定等)，使用所述探针检测样品中的mRNA。
在其他实施方案中，可以制备用于测试生物样品中化合物活性的核酸测定。测定通常含有固体支持物和接触支持物的至少一种核酸，其中所述核酸对应于mRNA的至少一部分，所述mRNA如生物标记物的mRNA在患者中的化合物治疗过程中具有改变的表达。所述测定也可以用于检测样品中mRNA的改变的表达。
可以根据所需的mRNA信息的类型来改变测定方法。示例性方法包括但不限于Northern印迹和基于PCR的方法(例如，qRT-PCR)。诸如qRT-PCR的方法也可以准确地定量样品中mRNA的量。
任何合适的测定平台都可以用于确定样品中mRNA的存在。例如，测定可以是浸量尺、膜、芯片、磁盘、测试条、过滤器、微球、载玻片、多孔板或光纤的形式。测定系统可以具有被对应于mRNA的核酸附着其上的固体支持物。固体支持物可以包括例如塑料、硅胶、金属、树脂、玻璃、膜、粒子、沉淀物、凝胶、聚合物、薄片、球体、多糖、毛细管、毛细血管、薄膜、板或载玻片。可以制备测定组分并将其包装在一起作为用于检测mRNA的试剂盒。
如果需要，可以对核酸进行标记以制备标记的mRNA的群体。一般而言，可以使用在本领域中熟知的方法(例如，使用DNA连接酶、末端转移酶或通过标记RNA骨架等)标记样品。参见例如，Ausubel等人,Short Protocols in Molecular Biology(Wiley&Sons,第3版1995)；Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor,N.Y.,第3版2001)。在一些实施方案中，用荧光标记来标记样品。示例性荧光染料包括但不限于呫吨染料、荧光素染料(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、6-羧基荧光素(FAM)、6-羧基-2’,4’,7’,4,7-六氯荧光素(HEX)、6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素(JOE))、罗丹明染料(例如，罗丹明110(R110)、N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、5-羧基罗丹明6G(R6G5或G5)、6-羧基罗丹明6G(R6G6或G6))、花青染料(例如，Cy3、Cy5和Cy7)、Alexa染料(例如，Alexa-fluor-555)、香豆素、二乙基氨基香豆素、伞形酮、苯甲酰亚胺染料(例如，Hoechst 33258)、菲啶染料(例如，德克萨斯红)、乙锭染料、吖啶染料、咔唑染料、吩噁嗪染料、卟啉染料、聚甲炔染料、BODIPY染料、喹啉染料、芘、氯三嗪基荧光素、曙红染料、四甲基罗丹明、丽丝胺、萘基荧光素等。
在一些实施方案中，所述mRNA序列包含本文提供的生物标记物的至少一种mRNA。
核酸可以存在于固体支持物上特定的、可寻址的位置，每个位置对应于在细胞或患者中用化合物治疗后差异表达的mRNA序列的至少一部分。
典型的mRNA测定方法可以包括以下步骤：1)获得表面结合的主题探针；2)在足以提供特异性结合的条件下使mRNA群体与表面结合的探针杂交；(3)杂交后洗涤以去除未与表面结合的探针特异性结合的核酸；以及(4)检测杂交的mRNA。在这些步骤中的每一个中使用的试剂及其使用条件可以根据特定应用而变化。
杂交可以在合适的杂交条件下进行，所述杂交条件的严格性可以根据需要而变化。典型的条件足以在固体表面上在互补结合成员之间即在表面结合的主题探针与样品中的互补mRNA之间产生探针/靶标复合物。在某些实施方案中，可以采用严格杂交条件。
杂交通常在严格杂交条件下进行。标准杂交技术(例如，在足以使样品中的靶mRNA与探针特异性结合的条件下)描述于Kallioniemi et al.,Science 1992,258:818-821和国际专利申请公开号WO 93/18186中。一些通用技术的指南可以通过例如Tijssen,Hybridization with Nucleic Acid Probes,第I和第II部分(Elsevier,Amsterdam 1993)获得。关于适用于原位杂交的技术的描述参见Gall等人,Meth.Enzymol.1981,21:470-480；Angerer等人,Genetic Engineering:Principles and Methods,第7卷,第43-65页(PlenumPress,New York,Setlow和Hollaender编辑1985)。适当条件(包括温度、盐浓度、多核苷酸浓度、杂交时间、洗涤条件的严格性等)的选择将取决于实验设计，包括样品来源、捕获剂的特性、预期的互补程度等，并且对于本领域的普通技术人员来说，其可以作为常规实验的问题来确定。
普通技术人员将容易地认识到，可以使用替代方案但可比较的杂交和洗涤条件来提供具有类似严格性的条件。
在mRNA杂交程序之后，通常洗涤表面结合的多核苷酸以去除未结合的核酸。洗涤可以使用任何方便的洗涤方案进行，其中洗涤条件通常是严格的，如上所述。然后使用标准技术检测靶mRNA与探针的杂交。
其他方法(如基于PCR的方法)也可以用于检测本文提供的生物标记物的表达。PCR方法的例子可以在美国专利号6,927,024中找到，将其通过引用以其整体并入本文。RT-PCR方法的例子可以在美国专利号7,122,799中找到，将其通过引用以其整体并入本文。美国专利号7,186,507中描述了荧光原位PCR的方法，将其通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，定量逆转录-PCR(qRT-PCR)可以用于RNA靶标的检测和量化(Bustin等人,Clin.Sci.2005,109:365-379)。通过qRT-PCR获得的定量结果通常比定性数据提供更多信息。因此，在一些实施方案中，基于qRT-PCR的测定可以用于在基于细胞的测定期间测量mRNA水平。qRT-PCR方法也可用于监测患者疗法。基于qRT-PCR的方法的例子可以在例如美国专利号7,101,663中找到，将其通过引用以其整体并入本文。
与常规逆转录酶-PCR和通过琼脂糖凝胶的分析形成对照，qRT-PCR提供定量结果。qRT-PCR的另一个优点是使用起来相对简单和方便。用于qRT-PCR的仪器(如AppliedBiosystems 7500)是可商购的，试剂(如
Figure BDA0003710765600000441
Sequence Detection Chemistry)也是如此。例如，可以按照制造商的说明使用
Figure BDA0003710765600000442
基因表达测定。这些试剂盒是预先配制的基因表达测定，以用于快速、可靠地检测和量化人、小鼠和大鼠mRNA转录物。例如，示例性qRT-PCR程序是50℃持续2分钟，95℃持续10分钟，40个如下循环：95℃持续15秒，然后60℃持续1分钟。
为了确定与特定扩增子积累相关的荧光信号超过阈值的循环数(称为CT)，例如可以使用7500实时PCR系统序列检测软件相比于使用比较性CT相对量化计算方法来分析数据。使用这种方法，输出表示为表达水平的倍数变化。在一些实施方案中，阈值水平可以选择为由软件自动确定。在一些实施方案中，阈值水平被设置为高于基线但足够低以在扩增曲线的指数增长区域内。
5.4.受试者、样品和细胞类型
在某些实施方案中，本文提供的各种方法使用来自受试者或个体(例如，患者)的样品(例如，生物样品)。受试者可以是患者，如患有癌症(例如，淋巴瘤、MM或白血病)的患者。受试者可以是哺乳动物，例如人。受试者可以是男性或女性，并且可以是成人、儿童或婴儿。样品可以在癌症(例如，淋巴瘤、MM或白血病)的活跃期或癌症(例如，淋巴瘤、MM或白血病)不活跃时进行分析。在某些实施方案中，可以从受试者获得多于一种样品。
在某些实施方案中，用于本文提供的方法中的样品包括来自受试者的体液。体液的非限制性例子包括血液(例如，全血)、血浆、羊水、房水、胆汁、耳垢、考珀氏液、射精前液、乳糜、食糜、女性射液、间隙液体、淋巴液、月经、母乳、粘液、胸液、脓液、唾液、皮脂、精液、血清、汗液、眼泪、尿液、阴道润滑性分泌物、呕吐物、水、粪便、内部体液(包括大脑和脊髓周围的脑脊液)、滑液、细胞内液(细胞内的液体)和玻璃体液(眼球内的液体)。在一些实施方案中，样品是血液样品。可以使用如在例如Innis等人,编辑,PCR Protocols(AcademicPress,1990)中描述的常规技术来获得血液样品。可以使用常规技术或可商购的试剂盒(例如，RosetteSep试剂盒(Stein Cell Technologies，加拿大温哥华))从血液样品分离白细胞。白细胞亚群(例如，单个核细胞、B细胞、T细胞、单核细胞、粒细胞或淋巴细胞)可以使用常规技术进一步分离，所述常规技术例如磁激活细胞分选(MACS)(Miltenyi Biotec，加利福尼亚州奥本)或荧光激活细胞分选(FACS)(Becton Dickinson，加利福尼亚州圣何塞)。
在一个实施方案中，血液样品是从约0.1mL至约10.0mL、从约0.2mL至约7mL、从约0.3mL至约5mL、从约0.4mL至约3.5mL、或从约0.5mL至约3mL。在另一个实施方案中，血液样品是约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.5、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约6.0、约7.0、约8.0、约9.0或约10.0mL。
在一些实施方案中，本发明方法中使用的样品包括活检(例如，肿瘤活检)。活检可以来自任何器官或组织，例如皮肤、肝脏、肺、心脏、结肠、肾脏、骨髓、牙齿、淋巴结、头发、脾脏、脑、乳房或其他器官。可以使用本领域技术人员已知的任何活检技术从受试者分离样品，所述活检技术例如开放性活检、闭合性活检、核芯活检、切开活检、切除活检或细针抽吸活检。
在一个实施方案中，本文提供的方法中使用的样品是在受试者接受用于所述疾病或障碍的治疗之前从受试者获得的。在另一个实施方案中，样品是在受试者接受用于所述疾病或障碍的治疗期间从受试者获得的。在另一个实施方案中，样品是在受试者接受用于所述疾病或障碍的治疗之后从受试者获得的。在各种实施方案中，治疗包括向受试者施用化合物(例如，下文第5.5节中提供的化合物)。
在某些实施方案中，用于本文提供的方法中的样品包含多种细胞，如癌症(例如，淋巴瘤、MM或白血病)细胞。此类细胞可以包括任何类型的细胞，例如干细胞、血细胞(例如，外周血单个核细胞(PBMC))、淋巴细胞、B细胞、T细胞、单核细胞、粒细胞、免疫细胞或癌细胞。
B细胞(B淋巴细胞)包括例如浆B细胞、记忆B细胞、B1细胞、B2细胞、边缘区B细胞和滤泡性B细胞。B细胞可以表达免疫球蛋白(抗体)和B细胞受体。
可以使用可商购的抗体(例如，来自Quest Diagnostic(San Juan Capistrano，加利福尼亚州)或Dako(丹麦)的抗体)的组合来获得特定的细胞群。
在某些实施方案中，本文提供的方法中的细胞是PBMC。在某些实施方案中，用于本文提供的方法中的样品来自患病组织，例如来自患有癌症(例如，淋巴瘤、MM或白血病)的个体。
在某些实施方案中，细胞系用于评价化合物的作用、研究作用机制或确定生物标记物的参考水平等的疾病模型。在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的细胞来自癌症(例如，AML)细胞系。在某些实施方案中，细胞来自淋巴瘤细胞系。在其他实施方案中，细胞来自MM细胞系。在其他实施方案中，细胞来自白血病细胞系。在一些实施方案中，白血病细胞系是CLL细胞系。在其他实施方案中，白血病细胞系是ALL细胞系。在又其他实施方案中，白血病细胞系是CML细胞系。在又其他实施方案中，白血病细胞系是AML细胞系。在一个实施方案中，AML细胞系是KG-1细胞系。在另一个实施方案中，AML细胞系是KG-1a细胞系。在又另一个实施方案中，AML细胞系是KASUMI-1细胞系。在仍另一个实施方案中，AML细胞系是NB4细胞系。在一个实施方案中，AML细胞系是MV-4-11细胞系。在另一个实施方案中，AML细胞系是MOLM-13细胞系。在又另一个实施方案中，AML细胞系是HL-60细胞系。在又一个实施方案中，AML细胞系是U-937细胞系。在一个实施方案中，AML细胞系是OCI-AML2细胞系。在另一个实施方案中，AML细胞系是OCI-AML3细胞系。在又另一个实施方案中，AML细胞系是HNT-34细胞系。在仍另一个实施方案中，AML细胞系是ML-2细胞系。在一个实施方案中，AML细胞系是AML-193细胞系。在另一个实施方案中，AML细胞系是F36-P细胞系。在又另一个实施方案中，AML细胞系是KASUMI-3细胞系。在仍另一个实施方案中，AML细胞系是MUTZ-8细胞系。在一个实施方案中，AML细胞系是GDM-1细胞系。在另一个实施方案中，AML细胞系是SIG-M5细胞系。在又另一个实施方案中，AML细胞系是TF-1细胞系。在仍另一个实施方案中，AML细胞系是Nomo-1细胞系。在一个实施方案中，AML细胞系是UT-7细胞系。在另一个实施方案中，AML细胞系是THP-1细胞系。
在某些实施方案中，本文提供的方法可用于检测来自健康个体的细胞中的基因重排。在某些实施方案中，用于本文提供的方法中的细胞的数量可以在从单个细胞至约109个细胞的范围内。在一些实施方案中，用于本文提供的方法中的细胞的数量是约1x104、约5x104、约1x105、约5x105、约1x106、约5x106、约1x107、约5x107、约1x108、约5x108或约1x109。
可以例如通过以下方式监测从受试者收集的细胞的数量和类型：通过使用标准细胞检测技术(如流式细胞术、细胞分选、免疫细胞化学(例如，用组织特异性或细胞标记物特异性抗体染色)、荧光激活细胞分选(FACS)、磁激活细胞分选(MACS))测量细胞表面标记物的变化、通过使用光或共聚焦显微术检查细胞的形态和/或通过使用本领域熟知的技术(如PCR和基因表达谱分析)测量基因表达的变化。这些技术也可以用于鉴定对一种或多种特定标记物呈阳性的细胞。
在某些实施方案中，细胞子集用于本文提供的方法中。分选和分离特定细胞群的方法在本领域中是熟知的并且可以基于细胞大小、形态或细胞内或细胞外标记物。此类方法包括但不限于流式细胞术、流式分选、FACS、基于珠粒的分离如磁性细胞分选、基于大小的分离(例如，筛子、一连串障碍物或过滤器)、在微流体装置中分选、基于抗体的分离、沉降、亲和吸附、亲和提取、密度梯度离心、激光捕获显微切割等。FACS是熟知的基于粒子的荧光特性分离粒子(包括细胞)的方法(Kamarch,Methods Enzymol.1987,151:150-165)。单独粒子中荧光部分的激光激发产生小电荷，从而允许从混合物电磁分离正粒子和负粒子。在一个实施方案中，细胞表面标记物特异性抗体或配体用不同的荧光标记进行标记。细胞通过细胞分选仪进行加工，以允许基于细胞与所用抗体结合的能力分离细胞。FACS分选的粒子可以直接沉积至96孔或384孔板的各个孔中，以促进分离和克隆。
在一个实施方案中，从肿瘤纯化RNA(例如，mRNA)或蛋白质，并且通过mRNA或蛋白质表达分析测量基因集的水平。在某些实施方案中，基因集的水平通过转录组分析、qRT-PCR、微阵列、高通量测序或本领域已知的其他类似方法来测量。在其他实施方案中，基因集的水平通过ELISA、流式细胞术、免疫荧光或本领域已知的其他类似方法来测量。
5.5.化合物
适用于本文提供的方法和配制品的化合物是具有以下结构化合物D：2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺：
Figure BDA0003710765600000471
或者其立体异构体或者其立体异构体、同位素体、药学上可接受的盐、互变异构体、溶剂化物、水合物、共晶、包合物或多晶型物的混合物。在某些实施方案中，化合物D是指2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺。
化合物D可以根据本文提供的实施例中描述的方法或如美国专利号9,499,514中所述的方法制备，将所述专利的公开内容通过引用以其整体并入本文。所述化合物还可以根据本领域技术人员所清楚的其他方法基于本文的教导来合成。
在某些实施方案中，化合物D是固体。在某些实施方案中，化合物D是水合物。在某些实施方案中，化合物D是溶剂化的。在某些实施方案中，化合物D是无水的。
在某些实施方案中，化合物D是无定形的。在某些实施方案中，化合物D是结晶的。在某些实施方案中，化合物D是在2017年1月6日提交的美国公开号2017-0197934中描述的结晶形式，将其通过引用以其整体并入本文。
固体形式的化合物D可以根据2017年1月6日提交的美国公开号2017-0197934的公开内容中描述的方法来制备。所述固体形式也可以根据本领域技术人员所清楚的其他方法来制备。
在一个实施方案中，化合物D是2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺的多晶型物形式A、形式B、形式C、形式D、形式E或无定形形式。本文简要描述了2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺的多晶型物。在某些实施方案中，化合物D具有如美国公开号2019/0030018中所述的多晶型物形式，将其公开内容通过引用以其整体并入本文，并且其部分在下文中进行了更详细的描述。
2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺的形式A
在某些实施方案中，本文提供的配制品由化合物D的形式A制备。
在一个实施方案中，形式A是化合物D的无水形式。在另一个实施方案中，化合物D的形式A是结晶的。
在某些实施方案中，形式A是通过从某些溶剂系统例如包含一种或多种以下溶剂的溶剂系统结晶获得的：丙酮和室温下的异丙醇和水的溶剂混合物。在某些实施方案中，在升高的温度(例如约50℃)下在乙醇/水(1:1)、丙酮或乙腈中从浆液获得作为中间固体形式的形式A。
在某些实施方案中，形式A基本上是结晶的，如通过例如X射线粉末衍射测量所表明的。在一个实施方案中，化合物D的形式A具有基本上如美国公开号2019/0030018的图2中所示的X射线粉末衍射图。
在一个实施方案中，化合物D的形式A具有在约11.5、15.6、16.6、17.2、18.1、19.0、19.6、21.1、23.2或24.8度2θ的2θ角处的一个或多个特征X射线粉末衍射峰，如美国公开号2019/0030018的图2中所描绘。在另一个实施方案中，化合物D的形式A具有在约15.6、16.6、17.2或24.8度2θ的2θ角处的一个、两个、三个或四个特征X射线粉末衍射峰。在另一个实施方案中，化合物D的形式A具有如表A中所示的一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个特征X射线粉末衍射峰。在另一个实施方案中，化合物D的形式A具有如表A中所示的一个、两个或三个特征X射线粉末衍射峰。
表A
Figure BDA0003710765600000481
