JP6259983B2 - Th1細胞のKIF20Aエピトープペプチドおよびこれを含有するワクチン - Google Patents
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Description
優先権
本出願は、2012年7月10日出願の米国特許仮出願第61/669,999号の恩典を主張し、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
最近、健常ボランティアのPBMCから腫瘍反応性かつHLA−A2(A*02:01)拘束性の細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を誘導することができる高度免疫原性のKIF20A由来のCTLエピトープ(非特許文献19、特許文献5)が同定された。さらに、KIF20A由来HLA−A24拘束性CTLエピトープも同定されている(特許文献6)。それゆえ、KIF20Aは、がん免疫療法に適用できる依然として魅力的な標的分子である。
そのために、本発明者らは、プロミスキャスな(promiscuous)HLAクラスII分子との関連で認識され、CTLエピトープを含む、新規KIF20A由来Th1細胞エピトープを同定する戦略を設計し、そのようにして特徴づけられたエピトープがより効率的なT細胞媒介性腫瘍免疫を誘導するという仮定の下で研究を進めた。HLAクラスII結合ペプチドを予測するコンピュータアルゴリズムおよびHLA−A24(A*24:02)またはA2拘束性CTLによって認識される公知のCTLエピトープ配列を使用して、候補となる、CTLエピトープを含有するプロミスキャスなHLAクラスII拘束性Th1細胞エピトープを選択した。
[1]10〜30アミノ酸長を有し、配列番号:11のアミノ酸配列の一部を含む単離されたペプチドであって:
(a)配列番号:1、2、3、または4のアミノ酸配列から選択される9を超えるアミノ酸長を有する連続するアミノ酸配列;および
(b)(a)のアミノ酸配列において1、2または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および/または付加されているアミノ酸配列
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含み、Tヘルパー1型(Th1)細胞を誘導する能力を有するペプチド。
[2]前記ペプチドまたはその断片が少なくとも2種類のMHCクラスII分子に結合する能力を有する、[1]に記載の単離されたペプチド。
[3]前記MHCクラスII分子がHLA−DR4、HLA−DR15、HLA−DR53およびHLA−DP2から成る群より選択される、[2]に記載の単離されたペプチド。
[4]前記ペプチドが、KIF20A特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)誘導能を有するペプチドのアミノ酸配列を含む、[1]から[3]のいずれか1つに記載の単離されたペプチド。
[5]前記ペプチドが、
(a)配列番号:1、2、3および4から成る群より選択されるアミノ酸配列;および
(b)(a)のアミノ酸配列において1、2または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および/または付加されているアミノ酸配列
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、[4]に記載の単離されたペプチド。
[6][1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
[7]
(i)Th1細胞、
(ii)CTL、
(iii)Th1細胞を誘導する能力を有する抗原提示細胞(APC)、および
(iv)CTLを誘導する能力を有するAPC
から成る群より選択される細胞の少なくとも1つを誘導するための組成物であって、[1]から[5]のいずれか1つに記載の1つもしくは複数のペプチド、またはそれらをコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む、組成物、または
(i)Th1細胞、
(ii)CTL、
(iii)Th1細胞を誘導する能力を有する抗原提示細胞(APC)、および
(iv)CTLを誘導する能力を有するAPC
から成る群より選択される少なくとも1種類の細胞を誘導するための組成物であって、[1]から[5]のいずれか1つに記載の1つもしくは複数のペプチド、またはそれらをコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む、組成物。
[8]
(a)[1]から[5]のいずれか1つに記載の1つまたは複数のペプチド;
(b)[6]に記載の1つまたは複数のポリヌクレオチド;
(c)[1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示する1つまたは複数のAPC;
(d)[1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するAPCを認識する1つまたは複数のTh1細胞;および
(e)上記(a)から(d)の任意の2つまたはそれ以上の組合せ
