TWI816603B - 新抗原表位疫苗及免疫刺激組合物及方法 - Google Patents

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Abstract

透過使用各種化合物與組合物的協調治療方案來治療癌症，該化合物與組合物採用初級-加強免疫接種與免疫調節治療組合使用並偏向一Th1圖譜的免疫反應。

Description

新抗原表位疫苗及免疫刺激組合物及方法
本案主張我們在美國同樣待審中的美國臨時專利申請案之優先權，該申請案的序列號分別為62/661,298，申請日為2018年04月23日，該申請案以引用之方式整體併入本文。
本發明之領域為癌症治療的組合物及方法，特別是涉及以協調方式利用疫苗及免疫調節劑的癌症免疫療法之方案及組合物。
背景描述包括可用於理解本發明之資訊。這並非承認本文提供之任何資訊為現有技術或與當前請求保護之發明相關，或者具體或隱含地引用的任何出版物為現有技術。
本文中的所有出版物及專利申請皆透過引用併入，其程度如同每個單獨的出版物或專利申請被具體且單獨地指出透過引用併入。如果併入的引用中術語的定義或用法與本文提供的術語的定義不一致或相反，則適用本文提供之該術語的定義，且不適用該術語在該引用中的定義。
免疫系統被描述為在癌症中發揮雙重作用，因為它可以透過檢測及消除腫瘤細胞來預防癌症發展，但也因為它可以透過選擇逃避免疫破壞的腫瘤細胞來促進癌症惡化。免疫系統在癌症中的這種矛盾作用也稱為癌症免疫編輯(參見例如，Science. 2011; 331:1565-70)。癌細胞經常使用各種機制來逃避免疫細胞的識別與破壞。例如，癌細胞可透過募集調節性T細胞(regulatory T cells, Tregs)、髓源性抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)，以及免疫抑制性巨噬細胞(M2巨噬細胞)以調節腫瘤微環境(tumor microenvironment, TME)。癌細胞還可以透過下調某些主要組織相容性複合體(major histocompatibility complex, MHC)分子的表現來逃避免疫系統，這些分子被認為是T細胞識別腫瘤相關抗原(tumor-associated antigens, TAA)所必需的。此外，癌細胞可以分泌免疫抑制細胞激素(例如，TGF-β、IL-8)以建立更具免疫抑制的環境。
為了克服腫瘤免疫逃避中的至少一些下調功能，已經測試了各種藥劑並取得了不同程度的成功。例如，可以施用免疫刺激劑以增加對特定腫瘤抗原的免疫反應。在其他免疫刺激劑中，經常使用某些細胞激素及衍生物，包括IL-2、IL-12，或IL-15，及其嵌合形式，例如ALT-803 (參見例如，Altor BioScience Corporation, 2810 North Commerce Parkway, Miramar, FL 33025； ALT-803 FACT SHEET)或NHS-IL-12 (參見例如，Oncotarget 2014, Vol.5, No.7, 1869-1884)。在增加免疫反應中的一些參數的同時，這些化合物本身的施用尚未證明在根除腫瘤方面具有治療效果。於另一種已知的方法中，各種檢查點抑制劑已用於治療癌症，且於某些情況下產生了顯著的結果。然而，與細胞激素型免疫刺激劑一樣，難以得到一致性反應，特別是在不同類型的癌症中。在其他已知方法中，已採用腫瘤疫苗產生針對腫瘤特異性或腫瘤相關抗原的免疫反應。於某些情況下，再次觀察到顯著的免疫反應。然而，以疫苗組合物的免疫刺激仍然經常與抑制腫瘤中的免疫反應相關。為了改善免疫反應並減少免疫抑制，已經描述了定時免疫療法以解決免疫編輯，如PCT專利公開號WO 2018005973中所教示者。這種協調治療有利地解決了各種角度的免疫逃逸。然而，這種治療通常很長期且需要多種治療劑以及複雜的治療方案。
因此，仍然需要提供改善癌症免疫療法的治療組合物及方法，尤其是使用最少量的治療劑在概念上簡單且有效的療法。
本發明之主題涉及癌症免疫療法的各種組合物及方法，其中對患者施用各種藥物組合物以引發治療有效之反應。最佳地，此類方法包括具有同時並重疊的免疫刺激與檢查點抑制方案的癌症疫苗的初級免疫/加強施用。進一步較佳透過施用引發偏向Th1的免疫反應的藥物進一步修飾/增強如此產生之免疫反應。
於本發明主題之一方面，本案發明人考慮了刺激一個體針對(通常為實體)腫瘤的免疫反應之方法。該方法包括使該個體接受定時治療組合之步驟，該組合包括一初級免疫 - 加強免疫接種方案、一免疫刺激方案、一檢查點抑制方案，以及一Th1刺激。最佳地，該免疫刺激方案在初次免疫接種後開始，該檢查點抑制方案在免疫刺激方案後開始，且該Th1刺激在該加強疫苗接種或隨後施用該疫苗組合物後開始。
雖非限制本發明之主題，但預期初級免疫 - 加強免疫接種方案包括給予針對腫瘤相關抗原及腫瘤特異性抗原中的至少一種的免疫反應之疫苗組合物，且通常較佳為，該疫苗組合物包含細菌、酵母或病毒疫苗組合物。於進一步的典型具體實施例中，該初級免疫 - 加強免疫接種方案包括以每週間隔施用該疫苗組合物。
進一步預期該免疫刺激方案包括施用IL-2、IL-12、IL-15、IL-21或其一衍生物(其可包括一標靶抗體或一抗體片段)中的至少一種，以及特別較佳的衍生物為ALT-803。例如，該免疫刺激方案可以包括以3-5天的間隔施用IL-2、IL-12、IL-15、IL-21或其一衍生物中的至少一種。關於檢查點抑制，預期該檢查點抑制方案包括施用一抗PD1抗體、一抗PD-L1抗體抗體，及/或抗CTLA4抗體，其較佳以1-3天間隔進行。
預期的Th1刺激通常包括施用一細胞激素或小分子藥物，其使得免疫反應偏向Th1反應。因此，特別較佳的細胞激素包括IL-12或其一衍生物(例如，包含結合一腫瘤細胞的抗體部分或一腫瘤細胞的壞死組成分)。
於進一步考慮之方面，該免疫刺激方案及該檢查點抑制將方案重疊，及/或該免疫刺激方案、該檢查點抑制方案，以及該Th1刺激至少在初級免疫 - 加強免疫接種方案期間開始。
於本發明主題之另一方面，本案發明人考慮了一種治療一個體腫瘤之方法，該方法包括以下步驟：(a) 使該個體接受一疫苗組合物的一疫苗接種方案以引發針對一腫瘤相關抗原以及一腫瘤特異性抗原中的至少一種之免疫反應，其中該疫苗接種方案包括至少一疫苗組合物的一第一次及第二次施用；(b) 在該疫苗組合物的第一次施用後對該個體進行一免疫刺激方案，其中該免疫刺激方案包括至少一免疫刺激組合物的一第一次及一第二次施用；(c) 在該免疫刺激組合物的第一次施用後對該個體進行一檢查點抑制方案，其中該檢查點抑制方案包括至少一檢查點抑制劑的一第一次及一第二次施用；以及(d) 在該疫苗組合物的第二次或隨後的施用後對該個體進行Th1刺激，其中該Th1刺激包括施用使一免疫反應偏向Th1反應的一化合物。
最典型地，該疫苗組合物的第一次及第二次施用，以及任選的該疫苗組合物的第二次施用及隨後的施用，為間隔5至10天，及/或該免疫刺激組合物的第一次施用介於該疫苗組合物的第一次及第二次施用之間。進一步預期該檢查點抑制劑的第一次施用介於該免疫刺激組合物的第一次及第二次施用之間，或者在該疫苗組合物的第二次施用同時或之後，及/或該免疫刺激方案以及該檢查點抑制方案介於該疫苗組合物的第一次及最後一次施用之間進行。因此，該免疫刺激方案及該檢查點抑制方案可能重疊。於進一步考慮的具體實施例中，該免疫刺激組合物的第一次及第二次施用間隔3-5天，及/或該檢查點抑制劑的第一次及第二次施用間隔1-3天。如上所述，還預期使該免疫反應偏向Th1反應的化合物還包含結合腫瘤細胞或壞死細胞組成分的抗體或抗體片段。
因此，應當理解的是，本案發明人還考慮協同使用一疫苗組合物、一免疫刺激組合物、一檢查點抑制劑，以及一使一免疫反應偏向Th1反應的化合物。在這種的用途中，通常較佳為在施用該疫苗組合物的第一劑後施用該免疫刺激組合物，在施用該免疫刺激組合物的第一劑後施用該檢查點抑制劑，以及在第二次或後續施用該疫苗組合物後施用使該免疫反應偏向Th1反應的組合物。