在一个实施方案中，化合物D的形式A具有如美国公开号2019/0030018的图3所示的SEM照片。
在一个实施方案中，化合物D的结晶形式具有基本上对应于如美国公开号2019/0030018的图4中所描绘的代表性TGA热谱图的热重分析(TGA)热图。在某些实施方案中，没有观察到形式A的TGA重量损失。
在一个实施方案中，化合物D的结晶形式A具有基本上对应于如美国公开号2019/0030018的图5中所描绘的DSC热谱图。在某些实施方案中，形式A通过包括具有229℃的起始温度和118J/g的熔化热的熔解事件的DSC图来表征。
在某些实施方案中，形式A通过动态蒸气吸附分析来表征。代表性动态蒸气吸附(DVS)等温线图显示在美国公开号2019/0030018的图6中。在某些实施方案中，当相对湿度(“RH”)从约0％RH增加至约90％RH时，形式A展现出小于1.5％、小于1.2％或约1.2％w/w的水吸收。在某些实施方案中，形式A包含小于0.1％的水，如在配备有设置在225℃下的烘箱样品处理器的库仑卡尔费休(KF)滴定仪中测定的。
在某些实施方案中，通过1H NMR没有观察到形式A的显著降解或残留溶剂(参见美国公开号2019/0030018的图7)。
在某些实施方案中，化合物D的形式A通过其压缩后的稳定性曲线来表征。在某些实施方案中，形式A是稳定的，例如在施加2000-psi压力约1分钟后，其XRPD图基本保持不变且具有更宽的衍射峰(参见美国公开号2019/0030018的图8)。
在仍另一个实施方案中，化合物D的形式A是基本上纯的。在某些实施方案中，化合物D的基本上纯的形式A基本上不含其他固体形式，例如无定形形式。在某些实施方案中，化合物D的基本上纯的形式A的纯度不低于约95％纯、不低于约96％纯、不低于约97％纯、不低于约98％纯、不低于约98.5％纯、不低于约99％纯、不低于约99.5％纯或不低于约99.8％纯。
在某些实施方案中，化合物D的形式A是基本上纯的。在本文的某些实施方案中，化合物D的形式A基本上不含包含化合物D的其他固体形式，包括例如包含化合物D的形式B、C、D、E和/或无定形固体形式。在某些实施方案中，形式A是包含化合物D的固体形式的混合物，包括例如包含以下中的一种或多种的混合物：包含化合物D的形式B、C、D、E和无定形固体形式。
2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺的形式B
在某些实施方案中，本文提供的配制品由化合物D的无定形形式B制备。
在某些实施方案中，形式B是通过反溶剂重结晶从某些溶剂系统例如包含一种或多种以下溶剂的溶剂系统获得的：甲醇/水、DMSO/异丙醇、DMSO/甲苯和DMSO/水。在某些实施方案中，形式B是通过从THF/水(1:1)冷却重结晶获得的。
在某些实施方案中，形式B是结晶的，如通过例如X射线粉末衍射测量所表明的。在一个实施方案中，化合物D的形式B具有基本上如美国公开号2019/0030018的图9中所示的X射线粉末衍射图。
在一个实施方案中，化合物D的形式B具有在约15.4、16.3、16.7、17.7、20.4、25.6或27.5度2θ的2θ角处的一个或多个特征X射线粉末衍射峰，如美国公开号2019/0030018的图9中所描绘。在另一个实施方案中，化合物D的形式B具有在约16.7、25.6、15.4或16.3度2θ的2θ角处的一个、两个、三个或四个特征X射线粉末衍射峰。在另一个实施方案中，化合物D的形式B具有如表B中所示的一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个特征X射线粉末衍射峰。在另一个实施方案中，化合物D的形式B具有如表B中所示的一个、两个或三个特征X射线粉末衍射峰。
表B
Figure BDA0003710765600000491
Figure BDA0003710765600000501
在一个实施方案中，化合物D的形式B具有如美国公开号2019/0030018的图10所示的SEM照片。在一个实施方案中，化合物D的结晶形式具有基本上对应于如美国公开号2019/0030018的图11中所描绘的代表性TGA热谱图的热重分析(TGA)热图。在某些实施方案中，形式B显示出低于170℃的TGA重量损失。在某些实施方案中，形式B在170℃-230℃之间显示出0.4％的TGA重量损失。
在一个实施方案中，化合物D的结晶形式B具有基本上对应于如美国公开号2019/0030018的图12中所描绘的DSC热谱图。在某些实施方案中，形式B通过包括在219℃-224℃下的熔解/重结晶事件和具有231℃的峰值温度的主要熔解事件的DSC图来表征。
在某些实施方案中，形式B通过动态蒸气吸附分析来表征。代表性动态蒸气吸附(DVS)等温线图显示在美国公开号2019/0030018的图13中。在某些实施方案中，当相对湿度(“RH”)从约0％RH增加至约90％RH时，形式B展现出约1.4％w/w的水吸收。在某些实施方案中，形式B包含小于0.1％的水，如在配备有设置在225℃下的烘箱样品处理器的库仑卡尔费休(KF)滴定仪中测定的。
在某些实施方案中，通过1H NMR，形式B没有显示出显著的降解或残留溶剂(参见美国公开号2019/0030018的图14)。
在某些实施方案中，化合物D的形式B通过其压缩后的稳定性曲线来表征。在某些实施方案中，形式B是稳定的，例如在施加2000-psi压力约1分钟后，其XRPD图基本保持不变且具有更宽的衍射峰(参见美国公开号2019/0030018的图15)。
在仍另一个实施方案中，化合物D的形式B是基本上纯的。在某些实施方案中，化合物D的基本上纯的形式B基本上不含其他固体形式，例如无定形形式。在某些实施方案中，化合物D的基本上纯的形式B的纯度不低于约95％纯、不低于约96％纯、不低于约97％纯、不低于约98％纯、不低于约98.5％纯、不低于约99％纯、不低于约99.5％纯或不低于约99.8％纯。
在某些实施方案中，化合物D的形式B是基本上纯的。在本文的某些实施方案中，化合物D的形式B基本上不含包含化合物D的其他固体形式，包括例如包含化合物D的形式A、C、D、E和/或无定形固体形式。在某些实施方案中，形式B是包含化合物D的固体形式的混合物，包括例如包含以下中的一种或多种的混合物：包含化合物D的形式A、C、D、E和无定形固体形式。
2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺的形式C
在某些实施方案中，本文提供的配制品由化合物D的无水形式C制备。在某些实施方案中，形式C是化合物D的晶形中热力学最稳定的无水物。
在某些实施方案中，形式C是通过将化合物D在某些溶剂系统(例如，包含一种或多种以下溶剂的溶剂系统：乙腈/水、丙酮或乙醇/水)中长时间浆化获得的。
在某些方面，形式C是通过以下方法获得的：在升高的温度(例如60℃-80℃或70℃-75℃)下将形式B型(1X wt)在丙酮(30X vol)中浆化至少24小时，并且将混合物冷却至室温。在一个方面，浆化在70℃-75℃的温度下、50psi-55psi的氮气压力下进行。在一个方面，混合物经至少6小时冷却至室温。
在某些实施方案中，形式C是结晶的，如通过例如X射线粉末衍射测量所表明的。在一个实施方案中，化合物D的形式C具有基本上如美国公开号2019/0030018的图16中所示的X射线粉末衍射图。
在一个实施方案中，化合物D的形式C具有在约7.4、11.5、15.8、16.7、16.9、17.7、18.4、19.2、19.5、21.1、23.4、24.7或29.9度2θ的2θ角处的一个或多个特征X射线粉末衍射峰，如美国公开号2019/0030018的图16中所描绘。在另一个实施方案中，化合物D的形式C具有在约16.7、16.9、17.7或24.7度2θ的2θ角处的一个、两个、三个或四个特征X射线粉末衍射峰。在另一个实施方案中，化合物D的形式C具有如表C中所示的一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个特征X射线粉末衍射峰。在另一个实施方案中，化合物D的形式C具有如表C中所示的一个、两个或三个特征X射线粉末衍射峰。
表C
Figure BDA0003710765600000511
在一个实施方案中，化合物D的形式C具有如美国公开号2019/0030018的图17所示的SEM照片。在一个实施方案中，化合物D的结晶形式具有基本上对应于如美国公开号2019/0030018的图18中所描绘的代表性TGA热谱图的热重分析(TGA)热图。在某些实施方案中，形式C没有显示出TGA重量损失。
在一个实施方案中，化合物D的结晶形式C具有基本上对应于如美国公开号2019/0030018的图19中所描绘的DSC热谱图。在某些实施方案中，形式C通过包括具有232℃的起始温度和126J/g的熔化热的熔解事件的DSC图来表征。
在某些实施方案中，形式C通过动态蒸气吸附分析来表征。代表性动态蒸气吸附(DVS)等温线图显示在美国公开号2019/0030018的图20中。在某些实施方案中，当相对湿度(“RH”)从约0％RH增加至约90％RH时，形式C展现出约0.6％w/w的水吸收。在某些实施方案中，形式C包含小于0.1％的水，如在配备有设置在225℃下的烘箱样品处理器的库仑卡尔费休(KF)滴定仪中测定的。
在某些实施方案中，通过1H NMR，形式C没有显示出显著的降解或残留溶剂(参见美国公开号2019/0030018的图21)。
在某些实施方案中，化合物D的形式C通过其压缩后的稳定性曲线来表征。在某些实施方案中，形式C是稳定的，例如在施加2000-psi压力约1分钟后，其XRPD图基本保持不变且具有更宽的衍射峰(参见美国公开号2019/0030018的图22)。
在仍另一个实施方案中，化合物C的形式B是基本上纯的。在某些实施方案中，化合物D的基本上纯的形式C基本上不含其他固体形式，例如无定形形式。在某些实施方案中，化合物D的基本上纯的形式C的纯度不低于约95％纯、不低于约96％纯、不低于约97％纯、不低于约98％纯、不低于约98.5％纯、不低于约99％纯、不低于约99.5％纯或不低于约99.8％纯。
在某些实施方案中，化合物D的形式C是基本上纯的。在本文的某些实施方案中，化合物D的形式C基本上不含包含化合物D的其他固体形式，包括例如包含化合物D的形式A、B、D、E和/或无定形固体形式。在某些实施方案中，形式C是包含化合物D的固体形式的混合物，包括例如包含以下中的一种或多种的混合物：包含化合物D的形式A、B、D、E和无定形固体形式。
2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺的形式D
在某些实施方案中，本文提供的配制品由化合物D的形式D制备。在某些实施方案中，化合物D的形式D是DMSO溶剂化物。
在某些实施方案中，形式D是通过在DMSO/甲基异丁基酮中加热形式B并且冷却溶液获得的。
在某些实施方案中，形式D是结晶的，如通过例如X射线粉末衍射测量所表明的。在一个实施方案中，化合物D的形式D具有基本上如美国公开号2019/0030018的图23中所示的X射线粉末衍射图。
在一个实施方案中，化合物D的形式D具有在约14.1、14.3、18.8、19.1、23.6或24.0度2θ的2θ角处的一个或多个特征X射线粉末衍射峰，如美国公开号2019/0030018的图23中所描绘。在另一个实施方案中，化合物D的形式D具有在约14.1、14.3、18.8或19.1度2θ的2θ角处的一个、两个、三个或四个特征X射线粉末衍射峰。在另一个实施方案中，化合物D的形式D具有如表D中所示的一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个特征X射线粉末衍射峰。在另一个实施方案中，化合物D的形式D具有如表D中所示的一个、两个或三个特征X射线粉末衍射峰。
表D
Figure BDA0003710765600000521
Figure BDA0003710765600000531
在一个实施方案中，本文提供了化合物D的结晶形式，其具有基本上对应于如美国公开号2019/0030018的图24中所描绘的代表性TGA热谱图的热重分析(TGA)热图。在某些实施方案中，形式D显示出高达140℃下约14.1％的TGA重量损失。
在某些实施方案中，形式D包含约14.3wt％的DMSO，如通过气相色谱法测量。
在仍另一个实施方案中，化合物D的形式D是基本上纯的。在某些实施方案中，化合物D的基本上纯的形式D基本上不含其他固体形式，例如无定形形式。在某些实施方案中，化合物D的基本上纯的形式D的纯度不低于约95％纯、不低于约96％纯、不低于约97％纯、不低于约98％纯、不低于约98.5％纯、不低于约99％纯、不低于约99.5％纯或不低于约99.8％纯。
在某些实施方案中，化合物D的形式D是基本上纯的。在某些实施方案中，化合物D的形式D基本上不含包含化合物D的其他固体形式，包括例如包含本文提供的化合物D的形式A、B、C、E和/或无定形固体形式。在某些实施方案中，形式D是包含化合物D的固体形式的混合物，包括例如包含以下中的一种或多种的混合物：包含化合物D的形式A、B、C、E和无定形固体形式。
2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺的形式E
在某些实施方案中，本文提供的配制品由化合物D的形式E制备。在某些实施方案中，化合物D的形式E是DMSO溶剂化物。
在某些实施方案中，形式E是在室温下从DMSO/MIBK或DMSO/IPA或DMSO/苯甲醚中的形式C获得。
在某些实施方案中，形式E是结晶的，如通过例如X射线粉末衍射测量所表明的。在一个实施方案中，化合物D的形式E具有基本上如美国公开号2019/0030018的图25中所示的X射线粉末衍射图。
在一个实施方案中，化合物D的形式E具有在约10.5、12.5、16.1、17.0、18.5、21.2、21.7、22.6、22.9、23.4、23.8、24.1、25.1或26.7度2θ的2θ角处的一个或多个特征X射线粉末衍射峰，如美国公开号2019/0030018的图25中所描绘。在另一个实施方案中，化合物D的形式E具有在约16.1、17.0、21.2或22.9度2θ的2θ角处的一个、两个、三个或四个特征X射线粉末衍射峰。在另一个实施方案中，化合物D的形式E具有如表E中所示的一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个特征X射线粉末衍射峰。在另一个实施方案中，化合物D的形式E具有如表E中所示的一个、两个或三个特征X射线粉末衍射峰。
表E
Figure BDA0003710765600000541
在一个实施方案中，本文提供了化合物D的结晶形式，其具有基本上对应于如美国公开号2019/0030018的图26中所描绘的代表性TGA热谱图的热重分析(TGA)热图。在某些实施方案中，形式E显示出高达120℃下约19.4％的TGA重量损失。在某些实施方案中，形式E在120℃与220℃之间显示出另外的24.9％的重量损失。
在一个实施方案中，化合物D的形式E是基本上纯的。在某些实施方案中，化合物D的基本上纯的形式E基本上不含其他固体形式，例如无定形形式。在某些实施方案中，化合物D的基本上纯的形式E的纯度不低于约95％纯、不低于约96％纯、不低于约97％纯、不低于约98％纯、不低于约98.5％纯、不低于约99％纯、不低于约99.5％纯或不低于约99.8％纯。
在某些实施方案中，化合物D的形式E是基本上纯的。在本文的某些实施方案中，化合物D的形式E基本上不含包含化合物D的其他固体形式，包括例如包含化合物D的形式A、B、C、D和/或无定形固体形式。在某些实施方案中，形式E是包含化合物D的固体形式的混合物，包括例如包含以下中的一种或多种的混合物：包含化合物D的形式A、B、C、D和无定形固体形式。
2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺的无定形形式
在某些实施方案中，本文提供的配制品包含无定形化合物D。
在某些实施方案中，本文提供了用于通过加热在THF和水中的化合物D并冷却溶液来制备无定形形式的方法。
在一个实施方案中，本文提供了化合物D的无定形固体形式，其具有如美国公开号2019/0030018的图27中所描绘的调制DSC热谱图。
在一个实施方案中，无定形化合物D具有基本上如美国公开号2019/0030018的图28中所示的X射线粉末衍射图。
在一个实施方案中，无定形化合物D具有基本上如美国公开号2019/0030018的图29中所示的1H NMR谱。
在仍另一个实施方案中，无定形化合物D是基本上纯的。在某些实施方案中，基本上纯的无定形化合物D基本上不含其他固体形式，例如形式A、形式B、形式C、形式D或形式E。在某些实施方案中，基本上纯的无定形化合物D的纯度是不低于约95％纯、不低于约96％纯、不低于约97％纯、不低于约98％纯、不低于约98.5％纯、不低于约99％纯、不低于约99.5％纯或不低于约99.8％纯。
2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺的同位素体
本文还提供了本文提供的2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺的同位素富集的类似物(“同位素体”)。用于改善药代动力学(“PK”)、药效学(“PD”)和毒性特征的药物的同位素富集(例如，氘化)先前已用某些类别的药物进行了证明。参见例如，Lijinsky等人,Food Cosmet.Toxicol.,20:393(1982)；Lijinsky等人,J.Nat.Cancer Inst.,69:1127(1982)；Mangold等人,MutationRes.308:33(1994)；Gordon等人,Drug Metab.Dispos.,15:589(1987)；Zello等人,Metabolism,43:487(1994)；Gately等人,J.Nucl.Med.,27:388(1986)；Wade D,Chem.Biol.Interact.117:191(1999)。
不受任何特定理论的限制，药物的同位素富集可以用于例如(1)降低或消除不需要的代谢物，(2)增加母体药物的半衰期，(3)减少实现所需效果所需的剂量的数量，(4)减少实现所需效果所需的剂量的量，(5)增加活性代谢物的形成(如果形成了的话)，和/或(6)减少特定组织中有害代谢物的产生和/或产生用于组合疗法的更有效的药物和/或更安全的药物，无论所述组合疗法是否为有意的。
将原子替换为其同位素中的一种通常会导致化学反应的反应速率的变化。这种现象被称为动力学同位素效应(“KIE”)。例如，如果C-H键在化学反应中的速率决定步骤(即具有最高过渡态能量的步骤)中断裂，则用氘取代该氢将导致反应速率降低，并且过程会变慢。这种现象被称为氘动力学同位素效应(“DKIE”)。(参见例如，Foster等人,Adv.DrugRes.,第14卷,第1-36页(1985)；Kushner等人,Can.J.Physiol.Pharmacol.,第77卷,第79-88页(1999))。