から成る群より選択される少なくとも1つの有効成分を含有し、ならびに
(i)がんの治療、
(ii)がんの予防、
(iii)がんにおける術後再発の予防、および
(iv)上記(i)から(iii)の任意の2つまたはそれ以上の組合せ
から成る群より選択される目的のために製剤化されている、医薬組成物。
[9]前記組成物が、MHCクラスII分子としてHLA−DR4、HLA−DR15、HLA−DR53およびHLA−DP2から成る群より選択される少なくとも1つを有する対象への投与のために製剤化されている[8]に記載の医薬組成物、または前記組成物が、HLA−DR4、HLA−DR15、HLA−DR53およびHLA−DP2から成る群より選択される少なくとも1つのMHCクラスII分子を有する対象への投与用に製剤化されている[8]に記載の医薬組成物。
[10]前記組成物が、CTL誘導能を有する1つまたは複数のペプチドをさらに含有する、[8]または[9]に記載の医薬組成物。
[11]MHCクラスII分子によって媒介される免疫応答を増強するための組成物であって、
(a)[1]から[5]のいずれか1つに記載の1つまたは複数のペプチド;
(b)[6]に記載の1つまたは複数のポリヌクレオチド;
(c)[1]から[5]のいずれか1つのペプチドまたはその断片を自らの表面に提示する1つまたは複数のAPC;
(d)[1]から[5]のいずれか1つのペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するAPCを認識する1つまたは複数のTh1細胞;および
(e)上記(a)から(d)の任意の2つまたはそれ以上の組合せ
から成る群より選択される少なくとも1つの有効成分を含有する組成物。
[12]Th1細胞を誘導する能力を有するAPCを誘導するための方法であって、APCを[1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチドとインビトロ、エクスビボまたはインビボで接触させる段階を含む方法。
[13]CTLを誘導する能力を有するAPCを誘導するための方法であって、
(a)APCを[1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチドとインビトロ、エクスビボまたはインビボで接触させる段階;および
(b)[1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドをAPCに導入する段階
から成る群より選択される段階を含む方法。
[14]Th1細胞を誘導するための方法であって、
(a)CD4陽性T細胞を、MHCクラスII分子と[1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチドまたはその断片との複合体を自らの表面に提示するAPCと共培養する段階;および
(b)T細胞受容体(TCR)サブユニットの両方をコードするポリヌクレオチド、またはTCRサブユニットの各々をコードするポリヌクレオチドをCD4陽性T細胞に導入する段階であって、ここでTCRが、細胞表面に提示されるMHCクラスII分子と[1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチドまたはその断片との複合体に結合することができる、段階
から成る群より選択される段階を含む方法、またはTh1細胞を誘導するための方法であって、
(a)CD4陽性T細胞を、MHCクラスII分子と[1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチドまたはその断片との複合体を自らの表面に提示するAPCと共培養する段階;および
(b)T細胞受容体(TCR)サブユニットの両方をコードする単一ポリヌクレオチド、または各々別々のTCRサブユニットをコードする複数のポリヌクレオチドをCD4陽性T細胞に導入する段階であって、ここでTCRが、APCの細胞表面に提示されるMHCクラスII分子と[1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチドまたはその断片との複合体に結合することができる、段階
から成る群より選択される段階を含む方法。
[15]CTLを誘導するための方法であって、
(a)CD4陽性T細胞およびCD8陽性T細胞の両方を、[4]または[5]に記載のペプチドと接触させたAPCと共培養する段階;ならびに
(b)CD8陽性T細胞を、[4]または[5]に記載のペプチドと接触させたAPCと共培養する段階
から成る群より選択される段階を含む方法。
[16]MHCクラスII分子によって媒介される免疫応答を増強するための方法であって、
(a)[1]から[5]のいずれか1つに記載の1つまたは複数のペプチド;
(b)[6]に記載の1つまたは複数のポリヌクレオチド;
(c)[1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示する1つまたは複数のAPC;
(d)[1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するAPCを認識する1つまたは複数のTh1細胞;および
(e)上記(a)から(d)の任意の2つまたはそれ以上の組合せ