較佳地，該疫苗組合物引發針對一腫瘤相關抗原以及一腫瘤特異性抗原中的至少一種的免疫反應，及/或包含一細菌疫苗、一酵母疫苗，或一病毒疫苗。此外，通常較佳為，該免疫刺激組合物包含一細胞激素或一細胞激素衍生物(例如，IL-2、IL-12、IL-15、IL-21或其一衍生物中的至少一種，其中其該衍生物包含一標靶抗體，或一抗體片段，及/或ALT-803)。任選地，該檢查點抑制劑包含一結合PD1、PD-L1，或CTLA4的抗體。進一步任選地，通常較佳為，該使免疫反應偏向Th1反應的化合物包含IL-12，其任選地與結合一腫瘤細胞或一壞死腫瘤細胞的一組成分的抗體或其片段偶聯(例如，NHS IL-12)。於進一步考慮的用途中，使用一每週時間表施用該疫苗組合物、使用一3-5天的時間表施用該免疫刺激組合物，以及使用一1-3天的時間表施用該檢查點抑制劑。
從以下詳細描述以及附圖中，本發明主題之各種目的、特徵、方面，以及優點將變得更加明顯。
本案發明人已經發現，可以使用某些免疫治療劑之組合的協調編配來施用癌症免疫療法，從而在哺乳動物中引發有效的抗腫瘤反應。較佳地，此類精心策劃的治療基於初級免疫/加強免疫接種方案，其包括使用一種或多種免疫刺激性的細胞激素的免疫刺激期，以及使用一種或多種檢查點抑制劑的檢查點抑制期，然後進一步維持如此引發的免疫反應及/或修改為朝向一Th1反應。
因此，還考慮透過在以免疫刺激性的細胞激素進行初次免疫接種後刺激免疫系統，以及透過以檢查點抑制劑進一步調節抑制訊息，較佳為在或在疫苗接種的加強階段期間進行，可以顯著改善使用癌症疫苗的初級免疫/加強免疫方案之免疫療法。在加強階段期間繼續刺激及檢查點抑制，然後透過施用一第二免疫刺激性的細胞激素，較佳以腫瘤為標靶的方式，支持及/或進一步調節所引發的免疫反應朝向Th1反應。
值得注意的是，這種方案提供了顯著的治療效果，如下更詳細地進一步所說明的。由於預期治療中的免疫調節不依賴於特定的腫瘤類型，並且由於疫苗對患者的特定腫瘤為特異性的，因此應該認識到的是，預期的組合物及方法適用於多種腫瘤，包括實體瘤、軟組織瘤，以及淋巴瘤。
如本文所用，術語“腫瘤”係指，且可與一種或多種癌細胞、癌組織、惡性腫瘤細胞，或惡性腫瘤組織交互使用，其可以在一人體的一個或多個解剖位置中被放置或發現。如本文所用，術語“結合”係指，且可以與術語“識別”及/或“檢測”交互使用，兩個分子之間的相互作用具有高親和力且K D等於或小於10 -6M ，或等於或小於10 -7M。如本文所用，術語“提供(動詞)”或“提供(動名詞)”係指並包括製造、生成、放置、使能使用，或準備使用之任何行為。
例如，關於疫苗接種方案，應當理解的是，引發針對腫瘤相關抗原及腫瘤特異性抗原中的至少一種的免疫反應的疫苗組合物之類型及含量可以顯著變化。因此，對一個體提供免疫原的所有方式都被認為是合適的，包括DNA疫苗、胜肽疫苗，尤其是重組疫苗。同樣地，疫苗的含量可以有很大的變化，可包括腫瘤相關抗原或其片段(例如，MUC1、brachyury、CEA等)，腫瘤特異性抗原或其片段(例如，PSA、PSMA、HER2等)，特別是腫瘤與患者特異性新抗原(即，新抗原表位)。如本文所用，腫瘤相關抗原係指可以在腫瘤細胞表面上呈現的任何抗原，其包括發言相關胜肽抗原、腫瘤相關胜肽抗原、腫瘤特異性胜肽抗原，以及癌症新抗原表位。
於某些具體實施例中，腫瘤相關抗原為腫瘤特異性的、患者特異性的新抗原表位。預期可以透過分析及比較來自患者的患病組織與健康組織的組學數據(例如，透過全基因組定序及/或外顯子組定序等)來鑑定患者與腫瘤特異性新抗原或新抗原表位，如美國專利申請公開號US 20120059670與US 20120066001中所述。例如，腫瘤相關抗原及新抗原表位(通常為患者特異性及腫瘤特異性)可以分別從(患者或健康個體的)患病或正常組織的癌組織獲得的組學數據中鑑定。腫瘤及/或正常細胞的組學數據較佳地包括基因組數據集，其包括基因組序列資訊。最典型地，基因組序列資訊包括從患者(例如，通過腫瘤活組織檢查)獲得的DNA序列資訊，最佳地來自腫瘤組織(患病組織)以及患者或健康個體的相對應的健康組織。例如，DNA序列資訊可以從患者胰腺中的胰腺癌細胞(及/或轉移細胞的附近區域)與該患者的正常胰腺細胞(非癌細胞)或來自一除了該患者之外的健康個體的正常胰腺細胞所獲得。
於本發明主題之一特別較佳之方面，透過腫瘤與相對應的正常樣品的全基因組定序及/或外顯子組定序(通常在至少10x的覆蓋深度，更通常至少20x)進行DNA分析。或者，也可以從先前序列確定的已建立的序列記錄(例如，SAM、BAM、FASTA、FASTQ，或VCF文件)提供DNA數據。因此，數據集可以包括未處理或已處理的數據集，且示例性數據集包括具有BAM格式、SAM格式、FASTQ格式，或FASTA格式的數據集。然而，特別較佳的是，數據集以BAM格式或BAMBAM差異對象提供(參見例如，美國專利申請公開號US 2012/0059670A1以及US 2012/0066001A1)。此外，應該注意的是，數據集反映了腫瘤以及同一患者的相對應的正常樣本，從而獲得患者及腫瘤特異性訊息。因此，可以排除不產生腫瘤的遺傳種系的改變(例如，沉默突變、SNP等)，進而針對已知的人類SNP及體細胞變異過濾出新抗原表位。當然，應該認識到該腫瘤樣品可以來自初始腫瘤、來自治療開始時的腫瘤、來自復發性腫瘤或轉移部位等。在大多數情況下，患者的相對應的正常樣品可為血液，或來自與腫瘤相同的組織類型的非患病組織。
然後可以使用預定義的結構及表現參數以及次細胞定位參數對如此獲得的新抗原表位進行進一步的詳細分析及過濾。例如，應當理解的是，只有當新抗原表位序列滿足預定義的表現閾值(例如，與正常相比至少20%、30%、40%、50%，或更高的表現)並且被識別為具有膜相關位置(例如，位於一細胞的細胞膜外部)。進一步考慮的分析將包括描述一新抗原表位或一腫瘤相關抗原，或一自身脂質是否可能暴露於溶劑，呈現結構穩定抗原表位等的結構計算。在PCT專利申請號PCT/US16/56550中詳細描述了關於患者特異性新抗原及/或癌症特異性，患者特異性新抗原之鑑定的進一步細節。
此外，特別考慮的是，腫瘤相關抗原為至少一種MHC第I類亞型或至少一種HLA型患者的MHC第II類亞型的高親和力結合劑，其可為使用de Bruijn圖的方法在電腦中確定，例如，如PCT專利申請公開號WO 2017/035392中所述，或使用本領域已知的常規方法(例如，基於抗體)。透過電腦測試人類疾病相關抗原的結合親和力為確定的HLA型。較佳的結合親和力可以透過最低KD測量，例如，小於500 nM，或小於250 nM，或小於150 nM，或小於50 nM，例如，使用NetMHC。最典型地，HLA型確定包括至少三種MHC-I亞型(例如，HLA-A、HLA-B、HLA-C等)以及至少三種MHC-II亞型(例如，HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR等)，較佳地，每個亞型被確定為至少4位數深度。應當理解的是，這種方法不僅將鑑定對患者及腫瘤為真實的特異性新抗原，而且還鑑定最可能在細胞上呈現的那些新抗原，因此最有可能引發具有治療效果的免疫反應。
當然，應該理解的是，患者的HLA型與患者與癌症特異性新抗原的相對應可以使用除NetMHC之外的系統來完成，且合適的系統包括NetMHC II、NetMHCpan、IEDB分析資源(URL immuneepitope.org)、RankPep、PREDEP、SVMHC、Epipredict、HLABinding等(參見例如，J Immunol Methods 2011;374:1–4)。在計算最高親和力時，應該注意可以使用其中移動改變的胺基酸的位置的新抗原序列的集合(見上文)。或者，或另外地，可以透過添加N-及/或C-端修飾來進行對新抗原的修飾，以進一步增加表現的新抗原與患者的HLA-型的結合。因此，新抗原可以是天然的，如鑑定或進一步修飾以更好地與特定的HLA型配對。