DKIE的量级可以表示为其中C-H键断裂的给定反应的速率与其中氘取代氢的相同反应的速率之间的比率。DKIE的范围可以从约1(无同位素效应)至非常大的数字，如50或更多，这意味着当氘取代氢时反应可以慢五十倍或更多倍。不受特定理论的限制，高DKIE值可能部分由于称为隧道效应的现象，这是不确定性原理的结果。隧穿效应归因于氢原子的小质量，并且由于以下原因而发生：涉及质子的过渡态有时可以在缺乏所需的活化能的情况下形成。因为氘的质量比氢大，所以在统计上其发生这种现象的可能性要低得多。
氚(“T”)是氢的放射性同位素，用于研究、聚变反应堆、中子发生器和放射性药物。氚是在原子核中具有2个中子且原子量接近3的氢原子。其在自然界中以非常低的浓度存在于环境中，最常见被发现为T2O。氚衰变缓慢(半衰期＝12.3年)并释放出无法穿透人体皮肤外层的低能量β粒子。内部暴露是与这种同位素相关的主要危害，但必须大量摄入才会对健康构成重大风险。与氘相比，氚在其达到危险水平之前必须食用较少量的氚。用氚(“T”)取代氢产生比氘更强的键，并在数值上产生更大的同位素效应。
类似地，对于其他元素的同位素取代(包括但不限于用13C或14C取代碳，33S、34S或36S取代硫，15N取代氮以及17O或18O取代氧)将提供类似的动力学同位素效应。
在某些实施方案中，本文提供的化合物是本文提供的化合物的前药(例如，化合物D的前药)。示例性化合物包括在美国公开号2017/0197933中公开的那些，将其公开内容通过引用以其整体并入本文。
5.6.药物组合物
在一些实施方案中，本文提供的化合物被配制在药物组合物中。在一些实施方案中，化合物D提供于化合物D的稳定配制品中。在一个实施方案中，化合物D的配制品包含2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺的固体形式。在一个实施方案中，化合物D的配制品包含2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺的无定形形式。
在某些实施方案中，所述配制品用二甲亚砜作为共溶剂或加工助剂来制备。在某些实施方案中，所述配制品用甲酸作为共溶剂或加工助剂来制备。在某些实施方案中，所述配制品在没有任何共溶剂或加工助剂的情况下制备。
在某些实施方案中，所述配制品包含二甲亚砜作为共溶剂或加工助剂。在某些实施方案中，所述配制品包含甲酸作为共溶剂或加工助剂。在某些实施方案中，所述配制品不包含任何共溶剂或加工助剂。
在某些实施方案中，本文提供的配制品是冻干配制品。在某些实施方案中，本文提供的配制品是在用于产生药学上可接受的溶液的药学上可接受的溶剂中获得的重构配制品。
配制品Ia
在一个实施方案中，本文提供了包含基于配制品的总重量的约0.05％-0.2％的量的化合物D、约3％-6％的量的柠檬酸盐缓冲液和约92％-98％的量的羟丙基β-环糊精(HPBCD)的配制品。
在一个实施方案中，本文提供了包含基于配制品的总重量的约0.05％-0.2％的量的化合物D、约3％-6％的量的柠檬酸盐缓冲液和约92％-98％的量的磺丁基醚-β-环糊精的配制品。
在一个实施方案中，本文提供了包含基于配制品的总重量的约0.05％-0.2％的量的化合物D、约3％-6％的量的柠檬酸盐缓冲液、约92％-98％的量的HPBCD和不多于约1％的二甲亚砜的配制品。
在一个实施方案中，本文提供了包含基于配制品的总重量的约0.05％-0.2％的量的化合物D、约3％-6％的量的柠檬酸盐缓冲液、约92％-98％的量的磺丁基醚-β-环糊精和不多于约1％的二甲亚砜的配制品。
在一个实施方案中，本文提供了包含基于配制品的总重量的约0.08％-0.15％的量的化合物D、约3％-6％的量的柠檬酸盐缓冲液和约94％-96％的量的HPBCD的配制品。
在一个实施方案中，本文提供了包含基于配制品的总重量的约0.08％-0.15％的量的化合物D、约3％-6％的量的柠檬酸盐缓冲液和约94％-96％的量的磺丁基醚-β-环糊精的配制品。
在一个实施方案中，本文提供了包含基于配制品的总重量的约0.08％-0.15％的量的化合物D、约3％-6％的量的柠檬酸盐缓冲液、约94％-96％的量的HPBCD和不多于约1％的二甲亚砜的配制品。
在一个实施方案中，本文提供了包含基于配制品的总重量的约0.08％-0.15％的量的化合物D、约3％-6％的量的柠檬酸盐缓冲液、约94％-96％的量的磺丁基醚-β-环糊精和不多于约1％的二甲亚砜的配制品。
在一个方面，本文提供的配制品包含基于配制品的总重量的约0.08％至约0.15％的量的化合物D。在某些实施方案中，化合物D的量是基于配制品的总重量的约0.09％至约0.15％、约0.1％至约0.13％或约0.11％至约0.12％。在某些实施方案中，化合物D的量是基于配制品的总重量的约0.05％、0.07％、0.09％、0.11％、0.12％、0.13％或0.15％。在一个实施方案中，配制品中化合物D的量是基于配制品的总重量的约0.12％。
在另一个方面，本文提供了如下配制品，其在20cc小瓶中包含约0.5mg至约2mg的量的化合物D。在仍另一个方面，本文提供了如下配制品，其在20cc小瓶中包含约0.5mg至约1.5mg、约0.75mg至约1.25mg或约0.8mg至约1.1mg的量的化合物D。在一个方面，化合物D在20cc小瓶中以约0.7、0.75、0.76、0.8、0.9、1.0、1.05或1.2mg的量存在。在一个方面，化合物D在20cc小瓶中以约1.05mg的量存在。
在一个方面，本文提供的配制品含有柠檬酸盐缓冲液。在一个方面，本文提供的配制品中柠檬酸盐缓冲液的量是基于配制品的总重量的约3％至约6％。在一个方面，本文提供的配制品中柠檬酸盐缓冲液的量是基于配制品的总重量的约3％、3.5％、4％、4.2％、4.5％或5％。在一个方面，本文提供的配制品中柠檬酸盐缓冲液的量是基于配制品的总重量的约4.2％。在一个方面，本文提供的配制品中柠檬酸盐缓冲液的量是在20cc小瓶中约37mg。
在一个实施方案中，柠檬酸盐缓冲液包含无水柠檬酸和无水柠檬酸钠。在某些实施方案中，无水柠檬酸的量是基于配制品的总重量的约1.5％至约3％、约1.75％至约2.75％或约2％至约2.5％。在某些实施方案中，配制品中无水柠檬酸的量是基于配制品的总重量的约1.5％、1.75％、2％、2.1％或2.5％。在一个实施方案中，配制品中无水柠檬酸的量是基于配制品的总重量的约2％、2.1％、2.22％或2.3％。在一个实施方案中，配制品中无水柠檬酸的量是基于配制品的总重量的约2.10％。
在仍另一个方面，本文提供了如下配制品，其在20cc小瓶中包含约16mg至约20mg的量的无水柠檬酸。在一个实施方案中，无水柠檬酸的量是在20cc小瓶中约16、17、18、18.2、18.4、18.6、18.8、19或20mg。在一个实施方案中，无水柠檬酸的量是在20cc小瓶中约18.6mg。
在某些实施方案中，无水柠檬酸钠的量是基于配制品的总重量的约1.5％至约3％、约1.75％至约2.75％或约2％至约2.5％。在某些实施方案中，配制品中无水柠檬酸钠的量是基于配制品的总重量的约1.5％、1.75％、2％、2.1％或2.5％。在一个实施方案中，配制品中无水柠檬酸钠的量是基于配制品的总重量的约2％、2.05％、2.08％或2.1％。在一个实施方案中，配制品中无水柠檬酸钠的量是基于配制品的总重量的约2.08％。
在仍另一个方面，本文提供了如下配制品，其在20cc小瓶中包含约16mg至约20mg的量的无水柠檬酸钠。在一个实施方案中，无水柠檬酸钠的量是在20cc小瓶中约16、17、18、18.2、18.4、18.6、18.8、19或20mg。在一个实施方案中，无水柠檬酸钠的量是在20cc小瓶中约18.4mg。
在某些实施方案中，本文提供的配制品中HPBCD的量是基于配制品的总重量的约94％至约97％。在一个实施方案中，本文提供的配制品中HPBCD的量是基于配制品的总重量的约94.5％、95％、95.5％或96％。在一个实施方案中，本文提供的配制品中HPBCD的量是基于配制品的总重量的约95％。
在某些实施方案中，本文提供的配制品中磺丁基醚-β-环糊精的量是基于配制品的总重量的约94％至约97％。在一个实施方案中，本文提供的配制品中磺丁基醚-β-环糊精的量是基于配制品的总重量的约94.5％、95％、95.5％或96％。在一个实施方案中，本文提供的配制品中磺丁基醚-β-环糊精的量是基于配制品的总重量的约95％。
在另一个方面，本文提供了如下配制品，其在20cc小瓶中包含约800-900mg的量的HPBCD。在另一个方面，本文提供了如下配制品，其在20cc小瓶中包含约810-880mg、820-860mg或830-850mg的量的HPBCD。在另一个方面，本文提供了如下配制品，其在20cc小瓶中包含约840mg的量的HPBCD。
在另一个方面，本文提供了如下配制品，其在20cc小瓶中包含约800-900mg的量的磺丁基醚-β-环糊精。在另一个方面，本文提供了如下配制品，其在20cc小瓶中包含约810-880mg、820-860mg或830-850mg的量的磺丁基醚-β-环糊精。在另一个方面，本文提供了如下配制品，其在20cc小瓶中包含约840mg的量的磺丁基醚-β-环糊精。
在另一个方面，本文提供了在20cc小瓶中包含约840mg的量的
Figure BDA0003710765600000581
HPB。
在一个实施方案中，所述配制品包含基于配制品的总重量不多于约1.5％的量的二甲亚砜。在一个实施方案中，所述配制品包含基于配制品的总重量的多达0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％的量的二甲亚砜。在一个实施方案中，所述配制品包含基于配制品的总重量的不多于约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％的二甲亚砜。在一个实施方案中，所述配制品包含基于配制品的总重量的多达约0.1至约1.5％的量的二甲亚砜。在一个实施方案中，本文提供的配制品中二甲亚砜的量是基于配制品的总重量的约0.1至约1.3％。在一个实施方案中，本文提供的配制品中二甲亚砜的量是基于配制品的总重量的约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％。在一个实施方案中，本文提供的配制品不含任何二甲亚砜。在一个实施方案中，本文提供的配制品中二甲亚砜的量是基于配制品的总重量的约0.4％至0.8％。
在另一个方面，本文提供了如下配制品，其在20cc小瓶中包含约4至7mg的量的二甲亚砜。在另一个方面，本文提供了如下配制品，其在20cc小瓶中包含约4.5-6.5mg或5-6mg的量的二甲亚砜。
在某些实施方案中，本文提供的配制品是冻干的，并且冻干配制品在重构后具有约4至5的pH。在某些实施方案中，所述配制品在重构后具有约4.2至4.4的pH。在一个实施方案中，冻干配制品在重构后具有约4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5的pH。
在某些实施方案中，冻干配制品在重构后具有约250-290mOsm/kg的渗透压。在某些实施方案中，冻干配制品在重构后具有约260-280mOsm/kg的渗透压。
在某些实施方案中，本文提供了包含本文提供的配制品的容器。在一个方面，所述容器是玻璃小瓶。在一个方面，所述容器是20cc玻璃小瓶。
在一个方面，本文提供了在20cc小瓶中的配制品，其包含：一定量的化合物D，所述量提供1.05mg 2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基))-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺；和药学上可接受的载体或赋形剂，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括如本文所述的填充剂。在一个实施方案中，所述配制品进一步包含不多于约7mg二甲亚砜作为残留溶剂。在一个实施方案中，所述配制品包含不多于约6mg二甲亚砜作为残留溶剂。在一个实施方案中，所述配制品包含不多于约5mg二甲亚砜作为残留溶剂。在一个实施方案中，所述配制品包含不多于约4mg二甲亚砜作为残留溶剂。在一个实施方案中，所述配制品包含约3mg至约7mg、约4mg至约6mg、约4mg至约5mg或约5mg至约6mg二甲亚砜作为残留溶剂。在一个实施方案中，所述配制品包含约4、4.5、5、5.3、5.5、5.7、6或6.5mg二甲亚砜作为残留溶剂。
在一个实施方案中，本文提供了如下配制品，其基本上由以下组成：基于配制品的总重量的约0.05％-0.2％的量的化合物D、约3％-6％的量的柠檬酸盐缓冲液和约92％-98％的量的HPBCD。
在一个实施方案中，本文提供了如下配制品，其基本上由以下组成：基于配制品的总重量的约0.05％-0.2％的量的化合物D、约3％-6％的量的柠檬酸盐缓冲液和约92％-98％的磺丁基醚-β-环糊精。
在一个实施方案中，本文提供了如下配制品，其基本上由以下组成：基于配制品的总重量的约0.05％-0.2％的量的化合物D、约3％-6％的量的柠檬酸盐缓冲液、约92％-98％的量的HPBCD和多于约1％的二甲亚砜。
在一个实施方案中，本文提供了如下配制品，其基本上由以下组成：基于配制品的总重量的约0.05％-0.2％的量的化合物D、约3％-6％的量的柠檬酸盐缓冲液、约92％-98％的量的磺丁基醚-β-环糊精和不多于约1％的二甲亚砜。
在一个方面，本文提供了在20cc小瓶中的配制品，其包含：一定量的化合物D，所述量提供1.05mg 2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基))-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺；药学上可接受的载体或赋形剂，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括如本文所述的填充剂；以及约5mg至约6mg作为残留溶剂的二甲亚砜。所述缓冲液和填充剂可以如本文所述的量存在。
在一个方面，本文提供了在20cc小瓶中的配制品，其包含：一定量的化合物D，所述量提供1.05mg 2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基))-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺；18.6mg无水柠檬酸；18.4mg无水柠檬酸钠；840mg HPBCD；以及约5mg至约6mg如本文所述作为残留溶剂的二甲亚砜。在一个实施方案中，将20cc小瓶中的配制品用3.8mL无菌注射用水重构。
在一个方面，本文提供了在20cc小瓶中的配制品，其基本上由以下组成：一定量的化合物D，所述量提供1.05mg 2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基))-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺；18.6mg无水柠檬酸；18.4mg无水柠檬酸钠；840mgHPBCD；以及约5mg至约6mg如本文所述作为残留溶剂的二甲亚砜。在一个实施方案中，将20cc小瓶中的配制品用3.8mL无菌注射用水重构。
在一个方面，本文提供了在20cc小瓶中的配制品，其由以下组成：一定量的化合物D，所述量提供1.05mg 2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基))-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺；18.6mg无水柠檬酸；18.4mg无水柠檬酸钠；840mg HPBCD；以及约5mg至约6mg如本文所述作为残留溶剂的二甲亚砜。在一个实施方案中，将20cc小瓶中的配制品用3.8mL无菌注射用水重构。
在一个实施方案中，本文提供了如下水性配制品，其包含基于固体总重量的约0.05％-0.2％的量的化合物D、基于固体总重量的约3％-6％的量的柠檬酸盐缓冲液、基于固体总重量的约92％-98％的HPBCD以及稀释剂。
在一个实施方案中，本文提供了如下水性配制品，其基本上由以下组成：基于固体总重量的约0.05％-0.2％的量的化合物D、基于固体总重量的约3％-6％的量的柠檬酸盐缓冲液、基于固体总重量的约92％-98％的量的HPBCD以及稀释剂。
在一个方面，本文提供了如下水性配制品，其包含：一定量的化合物D，所述量提供1.05mg 2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基))-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺；18.6mg无水柠檬酸；18.4mg无水柠檬酸钠；840mg HPBCD；以及约5mg至约6mg如本文所述作为残留溶剂的二甲亚砜和约3.8mL稀释剂。
在一个方面，本文提供了如下水性配制品，其基本上由以下组成：一定量的化合物D，所述量提供1.05mg 2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基))-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺；18.6mg无水柠檬酸；18.4mg无水柠檬酸钠；840mg HPBCD；以及约5mg至约6mg如本文所述作为残留溶剂的二甲亚砜和约3.8mL稀释剂。
在一个方面，本文提供了如下水性配制品，其由以下组成：一定量的化合物D，所述量提供1.05mg 2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基))-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺；18.6mg无水柠檬酸；18.4mg无水柠檬酸钠；840mg HPBCD；以及约5mg至约6mg如本文所述作为残留溶剂的二甲亚砜和约3.8mL稀释剂。
配制品Ib
在一个实施方案中，本文提供了如下配制品，其包含约0.01％-0.15％的量的化合物D、约99.1％-99.99％的量的羟丙基β-环糊精。在一个实施方案中，本文提供了如下配制品，其包含基于配制品的总重量的约0.01％-0.15％的量的化合物D、约99.1％-99.99％的量的羟丙基β-环糊精和不多于约0.5％的甲酸。
在一个实施方案中，本文提供了如下配制品，其包含基于配制品的总重量的约0.05％-0.25％的量的化合物D和约99.1％-99.9％的量的HPBCD。
在一个实施方案中，本文提供了如下配制品，其包含基于配制品的总重量的约0.05％-0.25％的量的化合物D、约99.1％-99.9％的量的HPBCD和不多于约0.5％的甲酸。
在一个实施方案中，本文提供了如下配制品，其包含基于配制品的总重量的约0.05％-0.25％的量的化合物D和约99.75％-99.9％的量的HPBCD。
在一个实施方案中，本文提供了如下配制品，其包含基于配制品的总重量的约0.05％-0.25％的量的化合物D、约99.75％-99.9％的量的HPBCD和不多于约0.5％的甲酸。
在一个实施方案中，本文提供了如下配制品，其包含基于配制品的总重量的约0.05％-0.25％的量的化合物D、约99.75％-99.9％的量的HPBCD和不多于约0.2％的甲酸。