から成る群より選択される少なくとも1つの有効成分を対象に投与する段階を含む方法。
[17]MHCクラスII分子と[1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチドまたはその断片との複合体を自らの表面に提示する、単離されたAPC。
[18][12]または[13]の方法によって誘導されるAPC。
[19]APCの表面に提示された[1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチドまたはその断片を認識する、単離されたTh1細胞。
[20][14]に記載の方法によって誘導されるTh1細胞。
[21]がんに対する免疫応答を、それを必要とする対象において誘導する方法であって、
(a)[1]から[5]のいずれか1つに記載の1つまたは複数のペプチド;
(b)[6]に記載の1つまたは複数のポリヌクレオチド;
(c)[1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示する1つまたは複数のAPC;
(d)[1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するAPCを認識する1つまたは複数のTh1細胞;および
(e)上記(a)から(d)の任意の2つまたはそれ以上の組合せ
から成る群より選択される少なくとも1つの有効成分を含有する組成物を対象に投与する段階を含む方法。
[22][1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチドに対する抗体またはその免疫学的に活性な断片。
[23][1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
[24][23]に記載の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
[25][1]から[5]のいずれか1つに記載のペプチド、[6]に記載のポリヌクレオチドまたは[22]に記載の抗体を含む、診断キット。
本発明の態様を実施または試験するにあたって、本明細書に記載の方法および材料と類似または等価の任意の方法および材料を使用することができるが、好ましい方法、装置および材料をここに記載する。しかしながら、本発明の材料および方法について記載する前に、本発明が本明細書で述べる特定の大きさ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコル等は慣例的な実験法および最適化に応じて変更可能であるため、本発明がこれらに限定されないことが理解されるべきである。また、本記載で用いる用語は、特定のバージョンまたは態様を説明することだけを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図されず、本発明の範囲は付属の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。
特に定義されない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および学術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。しかしながら、矛盾する場合は、定義を含む本明細書が支配する。
本明細書で使用する「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」という語は、特に明確に示されない限り「少なくとも1つの」を意味する。
アミノ酸は、本明細書ではIUPAC−IUB生化学命名法委員会によって推奨される、一般に公知の3文字表記、または1文字表記によって言及され得る。
「剤」および「組成物」という用語は、本明細書では、特定量の特定成分を含む生成物、ならびに特定量の特定成分の組合せから直接または間接的に生じる任意の生成物を指すために互換的に使用される。医薬組成物に関するそのような用語は、有効成分、および担体を構成する不活性成分を含む生成物、ならびに成分の任意の2つもしくはそれ以上の組合せ、錯体形成もしくは凝集から、または成分の1つもしくは複数の解離から、または成分の1つもしくは複数の他の種類の反応もしくは相互作用から直接または間接的に生じる任意の生成物を包含することが意図されている。したがって、本発明の医薬組成物は、本発明の化合物と医薬的または生理学的に許容される担体とを混合することによって作製される任意の組成物を包含する。
本明細書で使用する「医薬的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」という語句は、液体もしくは固体増量剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入材料を含むがこれらに限定されない、医薬的または生理学的に許容される材料、組成物、物質またはビヒクルを意味する。
特に定義されない限り、「Tリンパ球」および「T細胞」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