此外，如果需要，可以計算相對應的野生型序列(即沒有胺基酸改變的新抗原序列)的結合，以確保高差異親和力。例如，新抗原與其相應的野生型序列之間MHC結合中特別較佳的高差異親和力為至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少100倍、至少500倍、至少1000倍等。
此外，組學資訊(特別是該組學資訊包括全基因組定序或外顯子組定序、RNA序列及轉錄數據，以及(較佳定量的)蛋白質組學資訊)也可用於確定各種細胞訊息傳遞途徑的狀態。這種途徑訊息，特別是與突變訊息相結合，可以揭示細胞內與腫瘤解剖學特徵無關的其他可作為藥物的靶標(例如，在非乳腺癌中存在HER2訊息傳遞)。基於組學資訊的特別較佳的途徑分析包括如WO 2011/139345、WO 2013/062505、WO 2014/193982、WO 2014/059036、WO 2014/210611、WO 2015/184439，以及WO 2016/118527中描述的那些。從不同的角度來看，預期的治療與用途中的組學數據將被用於兩者，告知免疫治療組合物的產生以及基於途徑訊息而非腫瘤類型集位置來選擇化學治療藥物。因此，合適的組學數據包括全基因組定序數據、外顯子組定序數據、RNA序列與轉錄數據，以及蛋白質組學數據(例如，來自質譜分析的定量蛋白質組學數據)。
於某些具體實施例中，腫瘤相關的抗原或新抗原表位可為多抗原表位。如本文所用，多抗原表位係指表現為單一多胜肽的二種或更多種抗原(或新抗原表位)的串聯陣列。較佳地，二種或更多種人類疾病相關的抗原透過一連接子或間隔子胜肽分開。可以使用針對該連接子或該間隔子的胜肽序列的任何合適長度及順序。然而，較佳為該連接子胜肽的長度為3-30個胺基酸，較佳為5-20個胺基酸，更佳為5-15個胺基酸。本案發明人還考慮較佳富含甘胺酸的序列(例如，gly-gly-ser-gly-gly等)以提供兩種抗原之間的多抗原表位的可撓性。
如上所述的潛在有用的新抗原表位的顯著減少在圖1中示例性地示出，其中使用組學分析以及新抗原表位發現使用同一患者的正常組織比較該患者的腫瘤組織。一旦鑑定，接著對腺病毒進行基因工程改造以包括一表現匣，該表現匣包括編碼該患者的一個或多個新抗原表位的核酸區段。然後可以將這種修飾的病毒作為一重組病毒疫苗。圖2示例性地顯示一選擇過程，其中透過組學分析(左方柱狀)識別的所有新抗原表位首先透過表現程度進行過濾。於此，消除了未表現的新抗原表位，導致潛在的新抗原表位(中間柱狀)顯著減少。這些過濾的新抗原表位進一步針對患者的MHC類型進行過濾，並且由該圖(右方柱狀)可看出，該患者的抗原呈現細胞可以呈現的新抗原表位的數量再次顯著減少。然後該新抗原表位可用於治療，例如在重組病毒/重組表現系統中。
在特別考慮的方面中，可以將編碼一種或多種腫瘤相關抗原及/或新抗原表位的核酸序列置於一表現載體中。然後將重組核酸插入一表現載體中，使得該核酸可以遞送至該患者的抗原呈現細胞(例如，樹突細胞等)，或者將核酸序列轉錄到細菌或酵母中，使得由該核酸序列編碼的重組蛋白可作為整體或作為片段遞送至抗原呈現細胞。考慮了可用於表現蛋白質的任何合適的表現載體。特別較佳的表現載體可包括可攜帶至少1k，較佳為2k，更佳為5k的鹼基對的匣大小的那些表現載體。
因此，於一具體實施例中，較佳的表現載體包括一病毒載體(例如，非複製型重組腺病毒基因組，任選地具有缺失或非功能性E1及/或E2b基因)。當該表現載體為病毒載體(例如，一腺病毒，尤其是E1與E2b缺失的AdV)時，可以考慮將包括重組核酸的重組病毒單獨或組合作為一藥物組合物中的治療性疫苗，通常配製為無菌可注射組合物，其病毒力價為10 6-10 13個病毒顆粒，更通常為每劑量單位10 9-10 12個病毒顆粒。例如，該病毒疫苗可以配製一病毒力價為至少10 6個病毒顆粒/天，或至少10 8個病毒顆粒/天，或至少10 10個病毒顆粒/天，或至少10 11個病毒顆粒/天。或者，可以離體方式將病毒感染至患者(或其他HLA相對應的)細胞，然後將如此被感染的細胞輸注給患者。
於更進一步的具體實施例中，該表現載體也可為可在基因工程細菌中表現的細菌載體，其表現內毒素的程度夠低到不會在人體細胞中引起內毒素反應及/或當引入人體時不足以誘導CD-14調節的敗血症。具有修飾的脂多醣的一種示例性細菌菌株包括ClearColi® BL21 (DE3)電感受態細胞。該細菌菌株為具有基因型F– ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm lonλ(DE3 [ lacI lacUV5- T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]) msbA148 ΔgutQΔkdsD ΔlpxLΔlpxMΔpagPΔlpxPΔeptA的BL21菌株。於此情況下，應該理解的是，幾種特異性缺失突變( ΔgutQ ΔkdsD ΔlpxL ΔlpxMΔpagPΔlpxPΔeptA)編碼LPS對脂質IVA的修飾，而一個額外的補償突變(msbA148)使細胞能夠在LPS前驅物脂質IVA存在下維持生存力。這些突變導致LPS中寡糖鏈的缺失。更具體而言，六個醯基鏈中的二個被刪除。LPS的六個醯基鏈為類鐸受體4 (Toll-like receptor 4, TLR4)與骨髓分化因子2 (myeloid differentiation factor 2, MD-2)複合物識別的觸發因子，引起NF-κB的活化及促發炎性的細胞激素之產生。僅含有四個醯基鏈的脂質IVA不被TLR4所辨識，因此不會引發內毒素反應。雖然提供了電感受態BL21細菌作為實施例，但本案發明人認為遺傳修飾的細菌也可為化學感受態細菌。或者，或另外地，表現載體也可為一酵母載體，其可在酵母中表現，較佳為在釀酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)中表現(例如，GI-400系列重組免疫治療酵母菌株等)。當然，應該理解的是，本文考慮的重組核酸不必限於病毒、酵母或細菌表現載體，還可包括DNA疫苗載體、線性化DNA，以及mRNA，所有這些都可以根據本領域熟知的方法轉染到合適的細胞中。
此外，應該認識到該疫苗組合物可以在疫苗接種方案的過程中在製劑以及抗原組成分方面發生變化。例如，可以使用如上所述的重組細菌或酵母表現系統進行初次免疫接種，然後在加強階段使用腺病毒疫苗進行接種。另外，疫苗接種方案也可使用不同的給藥途徑，包括皮下或肌內施用細菌或酵母疫苗組合物，以及腫瘤內或靜脈內施用腺病毒疫苗組合物。類似地，在稍不為較佳的方面，該主要疫苗組合物可包括腫瘤相關抗原以及新抗原表位，而加強免疫接種可包括或僅編碼新抗原表位作為免疫原性劑。
更進一步地，預期該疫苗方案可使用各種時間表進行給藥。然而，通常預期初級免疫/加強免疫的時間將遵循關於抗原加工及呈現以及T細胞刺激及增殖的免疫反應的預期時間。因此，該疫苗組合物至少最初應至少間隔2天給藥，更典型地在3-5天，或5-7天，或7-10天，或10-14天的期間內，並且在某些情況下甚至更長。對於在加強免疫階段(例如，第四次，第五次等施用)的後續施用，間隔可以更長，包括數週、數月或甚至數年。於某些具體實施例中，該病毒製劑的劑量可以在該時間表期間逐漸增加，或者在該時間表期間逐漸減少。於其他具體實施例中，病毒製劑的數個連續給藥可以間隔分開(例如，連續3天每天給藥一次，以及間隔7天後再連續3天每天給藥一次等)。