在一个实施方案中，本文提供了如下配制品，其包含基于配制品的总重量的约0.08％-0.15％的量的化合物D和约99.8％-99.9％的量的HPBCD。
在一个实施方案中，本文提供了如下配制品，其包含基于配制品的总重量的约0.08％-0.15％的量的化合物D、约99.8％-99.9％的量的HPBCD和不多于约0.5％的甲酸。
在一个实施方案中，本文提供了如下配制品，其包含基于配制品的总重量的约0.08％-0.15％的量的化合物D、约99.8％-99.9％的量的HPBCD和不多于约0.12％的甲酸。
在一个实施方案中，本文提供了如下配制品，其包含基于配制品的总重量的约0.12％的量的化合物D和约99.88％的量的HPBCD。
在一个实施方案中，本文提供了如下配制品，其包含基于配制品的总重量的约0.05％-0.25％的量的化合物D和约99.1％-99.9％的量的磺丁基醚-β-环糊精。
在一个实施方案中，本文提供了如下配制品，其包含基于配制品的总重量的约0.05％-0.25％的量的化合物D、约99.1％-99.9％的量的磺丁基醚-β-环糊精和不多于约0.5％的甲酸。
在一个实施方案中，本文提供了如下配制品，其包含基于配制品的总重量的约0.05％-0.25％的量的化合物D和约99.75％-99.9％的量的磺丁基醚-β-环糊精。
在一个实施方案中，本文提供了如下配制品，其包含基于配制品的总重量的约0.08％-0.15％的量的化合物D和约99.8％-99.9％的量的磺丁基醚-β-环糊精。
在一个实施方案中，本文提供了如下配制品，其包含基于配制品的总重量的约0.08％-0.15％的量的化合物D、约99.8％-99.9％的量的磺丁基醚-β-环糊精和不多于约0.5％的甲酸。
在一个实施方案中，本文提供了如下配制品，其包含基于配制品的总重量的约0.12％的量的化合物D和约99.88％的量的磺丁基醚-β-环糊精。
在一个方面，本文提供的配制品包含基于配制品的总重量的约0.08％至约0.15％的量的化合物D。在某些实施方案中，化合物D的量是基于配制品的总重量的约0.09％至约0.15％、约0.1％至约0.13％或约0.11％至约0.12％。在某些实施方案中，化合物D的量是基于配制品的总重量的约0.05％、0.07％、0.09％、0.11％、0.12％、0.13％或0.15％。在一个实施方案中，配制品中化合物D的量是基于配制品的总重量的约0.12％。
在另一个方面，本文提供了如下配制品，其在20cc小瓶中包含约0.5mg至约2mg的量的化合物D。在仍另一个方面，本文提供了如下配制品，其在20cc小瓶中包含约0.5mg至约1.5mg、约0.75mg至约1.25mg或约0.8mg至约1.1mg的量的化合物D。在一个方面，化合物D在20cc小瓶中以约0.7、0.75、0.76、0.8、0.9、1.0、1.05或1.2mg的量存在。在一个方面，化合物D在20cc小瓶中以约1mg的量存在。
在一个实施方案中，本文提供的配制品中HPBCD的量是基于配制品的总重量的约97％至约99.9％。在一个实施方案中，本文提供的配制品中HPBCD的量是基于配制品的总重量的约98％至约99.9％。在一个实施方案中，本文提供的配制品中HPBCD的量是基于配制品的总重量的约99.1％、99.3％、99.5％、99.7％或99.9％。在一个实施方案中，本文提供的配制品中HPBCD的量是基于配制品的总重量的约99.5％。在另一个方面，本文提供了如下配制品，其在20cc小瓶中包含约750-850mg的量的HPBCD。在另一个方面，本文提供了如下配制品，其在20cc小瓶中包含约790-840mg、780-830mg或790-810mg的量的HPBCD。在另一个方面，本文提供了如下配制品，其在20cc小瓶中包含约800mg的量的HPBCD。
在另一个方面，本文提供了在20cc小瓶中包含约800mg的量的
Figure BDA0003710765600000611
HPB。
在一个实施方案中，本文提供的配制品中磺丁基醚-β-环糊精的量是基于配制品的总重量的约97％至约99.9％。在一个实施方案中，本文提供的配制品中磺丁基醚-β-环糊精的量是基于配制品的总重量的约98％至约99.9％。在一个实施方案中，本文提供的配制品中磺丁基醚-β-环糊精的量是基于配制品的总重量的约99.1％、99.3％、99.5％、99.7％或99.9％。在一个实施方案中，本文提供的配制品中磺丁基醚-β-环糊精的量是基于配制品的总重量的约99.5％。
在另一个方面，本文提供了如下配制品，其在20cc小瓶中包含约750-850mg的量的磺丁基醚-β-环糊精。在另一个方面，本文提供了如下配制品，其在20cc小瓶中包含约790-840mg、780-830mg或790-810mg的量的磺丁基醚-β-环糊精。在另一个方面，本文提供了如下配制品，其在20cc小瓶中包含约800mg的量的磺丁基醚-β-环糊精。
在另一个方面，本文提供了在20cc小瓶中包含约800mg的量的
Figure BDA0003710765600000612
HPB。
在一个实施方案中，所述配制品包含基于配制品的总重量的不多于约0.5％的甲酸。在一个实施方案中，所述配制品包含基于配制品的总重量的多达约0.05％、0.07％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％的量的甲酸。在一个实施方案中，所述配制品包含基于配制品的总重量的不多于约0.05％、0.07％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％的甲酸。在一个实施方案中，本文提供的配制品中甲酸的量是基于配制品的总重量的约0.05％至约0.5％。在一个实施方案中，本文提供的配制品中甲酸的量是基于配制品的总重量的约0.05％至约0.1％。在一个实施方案中，本文提供的配制品中甲酸的量是约0.05％、0.07％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％。在一个实施方案中，本文提供的配制品不含任何甲酸。在一个实施方案中，本文提供的配制品中甲酸的量是基于配制品的总重量的约0.05％至0.09％。
在另一个方面，本文提供了如下配制品，其在20cc小瓶中包含不多于约1mg的量的甲酸。在另一个方面，本文提供了如下配制品，其在20cc小瓶中包含多达约0.2、0 5、0.7、0.9mg或1mg的量的甲酸。在另一个方面，本文提供了如下配制品，其在20cc小瓶中包含约0.3-0.9mg或0.4至0.8mg的量的甲酸。
在另一个方面，本文提供了如下配制品，其在20cc小瓶中包含约1mg的量的化合物D和约800mg的量的HPBCD。
在另一个方面，本文提供了如下配制品，其在20cc小瓶中包含约1mg的量的化合物D、约800mg的量的HPBCD和约0.9mg的量的甲酸。
配制品Ic
在一个实施方案中，本文提供了如下配制品，其包含基于配制品的总重量的约0.01％-0.08％的量的化合物D和约99.40％-99.99％的量的HPBCD。
在一个实施方案中，本文提供了如下配制品，其包含基于配制品的总重量的约0.01％-0.08％的量的化合物D、约99.40％-99.99％的量的HPBCD和不多于约0.5％的甲酸。
在一个实施方案中，本文提供了如下配制品，其包含基于配制品的总重量的约0.03％-0.06％的量的化合物D和约99.60％-99.99％的量的HPBCD。
在一个实施方案中，本文提供了如下配制品，其包含基于配制品的总重量的从约0.01％至约0.08％的化合物D、从约99.40％至约99.99％的羟丙基β-环糊精和从约0.1％至约0.3％的甲酸。
在一个方面，本文提供的配制品包含基于配制品的总重量的约0.02％至约0.06％的量的化合物D。在某些实施方案中，化合物D的量是基于配制品的总重量的约0.03％至约0.06％、或约0.04％至约0.06％。在某些实施方案中，化合物D的量是基于配制品的总重量的约0.03％、0.04％、0.05％或0.06％。在一个实施方案中，配制品中化合物D的量是基于配制品的总重量的约0.05％。
在另一个方面，本文提供了如下配制品，其在20cc小瓶中包含约0.75mg至约1.5mg的量的化合物D。在仍另一个方面，本文提供了如下配制品，其在20cc小瓶中包含约0.75mg至约1.25mg的量的化合物D。在一个方面，化合物D在20cc小瓶中以约0.75、0.8、0.9、1.0、1.05或1.2mg的量存在。在一个方面，化合物D在20cc小瓶中以约1mg的量存在。
在一个实施方案中，本文提供的配制品中HPBCD的量是基于配制品的总重量的约99.40％至约99.99％。在一个实施方案中，本文提供的配制品中HPBCD的量是基于配制品的总重量的约99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％或99.99％。在另一个方面，本文提供了如下配制品，其在20cc小瓶中包含约1800-1900mg的量的HPBCD。在另一个方面，本文提供了如下配制品，其在20cc小瓶中包含约1850-1900mg的量的HPBCD。在另一个方面，本文提供了如下配制品，其在20cc小瓶中包含约1875mg的量的HPBCD。
在一个实施方案中，所述配制品包含基于配制品的总重量的不多于约0.5％的甲酸。在一个实施方案中，所述配制品包含基于配制品的总重量的多达约0.05％、0.07％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％的量的甲酸。在一个实施方案中，所述配制品包含基于配制品的总重量的不多于约0.05％、0.07％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％或0.5％的甲酸。在一个实施方案中，本文提供的配制品中甲酸的量是基于配制品的总重量的约0.05％至约0.3％。在一个实施方案中，本文提供的配制品中甲酸的量是基于配制品的总重量的约0.05％至约0.25％。在一个实施方案中，本文提供的配制品中甲酸的量是基于配制品的总重量的约0.05％、0.07％、0.09％、0.1％、0.2％或0.3％。在一个实施方案中，本文提供的配制品不含任何甲酸。在一个实施方案中，本文提供的配制品中甲酸的量是基于配制品的总重量的约0.11％至0.3％。
在另一个方面，本文提供了如下配制品，其在20cc小瓶中包含不多于约4mg的量的甲酸。在另一个方面，本文提供了如下配制品，其在20cc小瓶中包含多达约1、1.8、2、2.1、2.5、3、3.5、3.8、3.9、4、4.5、4.9mg或5mg的量的甲酸。在另一个方面，本文提供了如下配制品，其在20cc小瓶中包含约1-1.8mg、2.1-3.8mg或3.9-4.9mg的量的甲酸。
在另一个方面，本文提供了如下配制品，其在20cc小瓶中包含约1mg的量的化合物D和约1875mg的量的HPBCD。
在另一个方面，本文提供了如下配制品，其在20cc小瓶中包含约1mg的量的化合物D、约1875mg的量的HPBCD和约2.1-3.8mg的量的甲酸。
不含共溶剂的配制品
在一个实施方案中，本文提供了包含基于配制品的总重量的约0.15％-0.5％的量的化合物D、约15％至约35％的量的柠檬酸盐缓冲液和约92％至约98％的量的HPBCD的配制品。在一个实施方案中，柠檬酸盐缓冲液包含无水柠檬酸和无水柠檬酸钠。
在一个实施方案中，本文提供了包含基于配制品的总重量的约0.25％-0.30％的量的化合物D、约30％-32％的量的柠檬酸盐缓冲液和约67％-69％的量的HPBCD的配制品。
在一个实施方案中，本文提供了包含基于配制品的总重量的约0.30％-0.33％的量的化合物D、约17％-18％的量的柠檬酸盐缓冲液和约80％-85％的量的HPBCD的配制品。
示例性配制品
在一个实施方案中，本文提供了如下配制品，其基本上由以下组成：基于配制品的总重量的约0.05％-0.25％的量的化合物D和约99.75％-99.95％的量的HPBCD。
在一个实施方案中，本文提供了如下配制品，其基本上由以下组成：基于配制品的总重量的约0.05％-0.25％的量的化合物D和约99.75％-99.99％的量的HPBCD。
在一个实施方案中，本文提供了如下配制品，其基本上由以下组成：基于配制品的总重量的约0.05％-0.25％的量的化合物D和约99.75％-99.95％的量的磺丁基醚-β-环糊精。
在一个方面，本文提供了在20cc小瓶中的配制品，其包含：一定量的化合物D，所述量提供1mg 2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基))-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺；800mg HPBCD；和约0.6mg如本文所述的甲酸。在一个实施方案中，将20cc小瓶中的配制品用4.5mL无菌注射用水重构。
在一个方面，本文提供了在20cc小瓶中的配制品，其基本上由以下组成：一定量的化合物D，所述量提供1mg 2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基))-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺；800mg HPBCD；和约0.6mg如本文所述的甲酸。在一个实施方案中，将20cc小瓶中的配制品用4.5mL无菌注射用水重构。
在一个方面，本文提供了在20cc小瓶中的配制品，其由以下组成：一定量的化合物D，所述量提供1mg 2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基))-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺；800mg HPBCD；和约0.6mg如本文所述的甲酸。在一个实施方案中，将20cc小瓶中的配制品用4.5mL无菌注射用水重构。
在一个方面，本文提供了在20cc小瓶中的配制品，其包含：一定量的化合物D，所述量提供1mg 2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基))-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺；800mg磺丁基醚-β-环糊精；和约0.6mg如本文所述的甲酸。在一个实施方案中，将20cc小瓶中的配制品用4.5mL无菌注射用水重构。
在一个方面，本文提供了在20cc小瓶中的配制品，其基本上由以下组成：一定量的化合物D，所述量提供1mg 2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基))-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺；800mg磺丁基醚-β-环糊精；和约0.6mg如本文所述的甲酸。在一个实施方案中，将20cc小瓶中的配制品用4.5mL无菌注射用水重构。
在一个方面，本文提供了在20cc小瓶中的配制品，其由以下组成：一定量的化合物D，所述量提供1mg 2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基))-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺；800mg磺丁基醚-β-环糊精；和约0.6mg如本文所述的甲酸。在一个实施方案中，将20cc小瓶中的配制品用4.5mL无菌注射用水重构。
在一个方面，本文提供了在20cc小瓶中的配制品，其包含：一定量的化合物D，所述量提供1mg 2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基))-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺；1875mg HPBCD；和约2.1-3.8mg如本文所述的甲酸。在一个实施方案中，将20cc小瓶中的配制品用12.5ml注射用生理盐水重构。
在一个方面，本文提供了在20cc小瓶中的配制品，其基本上由以下组成：一定量的化合物D，所述量提供1mg 2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基))-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺；1875mg HPBCD；和约2.1-3.8mg如本文所述的甲酸。在一个实施方案中，将20cc小瓶中的配制品用12.5ml注射用生理盐水重构。
在一个方面，本文提供了在20cc小瓶中的配制品，其由以下组成：一定量的化合物D，所述量提供1mg 2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基))-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺；1875mg HPBCD；和约2.1-3.8mg如本文所述的甲酸。在一个实施方案中，将20cc小瓶中的配制品用12.5ml注射用生理盐水重构。
在一个实施方案中，本文提供了如下水性配制品，其包含基于固体总重量的约0.05％-0.25％的量的化合物D以及基于固体总重量的约99.1％-99.9％的HPBCD和稀释剂。
在一个实施方案中，本文提供了如下水性配制品，其包含基于固体总重量的约0.05％-0.25％的量的化合物D以及基于固体总重量的约99.75％-99.95％的HPBCD和稀释剂。
在一个实施方案中，本文提供了如下水性配制品，其基本上由以下组成：基于固体总重量的约0.05％-0.25％的量的化合物D以及基于固体总重量的约99.75％-99.95％的量的HPBCD和稀释剂。
在一个方面，本文提供了如下水性配制品，其包含：一定量的化合物D，所述量提供1mg 2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基))-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺；800mg HPBCD；约0.6mg甲酸；和约4.5mL稀释剂。
在一个方面，本文提供了如下水性配制品，其由以下组成：一定量的化合物D，所述量提供1mg 2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基))-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺；800mg HPBCD；约0.6mg甲酸；和约4.5mL稀释剂。
在一个实施方案中，本文提供了如下水性配制品，其包含基于固体总重量的约0.01％-0.08％的量的化合物D以及基于固体总重量的约99.50％-99.99％的HPBCD和稀释剂。
在一个实施方案中，本文提供了如下水性配制品，其包含基于固体总重量的约0.01％-0.08％的量的化合物D以及基于固体总重量的约99.50％-99.99％的HPBCD和稀释剂。
在一个实施方案中，本文提供了如下水性配制品，其基本上由以下组成：基于固体总重量的约0.01％-0.08％的量的化合物D以及基于固体总重量的约99.50％-99.99％的量的HPBCD和稀释剂。