特に定義されない限り、「HLA−A24」という用語は、サブタイプを含むHLA−A24型を指し、その例には、HLA−A*2401、HLA−A*2402、HLA−A*2403、HLA−A*2404、HLA−A*2407、HLA−A*2408、HLA−A*2420、HLA−A*2425およびHLA−A*2488が含まれるが、これらに限定されない。
特に定義されない限り、本明細書で使用する「HLA−A2」という用語は、典型的にはサブタイプを指し、その例には、HLA−A*0201、HLA−A*0202、HLA−A*0203、HLA−A*0204、HLA−A*0205、HLA−A*0206、HLA−A*0207、HLA−A*0210、HLA−A*0211、HLA−A*0213、HLA−A*0216、HLA−A*0218、HLA−A*0219、HLA−A*0228およびHLA−A*0250が含まれるが、これらに限定されない。
特に定義されない限り、「HLA−DR9」という用語はサブタイプを指し、その例には、HLA−DRB1*09:01、HLA−DRB1*09:02、HLA−DRB1*09:03、LA−DRB1*09:04、HLA−DRB1*09:05、HLA−DRB1*09:06、HLA−DRB1*09:07、HLA−DRB1*09:08およびHLA−DRB1*09:09が含まれるが、これらに限定されない。
特に定義されない限り、「HLA−DR15」という用語はサブタイプを指し、その例には、HLA−DRB1*15:01、HLA−DRB1*15:02、HLA−DRB1*15:03、LA−DRB1*15:04、HLA−DRB1*15:05、HLA−DRB1*15:06、HLA−DRB1*15:07、HLA−DRB1*15:08、HLA−DRB1*15:09、HLA−DRB1*15:10およびHLA−DRB1*15:11が含まれるが、これらに限定されない。
特に定義されない限り、「HLA−DR53」という用語はサブタイプを指し、その例には、HLA−DRB4*01:01およびHLA−DRB4*01:03が含まれるが、これらに限定されない。
特に定義されない限り、「HLA−DP2」という用語はサブタイプを指し、その例には、HLA−DPB1*0201およびHLA−DPB1*02:02が含まれるが、これらに限定されない。
特に定義されない限り、「KIF20Aに特異的なTh1細胞」という語句は、KIF20Aに由来するペプチドを提示する抗原提示細胞によって特異的に活性化されるが、他の抗原提示細胞では特異的に活性化されないTh1細胞を指す。
特に定義されない限り、ペプチドに関連して使用される場合、「CTL誘導能」という語句は、抗原提示細胞上に提示された場合CTLを誘導するペプチドの能力を指す。
特に定義されない限り、本明細書で使用する「キット」という用語は、試薬と他の材料の組合せに関して用いられる。キットは、マイクロアレイ、チップ、マーカー等を含み得ることが本明細書で企図される。「キット」という用語は、試薬および/または材料の特定の組合せに限定されることを意図しない。
本発明に関連して、「抗体」という用語は、指定されるタンパク質またはそのペプチドに特異的に反応性である免疫グロブリンおよびその断片を指す。抗体は、ヒト抗体、霊長類化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、他のタンパク質または放射性標識に融合した抗体、および抗体断片を含み得る。さらに、本明細書における抗体はその最も広い意味で使用され、特に無傷モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも2つの無傷抗体から形成される多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、および所望の生物学的活性を示す限り、抗体断片を包含する。「抗体]は、すべてのクラス(例えばIgA、IgD、IgE、IgGおよびIgM)を示す。
特に定義されない限り、本明細書で使用するすべての技術および学術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
以下で詳細に説明する本発明のペプチドは、「KIF20Aペプチド」または「KIF20Aポリペプチド」と称され得る。
KIF20Aに由来するペプチドがTヘルパー1型(Th1)細胞によって認識される抗原として機能することを明らかにするため、KIF20Aに由来するペプチド(配列番号:11)を、これらがMHCクラスII分子によってプロミスキャスに拘束される抗原エピトープであるかどうかを判定するために分析した。
KIF20Aに由来するプロミスキャスなMHCクラスII結合ペプチドの候補を、HLA−DR4、HLA−DR15、HLA−DR53およびHLA−DP2への結合親和性に基づいて同定した。これらのペプチドをロードした樹状細胞(DC)によるCD4+T細胞のインビトロ刺激後、以下のペプチドの各々を用いてTh1細胞を成功裏に樹立した:
KIF20A(60−84)/DSMEKVKVYLRVRPLLPSELERQED(配列番号:1)、
KIF20A(809−833)/CIAEQYHTVLKLQGQVSAKKRLGTN(配列番号:2)、
KIF20A(494−517)/TLHVAKFSAIASQLVHAPPMQLGF(配列番号:3)、および