關於預期的免疫刺激方案，通常較佳為這種方案包括至少一第一次及一第二次施用一種或多種免疫刺激組合物，且通常較佳為該免疫刺激組合物包含一免疫刺激性的細胞激素。例如，特別較佳的細胞激素包括各種介白素，特別是IL-2、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21，以及包括Th1細胞激素在內的其他細胞激素(例如，IFN-γ、TNFα等 )。用於免疫刺激的合適劑量通常在臨床上可接受的劑量範圍內，此為本領域所熟知的。此外，進一步預期免疫刺激組合物還可包括上述蛋白的修飾形式，特別是修飾形式包括增加血清半衰期及/或降低毒性的那些形式。例如，預期的免疫刺激組合物可包括缺乏PEP部分的截短的IL-2，或ALT-803，這是一種基於IL-15的嵌合蛋白複合物，具有IL-15超級激動子功能。進一步考慮的免疫刺激化合物也可為標靶特異性的，例如，透過偶聯一抗體或其部分，其中該抗體通常結合一腫瘤抗原表位、一新抗原表位，或一壞死細胞的組成分(例如，dsDNA、組蛋白等)。 再一次地，應該注意的是，使用這些化合物進行免疫刺激的合適劑量通常在臨床可接受的劑量範圍內，此為本領域中所熟知的。
或者，或另外地，進一步預期的免疫刺激化合物包括增強免疫反應的各種TLR配體及/或NOD配體。例如，合適的TLR配體包括TLR2、TLR3、TLR4、TLR7，或TLR8，尤其包括mRNA、dsDNA、ssRNA、CpG、醣脂質等。於更進一步考慮之方面，免疫刺激化合物還可包括OX40激動性抗體。因此，許多免疫刺激化合物被認為是合適的，且包含其所有合理的組合。
當然，應該認識到的是，該免疫刺激化合物可以在治療方案的過程中在該免疫刺激化合物的類型及劑量方面發生變化。例如，可使用更具急性作用的化合物(例如，IL-2，IL-15)進行初始刺激，而隨後的給藥可使用具有更長效作用的免疫刺激化合物(例如，ALT-803)。另一方面，免疫刺激化合物也可以如上所述以標靶特異性方式施用，以減少全身(毒性)作用。該免疫刺激方案可能使用不同的給藥途徑，包括皮下或肌內給藥，然而，特別較佳為腫瘤內或靜脈內給藥。
更進一步地，預期免疫刺激方案可以使用各種時間表進行給藥。然而，通常預期第一次施用將在如上所述的疫苗的初次施用後進行。隨後的給藥通常將相對快速地連續進行以引發基本上連續的刺激作用。因此，免疫刺激化合物將間隔約1天給藥，更通常在1-2天、2-3天，或1-3天，或2-4天的期間內給藥，於某些情況下甚至是更長的間隔。對於更晚的給藥(例如，在疫苗加強階段之後)，該間隔可以更長，包括數週、數月或甚至數年。
更進一步地，通常較佳的是，該免疫刺激化合物至少在初級免疫/加強疫苗方案內給藥，且該免疫刺激方案至少在一定程度上與一檢查點抑制方案重疊，如以下更詳細描述者。雖非限制本發明之主題，但據信在施用初次免疫接種後，支持免疫細胞活化的一免疫刺激期以及減少檢查點抑制的一方案將調節該免疫系統以提供對該初級免疫以及同期/後續的加強免疫階段的最佳反應。
因此，通常較佳為該檢查點抑制方案包括至少一第一次以及一第二次施用一檢查點抑制劑，並認為所有已知的檢查點抑制劑都適用於本文。例如，合適的檢查點抑制劑包括干擾通過PD-1 (例如，匹博利組單抗(pembrozilumab)、納武單抗(nivolumab))、PD-L1 (例如，阿特珠單抗(atezolizumab)、阿維魯單抗(avelumab)、度伐魯單抗(durvalumab))及/或CTLA4 (例如，伊匹單抗(ipilimumab))的訊息傳遞的那些檢查點抑制劑。本領域已知有許多這樣的抑制劑，所有這些都被認為適用於本發明。用於免疫刺激的合適劑量通常為在臨床上可接受的劑量範圍內，這是本領域熟知的。同樣地，當腫瘤將可溶性配體分泌至檢查點受體時，預期清除這些可溶性因子的抗體可用於減少此類可溶形式的不利影響。
如上所述，預期該檢查點抑制方案可採用各種時間表進行給藥。然而，通常預期第一次施用將在第一次施用疫苗之後以及在第一次施用免疫刺激化合物之後施用。因此，該免疫刺激以及檢查點抑制將至少部分重疊。隨後的給藥通常將相對快速地連續進行以引發基本上連續的刺激作用。因此，該檢查點抑制劑將間隔約1天施用，更通常在1-2天，或2-3天，或1-3天，或2-4天的期間內施用，且於某些情況下甚至為更長的間隔施用。對於更晚的給藥(例如，在疫苗加強階段之後)，該間隔可以更長，包括數週、數月或甚至數年。
關於透過免疫記憶的發展使免疫反應偏向Th1反應及/或維持針對腫瘤抗原的免疫反應的化合物的給藥，通常較佳為，該化合物為一細胞激素，特別是IL-12。最佳地，為了增加IL-12的位點特異性以及血清半衰期，預期IL-12與一抗體或其部分綴合，其中該抗體結合一腫瘤抗原、一腫瘤新抗原表位，或一壞死細胞的一個組成分。因此，特別較佳的化合物包括NHS IL-12及其衍生物。或者，可以使用各種其他化合物，包括基於植物的組合物(例如， PLoS Negl Trop Dis. 2015 Jan; 9(1): e3321)、口服遞送的去氧核苷酸(例如， e.g., Molecular Therapy, Vol.23, Issue 2, 222 - 223)，利巴韋林(ribavirin)(例如， PLoS One. 2012; 7(7): e42094.)，以及較不為較佳的IL-4及IL-10。
這些化合物的給藥通常遵循本領域熟知的劑量，且所有這些劑量都被認為適用於本文。如上所述，預期Th1刺激/免疫支持可採用各種時間表進行給藥。然而，通常預期第一次施用將在疫苗施用第二次或隨後施用之後以及在施用免疫刺激化合物以及檢查點抑制劑之後。因此，該Th1刺激通常與疫苗接種的加強免疫階段一致，且最通常提供維持免疫刺激的支持功能。隨後的給藥通常會相對緩慢地繼續以維持持續的刺激作用。因此，將給予刺激Th1的化合物，需要時，間隔約3天，更通常在2-5天，或5-7天，或7-14的期間內，於某些情況下甚至更長的間隔。對於更晚的給藥(例如，進一步的疫苗加強給藥)，該間隔可以更長，包括數週、數月或甚至數年。
當然，應當理解的是，預期的治療可進一步包括補充或以其他方式支持本文所述方法的其他治療組合物。例如，預期的方法可包括對一患者施用自體或異源天然殺手(natural killer, NK)細胞，特別是經遺傳修飾以顯示較少抑制的天然殺手(NK)細胞。例如，經遺傳修飾的NK細胞可為NK-92衍生物，其被修飾為具有至少一種殺手細胞類免疫球蛋白受體(killer cell immunoglobulin-like receptor, KIR)的表現降低或消除，這將使這些細胞組成性活化。當然，應該注意的是，可以刪除一個或多個殺手細胞類免疫球蛋白受體(KIR)或者可以抑制它們的表現(例如，透過miRNA，siRNA等)，包括KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3，以及KIR3DS1。可以使用本領域熟知的方案製備這種修飾的細胞。或者，此類細胞也可以從NantKwest購得，作為aNK細胞('活化的天然殺手細胞)。然後可以進一步修飾這些細胞以表現共刺激分子，如以下進一步所討論的。此外，適用於本文的預期天然殺手(NK)細胞還包括已消除或沉默NKG2A表現的天然殺手(NK)細胞，這是對調節性T細胞(Treg)以及髓源性抑制細胞(MDSCs)的一種活化訊息。
或者，基因工程改造的天然殺手(NK)細胞也可為經修飾以表現高親和力Fcγ受體(CD16-158V)的NK-92衍生物。Fcγ受體的高親和力變體的序列為本領域熟知的，且所有產生及表現的方式都被認為適用於本文。據信這種受體的表現允許使用由患者對本文考慮的治療的反應而產生的抗體以腫瘤細胞作為特定標靶，或供應作為治療性抗體，其中那些抗體對一患者的腫瘤細胞具有特異性(例如，新抗原表位)，對特定腫瘤類型具有特異性(例如，her2neu、PSA、PSMA等)或對於與癌症相關的抗原具有特異性(例如CEA-CAM)。有利地，這樣的細胞可自NantKwest購得，作為haNK細胞('高親和力天然殺手細胞)，然後可以進一步修飾(例如，表現共刺激分子)。
於其他方面，基因工程改造的天然殺手(NK)細胞也可以進行基因工程改造以表現嵌合T細胞受體。於特別較佳之方面，該嵌合T細胞受體將具有單鏈可變區(single-chain variable fragment, scFv)部分或其他胞外結構域，其具有針對腫瘤相關抗原、腫瘤特異性抗原，及/或患者的新抗原表位的結合特異性，如透過組學分析所確定的。如前所述，這些細胞可以自NantKwest購得，作為taNK細胞('標靶活化的自然殺手細胞')並根據需要進一步修飾。當細胞具有經工程改造以對癌症相關抗原或新抗原表位具有親和力的嵌合T細胞受體時，預期所有已知的癌症相關抗原及新抗原表位被認為是適合使用的。例如，腫瘤相關抗原包括CEA、MUC-1、CYPB1、PSA、Her-2、PSA、brachyury等。