在一个方面，本文提供了如下水性配制品，其包含：一定量的化合物D，所述量提供1mg 2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基))-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺；800mg HPBCD；约0.6mg甲酸；和约4.5mL稀释剂。
在一个方面，本文提供了如下水性配制品，其由以下组成：一定量的化合物D，所述量提供1mg 2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基))-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺；800mg HPBCD；约0.6mg甲酸；和约4.5mL稀释剂。
在某些实施方案中，本文提供的配制品是冻干的，并且冻干配制品在重构后具有约2.5至4的pH。在某些实施方案中，冻干配制品在重构后具有约2.5至3.5的pH。在某些实施方案中，冻干配制品在重构后具有约3.0至3.6的pH。在一个实施方案中，冻干配制品在重构后具有约2.5、3、3.2、3.4、3.6、3.8或4的pH。在一个实施方案中，冻干配制品在重构后具有约2.5、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8或4的pH。
在某些实施方案中，冻干配制品在重构后具有约260-290mOsm/kg的渗透压。在某些实施方案中，冻干配制品在重构后具有约280mOsm/kg的渗透压。在某些实施方案中，冻干配制品在重构后具有约260-370mOsm/kg的渗透压。在某些实施方案中，冻干配制品在重构后具有约360mOsm/kg的渗透压。在某些实施方案中，冻干配制品在重构后具有约350-450mOsm/kg的渗透压。在某些实施方案中，冻干配制品在重构后具有约416mOsm的渗透压。
在某些实施方案中，将冻干配制品用半生理盐水(0.45％注射用氯化钠无菌溶液)重构并且在重构后具有约280-320mOsm/kg的渗透压。在某些实施方案中，冻干配制品用半生理盐水(0.45％注射用氯化钠无菌溶液)重构并且在重构后具有3.0-3.2的pH和约280-320mOsm/kg的渗透压。在某些实施方案中，将冻干配制品用4.5mL半生理盐水(0.45％注射用氯化钠无菌溶液)重构并且在重构后具有3.0-3.2的pH和约280-320mOsm/kg的渗透压。在一个实施方案中，将所需剂量的重构溶液在输液袋中用生理盐水(0.9％注射用氯化钠无菌溶液)稀释至50mL的体积，以用于30分钟静脉内施用。
在某些实施方案中，将冻干配制品用生理盐水重构并且在重构后具有约440mOsm/kg的渗透压。在一个实施方案中，将所需剂量的重构溶液用生理盐水稀释至50mL的体积以获得具有约310-380mOsm/kg的渗透压的给药溶液。在一个实施方案中，将所需剂量的重构溶液用生理盐水稀释至50mL的体积以获得具有约310-355mOsm/kg的渗透压的给药溶液。在一个实施方案中，将所需剂量的重构溶液用生理盐水稀释至50mL的体积以获得具有约317-371mOsm/kg的渗透压的给药溶液。在一个实施方案中，将所需剂量的重构溶液用生理盐水稀释至50mL的体积以获得具有约317mOsm/kg的渗透压的给药溶液。在一个实施方案中，将所需剂量的重构溶液用生理盐水稀释至50mL的体积以获得具有约371mOsm/kg的渗透压的给药溶液。在一个实施方案中，给药溶液的渗透压不超过352mOsm/kg。在一个实施方案中，具有4.8mg剂量的化合物D的给药溶液的渗透压为352mOsm/kg。
在某些实施方案中，本文提供了包含本文提供的配制品的容器。在一个方面，所述容器是玻璃小瓶。在一个方面，所述容器是20cc玻璃小瓶。
在一个方面，本文提供了在20cc小瓶中的配制品，其包含：一定量的化合物D，所述量提供1mg 2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基))-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺；和如本文所述的填充剂。在一个实施方案中，所述配制品进一步包含不多于约5mg甲酸作为残留溶剂。在一个实施方案中，所述配制品进一步包含不多于约4mg甲酸作为残留溶剂。在一个实施方案中，所述配制品进一步包含不多于约3mg甲酸作为残留溶剂。在一个实施方案中，所述配制品进一步包含不多于约2mg甲酸作为残留溶剂。在一个实施方案中，所述配制品进一步包含不多于约1.5mg甲酸作为残留溶剂。在一个实施方案中，所述配制品进一步包含不多于约1mg甲酸作为残留溶剂。在一个实施方案中，所述配制品进一步包含不多于约0.8mg甲酸作为残留溶剂。在一个实施方案中，所述配制品包含从约0.4mg至约1.5mg、约0.5mg至约1mg或约0.5mg至约0.9mg甲酸作为残留溶剂。在一个实施方案中，所述配制品包含约0.4mg、约0.6mg、约0.8mg、约1mg或约1.5mg甲酸作为残留溶剂。在一个实施方案中，所述配制品包含如下量的甲酸作为残留溶剂：约1.0mg/mg化合物D至约1.8mg/mg化合物D、约2.1mg/mg化合物D至约3.8mg/mg化合物D或约3.9mg/mg化合物D至约4.9mg/mg化合物D。
可以使用用于递送化合物D的标准治疗方法(包括但不限于本文所述的方法)将本文提供的化合物D的配制品施用至有需要的患者。在一个实施方案中，将本文提供的配制品在药学上可接受的溶剂中重构以产生药学上可接受的溶液，其中将溶液施用至(如通过静脉内注射)患者。
在一个方面，本文提供的配制品是冻干的，并且冻干配制品适合于在施用前用合适的稀释剂重构至合适的浓度。在一个实施方案中，冻干配制品在室温下是稳定的。在一个实施方案中，冻干配制品在室温下稳定长达约24个月。在一个实施方案中，冻干配制品在室温下稳定长达约24个月、长达约18个月、长达约12个月、长达约6个月、长达约3个月或长达约1个月。在一个实施方案中，冻干配制品在40℃/75％RH的加速条件下储存长达约12个月、长达约6个月或长达约3个月时是稳定的。
可以使用任何药学上可接受的稀释剂重构本文提供的冻干配制品以用于肠胃外施用至患者。此类稀释剂包括但不限于无菌注射用水(SWFI)、5％葡萄糖水溶液(D5W)或共溶剂系统。可以使用任何量的稀释剂重构冻干配制品，从而制备合适的注射用溶液。因此，稀释剂的量必须足以溶解冻干配制品。在一个实施方案中，使用1-5mL或1至4mL的稀释剂重构冻干配制品以产生最终浓度为约0.05-0.3mg/mL或约0.15-0.25mg/mL的化合物D。在某些实施方案中，重构溶液中化合物D的最终浓度为约0.25mg/mL。在某些实施方案中，重构溶液中化合物D的最终浓度为约0.20mg/mL。在某些实施方案中，重构稀释剂的体积在3ml与5ml之间变化以产生0.15-0.3mg/mL的最终浓度。在某些实施方案中，取决于所需剂量，可以使用多个小瓶进行重构。
冻干配制品的重构溶液可以在长达约24小时、约12小时或约8小时内储存和使用。在一个实施方案中，重构水溶液在重构后在室温下稳定约1-24、2-20、2-15、2-10小时。在一个实施方案中，重构水溶液在重构后在室温下稳定长达约20、15、12、10、8、6、4或2小时。在一些实施方案中，所述溶液在制备的8小时内使用。在一些实施方案中，所述溶液在制备的5小时内使用。在一些实施方案中，所述溶液在制备的1小时内使用。
用于制备配制品的过程
本文提供的配制品可以通过本领域已知的和如本文所述的任何方法制备，但所有方法都包括使活性成分与药学上可接受的赋形剂缔合的步骤，所述药学上可接受的赋形剂构成一种或多种必需的成分(如填充剂和/或缓冲液)。
在一个方面，本文提供的配制品通过以下方法来制备：将化合物D、填充剂和柠檬酸盐缓冲液溶解在水和二甲亚砜(DMSO)中以获得溶液，并任选地冻干所述溶液。
在一个实施方案中，用于制备所述配制品的方法包括：将HPBCD溶解在柠檬酸盐缓冲液中以得到缓冲溶液，将化合物D溶解在DMSO中以得到预混物，将预混物添加至缓冲溶液中以得到溶液；以及任选地冻干所述溶液以产生冻干配制品。
在一个实施方案中，所述方法包括将
Figure BDA0003710765600000661
HPB溶解在20mM、pH 4-4.5的柠檬酸盐缓冲液中以获得缓冲溶液，将化合物D溶解在DMSO中以获得活性预混物，将预混物添加至缓冲溶液中以获得混合物，向混合物中添加水以获得本体溶液，将本体溶液通过一个或多个0.45μm和0.22μm过滤器过滤以获得过滤溶液，将过滤溶液装入小瓶中，并冻干所述溶液。在一个实施方案中，将所述溶液通过一个0.45μm和两个0.22μm过滤器过滤。在一个实施方案中，所述方法包括将
Figure BDA0003710765600000662
HPB溶解在20mM、pH 4.3的柠檬酸盐缓冲液中以获得缓冲溶液，将化合物D溶解在DMSO中以获得活性预混物，将预混物添加至缓冲溶液中以获得混合物，向混合物中添加水以获得本体溶液，将本体溶液通过一个0.45μm过滤器和两个0.22μm过滤器过滤以获得过滤溶液，将过滤溶液装入20cc玻璃小瓶中，并任选地冻干所述溶液。在一个实施方案中，将小瓶在冻干后在氮气下密封。
在一个方面，本文提供的配制品通过以下方法制备：将化合物D溶解在甲酸中以获得预混物，将HPBCD溶解在水中以获得溶液，将预混物添加至所述溶液中以获得药物溶液；以及任选地冻干所述药物溶液以产生冻干配制品。
在一个方面，本文提供的配制品通过以下方法制备：将化合物D溶解在甲酸中以获得活性预混物，将
Figure BDA0003710765600000663
HPB溶解在水中以获得Kleptose溶液，将预混物添加至Kleptose溶液中以获得混合物，向混合物中添加水以获得本体溶液，将本体溶液通过一个或多个0.45μm和0.22μm过滤器过滤以获得过滤溶液，将过滤溶液装入小瓶中，并冻干所述溶液。在一个实施方案中，将所述溶液通过一个0.45μm和两个0.22μm过滤器过滤。在一个实施方案中，所述方法包括将化合物D溶解在甲酸中以获得活性预混物，将
Figure BDA0003710765600000664
HPB溶解在水中以获得Kleptose溶液，将预混物添加至Kleptose溶液中以获得混合物，向混合物中添加水以获得本体溶液，将本体溶液通过一个0.45μm和两个0.22μm过滤器过滤以获得过滤溶液，将过滤溶液装入20cc玻璃小瓶中，并冻干所述溶液。在一个实施方案中，将小瓶在冻干后在氮气下密封。
在一个方面，所述冻干方法包括三个阶段：冷冻、初步干燥和二次干燥。液体配制品通过经历以下步骤转化为冻干粉末形式：通过冷冻阶段的完全固化、通过初步干燥的冰和溶剂的升华、以及通过二次干燥的残留水分和溶剂的解吸。控制初步干燥和二次干燥中的搁板温度和炉膛压力以获得所需质量的成品药。在所述方法的一个方面，饼的外观和结构通过目视检查来表征。
5.7.试剂盒
在一个方面，本文提供了一种用于鉴定可能对治疗化合物有反应的患有癌症的受试者的试剂盒，所述试剂盒包含用于测定一种或多种基因的表达水平的装置。
在另一个方面，本文提供了一种用于治疗癌症的试剂盒，所述试剂盒包含用于测定样品中一种或多种基因的表达水平的装置。
在又另一个方面，本文提供了用于监测治疗化合物在治疗受试者中的癌症中的功效的试剂盒，所述试剂盒包含用于测定样品中一种或多种基因的表达水平的装置。
在某些实施方案中，所述癌症是血癌。在一个实施方案中，所述血癌是淋巴瘤。在另一个实施方案中，所述血癌是白血病。在又另一个实施方案中，所述血癌是MM。在具体实施方案中，所述白血病是ALL。在另一个具体实施方案中，所述白血病是AML。在又另一个具体实施方案中，所述白血病是CLL。在仍另一个实施方案中，所述白血病是CML。在一些实施方案中，AML是复发的。在某些实施方案中，AML是难治的。在其他实施方案中，AML对常规疗法具有抗性。
在某些实施方案中，本文提供的试剂盒测量本文提供的和上文描述的一种或多种基因的表达水平，以确定受试者对用化合物D治疗的反应性。所述试剂盒可以包含用于从受试者获得样品的工具。所述试剂盒可以包含工具或药剂或测量一种或多种基因的表达水平。所述试剂盒还可以包含关于如何解释测量结果的说明书，例如通过提供所述基因的参考水平。
在本文提供的各种试剂盒的某些实施方案中，所述样品获自肿瘤活检、淋巴结活检或者是来自骨髓、脾脏、肝脏、脑或乳房的活检。
在某些实施方案中，本文提供了用于检测一种或多种基因的mRNA水平的试剂盒。在某些实施方案中，所述试剂盒包含与一种或多种基因的mRNA特异性结合的一种或多种探针。在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包含洗涤溶液。在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包含用于进行杂交测定的试剂、mRNA分离或纯化装置、检测装置以及阳性和阴性对照。在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包含关于使用所述试剂盒的说明书。所述试剂盒可以专门用于家庭使用、临床使用或研究使用。
在某些实施方案中，本文提供了用于检测一种或多种基因的蛋白质水平的试剂盒。在某些实施方案中，所述试剂盒包含用可识别蛋白质生物标记物的抗体包被的浸量尺、洗涤溶液、用于进行测定的试剂、蛋白质分离或纯化装置、检测装置以及阳性和阴性对照。在某些实施方案中，所述试剂盒进一步包含关于使用所述试剂盒的说明书。所述试剂盒可以专门用于家庭使用、临床使用或研究使用。
这种试剂盒可以采用例如浸量尺、膜、芯片、磁盘、测试条、过滤器、微球、载玻片、多孔板或光纤。所述试剂盒的固体支持物可以是例如塑料、硅胶、金属、树脂、玻璃、膜、粒子、沉淀物、凝胶、聚合物、薄片、球体、多糖、毛细管、毛细血管、薄膜、板或载玻片。所述生物样品可以是例如细胞培养物、细胞系、组织、器官、细胞器、生物流体、血液样品、尿液样品或皮肤样品。
在另一个实施方案中，所述试剂盒包含固体支持物；附接至所述支持物的核酸，其中所述核酸与mRNA的至少20、50、100、200、350个或更多个碱基互补；以及用于检测生物样品中mRNA的表达的装置。
在具体实施方案中，所述药物或测定试剂盒在容器中包含化合物或其药物组合物，并且在一个或多个容器中进一步包含用于分离RNA的组分。在另一个具体实施方案中，所述药物或测定试剂盒在容器中包含化合物或药物组合物，并且在一个或多个容器中进一步包含用于进行RT-PCR、qRT-PCR、深度测序或微阵列的组分。
在某些实施方案中，本文提供的试剂盒采用通过qRT-PCR、微阵列、流式细胞术或免疫荧光检测生物标记物表达的装置。在其他实施方案中，通过基于ELISA的方法或本领域已知的其他类似方法测量生物标记物的表达。
在另一个实施方案中，所述药物或测定试剂盒在容器中包含化合物或其药物组合物，并且在一个或多个容器中进一步包含用于分离蛋白质的组分。在另一个具体实施方案中，所述药物或测定试剂盒在容器中包含化合物或药物组合物，并且在一个或多个容器中进一步包含用于进行流式细胞术或ELISA的组分。
在另一个方面，本文提供了用于测定基因水平的试剂盒，所述试剂盒提供了测量本文提供的一种或多种基因产物(例如，一种、两种、三种、四种、五种或更多种基因)的丰度所需的材料。此类试剂盒可以包含对于测量RNA或蛋白质所需的材料和试剂。在一些实施方案中，此类试剂盒包含微阵列，其中所述微阵列由与本文提供的一种或多种基因产物杂交的寡核苷酸和/或DNA和/或RNA片段或其任何组合组成。在一些实施方案中，此类试剂盒可以包含用于所述基因的RNA产物或RNA产物的cDNA拷贝的PCR的引物。在一些实施方案中，此类试剂盒可以包含用于PCR的引物以及用于qPCR的探针。在一些实施方案中，此类试剂盒可以包含多种引物和多种探针，其中一些探针具有不同的荧光团以允许同时测量本文提供的多种基因产物。在一些实施方案中，此类试剂盒可以进一步包含用于从RNA产生cDNA的材料和试剂。在一些实施方案中，此类试剂盒可以包含对本文提供的基因的蛋白质产物具有特异性的抗体。此类试剂盒可以另外包含用于从生物样品中分离RNA和/或蛋白质的材料和试剂。此外，此类试剂盒可以包含用于从分离自生物样品的RNA合成cDNA的材料和试剂。在一些实施方案中，此类试剂盒可以包含嵌入在计算机可读介质上的计算机程序产品，以用于预测患者是否在临床上对化合物敏感。在一些实施方案中，试剂盒可以包含嵌入在计算机可读介质上的计算机程序产品以及说明书。
在一些实施方案中，此类试剂盒测量本文提供的基因的一种或多种核酸产物的表达。根据该实施方案，所述试剂盒可以包含对于测量本文提供的基因的特定核酸产物的表达所需的材料和试剂。例如，可以产生微阵列或RT-PCR试剂盒以用于特定条件，并且所述微阵列或RT-PCR试剂盒仅含有对于测量本文提供的基因的特定RNA转录产物的水平所需的那些试剂和材料，以预测患者中的血液癌是否在临床上对化合物敏感。可替代地，在一些实施方案中，所述试剂盒可以包含对于测量本文提供的基因之外的基因的特定核酸产物的表达所需的材料和试剂。例如，在某些实施方案中，所述试剂盒包含对于测量1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、20、25、30、35、40、45、50种或更多种所述基因的表达水平所需的材料和试剂，以及对于测量本文提供的基因的表达水平所需的试剂和材料。在其他实施方案中，所述试剂盒含有对于测量至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10种或更多种本文提供的基因的表达水平，以及非本文提供的基因的1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450种或更多种基因的表达水平所需的试剂和材料。
对于核酸微阵列试剂盒，所述试剂盒通常包含附接至固体支持物表面的探针。在一个这种实施方案中，探针可以是寡核苷酸或更长的探针，包括长度在从150个核苷酸至800个核苷酸范围内的探针。所述探针可以用可检测标记进行标记。在具体实施方案中，所述探针对于本文提供的生物标记物的一种或多种基因产物具有特异性。所述微阵列试剂盒可以包含关于进行所述测定和用于解释和分析由进行所述测定所产生的数据的方法的说明书。在具体实施方案中，所述试剂盒包含关于预测患者中的血液癌是否在临床上对化合物敏感的说明书。所述试剂盒还可以包含杂交试剂和/或对于检测当探针与靶核酸序列杂交时产生的信号所需的试剂。通常，用于微阵列试剂盒的材料和试剂在一个或多个容器中。所述试剂盒的每个组分通常都在其自己合适的容器中。