KIF20A(843−863)/PPGKKPFLRNLLPRTPTCQSS(配列番号:4)。
(a)配列番号:1、2、3または4のアミノ酸配列からの9個より多い連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列;および
(b)1、2または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および/または付加されている(a)のアミノ酸配列。
[1]10〜30アミノ酸長を有し、配列番号:11のアミノ酸配列の一部を含む単離されたペプチドであって、
(a)配列番号:1、2、3または4のアミノ酸配列から選択される9を超えるアミノ酸長を有する連続するアミノ酸配列;および
(b)1、2または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および/または付加されている(a)のアミノ酸配列
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含み、Th1細胞を誘導する能力を有するペプチド;
[2]前記ペプチドまたはその断片が少なくとも2種類のMHCクラスII分子に結合する能力を有する、[1]に記載の単離されたペプチド;
[3]前記MHCクラスII分子がHLA−DR4、DR15、DR53およびDP2から成る群より選択される、[2]に記載の単離されたペプチド;
[4]前記ペプチドが、KIF20A特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)誘導能を有するペプチドのアミノ酸配列を含む、[1]から[3]のいずれか1つに記載の単離されたペプチド;ならびに
[5]前記ペプチドが、
(a)配列番号:1、2、3および4から成る群より選択されるアミノ酸配列;ならびに
(b)1、2または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および/または付加されている(a)のアミノ酸配列
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、[4]に記載の単離されたペプチド。
1)アラニン(A)、グリシン(G);
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4)アルギニン(R)、リシン(K);
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);
7)セリン(S)、トレオニン(T);および
8)システイン(C)、メチオニン(M)(例えばCreighton,Proteins 1984参照)。
例えば、本発明は、HLAクラスII抗原に結合し、Th1細胞誘導能を有し、配列番号:1、2、3および4から成る群より選択されるアミノ酸配列において1、2または数個のアミノ酸が改変されているアミノ酸配列を含む、31、30、29、28、27または26未満のアミノ酸長の単離されたペプチドを提供する。
これらのペプチドはまた、APCと接触するかまたはAPCに導入された場合、APC中でプロセシングされて、プロセシングされた断片をその上に提示し得る。例えば、本発明のペプチドは、APCの表面に提示される通常11〜26(典型的には15〜25)アミノ酸残基から成る断片にプロセシングされ得る。
したがって、好ましい態様では、配列番号:1のアミノ酸配列を有するペプチドを、誘導の前にHLA−DR4、HLA−DR15、HLA−DR53またはHLA−DP2を有すると同定された対象においてTh1細胞の誘導のために使用し得る。同様に、配列番号:2のアミノ酸配列を有するペプチドを、誘導の前にHLA−DR15またはHLA−DR53を有すると同定された対象においてTh1細胞の誘導のために使用し得る。同様に、配列番号:3のアミノ酸配列を有するペプチドを、誘導の前にHLA−DR4を有すると同定された対象においてTh1細胞の誘導のために使用し得る。配列番号:4のアミノ酸配列を有するペプチドも、誘導の前にHLA−DR4またはHLA−DR53を有すると同定された対象においてTh1細胞の誘導のために使用し得る。
本発明のペプチドは周知の技術を用いて調製することができる。例えば、本発明のペプチドは、組換えDNA技術または化学合成を用いて、合成によって調製することができる。本発明のペプチドは、個別にまたは2もしくはそれ以上のペプチドから成るより長いポリペプチドとして合成することができる。本発明のペプチドを、次に、他の天然の宿主細胞タンパク質およびその断片、または他の何らかの化学物質を実質的に含まないようにするために、単離する、すなわち精製することができる。
本発明のペプチドは、修飾がもとの参照ペプチドの生物学的活性を損なわない限り、グリコシル化、側鎖酸化またはリン酸化などの修飾を含み得る。他の例示的な修飾には、例えばペプチドの血清半減期を延長させるために使用できる、D−アミノ酸または他のアミノ酸模倣体の組み込みが含まれる。
(i)Peptide Synthesis,Interscience,New York,1966;
(ii)The Proteins,Vol.2,Academic Press,New York,1976;
(iii)「ペプチド合成」(日本語)、丸善、1975;