此外，應該注意的是，本文考慮之方法及用途還包括以天然殺手(NK)細胞以外(或除天然殺手(NK)細胞外)的細胞進行的基於細胞的治療。例如，合適的基於細胞的治療包括基於T細胞的治療。在其他選擇中，預期可以檢測與T細胞相關的一種或多種特徵(例如，CD4 +T細胞、CD8 +T細胞等)。更具體而言，預期的組學分析可以鑑定特異性新抗原表位(例如，對於MHC I為8聚體至12聚體，對於MHC II為12聚體至25聚體等)，其可用於鑑定新抗原表位反應性T細胞，其攜帶針對該新抗原表位/MHC蛋白複合物的一特異性T細胞受體。因此，該方法可包括收穫該新抗原表位反應性T細胞。該收穫的T細胞可以離體生長或擴增(或在耗竭時再活化)，以準備重新引入該患者體內。或者，可以分離收穫的T細胞中的T細胞受體基因並將其轉移到病毒或其他過繼細胞療法系統(例如CAR-T、CAR-TANK等)中。除了新抗原表位之外，組學分析還可以提供一種或多種腫瘤相關抗原(tumor associated antigens, TAAs)。因此，人們還可以收穫具有對這些分析中鑑定的腫瘤相關抗原(TAA)敏感的受體的T細胞。這些細胞可以離體生長或培養，並以與上述類似的治療方式使用。可以透過產生胜肽的合成形式並將它們與商業上產生的MHC或類MHC蛋白結合，然後使用這些離體複合物結合標靶T細胞以鑑定T細胞。應當理解的是，收穫的T細胞可以包括已經由該患者對疾病的免疫反應活化的T細胞、耗竭的T細胞，或對所討論的特徵反應的其他T細胞。 實施例
以下描述提供了根據本發明主題之治療患者癌症的示例性方案。應當理解的是，雖然這些方案單獨或組合地列出了特定的化合物及組合物，但是可以提供具有相同或相似作用的各種替代化合物及組合物。此外，劑量與時間表可根據患者年齡、癌症階段以及總體健康狀況而改變。
實施例 1：從圖3中可以容易地看出，相較於缺乏其中一種組成分的任何治療方案，初級免疫/加強免疫接種並用免疫刺激以及檢查點抑制與Th1刺激的定時順序具有顯著效果(組合治療40天後腫瘤體積顯著降低)。這種顯著的圖像也反映在圖4所示的組織病理學分析中。於此，顯微照片顯示了染色的CD8 +腫瘤浸潤細胞。再次地，初級免疫/加強免疫接種並用免疫刺激、檢查點抑制，以及Th1刺激的定時順序造成浸潤腫瘤的T細胞顯著增加。圖5顯示了NHS IL-12給藥後數天的隨後研究之結果。同樣地，初級免疫/加強免疫接種並用免疫刺激與檢查點抑制，以及Th1刺激的定時順序的效果是顯而易見的，並在除了二隻治癒的動物之外的所有動物中產生效果。
實施例 2：
細胞培養：MC38與RMA-S細胞在具有L-麩醯胺酸(Corning公司)補充有10% (v/v)胎牛血清(Atlanta Biologicals公司)以及1% (v/v)抗生素/抗有絲分裂溶液(Corning公司)的RPMI-1640培養基中生長。所有細胞培養於37℃、5% CO 2下培養。
動物及腫瘤植入：根據實驗動物護理評估及認可協會指南，並在國家衛生研究院(National Institutes of Health, NIH)內部動物護理暨使用委員會的核准下處理小鼠。於國家衛生研究院(NIH)繁殖並飼養小鼠。透過皮下植入3×10 5個腫瘤細胞誘導腫瘤。所有研究均使用雌性C57BL/6動物。
鑑定腫瘤變異及新抗原表位：如前所述(26)鑑定單核苷酸變體(single nucleotide variants, SNVs)與插入/缺失(indels)。透過產生源自鑑定的非沉默單核苷酸變體(SNV)或插入缺失(indel)的9聚體胺基酸序列的所有可能排列來鑑定新抗原表位。透過RNA表現以及觀察到的編碼變體的等位基因頻率對新抗原表位進行排序以抵消由腫瘤異質性引起的問題。NetMHC 3.4 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC-3.4/)(27,28)用於預測新抗原表位與特定MHC H-2等位基因的結合。保留具有＜ 500 nM的預測結合親和力的新抗原表位以用於進一步分析。
胜肽合成：透過Bio-Synthesis或GenScript合成胜肽至純度 ＞ 85%。
細胞分離及製備：收穫脾臟，通過70 μm過濾器解離並進行ACK裂解以獲得脾細胞以用於分析。收穫腫瘤，切成小塊並在消化混合物中作用1小時，該消化混合物包含補充有5% (v/v) FBS、2 mg/mL第I型膠原蛋白酶(Worthington Biochemical公司)，以及40 U/mL DNase I (Calbiochem公司)的RPMI培養基。消化後，將腫瘤通過70 μm過濾器研磨，並使用40%/70% Percoll (Sigma公司)梯度分層收集腫瘤浸潤性白血球(tumor- infiltrating leukocytes, TILs)。透過在淋巴細胞分離培養基(MP Biomedicals公司)上分層並收集淋巴細胞層，從整個抗凝血小鼠血液中分離周圍血單核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)。
流式細胞儀分析：用於流式細胞儀分析的所有抗體在補充表S1中有充分描述。使用與50 μg/mL單個胜肽培養過夜的RMA-S細胞進行胜肽結合測定。培養後，以抗MHC抗體染色細胞。使用FACS Calibur流式細胞儀(BD Biosciences公司)獲得數據，並報告做為體外結合評分，該評分為在細胞表面上表現MHC的RMA-S細胞的百分比。將腫瘤浸潤性白血球進行免疫細胞亞群染色，並使用Attune NxT流式細胞儀(ThermoFisher公司)或BD LSRFortessa高階多色流式細胞分析儀(BD Biosciences公司)收集數據。細胞群體鑑定如下：CD8 +T細胞：活細胞/CD45 +/CD3 +/CD8 +；巨噬細胞：活細胞/CD45 +/CD3/CD11b +F4/80 +。針對細胞內細胞激素染色，將脾細胞與指定的胜肽一起培養4小時，此時加入GolgiPlug/GolgiStop溶液(BD Biosciences公司)。將培養物再培養20小時，並固定、透化並染色以進行TNF和IFNγ的產生。使用Attune NxT流式細胞儀收集數據。
疫苗接種以及以免疫調節劑處理：以9-聚體或25-聚體新抗原表位胜肽(每種胜肽100 μg)接種動物，在Montanide ISA 51 VG佐劑(Seppic公司)中乳化，皮下注射給藥。編碼TWIST1或新抗原表位的腺病毒載體由Etubics/NantCell公司友情生產並提供。編碼多抗原表位病毒的10 10個病毒顆粒以皮下注射給藥。透過對動物皮下注射10 10個病毒顆粒給予混合的病毒，每個病毒顆粒編碼病毒的單一新抗原表位。Nantworks公司友情提供N-803，並將1 μg皮下注射到動物體內。腹膜內施用抗PD-L1抗體(10F.9G2，BioXCell公司，200 μg)。以50 μg的劑量施用鼠NHS-IL12。
評估免疫力：收穫脾細胞或周圍血單核細胞(PBMCs)，並使用IFNγ (BD Bioscience公司)或TNFα (Cellular Technology Ltd.公司) ELISPOT評估離體抗原依賴性的細胞激素分泌。將標靶胜肽(終濃度10 μg/mL)與細胞一起培養過夜。 根據製造商的說明進行測定。在減去含有對照胜肽的成對孔中的斑點數後，將ELISPOT數據調整至斑點數/百萬個脾細胞。
免疫組織化學：將固定在Z-fix (Anatech公司)中的腫瘤以石蠟包埋並切片。使用Opal Multiplex Immunohistochemistry Kits (PerkinElmer公司)對載玻片進行CD8a染色(4SM16)。使用Axio Scan.Z1載玻片掃描儀(Zeiss公司)獲取圖像。