在某些实施方案中，核酸微阵列试剂盒包含对于测量1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50种或更多种本文提供的基因或其组合的表达水平所需的材料和试剂，以及对于测量本文提供的那些基因之外的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50种或更多种基因所需的试剂和材料。在其他实施方案中，核酸微阵列试剂盒含有对于测量至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50种或更多种本文提供的基因或其任何组合的表达水平，以及非本文提供的基因的1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90，95、100、125、150、175、200、225、250、300、350、400、450种或更多种基因的表达水平所需的试剂和材料。在另一个实施方案中，核酸微阵列试剂盒含有对于测量至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50或更多种本文提供的基因或其任何组合的表达水平，以及非本文提供的基因的1-10、1-100、1-150、1-200、1-300、1-400、1-500、1-1000、25-100、25-200、25-300、25-400、25-500、25-1000、100-150、100-200、100-300、100-400、100-500、100-1000或500-1000种基因的表达水平所需的试剂和材料。
对于定量PCR，所述试剂盒通常包含对特定核酸序列具有特异性的预选引物。定量PCR试剂盒还可以包含适用于扩增核酸的酶(例如，聚合酶，如Taq聚合酶)、脱氧核苷酸和扩增反应所需的缓冲液。定量PCR试剂盒还可以包含对与病症相关或指示病症的核酸序列具有特异性的探针。所述探针可以用或不用荧光团标记。所述探针可以用或可以不用猝灭剂分子标记。在一些实施方案中，定量PCR试剂盒还包含适用于逆转录RNA的组分，包括用于逆转录的酶(例如，逆转录酶，如AMV、MMLV等)和引物以及逆转录反应所需的脱氧核苷酸和缓冲液。定量PCR试剂盒的每个组分通常都在其自己合适的容器中。因此，这些试剂盒通常包含适用于每种单独的试剂、酶、引物和探针的不同容器。此外，定量PCR试剂盒可以包含关于进行所述反应和用于解释和分析由进行反应所产生的数据的方法的说明书。在具体实施方案中，所述试剂盒含有关于预测患者中的血液癌是否在临床上对化合物敏感的说明书。
对于基于抗体的试剂盒，所述试剂盒可以包含，例如：(1)与目的肽、多肽或蛋白质结合的第一抗体(其可以附接至或可以不附接至固体支持物)；以及任选地(2)与所述第一抗体或所述肽、多肽或蛋白质结合且与可检测标记(例如，荧光标记、放射性同位素或酶)缀合的第二种不同的抗体。在具体实施方案中，所述目的肽、多肽或蛋白质与病症(例如，疾病)相关或指示病症。基于抗体的试剂盒还可以包含用于进行免疫沉淀的珠粒。基于抗体的试剂盒的每个组分通常都在其自己合适的容器中。因此，这些试剂盒通常包含适用于每种抗体和试剂的不同容器。此外，基于抗体的试剂盒可以包含关于进行所述测定和用于解释和分析由进行所述测定所产生的数据的方法的说明书。在具体实施方案中，所述试剂盒含有关于预测患者中的血液癌是否在临床上对化合物敏感的说明书。
在一个实施方案中，本文提供的试剂盒包含本文提供的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、立体异构体、同位素体、前药、水合物、共晶、包合物或多晶型物。试剂盒进一步包含另外的活性剂，包括但不限于本文公开的那些。
本文提供的试剂盒可以进一步包含用于施用所述活性成分的装置。此类装置的例子包括但不限于注射器、滴注袋、贴片和吸入器。
试剂盒可以进一步包含用于移植的细胞或血液，以及可用于施用一种或多种活性成分的药学上可接受的载体。例如，如果活性成分以必须重构才可肠胃外施用的固体形式提供，则所述试剂盒可以包含合适媒介物的密封容器，活性成分可以在所述媒介物中溶解以形成适合于肠胃外施用的不含颗粒的无菌溶液。药学上可接受的媒介物的例子包括但不限于注射用水USP；水性媒介物(如但不限于氯化钠注射液、林格氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液以及乳酸林格氏注射液)；与水混溶性媒介物(如但不限于乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇)；和非水性媒介物(如但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯)。
在本文提供的方法和试剂盒的某些实施方案中，固相支持物用于纯化蛋白质、标记样品或进行固相测定。适合于实施本文公开的方法的固相的例子包括珠粒、颗粒、胶体、单表面、管、多孔板、微量滴定板、载玻片、膜、凝胶和电极。当固相是颗粒材料(例如，珠粒)时，在一个实施方案中，其分布在多孔板的孔中以允许并行加工固相支持物。
应注意，针对本文提供的各种方法和/或试剂盒中的任一种，考虑了例如关于一种或多种试剂(如但不限于核酸引物、固相支持物等)的上述实施方案的任何组合。
通过以下非限制性实施例说明本发明的某些实施方案。
6.实施例
除非另有详细描述，否则以下实施例使用对于本领域技术人员来说熟知的且常规的标准技术来实施。实施例旨在仅仅是说明性的。
6.1.化合物D的抗增殖活性
化合物D在11个AML细胞系中的10个中显示出有效的抗增殖活性(图1A和图1B)。
对于细胞增殖测定，将在供应商推荐的生长培养基(如上所述)中培养的人癌细胞系接种至含有DMSO或测试化合物的黑色384孔板中。优化每种细胞系的接种密度以允许在3天培养期内呈直线生长期的细胞生长。为了测试化合物对AML细胞系中细胞增殖的影响，将在200μL完全培养基中的每孔5,000至10,000个细胞接种至含有DMSO或测试化合物的黑色96孔板中。72小时后，根据制造商的说明使用CTG测定评估细胞增殖。为了测试GSPT1耗尽对细胞增殖的影响，将U937细胞用慢病毒shRNA载体感染4天，之后每隔一天使用CTG对细胞增殖进行量化。相对细胞增殖针对第4天的细胞生长值进行归一化。使用GraphPad Prism第7版处理和绘制生长抑制曲线(未配对的双侧t检验，P<0.05被认为是显著的)。
与所有其他赛拉隆蛋白调节剂一样，化合物D含有戊二酰亚胺环(图1A)，它可以结合赛拉隆蛋白并将其重定向以靶向新底物从而进行降解。因此，使用串联质量标签(TMT)定量质谱法评估化合物D对AML细胞系KG-1中整体蛋白质组的影响。用0.1μM化合物D处理4小时引发GSPT1蛋白质丰度的显著降低，而对蛋白质组的其余部分影响极小(图2A)。通过化合物D对GSPT1的下调可以通过以下方法完全阻断：使用硼替佐米的蛋白酶体抑制、使用NEDD8E1抑制剂MLN4924灭活CRL4CRBN E3泛素连接酶复合物或经由CRISPR/Cas9介导的基因编辑敲除CRBN(图2B、图2C、图2E和图2F)。
6.2.经由含甘氨酸的降解决定子通过化合物D靶向降解GSPT1来介导化合物D的抗增殖活性
当直接添加至用细胞提取物进行的结合测定中时，化合物D促进了赛拉隆蛋白与GSPT1的结合，但不促进与IKZF1的结合，而来那度胺展现出对IKZF1的结合选择性优于对GSPT1的结合选择性(图3A)。携带两个点突变Y384A和W386A的赛拉隆蛋白突变体在化合物D或来那度胺的存在下分别完全消除了赛拉隆蛋白与GSPT1或IKZF1的结合(图3A)，所述两个点突变损害了赛拉隆蛋白调节剂在赛拉隆蛋白沙利度胺结合结构域的三色氨酸口袋中的对接。
为了进一步定义通过化合物D将GSPT1选择性募集至赛拉隆蛋白E3连接酶复合物的分子基础，使GSPT1与人DDB1、赛拉隆蛋白和化合物D共结晶成复合物(图3B和图3C)。
为了表达和纯化DDB1-赛拉隆蛋白，使ZZ-结构域-6xHis-凝血酶标记的人赛拉隆蛋白(氨基酸40-442)和全长人DDB1在具有50μM醋酸锌的ESF921培养基中的SF9昆虫细胞(Expression Systems)中共表达。使用手持式均化器将细胞在50mM Tris-HCl(pH7.5)、500mM NaCl、10mM咪唑、10％甘油、5mM BME、盐活性核酸酶(Sigma-Aldrich)和不含EDTA的蛋白酶抑制剂XL胶囊(Pierce)中裂解。将裂解物以38,400x g离心45分钟，并将澄清的裂解物与Ni-NTA亲和树脂(Qiagen)一起在旋转下孵育1小时。用具有250mM咪唑的裂解缓冲液洗脱复合物，并通过凝血酶切割(Enzyme Research)过夜去除ZZ-结构域-6xHis标记，并在裂解缓冲液中透析。切割的蛋白质在HisTrap柱(GE Healthcare)上运行，将流过洗涤液稀释至150mM NaCl并在ANX HiTrap离子交换柱(GE Healthcare)上运行。用50mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl、3mM TCEP洗涤ANX柱，然后用50mM Bis-Tris(pH 6.0)、150mM NaCl、3mMTCEP洗涤ANX柱。CRBN-DDB1峰在10mM HEPES(pH 7.0)、240mM NaCl和3mM TECP中在Superdex S200 26/60柱(GE Healthcare)上运行。赛拉隆蛋白-DDB1复合物被浓缩至50mg/mL。
为了表达和纯化GSPT1，GSPT1结构域2和3(氨基酸437-633)使用2XYT培养基(Teknova)在大肠杆菌BL21(DE3)星状细胞(Life Technologies)中表达为MBP融合物。细胞在OD600为0.6的密度下进行诱导，并在16℃下生长过夜。使细胞沉淀，重悬于50mM Tris(pH7.5)、200mM NaCl、1mM TCEP、10％甘油、溶菌酶(Sigma)、Benzonase(Novagen)和不含EDTA的蛋白酶抑制剂XL胶囊中(Pierce)中。对细胞进行超声处理，并将裂解物以384,000x g离心45min。将裂解物与直链淀粉树脂(NEB)在4℃下在旋转下孵育1小时。用10mM麦芽糖在裂解缓冲液中洗脱蛋白质，并通过用凝血酶(Enzyme Research)过夜切割去除MBP标记。将切割的GSPT1稀释至90mM NaCl并在Heparin HiTrap柱(GE Healthcare)上运行。GSPT1峰在10mM HEPES(pH 7.0)、240mM NaCl和3mM TECP中在Superdex 75 26/600柱(GEHealthcare)上运行。将含有GSPT1的峰浓缩至10mg/mL以用于结晶试验。
复合物的结晶通过沉滴蒸气扩散实现。将赛拉隆蛋白-DDB1和GSPT1混合在一起达到在150μM的最终浓度下的等摩尔化学计量。将在500μM化合物D的存在下的赛拉隆蛋白-DDB1-GSPT1溶液与300mM柠檬酸钠、100mM Tris-HCl(pH 7.5)、20％PEG 3350的母液溶液1:1混合并随后针对其进行平衡并在20℃下孵育。将晶体在补充有20％乙二醇的储藏溶液中进行低温保护，并在液氮下冷却。在先进光源光束线5.0.2下从单晶收集数据。使用Phaser(McCoy等人,J.Appl.Crystallogr.,2007,40:658-74)通过分子置换且人赛拉隆蛋白-DDB1-GSPT1-对照组合物(PDB编码5HXB)作为搜索模型来求解人赛拉隆蛋白-DDB1-GSPT1-化合物D的结构。使用具有非晶体对称性和外部结构约束的Phenix进行随后使用Coot的手动模型构建和精细化(Liebschner等人,Acta Crystallogr.D Struct.Biol.,2019,75:861-77)。
GSPT1与赛拉隆蛋白和化合物D的相互作用通过由GSPT1残基568-576形成的β-发夹降解决定子环介导(图3D)。分别在GSPT1残基K572、K573和S574的骨架羰基与赛拉隆蛋白残基N351、H357和W400之间形成氢键相互作用(图3D)。化合物D的戊二酰亚胺部分结合由残基W380、W386和W400形成的赛拉隆蛋白三色氨酸口袋，在赛拉隆蛋白表面上方呈现异二氢吲哚环，使得其与GSPT1甘氨酸残基575形成范德华和疏水相互作用(图3E)。用天冬酰胺替代甘氨酸575赋予了对化合物D诱导的降解的完全抗性(图3F-图3H)。化合物D从异吲哚啉酮延伸，在二氟乙酰胺部分与赛拉隆蛋白残基H353的侧链之间形成氢键相互作用，并将氯苯基部分定位在GSPT1结构域3的β-片层核心附近(图3E)。相对于对照化合物结构，观察到赛拉隆蛋白残基E377侧链位置的显著差异，这表明在E377与化合物D之间缺乏相互作用(图3I)。
虽然CRBN的消融完全消除了化合物D在U937、OCI-AML2和MOLM-13中的抗增殖作用(图2D-图2F)，但化合物D的抗AML活性可能通过GSPT1和/或由于技术限制而无法通过质谱法检测到的其他底物来介导。为了探索这一假设，测定了化合物D在U937、OCI-AML2和MOLM-13亲本细胞以及稳定过表达GSPT1-G575N的细胞中的抗增殖作用。GSPT1稳定完全抑制了对化合物D的反应(图3F-图3H)，排除了其他底物参与化合物D的抗肿瘤作用。此外，RNAi介导的GSPT1敲低导致U937细胞中的细胞适应性迅速丧失(图3J和图3K)，这与我们之前在其他AML细胞系中的观察结果一致(Matyskiela等人,Nat.Chem.Biol.,2016,535:252-57)。因此，GSPT1降解对于解释化合物D的抗AML活性是必要且充分的。
6.3.AML细胞中涉及对化合物D的反应的基因
使用全基因组CRISPR筛选(参见图5A)确定AML细胞系中涉及化合物D敏感性和抗性的基因。用合并的小向导RNA(sgRNA)文库接种稳定表达Cas9蛋白的U937细胞。合并的人sgRNA文库表达靶向超过19,000个蛋白质编码基因的4-8个sgRNA，总共150,076个独特的sgRNA。将U937细胞用100nM的化合物D处理2天(感染后D3)、7天(感染后D8)或11天(感染后D12)或用1μM或10μM的化合物D处理5天(感染后D8)或9天(感染后D12)。
具体地，根据Cellecta CRISPR合并的sgRNA文库筛选指南，以0.3的感染复数(MOI)用含有小向导RNA(sgRNA)文库(Cellecta)的慢病毒上清液接种稳定表达Cas9蛋白的总共6x108个U937细胞，以确保每个细胞仅用一个sgRNA转导。所用的Cellecta合并的人sgRNA文库表达靶向超过19,000个蛋白质编码基因中每一个的4-8个sgRNA，总共150,076个独特的sgRNA。载体还表达RFP报告基因和嘌呤霉素抗性基因。在选择嘌呤霉素24小时后，将细胞分成多个样品并用DMSO或100nM的亚致死剂量的化合物D处理以进行敏感性筛选。在另外48小时之后，将DMSO处理的细胞分成三个样品，将其用DMSO、1μM或10μM的半致死或致死剂量的化合物D处理以进行抗性筛选。细胞在2L烧瓶中在搅拌下生长，并且每次传代后维持至少2亿个细胞以超过150K文库复杂性多于1000倍，如由Cellecta CRISPR筛选指南对于维持文库代表性所建议的。在治疗的前五天之后，化合物D被充分补足。在感染后第3、8和12天以技术复制品的形式收集9x107个细胞沉淀物，以用于基因组DNA分离和测序文库制备。第3天收集的样品代表T0对照以用于与第8天和第12天的处理进行比较。为了生成用于下一代测序(NGS)的sgRNA文库，从沉淀物分离基因组DNA，并扩增构建体的sgRNA部分。在IlluminaHiSeq 4000上对文库进行测序。通过比较样品之间的sgRNA计数来分析数据。对于敏感性筛选，与DMSO相比，已用化合物D处理“去掉”的sgRNA指示这样的基因，其敲除增强了敏感性。相对于DMSO在用致死剂量处理的样品中富集的sgRNA指示这样的基因，其敲除赋予了抗性(参见图5A)。
图5B显示了在用化合物D处理后去掉或富集的基因。结果表明敲除RPTOR、MTOR、RICTOR、GSPT1或DDX5增强了对致死剂量的化合物D的敏感性，而敲除CRBN、TSC1、TSC2、ILF2、ILF3、ATF4、GCN2、DDIT4或GCN1L1基因赋予了对致死剂量的化合物D的抗性。
为了进一步阐明化合物D在AML中的抗增殖活性的机制，使用另一种全基因组正选择CRISPR-Cas9筛选来描绘控制对化合物D的反应的基因和途径(图4A)。将稳定表达Cas9的U937细胞以0.3的低感染复数(MOI)用合并的慢病毒文库转导，所述合并的慢病毒文库用4-8个不同sgRNA靶向每个蛋白质编码基因。在转导后第3天，用10μM化合物D或DMSO载体对照再处理细胞9天，接着从存活细胞中的基因组DNA扩增sgRNA编码区，并进行下一代测序以鉴定和量化sgRNA的丰度。
为了生成用于下一代测序(NGS)的sgRNA文库，将每个样品中的9x107细胞用添加了RNA酶A的Qiagen缓冲液P1裂解。将裂解物调整至0.5％SDS，并用探针超声波仪将染色质剪成10-100kb片段。用蛋白酶K处理后，用苯酚:氯仿:异戊醇提取基因组DNA，并将其用异丙醇和10％乙酸钠沉淀过夜。将DNA沉淀物用乙醇洗涤并溶解在水中。在Nanodrop上对总基因组DNA进行定量。
为了扩增在每个细胞中转导的sgRNA构建体的sgRNA部分，对每个样品中分离的所有基因组DNA进行PCR，其中每个反应扩增25μg DNA。在65℃的退火温度下进行了二十四个PCR循环。在琼脂糖凝胶上对477个碱基对PCR产物可视化后，将来自每个样品的PCR反应合并、混合，并在2步清洁方案中用1X体积的SPRIselect珠粒清洁每个样品100μl，以消除引物和基因组DNA遗留。将产物在Qiagen洗脱缓冲液中洗脱并在Nanodrop上进行测量。对第一PCR产物进行第二PCR反应，以将双重索引Illumina引物并入最终的sgRNA文库中。在65℃的退火温度下运行六个PCR循环，用71℃的退火温度运行四个循环以减少非特异性产物。在混合每个样品的四个反应并在琼脂糖凝胶上确认339个碱基对文库后，在2步清洁方案中用1X体积的SPRIselect珠粒清洁每个100μl文库，以消除引物和第一PCR反应的遗留。
将最终的sgRNA文库在Agilent Bioanalyzer上可视化，并使用KAPA文库定量试剂盒进行量化。将样品稀释至3nM，并在Illumina HiSeq 4000上的每个泳道上运行2-3个样品。每个泳道还含有5％摩尔比率的PhiX掺入以增强序列多样性。通过比较样品之间的sgRNA计数来分析数据。相对于DMSO条件，在相同时间点用致死剂量处理的样品中富集的sgRNA指示这样的基因，其敲除赋予了抗性。
与DMSO对照处理的样品相比，化合物D处理的样品中sgRNA读段计数的log2倍数变化(log2FC)被称为富集得分，并且使用目的基因的所有sgRNA的平均log2FC值来量化基因敲除对化合物D反应的影响(图4A)。与DMSO对照相比，化合物D处理导致用慢病毒CRISPR文库转导的U937细胞的生长停滞，并且显著影响sgRNA分布(图4B和图4C)。sgRNA子集(包括靶向CRBN和UBE2G1的那些)与其余sgRNA分别聚集(图4C)。