耗竭研究：透過流式細胞儀監測周圍血中的耗竭。
NanoString與T細胞受體(T cell receptor, TCR)定序：使用CD45 +或CD4 +/CD8 +鼠腫瘤浸潤性白血球(TIL)微珠套組(Miltenyi Biotech公司)收集分離的腫瘤浸潤性白血球。使用RNeasy mini套組(Qiagen公司)從CD45 +細胞中純化RNA。使用鼠nCounter PanCancer Immune Profiling Panel (NanoString公司)測定基因表現。使用nSolver分析軟體4.0版對奈米串數據進行標準化。相較於未處理的對照組動物，其表現在生物學重複中改變至少2倍的基因被認為是顯著的。使用QIAamp DNA mini套組(Qiagen公司)，使用從腫瘤浸潤的CD4 +以及CD8 +細胞純化的基因組DNA評估T細胞受體(TCR)多樣性。T細胞受體　 (TCR　)鏈定序由Adaptive Biotechnologies公司進行，並使用Immunoseq分析儀進行分析。分析了前100個T細胞受體(TCR)序列。
數據及統計分析：使用FlowJo軟體(第10版，BD Biosciences公司)分析流式細胞儀數據。所有分層集群均使用Partek Genomics Suite生成。使用GraphPad Prism軟體(第7版；GraphPad Software公司)進行統計。所有數據點代表平均值±平均值標準誤差(standard error of the mean, SEM)，P≤0.05被認為是顯著的。顯著性如下圖所示：*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001，****P≤0.0001。
對兩個MC38腫瘤進行全外顯子組DNA及RNA定序，並使用從相同動物收穫的脾細胞的腫瘤正常DNA分析鑑定表現的非同義突變(圖6A)。儘管使用從相同培養瓶中收穫的MC38細胞誘導二種腫瘤，但本案發明人觀察到DNA突變數量的巨大差異，以及在所分析的每個腫瘤中鑑定的潛在新抗原表位(表1)。
  腫瘤1 腫瘤2
非同義突變的數量 16828 8676
表現的非同義突變的數量 7098 (42.2%) 3548 (40.9%)
預計結合MHC的非同義突變的數量 124 (0.7%) 66 (0.8%)
共有新抗原表位的數量 51 (0.3-0.5%)
表 1
該觀察結果支持先前的研究，其中MC38腫瘤細胞株已被鑑定為微衛星不穩定的。總體而言，本案發明人鑑定了51種潛在的新抗原表位，代表了43種獨特的非同義突變，在所測定的二種腫瘤中共有(表1)。仍然沒有確定的方法來選擇適當的非同義突變以用疫苗進行標靶；本案發明人認為理想的新抗原表位既高度表現又對結合MHC具有高親和力。基於該度量，本案發明人最初透過將相對表現除以預測的MHC結合親和力來對潛在的新抗原表位進行排序。此外，本案發明人還利用了第二度量，其僅通過其預測的MHC結合親和力對新抗原表位進行排序。合成了代表來自兩個指標的前10個胜肽的13種胜肽。這13個新抗原表位中的7個能夠在體外結合MHC (圖6B)，並且透過以在Montanide ISA 51 VG佐劑(Montanide公司)中乳化的新抗原表位胜肽庫接種未攜帶腫瘤小鼠以評估每種胜肽的免疫原性。使用離體INFγ ELISPOT試驗，發現6/13的新抗原表位在使用未攜帶腫瘤動物的重複實驗中誘導免疫反應(圖6C，以陰影條突出顯示的反應性胜肽)。基於這些觀察，我們選擇利用疫苗接種策略，其包含在Montanide佐劑中乳化的四種9-聚體新抗原表位胜肽(Jak1、Olfr99、Ptgfr，以及Trp53)的庫。當作為單一藥劑施用時，新抗原表位疫苗誘導低程度的免疫，但相較於對照組動物未能提供任何存活益處。為了增強新抗原表位疫苗的有效性，本案發明人將其與IL15超激動劑融合蛋白N-803以及抗PD-L1單株抗體組合。使用圖6D中概述的治療方案，N-803以及抗PD-L1抗體協同增加9-聚體，而非25-聚體，新抗原表位疫苗在攜帶腫瘤的動物中的免疫原性(圖6E及6F)。相較於對照組動物，當將我們的9-聚體新抗原表位疫苗與N-803以及抗-PD-L1抗體組合使用時，免疫原性的增強與治療後存活率的輕微但顯著增加相關(圖6G)。這種存活益處僅見於對疫苗成分產生強烈免疫反應的動物，如透過在腫瘤生長的第13天使用從動物收集的周圍血進行ELISPOT所評估的(圖6H)。
使用圖7A中描繪的治療方案，本案發明人在腫瘤生長的第11、18以及25天測定接種動物中的免疫反應，並觀察到針對疫苗組成分產生的免疫力的大小隨時間降低。有趣的是，本案發明人觀察到新抗原表位疫苗還導致T細胞的原位擴增，其對疫苗中未包含的新抗原表位具有反應性。然而，儘管繼續接種疫苗，這些新生免疫反應的程度也隨著時間的進展而減少(圖7B)。為了促進腫瘤微環境中新抗原表位反應性細胞的維持，本案發明人在腫瘤生長的第18天將單次NHS-IL12注射到疫苗方案中。以抗PD-L1抗體、NHS-IL12、N-803以及新抗原表位疫苗聯合治療的動物能夠維持對新抗原表位Ptgfr以及Trp53的強烈免疫反應，這兩種新抗原表位都是新抗原表位疫苗的組成分，還有額外由MC38腫瘤表現，但未包括在疫苗中的新抗原表位 (圖7B)。有趣的是，以N-803、抗PD-L1抗體，以及NHS-IL12處理小鼠，但沒有以疫苗處理，只促進了對GP70 (一種由MC38細胞表現的內源性反轉錄病毒蛋白)衍生的胜肽(P15e)特異性的T細胞的擴增，但未測定到任何新抗原表位(圖7B)。
在存在或不存在疫苗接種的情況下，以N-803以及抗PD-L1抗體處理的動物未顯示出腫瘤控制的跡象(圖7C)；此外，以N-803、抗PD-L1抗體，以及NHS-IL12的組合處理的動物，但沒有以疫苗處理，具有短暫的腫瘤控制(圖7C)，中位總生存期從未治療動物的21天增加至以三聯組合處理動物的39天。然而，對該組合添加新抗原表位疫苗導致大多數MC38腫瘤顯著消退(圖7C，右圖)。透過評估疫苗成分產生的免疫反應的大小，在施用NHS-IL12前在腫瘤生長的第13天從動物採集的周圍血測量，對於哪種動物對這種治療有反應也存在相關性(圖7D)。在第39天停止接種後腫瘤在治療後消退的動物保持無腫瘤，且4/6的動物隨後在第76天以MC38抵抗腫瘤再次攻毒。這些被再次攻毒的動物可能能夠完全清除任何殘留的MC38細胞，因為即使在第二次腫瘤植入後81天耗竭動物的CD8 +T細胞，本案發明人也沒有觀察到腫瘤生長(圖7E)。有趣的是，本案發明人觀察到，與ELISPOT評估的疫苗中所含的T細胞相比，對級聯新抗原表位產生的TNFα的比例更高(圖7F)。類似地，流式細胞儀分析證明，相較於疫苗中包含的那些，多功能T細胞在與級聯新抗原表位反應的T細胞中產生抗原依賴性IFN與TNFα的優勢更大(圖7G)。以疫苗及NHS-IL12處理的動物，使用圖7A中概述的相同治療時間線，能夠在不存在N-803以及抗PD-L1抗體處理的情況下調節一定程度的腫瘤消退。然而，所有治療的動物最終都屈服於進行性腫瘤生長(圖7H)。
組合治療組腫瘤的劇烈消退與有限的毒性有關。檢查的所有組織在組織學上是正常的，除了十二指腸無發炎的腺上皮壞死病灶區，以及處理過的動物的小腸中的細胞過多。在治療小鼠中，血清肝酶含量也短暫、輕微地增加，與任何肝臟病理學無關。
為了確定由單個新抗原表位組成的疫苗是否能夠調節腫瘤消退，以單個9聚體或所有四種新抗原表位胜肽庫結合N-803、抗PD-L1抗體，以及NHS-IL12處理荷瘤動物。相較於任何單胜肽疫苗接種，新抗原表位庫在誘導MC38腫瘤消退方面更為有效(圖8A)。為了確定調節有效抗腫瘤免疫的細胞群，從腫瘤生長的第1天(早期耗竭)或腫瘤生長的第15天(晚期耗竭)開始，動物耗竭NK1.1 +、CD4 +或CD8 +T細胞。在腫瘤生長早期耗竭NK1.1+細胞的動物能夠以與非耗竭動物中所見相似的動力學解析MC38腫瘤。相較於未耗竭的動物，治療動物中CD4 +細胞的早期消耗與腫瘤的更快速消退相關。NK1.1 +細胞的晚期耗竭僅與控制腫瘤生長的2/10的動物相關。CD4 +細胞的晚期耗竭與腫瘤消退的速率相關，類似於未耗竭的治療動物中所見。如所預期的，CD8 +細胞的早期及晚期耗竭都與治療缺乏反應相關，導致腫瘤進展性惡化(圖8B)。
使用圖7A中描述的相同治療方案，本案發明人評估了免疫系統的哪些組成分被腫瘤微環境中的每種不同藥劑及其組合調節。四重治療方案顯示出最大程度地增強CD8 +T細胞向腫瘤的浸潤(圖9A及9B)。於治療方案中添加NHS-IL12對腫瘤微環境中的先天性脊適應性免疫細胞具有深遠的影響。它促進M1巨噬細胞的擴增，伴隨M2巨噬細胞的協調收縮(圖9C)；還觀察到效應子及中樞記憶CD8 +T細胞減少的趨勢，以及CD8 +效應子記憶細胞的擴增(圖9D)。以疫苗及NHS-IL12結合N-803或抗PD-L1抗體的組合治療，能夠在60%的MC38腫瘤中誘導消退，而以四重治療則觀察到80%。相較於以N-803、疫苗，以及NHS-IL12處理的動物，以四重治療或疫苗、抗PD-L1抗體以及NHS-IL12治療的動物更有效地產生保護性免疫記憶。
為了更好地評估治療方案對浸潤腫瘤的免疫細胞之影響，本案發明人對從第25天腫瘤分離的CD45 +細胞中的基因表現進行了分析。相較於從未處理的腫瘤中分離的細胞，處理N-803、抗PD-L1抗體，以及新抗原表位疫苗的組合對免疫相關基因的表現幾乎沒有可觀察到的影響(圖5A)。於N-803以及抗PD-L1抗體治療方案中添加NHS-IL12與主要與先天免疫系統增強相關的大量基因的表現增加相關。於該治療添加新抗原表位疫苗是誘導最大腫瘤清除所必需的，且與T細胞活化以及效應子功能相關的轉錄本的大量擴增相關(圖10A)。
為了評估治療對浸潤腫瘤的細胞的免疫庫的多樣性之影響，本案發明人對以指定療法治療後第25天腫瘤分離的CD4 +及CD8 +細胞的T細胞受體的β鏈(TCRβ)進行了定序。在治療方案中使用NHS-IL12、N-803以及抗PD-L1抗體導致腫瘤內T細胞選殖性的最大增加，其在摻入新抗原表位疫苗後適度降低(圖10B)。為了更好地了解每個腫瘤內T細胞浸潤的選殖性，本案發明人檢查了構成前25%生產性選殖株所需的選殖數。在以新抗原表位疫苗、N-803以及抗PD-L1抗體處理的小鼠中，前25%的生產性重排由21、57以及126個選殖株所組成。在以N-803、抗PD-L1抗體，以及NHS-IL12處理的動物中，數量減少至1、2，以及6個。透過添加腫瘤消退所需的新抗原表位疫苗，選殖株的數量為3、7，以及22。這些結果顯示NHS-IL12驅動有限數量的選殖株擴增，而新抗原表位疫苗拓寬了與腫瘤清除相關的所有組成成分(圖10C)。對每個樣品中檢測到的前100個TCRβ序列的分析顯示，無論處理為何，每隻動物都具有獨特的T細胞庫(圖10D)。
產生重組腺病毒載體，其在單個病毒載體中編碼單個新抗原表位或四個新抗原表位(圖11A)。按照圖11B中概述的治療方案， 使用帶有每種單一新抗原表位載體的四種載體的混合物處理荷瘤動物，在空間分離的注射部位給藥，或者以編碼四種新抗原表位的單一病毒載體(多抗原表位)處理。混合抗原表位載體以及多抗原表位載體均產生針對包含疫苗的四種新抗原表位產生的相當的免疫力(圖11C)；然而，以多抗原表位載體接種疫苗在促進腫瘤表現的新抗原表位的免疫原位擴散方面更有效，但未摻入載體中(圖11D)。本案發明人假設透過在注射前混合四種病毒顆粒製劑，可以促進由混合疫苗誘導的抗原表位擴散。然而，即使當所有四種混合的新抗原表位疫苗一起施用，並且可能在相同的引流淋巴結內活化T細胞時，相較於多抗原表位疫苗，混合的疫苗在調節抗原表位擴散方面仍是低效的。相較於單個新抗原表位載體的混合物，在以多抗原表位載體接種的動物中，透過施用與更有效的腫瘤分辨率相關的多抗原表位疫苗觀察到的這種增加的抗原表位擴散(圖11E)。這種保護性抗腫瘤免疫反應與CD8 +T細胞的腫瘤浸潤增加以及更高的CD8：CD4 T細胞比率相關(圖11F及G)。本案發明人未觀察到二個實驗組中腫瘤浸潤性T調節細胞存在的任何差異(圖11H)。治療後腫瘤消退的動物即使在第39天停止接種疫苗後仍保持無腫瘤，且所有動物在之後抵抗隨後的腫瘤再次攻毒。
本案發明人試圖確定在腫瘤生長的第25天檢測到的抗原表位擴散程度是否與以新抗原表位疫苗、N-803、抗PD-L1抗體，以及NHS- IL12的組合治療的動物中腫瘤生長速率的變化相關聯。本案發明人觀察到腫瘤生長速率降低以及抗原表位擴散到許多新抗原表位之間的正相關性。有趣的是，腫瘤生長速率降低與疫苗成分或P15e胜肽產生的免疫程度無相關性。
利用相同的治療時程及方案，包括圖11B中概述的N-803、抗PD-L1抗體，以及NHS-IL12，以編碼'自身'腫瘤相關抗原TWIST1的腺病毒載體接種小鼠，抗原TWIST1由 MC38細胞株表現(32)，且已用於先前的抗癌疫苗研究(33,34)。僅以摻入TWIST1標靶疫苗的方案治療的2/10的動物觀察到腫瘤消退(圖11I)。有趣的是，TWIST1疫苗接種與腫瘤新抗原表位反應的T細胞的擴增有關(圖11J)；然而，相較於標靶腫瘤相關抗原的疫苗，新抗原表位疫苗在調節抗原表位擴散方面更為有效(圖11K)。
於某些具體實施例中，用於描述及要求保護本發明某些具體實施例的表示成分、性質的量如濃度、反應條件等的數字應被理解為在某些情況下由術語“約”修飾。因此，於某些具體實施例中，書面描述以及所附申請專利範圍中列出的數值參數是近似值，其可根據特定具體實施例試圖獲得的所需性質而變化。於某些具體實施例中，數值參數應根據報告的有效數字的數量並透過應用普通的捨入技術來解釋。儘管闡述本發明的一些具體實施例的廣泛範圍的數值範圍及參數為近似值，但具體實施例中列出的數值被盡可能精確地報告。在本發明的一些實施例中呈現的數值可能包含必然由其各自的測試測量中發現的標準偏差引起的某些誤差。除非上下文指示相反，否則本文所述之所有範圍應被解釋為包括其端點，且開放式範圍應解釋為包括商業實用數值。同樣地，除非上下文指示相反，否則應將所有數值列表視為包含中間值。
如本文之描述及隨後的申請專利範圍中所使用的，“一”、“一個”以及“該”的含義包括複數指示物，除非上下文另有明確說明。此外，如在本文的描述中所使用的，除非上下文另有明確規定，否則“在...中”的含義包括“在…中”以及“在…上”。此外，且除非上下文另有指示，否則術語“耦合到”目的在包括直接耦合(其中兩個彼此耦合的元件彼此接觸)以及間接耦合(其中至少一個附加元件位於兩個元件之間)。因此，術語“耦合到”以及“與…耦合”為同義使用。
如本文所用，任何疾病或病症的術語“治療(動詞)”、“治療(動名詞)”或“治療(名詞)”，於一具體實施例中，係指一種或多種化合物或組合物的施用以改善疾病或病症(例如，減緩或阻止或減少疾病的發展或其至少一種臨床症狀)。於另一具體實施例中，“治療(動詞)”、“治療(動名詞)”或“治療(名詞)”係指給予一種或多種化合物或組合物以減輕或改善至少一種物理參數，包括患者可能無法辨別的物理參數。於又一具體實施例中，“治療(動詞)”、“治療(動名詞)”或“治療(名詞)”係指施用一種或多種化合物或組合物，用於調節疾病或病症，不論是症狀上的(例如，可辨別症狀的穩定) 、生理學上的(例如，打破癌症免疫編輯的逃避階段、誘導癌症免疫編輯的消除階段、恢復癌症免疫編輯的平衡階段)，或兩者皆有。於另一具體實施例中，“治療(動詞)”、“治療(動名詞)”或“治療(名詞)”係指給予一種或多種化合物或組合物以預防或延遲疾病或病症的發作或發展或進展。術語“治療(動詞)”、“治療(動名詞)”以及“治療(名詞)”可能導致例如癌症穩定，部分或完全反應。然而，特別是在癌症具有治療抗性的情況下，術語“治療(動詞)”、“治療(動名詞)”以及“治療(名詞)”並非意指治癒甚至部分治癒。如本文所用，術語“患者”係指被診斷或懷疑患有疾病，特別是癌症的人類(包括成人及兒童)或其他哺乳動物。