log2FC>2且错误发现率(FDR)<0.05的排名靠前的基因的途径富集分析产生了一些调节对化合物D的反应的蛋白质复合物和信号传导级联(图4D-图4F)。正如预期的那样，很大一部分化合物D富集的基因编码已知对所有赛拉隆蛋白调节剂的生物活性至关重要的蛋白质，包括赛拉隆蛋白E3连接酶复合物和COP9信号转导体的亚基、泛素缀合酶UBE2D3和UBE2G1、NEDD8缀合途径的组分和Cullin Ring E3连接酶组装因子CAND1(图4E和图4G)。此外，在明确的机制基础上发现了许多以前没有报道过的可影响对其他赛拉隆蛋白调节剂的反应的候选基因。这些包括RNA交替剪接的调节剂(如ILF2和ILF3)、mTOR信号传导的抑制剂(如TSC1和TSC2)以及整合应激反应(ISR)途径的关键组分(如GCN1(GCN1L1)、GCN2(EIF2AK4)和ATF4)(图4D和图4H)。通过化合物D显著富集了靶向这些排名靠前的基因中的每一个的多个sgRNA，有力地支持了对化合物D反应的靶向基因敲除影响(图4G和图4H)。
为了进一步分析化合物D敏感性和抗性的潜在机制，关于这些基因进行了进一步的研究。
6.4.mTOR、Raptor和Rictor的敲除增强对化合物D的敏感性
为了研究mTOR信号传导途径在介导化合物D敏感性中的作用，进行了CRISPR竞争测定(参见图6A)。用表达GFP和非靶向sgRNA(sgNT)的慢病毒载体，或表达RFP和非靶向sgRNA(sgNT)的慢病毒载体，或表达RFP和靶向MTOR、RICTOR或RAPTOR的sgRNA的慢病毒载体感染稳定表达Cas9的U937细胞。然后用DMSO或100nM化合物D处理细胞。此后每2-3天通过流式细胞术监测RFP+/GFP+比率。
为了确认靶基因的敲除，在收获前，在缓冲液A[50mM Tris.Cl(pH 7.6)、150mMNaCl、1％Triton X-100、1mM EDTA、1mM EGTA、1mMβ-甘油磷酸盐、2.5mM焦磷酸钠、1mMNa3VO4、1μg/mL亮肽素、1片完全ULTRA蛋白酶抑制剂混合物(Roche)和1片PhosSTOP磷酸酶抑制剂混合物(Roche)]中在冰冷的1X PBS中洗涤每个样品中的一百万个细胞。以最高速度离心10分钟后收集全细胞提取物，将其通过SDS-PAGE凝胶电泳解析，使用Turboblot系统(Bio-Rad)转移至硝酸纤维素膜上，并用所示的一抗进行探测。使用LI-COR扫描仪用IRDye-680或-800缀合的二抗检测结合的抗体。mTOR、Raptor和Rictor敲除的确认示于图6B。
如图6C-图6E所示，与对照细胞相比，mTOR、Raptor和Rictor的敲除增强了U937对化合物D的敏感性，这表明mTOR途径及其组分可能涉及化合物D抗性。
6.5.由mTOR介导的化合物D抗性
响应于氨基酸和葡萄糖刺激，mTOR易位至溶酶体表面，在那里它被Rheb激活(Liu和Sabatini,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.,2020,21:246)。mTOR的溶酶体易位通过KICSTOR复合物(由SZT2、C12orf66、ITFG2和KPTN组成)和GATOR1复合物(由NPRL2、NPRL3和DEPDC5组成)负调节，而Rheb被TSC复合物(由TSC1、TSC2和TBC1D7组成)抑制(Liu和Sabatini，同上)。
为了进一步分析mTOR在化合物D反应性中的作用，mTOR信号传导的各种调节物(例如，负调节物)被敲除。
TSC1或TSC2的丧失赋予对化合物D的抗性
如上所述，通过CRISPR介导的基因编辑在AML细胞系U937和OCI-AML2中完成了TSC1和TSC2的敲除。
具体地，用组成性表达RFP和非靶向或非编码sgRNA(sgNT)对照或靶向TSC1或TSC2的sgRNA的慢病毒载体感染稳定表达Cas9的U937细胞。用1μg/ml嘌呤霉素选择感染的细胞。在感染之后五天，在收获前，在缓冲液A[50mM Tris.Cl(pH 7.6)、150mM NaCl、1％TritonX-100、1mM EDTA、1mM EGTA、1mMβ-甘油磷酸盐、2.5mM焦磷酸钠、1mM Na3VO4、1μg/mL亮肽素、1片完全ULTRA蛋白酶抑制剂混合物(Roche)和1片PhosSTOP磷酸酶抑制剂混合物(Roche)]中在冰冷的1X PBS中洗涤每个样品中的一百万个细胞两次。以最高速度离心10分钟后收集全细胞提取物，将其通过SDS-PAGE凝胶电泳解析，使用Turboblot系统(Bio-Rad)转移至硝酸纤维素膜上，并用所示的一抗进行探测。使用LI-COR扫描仪用IRDye-680或-800缀合的二抗检测结合的抗体。
类似地，用组成性表达RFP和非靶向或非编码sgRNA(sgNT)对照或靶向TSC1或TSC2的sgRNA的慢病毒载体感染稳定表达Cas9的OCI-AML2细胞。用1μg/ml嘌呤霉素选择感染的细胞。在感染之后五天，将每个样品中的一百万个OCI-AML2细胞用冰冷的1X PBS洗涤，并用含有2-巯基乙醇的100μl 2x LDS缓冲液裂解。将裂解物在95℃下煮沸10分钟。收集全细胞提取物，将其通过SDS-PAGE凝胶电泳解析，使用Turboblot系统(Bio-Rad)转移至硝酸纤维素膜上，并用所示的一抗进行探测。使用LI-COR扫描仪用IRDye-680或-800缀合的二抗检测结合的抗体。
蛋白质印迹分析证实了这些基因分别在U937和OCI-AML2细胞中被敲除(参见图7A和图7B)。
然后，进行细胞增殖测定。使用HP D300数字分配器将溶解在DMSO中的化合物D对于化合物D浓度一式三份地注射至96孔细胞培养板中。在感染以敲除所示基因之后一周，将U937 Cas9细胞系和OCI-AML2 Cas9细胞系中的每一个以每孔100μL完全培养基中的5000个细胞一式三份地铺板在96孔板中。5天后，根据制造商的说明使用CTG(CellTiter-Glo)评估细胞增殖，以评估化合物D对每个细胞系的增殖的影响。图7C和图7D显示化合物D在亲本、非靶向(sgNT-1)和非编码(sgNC-8)对照中展现出剂量依赖性抗增殖作用。然而，U937细胞中TSC1和TSC2的耗尽减弱了这种作用。
接着，如上所述，在U937和OCI-AML2细胞中进行CRISPR竞争测定。具体地，用组成性表达GFP和非靶向sgRNA(sgNT)的慢病毒载体，或组成性表达RFP和非靶向sgRNA(sgNT)或靶向TSC1或TSC2的sgRNA的慢病毒载体感染稳定表达Cas9的U937细胞。在感染之后三天，将RFP和GFP细胞以1:1比率混合，并用DMSO、1μM化合物D或10μM化合物D处理。此后每2-3天通过流式细胞术监测RFP+/GFP+比率的变化。类似地，用组成性表达GFP和非靶向sgRNA(sgNT)的慢病毒载体，或组成性表达RFP和非靶向sgRNA(sgNT)或靶向TSC1或TSC2的sgRNA的慢病毒载体感染稳定表达Cas9的OCI-AML2细胞。在感染之后三天，将RFP和GFP细胞以1:1比率混合，并用DMSO、0.1μM化合物D或1μM化合物D处理。此后每2-3天通过流式细胞术监测RFP+/GFP+比率的变化。
还进行了免疫印迹分析。在感染之后两周，将每个样品中的一百万个U937细胞用冰冷的1X PBS洗涤，并用含有2-巯基乙醇的100μl 2x LDS缓冲液裂解。将裂解物在95℃下煮沸10分钟。收集全细胞提取物，将其通过SDS-PAGE凝胶电泳解析，使用Turboblot系统(Bio-Rad)转移至硝酸纤维素膜上，并用所示的一抗进行探测。使用LI-COR扫描仪用IRDye-680或-800缀合的二抗检测结合的抗体。示例性结果示于图7E。
在CRISPR筛选中，编码TSC复合物、GATOR1复合物或KICSTOR复合物的亚基的几乎每个sgRNA靶向基因都被化合物D显著富集(图7K)。TSC1或TSC2的敲除导致S6K1磷酸化的增强，这表明mTOR过度激活(图7B和图7E)。与CRISPR筛选一致，当在CRISPR竞争测定中测试时，TSC1或TSC2缺乏在存在化合物D的情况下在U937和OCI-AML2中赋予生长优势，但在不存在化合物D的情况下不赋予生长优势(图7H-图7J)。TSC1或TSC2的丧失部分地阻断了由化合物D诱导的GSPT1降解，提供了对mTOR激活后减弱的化合物D反应的解释(图8A和图8B)。
CRISPR竞争测定(参见图7F和图7G)的结果还显示，TSC1或TSC2的耗尽增加了U937和OCI-AML2细胞中对化合物D的抗性。
TSC1和TSC2的敲除减弱化合物D诱导的GSPT1降解
为了了解mTOR激活对化合物D诱导的GSPT1降解的影响是否可以归因于增加的GSPT1蛋白合成速率和/或降低的GSPT1降解速率，测定了在存在或不存在化合物D的情况下响应于TSC1或TSC2丧失的GSPT1蛋白半衰期的变化。用化合物D和放线菌酮(蛋白质合成抑制剂)共同处理下调了GSPT1表达并且TSC1或TSC2丧失在很大程度上消除了这种作用，而单独的放线菌酮处理对U937亲本、TSC1-/-和TSC2-/-细胞中的GSPT1的蛋白质水平未显示出太大影响(图8C)。与内源性GSPT1的降解相比，mTOR的过度激活还对由化合物D诱导的HA标记的GSPT1的降解展现出相同的影响(图8D)。由于TSC1或TSC2缺乏没有影响通过泊马度胺对Ikaros的降解(图8E)，因此推断mTOR激活可能限制赛拉隆蛋白对GSPT1的可及性，而不影响赛拉隆蛋白E3连接酶复合物或26S蛋白酶体的活性。与该假设一致，TSC1丧失显著降低了HA标记的GSPT1与由化合物D诱导的内源性赛拉隆蛋白之间的相互作用(图8F)。
如上所述，通过如先前所述的CRISPR介导的基因编辑工具在AML细胞系U937和OCI-AML2中完成了TSC1和TSC2的敲除。蛋白质印迹分析证实了这些基因分别在U937和OCI-AML2细胞中被敲除(参见图8A和图8B)。此外，图8A和图8B显示了TSC1或TSC2敲除。在亲本、非靶向(sgNT-1)和非编码(sgNC-8)对照中，相对于化合物D诱导的GSPT1降解，减弱的化合物D诱导的GSPT1降解。
GCN2和mTOR的其他负调节物的敲除赋予对化合物D的抗性
如图5A的上图所示且与上述的测定类似地进行CRISPR竞争测定。用组成性表达GFP和非靶向sgRNA(sgNT)的慢病毒载体，或组成性表达RFP和非靶向sgRNA(sgNT)或靶向GCN2的sgRNA的慢病毒载体感染稳定表达Cas9的U937细胞。在第2天，将RFP和GFP细胞以1:1比率混合，并用DMSO或100nM化合物D处理。此后每2-3天通过流式细胞术监测RFP+/GFP+比率的变化。
为了确认靶基因的敲除，在收获前，在缓冲液A[50mM Tris.Cl(pH 7.6)、150mMNaCl、1％Triton X-100、1mM EDTA、1mM EGTA、1mMβ-甘油磷酸盐、2.5mM焦磷酸钠、1mMNa3VO4、1μg/mL亮肽素、1片完全ULTRA蛋白酶抑制剂混合物(Roche)和1片PhosSTOP磷酸酶抑制剂混合物(Roche)]中在冰冷的1X PBS中洗涤每个样品中的一百万个细胞。以最高速度离心10分钟后收集全细胞提取物，将其通过SDS-PAGE凝胶电泳解析，使用Turboblot系统(Bio-Rad)转移至硝酸纤维素膜上，并用所示的一抗进行探测。使用LI-COR扫描仪用IRDye-680或-800缀合的二抗检测结合的抗体。蛋白质印迹分析证实了GCN2敲除(参见图9A)。
CRISPR竞争测定的结果示于图9B，这表明缺乏GCN2的U937细胞对化合物D具有抗性。
接着，研究了mTOR的另外的负调节物的作用。为了敲除所研究的基因，使用了基于电穿孔的方法，其中将由Cas9蛋白和基因靶向gRNA组成的核糖核蛋白(RNP)直接递送至U937细胞。首先制备了crRNA-tracrRNA双链体，其由含有对每个靶基因具有特异性的20nt序列的crRNA和用于将Cas9核酸酶引导至基因座的通用tracrRNA组成。靶向CRBN、ATF4、GCN1、GCN2、DDIT4、TSC1、TSC2的sgRNA序列或非靶向(NT-1)和非编码(NC-8)对照选自Cellecta sgRNA文库。在将Cas9酶与crRNA-tracrRNA双链体预偶联后，在核转染溶液(4D核转染器X试剂盒SE；Lonza)中将复合物与每个样品中的一百万个U937细胞混合。根据制造商的说明，将细胞在4D核转染器中电穿孔，并铺板至完全细胞培养基中。
为了证实靶基因的敲除，在电穿孔之后五天，将每个样品中的一百万个U937细胞用冰冷的1X PBS洗涤，并用含有2-巯基乙醇的100μl 2x LDS缓冲液裂解。将裂解物在95℃下煮沸10分钟。收集全细胞提取物，将其通过SDS-PAGE凝胶电泳解析，使用Turboblot系统(Bio-Rad)转移至硝酸纤维素膜上，并用所示的一抗进行探测。使用LI-COR扫描仪用IRDye-680或-800缀合的二抗检测结合的抗体(参见图9C)。
然后进行细胞增殖测定。使用HP D300数字分配器将溶解在DMSO中的化合物D对于每个最终的化合物D浓度一式三份地注射至96孔细胞培养板中。在电穿孔以敲除所示基因之后一周，将U937 Cas9细胞系以每孔100μL完全培养基中的5000个细胞一式三份地铺板在96孔板中。5天后，根据制造商的说明使用CTG(CellTiter-Glo)评估细胞增殖，以评估化合物D对每个细胞系的增殖的影响。
增殖测定显示化合物D在亲本和非编码(NC-8)对照中展现出剂量依赖性抗增殖作用(参见图9D和图9E)。然而，GCN2、ATF4、GCN1、CRBN、DDIT4、TSC1和TSC2的耗尽减弱了这种作用(参见图9D和图9E)。
总之，当mTOR或其组分被敲除时，观察到对化合物D的敏感性增强。此外，当mTOR的抑制通过mTOR的各种上游和下游负调节物的耗尽而降低时，细胞对化合物D产生抗性。总之，这些数据表明AML细胞中的化合物D抗性至少部分地由mTOR信号传导途径驱动。
6.6.由ILF2/ILF3介导的化合物D抗性
除了涉及被发现参与化合物D抗性的mTOR途径的基因外，ILF2和ILF3显示出对化合物D抗性有贡献(参见图5)。ILF2和ILF3形成异二聚体复合物，其充当在T细胞激活期间调节IL-2表达的转录因子。为了确定ILF2/3介导的化合物D抗性的潜在机制，敲除ILF2和ILF3。
接着，如上所述，在U937和OCI-AML2细胞中进行CRISPR竞争测定。具体地，将U937和OCI-AML2细胞系用plenti-EF1á-Cas9-P2A-原始细胞转导，接着选择杀稻瘟菌素来建立Cas9表达细胞系。然后将U937-Cas9和OCI-AML2-Cas9细胞用pRSG17-U6-sgNT-1-UbiC-TagGFP2-2A-Puro或表达sgNT-1、sgNC-1、sgNC-8或基因特异性sgRNA的pRSG16-U6-UbiC-TagRFP-2A-Puro载体转导。在转导后72小时用1X PBS洗涤转导的细胞。经由RFP或GFP荧光报告基因表达评估细胞的转导。一旦确认荧光报告基因的表达，将RFP和GFP转导的细胞以1:1比率混合，并以200,000个细胞/mL的细胞密度接种在12孔组织培养板中的每孔2ml培养基中，并用DMSO或适当剂量的化合物处理。剩余的细胞经过3-7天的嘌呤霉素选择，并收获用于免疫印迹分析以确认基因敲除。在将细胞接种在12孔板中进行培养后，每孔取出100ìL细胞培养物以进行流式细胞术分析，作为每个孔中的基线“第0天”RFP阳性和GFP阳性百分比。这一步骤每2-4天重复一次，以对经历每个实验的所示时间过程的RFP阳性和GFP阳性百分比的流式细胞术分析。将每个时间点的RFP+/GF P+比率针对各自“第0天”的RFP+/GFP+比率进行归一化。
ILF2和ILF3的敲除赋予化合物D抗性
U937和OCI-AML2细胞中ILF2和ILF3的敲除通过如上所述的CRISPR介导的基因编辑工具来完成。如图10A和图10C中所示的蛋白质印迹分析证实了在U937细胞中这些基因的敲除，并且图10E中所示的分析证实了在OCI-AML2细胞中这些基因的敲除。CRISPR竞争分析表明，U937和OCI-AML2细胞中的ILF2或ILF3敲除导致化合物D抗性(参见图10B、图10D、图10F)。在图10A、图10B、图10G和图10H中，U937 Cas9细胞已经用诱导性载体转导，在每次测定前用1μg/ml多西环素诱导其sgRNA表达若干天。组成性表达的sgRNA用于所示的其余ILF2/3测定中(图10C、图10D、图10E和图10F)。
ILF3的敲除导致CRBN下调和GSPT1积累
为了确定ILF3的失活是否消除了对化合物D的反应，使用基于流式细胞术的CRISPR竞争测定来辨别在存在或不存在化合物D的情况下ILF3敲除对细胞适应性的影响(图10I)。具体地，用表达sgNT-1、sgNC-1、sgILF3-2或sgILF3-4的lenti-H1TO-EF1a-HTLV-TetR-P2A-RFP-P2A-Puro载体转导U937-Cas9细胞以产生稳定的多西环素诱导性sgR NA细胞系。用1μg/ml多西环素处理可诱导表达sgNT-1、sgNC-1、sgILF3-2或sgILF3-4的U937-Cas9细胞，并在同一天用pRSG17-U6-sgNT-1-UbiC-TagGFP2-2A-Puro转导U937-Ca s9细胞。3天后，以1:1比率混合表达RFP和GFP的细胞并将其用DMSO或化合物D处理，接着如下所述通过流式细胞术进行细胞活力评估。
对于细胞凋亡测定，在选择的AML细胞系中在所示的时间点和化合物浓度下评估化合物D诱导细胞凋亡的能力。对于通过流式细胞术得到的膜联蛋白V/7AAD读出，将AML细胞系以0.1-0.3x106个细胞/mL的接种密度铺板在平底96孔板(BD Falcon)中的200μL完全培养基中。将化合物D分配至板上并将细胞孵育24-48小时。在孵育期结束时，将100μL细胞转移到96孔U型底板(BD Falcon)中，以1200rpm离心5分钟，并且去除培养基。将2.5μL的膜联蛋白V-AF647(Biolegend)和5μL 7AAD(Biolegend)稀释到100μL的1x膜联蛋白结合缓冲液(BD Biosciences)中。在将100μL膜联蛋白V/7AAD缓冲液添加至每个孔中后十五分钟，使用Attune流式细胞仪(Invitrogen)分析细胞。使用GraphPad Prism第7版处理和绘制细胞凋亡诱导曲线(未配对的双侧t检验，P<0.05被认为是显著的)。
多西环素诱导的sgILF3表达而不是对照sgRNA、sgNT或sgNC的表达触发了U937细胞中ILF3的有效敲除，导致ILF3耗尽的细胞相对于对照细胞的显著富集，这与CRISPR筛选结果一致(图10B和图10J)。ILF3丧失显著降低了赛拉隆蛋白水平，因此降低了化合物D诱导的GSPT1降解，这可能导致ILF3丧失后化合物D的活性减弱(图10G和图10J)。ILF2/NF45和ILF3/NF90形成异二聚体复合物，已知其在多个水平上调节基因表达，包括RNA转录、交替剪接、翻译和微小RNA生物发生(Marchesini等人,Cancer Cell,2017,32:88-100；Pfeifer等人,Proc Natl Acad Sci U S A 2008；Reichman等人,2002；Sakamoto等人,2009；Masuda等人,2013)。ILF2敲除在U937中显示出与ILF3敲除相同的作用(图10C、图10D和图10K)。此外，在OCI-AML2中也可以观察到ILF2或ILF3消融对赛拉隆蛋白表达和化合物D反应的影响(图10E和图10F)。