對於本領域技術人員顯而易見的是，在不脫離本文的發明構思之情況下，除了已經描述的那些以外的更多修改是可能的。因此，除了所附之申請專利範圍的範圍之外，本發明的主題不受限制。此外，在解釋說明書及申請專利範圍時，所有術語應以與上下文一致的最廣泛之方式解釋。特別是，術語“包括”以及“包含”應被解釋為以非排他的方式指代元件、組件或步驟，指示所引用的元件、組件或步驟可以存在，或者被利用，或者與未明確引用的其他元件、組件或步驟組合。當說明書申請專利範圍涉及選自由A、B、C…以及N所組成之群組中的至少一種時，該文字應解釋為只需要該群組中的一個元件，而非A加N，或B加N等。
圖 1為用於本發明主題的客製化疫苗製劑之示意圖。
圖2為描繪使用表現及計算的MHC結合之患者新抗原表位過濾之示例性結果的圖。
圖3為相較於一根據本發明主題之疫苗接種方案的各種對照實驗之示例性示意圖。
圖4描繪了該方案或圖3的動物中腫瘤的CD8 T細胞浸潤的顯微照片。
圖5為使用一根據本發明主題之方案治療的動物中腫瘤體積之示例性圖。
圖6A-H所示為鑑定免疫原性新抗原表位之程序。圖6A所示為皮下植入的MC38腫瘤中新抗原表位發現之工作流程。圖6B所示為MC38新抗原表位的體外結合評分。圖6C所示為以9-聚體(mer)的新抗原表位庫接種二次的免疫初始小鼠的IFNγ ELISPOT分析。在第二次疫苗接種後1週收穫脾細胞。陰影條代表在重複實驗中誘導強烈免疫反應的胜肽。圖6D所示為治療方案。圖6E-F所示為以(6E)四個9-聚體或(6F)二個25-聚體新抗原表位單獨或與N-803及/或抗PD-L1抗體組合接種的小鼠的第18天IFNγ ELELPOT分析。圖6G所示為以N-803、抗PD-L1抗體以及四種9-聚體新抗原表位胜肽(黑線)、N-803、抗PD-L1抗體以及PBS (虛線)處理，或未處理(灰線)的荷瘤小鼠之存活曲線。圖6H所示為在第13天以周圍血中每10 6個細胞透過抗原特異性IFNγ分泌細胞分層的9-聚體新抗原表位疫苗、N-803以及抗PD-L1抗體處理的小鼠之存活曲線，*P＜0.05。
圖7A-H所示為使用9-聚體新抗原表位疫苗、N-803、抗PD-L1抗體以及NHS-IL12的組合療法。圖7A所示為治療方案。圖7B所示為針對該疫苗(上圖)中包含的胜肽或疫苗中未包含的MC38新抗原表位或P15e (下圖)中腫瘤生長的第11、18以及25天的IFNγ ELISPOT分析。每列代表一隻小鼠。圖7C所示為腫瘤生長曲線。圖7D所示為在第13天以周圍血中的每10 6個細胞透過抗原特異性IFNγ分泌細胞分層的9-聚體新抗原表位疫苗、N-803、抗PD-L1抗體以及NHS-IL12處理的小鼠中的腫瘤生長。圖7E所示為在免疫初始動物或具有指定治療後具有先前退化的MC38腫瘤的動物再次攻毒後的存活曲線。在存活曲線的第0天，將MC38腫瘤植入被再次攻毒的動物中，並且不接受後續治療。箭頭表示CD8 +細胞的耗竭。圖7F-G所示為來自以9-聚體新抗原表位疫苗、N-803、抗-PD-L1，以及NHS-IL12處理的小鼠的脾細胞之分析，其在第25天收穫並以疫苗組成分或級聯抗原刺激過夜。圖7F所示為抗原依賴性TNFα：IFNγ分泌脾細胞的比率之ELISPOT分析。圖7G所示為單一IFNγ (橙色)、單一TNFα (粉紅色)，或雙重(紫色)生產者的CD8 +細胞百分比之流式細胞儀分析。圖7H所示為根據圖7A中的時間表以9-聚體新抗原表位疫苗以及NHS-IL12處理的小鼠中的腫瘤生長。
圖8A-B所示為使用單胜肽疫苗或免疫細胞耗竭的聯合療法治療的小鼠中的腫瘤惡化。圖8A所示為以N-803、抗PD-L1抗體、NHS-IL12，以及由單個9-聚體新抗原表位或四個9-聚體新抗原表位組成的新抗原表位疫苗處理的小鼠中的腫瘤生長。根據圖7A中的時間表處理小鼠。圖8B所示為耗竭研究的時間線(左)及腫瘤生長(右)。在第一次疫苗(早期耗竭)或施用NHS-IL12 (晚期耗竭)之前3天開始，攜帶腫瘤的小鼠耗竭NK、CD4或CD8細胞。
圖9A-D所示為以N-803、抗PD-L1抗體、NHS-IL12，以及9-聚體新抗原表位疫苗的單一、三重，或四重組合治療的小鼠中的腫瘤惡化及腫瘤浸潤免疫細胞。如前所述處理小鼠，並在腫瘤植入後第22天收穫腫瘤。透過(9A+9B)免疫螢光分析或(9C+9D)流式細胞儀分析腫瘤。圖9A所示為鋅甲醛固定的石蠟包埋的腫瘤切片中CD8 +(紅色)細胞的代表性免疫螢光圖像。藍色對應於DAPI染色。 比例尺=50 µm。圖9B所示為免疫螢光切片中的CD8 +細胞百分比(總DAPI +細胞)。圖9C所示為腫瘤內M1巨噬細胞(頂部，CD11b +F4/80 +CD38 +)以及M2巨噬細胞(CD11b +F4/80 +CD206 +)。圖9D所示為CD8 +腫瘤浸潤性白血球(TIL)成熟(CD44/CD62L/CD127)。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001。
圖10A-D所示為以9-聚體新抗原表位疫苗、N-803、抗PD-L1抗體，以及NHS-IL12處理後腫瘤浸潤性免疫細胞的基因表現與選殖性。圖10A所示為腫瘤浸潤性白血球的基因表現分析。圖10B所示為在腫瘤浸潤中檢測到的TCR　鏈的選殖性**P＜0.001。圖10C所示為包含檢測到的序列的前25%的TCR　選殖株的數量。圖10D所示為在每個樣品中檢測到的前100個TCR　序列的頻率。每列代表一隻小鼠，且每行代表一個唯一的選殖株。
圖11A-K所示為利用腺病毒載體之組合療法。圖11A所示為以新抗原表位為標靶的混合及多抗原表位腺病毒疫苗之視覺表示。圖11B所示為治療方案。圖11C所示為腫瘤生長的第25天針對該疫苗中包含的新抗原表位之IFNγ ELISPOT分析。每行代表一隻小鼠。圖11D所示為相對於以混合的腺病毒處理的動物之配對新抗原表位，在以多抗原表位腺病毒接種的動物中產生的免疫反應。每行代表一隻小鼠。圖11E所示為腫瘤生長曲線。圖11F所示為在鋅甲醛固定的石蠟包埋的腫瘤切片中，CD8 +(紅色)細胞的代表性免疫螢光圖像。藍色對應於DAPI染色。比例尺 = 50 µm。圖11G所示為免疫螢光切片中CD8：CD4 TIL的比率。圖11H所示為免疫螢光切片內的% FoxP3 +細胞。圖11I所示為利用以TWIST1為標靶的腺病毒處理如圖11B所示處理的小鼠中的腫瘤生長。圖11J所示為在MC38細胞株中鑑定的針對新抗原表位的腫瘤生長的第25天之IFNγ ELISPOT分析。每列代表一隻小鼠。圖11K所示為相較於以腺-TWIST1疫苗接種的動物，動物中產生的免疫反應對腺多抗原表位接種的動物的新抗原表位的相對免疫。每列代表一隻小鼠。

Claims (8)

  1. 一種包含有一核酸序列、一IL-15、一抗PD-L1抗體和一IL-12的疫苗組合物於製備用於一患有一腫瘤的個體之醫藥品的用途，其中該核酸序列包含選自由腫瘤相關抗原、腫瘤特異性抗原和新抗原的群組中至少一種的抗原序列，該IL-15在施用一第一劑的核酸序列後7天內施用，該抗PD-L1抗體在施用一第一劑的IL-15後7天內施用，在施用該第一劑的核酸序列後14至28天內施用一第二劑的核酸序列，該IL-12在施用該第二劑的核酸序列後8天內施用。
  2. 如請求項1之用途，其中該疫苗組合物引發針對一腫瘤相關抗原以及一腫瘤特異性抗原中的至少一種的一免疫反應。
  3. 如請求項1之用途，其中該核酸序列包含一細菌疫苗、一酵母疫苗，或一病毒疫苗。
  4. 如請求項1之用途，其中該IL-15在治療周期內施用2-3次。
  5. 如請求項1之用途，其中該檢查點抑制劑在治療周期施用2-3次。
  6. 如請求項1之用途，其中該IL-15是IL15超激動劑。
  7. 如請求項6之用途，其中該IL15超激動劑是Alt-803。
  8. 如請求項1之用途，其中該IL-12是NHS IL-12。
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