图10A、图10C、图10E、图10G中所示的结果表明，相对于化合物D诱导的GSPT1降解，在亲本、非靶向(sgNT-1)和非编码(sgNC-8)对照中ILF2或ILF3的敲除导致CRBN下调和减弱的化合物D诱导的GSPT1降解。
为了研究ILF2/ILF3复合物调节赛拉隆蛋白表达的机制，在表达sgNT和sgILF3的U937-Cas9细胞中进行了mRNA-Seq。具体地，将表达诱导性sgNT-1或sgILF3-2的U937-Cas9细胞用或不用1μg/ml多西环素一式三份地处理5天。根据制造商的方案，使用TruSeq mRNA试剂盒(Illumina)制备聚A选择的mRNA文库。简而言之，使用RNeasy迷你试剂盒从细胞沉淀物提取总RNA，接着经由聚A选择进行mRNA分离。纯化的mRNA被片段化并用逆转录酶转化为第一链cDNA。将得到的第一链cDNA转化为双链cDNA，并进行末端修复、A尾添加和适配体连接。使用Illumina的HiSeq 4000(2x150bp配置，单索引，每个泳道)对文库进行扩增和测序。Fastq转换的序列文件使用Cutadapt v1.15(Martin等人,EMBnetjournal,2011,17:10-12)进行适配体和质量修整，并使用STAR v2.5(Dobin等人,Bioinformatics,2013,29:15-21)与基因组形式hg38比对。使用与R包DEXSeq一起提供的Python脚本“dexseq_prepare_annotation.py”准备了基于Gencode v24注释的扁平化外显子文件(Anders等人,GenomeRes.,2012,22:2008-17)。该脚本通过折叠重叠的外显子或外显子区域以及表示来自不同转录物的独特外显子边界区域来生成独特的外显子组。来自Subread v1.6.2包中的“featureCounts”函数用于生成对于每个STAR比对的bam文件的外显子箱元计数(Liao等人,Bioinformatics,2014,30:923-30)。使用R包edgeR(Robinson等人,Bioinformatics,2010,26:139-40)评估加工后的读段计数在两种实验条件之间ILF3KO相比于非靶向(NT)对照的差异基因表达和交替剪接。应用于由一般化线性模型拟合的标准化外显子箱元计数的“diffSpliceDGE”函数针对差异外显子使用(DEU)进行测试。DEU是比较外显子箱元相对于整个基因的logFC的log2倍数变化(logFC)的量度。因此，显著的DEU表示在两个实验条件之间与在整个基因上的丰度相比，外显子或外显子区域的相对丰度的显著差异。应用错误发现率(FDR)<0.05来定义统计上显著的基因和外显子丰度。
使用超几何模型进行途径富集分析，以鉴定与大于在sgILF3-2与sgNT-1转染的细胞之间差异表达的基因的预期数量相关的Reactome途径。具有差异外显子使用的迹象的基因被类似地询问Reactome途径富集，各自使用R包ReactomePA(Yu和He,Mol.Biosyst.,2016,12:477-79)。
ILF3丧失显著地(FDR<0.05)影响645个基因的表达，其中许多与流感感染和复制有关，并且不太显著地与翻译延伸有关(图11A和图11B)。与ILF2/ILF3在前mRNA剪接中的作用相一致，ILF3丧失显著地改变了967个基因的选择性剪接转录物的水平，所述基因涉及若干种细胞功能，包括前mRNA和rRNA的加工、染色质修饰和无意义介导的mRNA衰变(图11A和图11B)。该转录组分析揭示了响应于ILF3丧失的CRBN的外显子使用的显著变化，但其总mRNA水平没有显著变化(图7K、图11A和图11B)。人CRBN具有15个剪接变体，其中两个(CRBN-201和CRBN-203)产生全长功能蛋白(图11C)。ILF3敲除降低了CRBN-201和CRBN-203的mRNA水平，并增加了剪接变体CRBN-213的水平，所述剪接变体由外显子1-4和含有提前终止密码子的隐藏外显子5组成(图7K和图11C)。CRBN-213编码截短的赛拉隆蛋白，其缺乏涉及所有赛拉隆蛋白调节剂的结合的关键结构域。
然后，使用定量PCR分析CRBN剪接同种型。将表达靶向ILF3的多西环素诱导性sgRNA载体或非靶向(sgNT)对照的U937 Cas9细胞用1μg/ml多西环素诱导三天。诱导后，用冰冷的1X PBS洗涤每个样品中的一百万个U937细胞，并使用RNeasy Plus迷你试剂盒(Qiagen)从每个样品分离总RNA。在使用具有随机引物的亲和力AffinityScript逆转录试剂盒进行逆转录以合成cDNA后，使用对全长CRBN转录物、截短的CRBN-213转录物或GAPDH转录物具有特异性的引物作为上样对照进行SYBR Green qPCR。在ILF3敲除与sgNT细胞系之间比较了全长和截短的CRBN同种型的表达水平。如图6H所示，ILF3的丧失导致CRBN的全长同种型1和2的水平降低，以及交替剪接的CRBN-213的表达增加。这表明ILF3在转录后调节CRBN的表达。当ILF3耗尽时，CRBN的替代转录物无法调节其下游靶标，如GSPT1。
从前述内容可以理解，尽管为了说明的目的在本文中描述了具体的实施方案，但是可以在不偏离本文所提供的精神和范围的情况下进行各种修改。将上面提到的所有参考文献通过引用以其整体并入本文。
6.7.由ISR介导的化合物D抗增殖活性
整合应激反应(ISR)是进化上保守的稳态途径。ISR的激活由翻译起始因子eIF2a被四种同源应激感应激酶PERK、GCN2、HRI或PKR之一磷酸化来启动，从而导致抑制整体蛋白质翻译以及ISR效应子ATF4和其他拥有上游开放读框的基因的优先翻译(Barid和Wek,Advances in Nutrition,2012,3:307-21；Donnelly等人,CMLS,2013,3493-511)。GCN2与GCN1在翻译核糖体上形成复合物，并在感应包括氨基酸剥夺、蛋白质翻译停滞、蛋白酶体抑制、UV辐照和氧化应激在内的细胞应激时激活ATF4途径(Anda等人,PLoS One,2017,12:e0182143)。
在CRISPR筛选中，几乎所有靶向GCN1、GCN2以及ATF4及其下游转录靶基因DDIT4的sgRNA都通过化合物D显著富集(图4H)，而未观察到靶向其他eIF2a激酶(包括PERK(EIF2AK3)、HRI(EIF2AK1)和PKR(EIF2AK2))的sgRNA的富集。使用CRISPR竞争测定，我们证实了GCN1、GCN2、ATF4或DDIT4的丧失保护细胞免于在U937和OCI-AML2细胞中的化合物D诱导的生长抑制(图12A-图12K)，这表明GCN2介导的ISR的激活在化合物D的抗AML作用中起关键作用。事实上，化合物D处理引发了eIF2a的快速磷酸化、ATF4及其转录靶标DDIT4、CHOP和ATF3的积累，以及随后对细胞凋亡的诱导(图13A和图13B)。
定量RT-PCR分析证实了在用化合物D处理后在mRNA水平上对ATF4靶基因ATF3、CHOP和DDIT4的显著诱导(图13C和图13D)。具体地，在与DMSO或化合物D一起孵育后，经由以2000rpm离心2分钟收集细胞。然后将细胞沉淀物在冰冷的PBS中洗涤一次，并在液氮中急速冷冻。根据制造商的说明，使用RNeasy迷你试剂盒提取总RNA，并使用具有随机引物的AffinityScript QPCR cDNA合成试剂盒将其逆转录成第一链cDNA。通过ViiATM7实时PCR系统使用TaqMan基因表达测定探针(Invitrogen)对GADPH、DDIT3(CHOP)、DDIT4(REDD)和ATF3的cDNA转录物进行量化。使用RT2 SYBR Green qPCR Mastermixes(Qiagen)对各种CRBN转录物的cDNA水平进行量化。每个反应一式三份地或一式四份地进行，并且取平均值以计算相对表达水平。检测的交替转录的CRBN转录物的引物序列列于下表1：
表1.qRT-PCR引物序列
Figure BDA0003710765600000791
为了确定化合物D对ISR的激活是否仅由GCN2介导，评价了GCN2消融对化合物D反应的影响。在用化合物D处理的U937细胞中GCN2敲除抑制eIF2a的磷酸化、ATF4及其靶基因DDIT4的诱导以及胱天蛋白酶-3的切割(图13A和图13C)。GCN2丧失在很大程度上但不是完全阻断了其他ATF4靶基因ATF3和CHOP的诱导(图13C)，这表明涉及了能够诱导这两个基因的其他信号传导途径。重新引入GCN2野生型但不是其任何酶促死亡突变体T899A/T904A、K619R和F1143L/R1144L显著地恢复了U937 GCN2-/-细胞中对化合物D的反应(图13E和图13F)。总体上，这些发现表明响应于GSPT1降解的ISR途径的激活至少部分地调节了化合物D的抗AML活性。

Claims (49)

1.一种鉴定可能对包含化合物的治疗有反应的患有癌症的受试者，或者预测患有或被怀疑患有癌症的受试者对包含所述化合物的治疗的反应性的方法，所述方法包括：
i.提供来自所述受试者的样品；
ii.测量所述样品中一种或多种基因的基因表达水平；以及
iii.如果所述基因的表达水平不同于参考水平，则鉴定所述受试者为可能对包含所述化合物的治疗有反应，
其中所述化合物是2-(4-氯苯基)-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺(化合物D)，其具有如下结构：
Figure FDA0003710765590000011
或者其立体异构体或者其立体异构体、同位素体、药学上可接受的盐、互变异构体、溶剂化物、水合物、共晶、包合物或多晶型物的混合物，并且
其中所述基因是参与mTOR信号传导的基因，或所述基因是ILF2或ILF3。
2.一种用化合物治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括：
(a)鉴定可能对包含所述化合物的治疗有反应的患有癌症的受试者，其包括：
i.提供来自所述受试者的样品；
ii.测量所述样品中一种或多种基因的基因表达水平；以及
iii.如果所述基因的表达水平不同于参考水平，则鉴定所述受试者为可能对包含所述化合物的治疗有反应，
(b)如果所述受试者被鉴定为可能对包含所述化合物的治疗有反应，则向所述受试者施用治疗有效量的所述化合物，
其中所述化合物是化合物D，或者其立体异构体或者其立体异构体、同位素体、药学上可接受的盐、互变异构体、溶剂化物、水合物、共晶、包合物或多晶型物的混合物，并且
其中所述基因是参与mTOR信号传导的基因，或所述基因是ILF2或ILF3。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述基因是参与mTOR信号传导的基因。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述基因是mTOR信号传导的正调节物。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述基因是mTOR。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述基因是Raptor。
7.根据权利要求3所述的方法，其中所述基因是Rictor。
8.根据权利要求4-7中任一项所述的方法，其中所述方法包括如果所述基因的表达水平低于参考水平，则鉴定所述受试者为可能对包含所述化合物的治疗有反应。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述参考水平是所述基因在对化合物D有抗性的受试者中的表达水平。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述参考水平是所述基因在没有所述癌症的受试者中的表达水平。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述参考水平是预先确定的水平。
12.根据权利要求3所述的方法，其中所述基因是mTOR信号传导的负调节物。
13.根据权利要求3所述的方法，其中所述基因是TSC1。
14.根据权利要求3所述的方法，其中所述基因是TSC2。
15.根据权利要求3所述的方法，其中所述基因是GCN1。
16.根据权利要求3所述的方法，其中所述基因是GCN2。
17.根据权利要求3所述的方法，其中所述基因是DDIT4。
18.根据权利要求3所述的方法，其中所述基因是ATF4。
19.根据权利要求12-18中任一项所述的方法，其中所述方法包括如果所述基因的表达水平高于参考水平，则鉴定所述受试者为可能对包含所述化合物的治疗有反应。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述参考水平是所述基因在对化合物D有反应的受试者中的表达水平。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述参考水平是所述基因在没有所述癌症的受试者中的表达水平。
22.根据权利要求19所述的方法，其中所述参考水平是预先确定的水平。
23.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述基因是ILF2。
24.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述基因是ILF3。
25.根据权利要求23或权利要求24所述的方法，其中所述方法包括如果所述基因的表达水平高于参考水平，则鉴定所述受试者为可能对包含所述化合物的治疗有反应。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述参考水平是所述基因在对化合物D有反应的受试者中的表达水平。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述参考水平是所述基因在没有所述癌症的受试者中的表达水平。
28.根据权利要求25所述的方法，其中所述参考水平是预先确定的水平。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述癌症是血液癌。
30.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述癌症是淋巴瘤。
31.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述癌症是白血病。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述癌症是AML。
33.一种鉴定可能对包含化合物的治疗有反应的患有癌症的受试者，或者预测患有或被怀疑患有癌症的受试者对包含所述化合物的治疗的反应性的方法，所述方法包括：
i.提供来自所述受试者的样品；
ii.测定所述样品中生物标记物的序列；以及
iii.如果在所述生物标记物中鉴定出突变，则鉴定所述受试者为不太可能对包含所述化合物的治疗有反应，和/或如果在所述生物标记物中未鉴定出所述突变，则鉴定所述受试者为可能对包含所述化合物的治疗有反应；
其中所述化合物是化合物D，或者其立体异构体或者其立体异构体、同位素体、药学上可接受的盐、互变异构体、溶剂化物、水合物、共晶、包合物或多晶型物的混合物，并且
其中所述生物标记物是CRBN或GSPT1。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述生物标记物是GSPT1，并且其中所述突变是GSPT1的氨基酸残基C568、L569、V570、D571、K572、K573、S574、G575或E576的突变。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述突变选自K572、K573、S574、G575及其组合。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述突变包含G575N。
37.根据权利要求33所述的方法，其中所述生物标记物是CRBN，并且其中所述突变是氨基酸残基N351、H357、W380、Y384、W386或W400的突变。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述突变是Y384A或W386A。
39.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用化合物，其中所述受试者已经根据包括以下的方法被确定为可能对所述化合物有反应：
i.提供来自所述受试者的样品；
ii.测定所述样品中生物标记物的序列；以及
iii.如果在所述生物标记物中未鉴定出突变，则鉴定所述受试者为可能对所述化合物有反应；
其中所述化合物是化合物D，或者其立体异构体或者其立体异构体、同位素体、药学上可接受的盐、互变异构体、溶剂化物、水合物、共晶、包合物或多晶型物的混合物，并且
其中所述生物标记物是CRBN或GSPT1。
40.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用第二化合物，其中所述受试者已经根据包括以下的方法被确定为不太可能对第一化合物有反应：
i.提供来自所述受试者的样品；
ii.测定所述样品中生物标记物的序列；以及
iii.如果在所述生物标记物中鉴定出突变，则鉴定所述受试者为不太可能对所述化合物有反应；
其中所述第一化合物是化合物D，或者其立体异构体或者其立体异构体、同位素体、药学上可接受的盐、互变异构体、溶剂化物、水合物、共晶、包合物或多晶型物的混合物，
其中所述第二化合物不是化合物D，或者其立体异构体或者其立体异构体、同位素体、药学上可接受的盐、互变异构体、溶剂化物、水合物、共晶、包合物或多晶型物的混合物，并且
其中所述生物标记物是CRBN或GSPT1。
41.根据权利要求39或权利要求40所述的方法，其中所述生物标记物是GSPT1，并且其中所述突变是GSPT1的氨基酸残基C568、L569、V570、D571、K572、K573、S574、G575或E576的突变。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述突变选自K572、K573、S574、G575及其组合。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述突变包含G575N。
44.根据权利要求39或权利要求40所述的方法，其中所述生物标记物是CRBN，并且其中所述突变是氨基酸残基N351、H357、W380、Y384、W386或W400的突变。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述突变是Y384A或W386A。
46.根据权利要求33至45中任一项所述的方法，其中所述癌症是血液癌。
47.根据权利要求33至45中任一项所述的方法，其中所述癌症是淋巴瘤。
48.根据权利要求33至45中任一项所述的方法，其中所述癌症是白血病。
49.根据权利要求33至45中任一项所述的方法，其中所述癌症是AML。
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