(iv)「ペプチド合成の基礎と実験」(日本語)、丸善、1985;
(v)「医薬品の開発」(日本語)、続第14巻(ペプチド合成)、広川書店1991;
(vi)国際公開第99/67288号;および
(vii)Barany G.& Merrifield R.B.,Peptides Vol.2,「Solid Phase Peptide Synthesis」,Academic Press,New York,1980,100−118。
本発明はまた、本発明の前記ペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドも提供する。これらには、天然のKIF20A遺伝子(GenBankアクセッション番号NM_005733(配列番号:10))に由来するポリヌクレオチド、ならびにその保存的に改変されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。本明細書では、「保存的に修飾されたヌクレオチド配列」という語句は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする配列を指す。遺伝暗号の縮重に起因して、数多くの機能的に同一の核酸が所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCGおよびGCUはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって特定されるあらゆる位置で、コドンを、コードされるポリペプチドを変化させることなく前述した対応するコドンのいずれかに変化させることができる。そのような核酸変異は、保存的に改変された変異の一種である、「サイレント変異」である。ペプチドをコードする本明細書のあらゆる核酸配列は、核酸のあらゆる可能なサイレント変異も表す。当業者は、核酸中の各々のコドン(通常メチオニンの唯一のコドンであるAUG、および通常トリプトファンの唯一のコドンであるTGGを除く)を、機能的に同一の分子を生じるように改変できることを認識する。したがって、ペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、各々の開示される配列において暗黙のうちに表現される。
本発明はまた、HLAクラスII抗原と本発明のペプチドまたはその断片との間で形成される複合体を自らの表面に提示する抗原提示細胞(APC)も提供する。本発明のペプチドと接触させることによって得られるAPCは、治療および/または予防の対象である患者に由来することができ、それだけでまたは本発明のペプチド、Th1細胞またはCTLを含む他の薬剤と組み合わせてワクチンとして投与することができる。
a:最初の対象からAPCを回収する段階、
b:段階aのAPCを本発明のペプチドと接触させる段階、および
c:ペプチドをロードしたAPCを2番目の対象に投与する段階
を含み得る。
本発明のペプチドのいずれかに対して誘導されるTh1細胞は、インビボでがん細胞を標的とするCTLを含むエフェクター細胞のいずれかの免疫応答を強化し、したがってペプチド自体と同様の方法で、ワクチンとして役立つ。そこで、本発明はまた、本発明のペプチドのいずれかによって特異的に誘導されるまたは活性化される単離されたTh1細胞も提供する。
本発明はまた、T細胞受容体(TCR)のサブユニットを形成することができる1つまたは複数のポリペプチドをコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを含有する組成物、およびこれを使用する方法を提供する。そのようなTCRサブユニットは、KIF20Aペプチドを提示するAPCに対する特異性をCD4+T細胞に付与するTCRを形成する能力を有する。当技術分野において公知の方法を用いることにより、本発明のペプチドによって誘導されるTh1細胞のTCRサブユニットとしてα鎖およびβ鎖の核酸を同定することができる(国際公開第2007/032255号およびMorgan et al.,J Immunol,171,3288(2003))。誘導体TCRは、KIF20Aペプチドを提示するAPCに高い結合力で結合することができ、場合により効率的なサイトカイン産生を媒介することができる。
本発明の方法および組成物ががんの「治療」に関連して有用性を有する限り、治療が臨床上の利益、例えばKIF20A遺伝子の発現の低下、または対象におけるがんの大きさ、有病率または転移能の低減を導く場合、治療は「有効」とみなされる。治療が予防的に適用される場合、「有効」は、がんの形成を遅延させるもしくは予防するまたはがんの臨床症状を予防するもしくは軽減することを意味する。有効性は、特定の腫瘍型を診断するまたは治療するための任意の公知の方法に関連して決定される。
さらに、図5および6に示すように、本発明の過程で同定されたKIF20A由来ペプチドは、CTLエピトープ単独での刺激と比較してCTL誘導を増強することが確認されている。それゆえ、本発明はまた、HLA−A2およびHLA−A24などのMHCクラスI抗原によって媒介される免疫応答を増強するまたは刺激するための薬剤または組成物も提供する。別の態様では、本発明はさらに、MHCクラスI抗原によって媒介される免疫応答を増強するまたは刺激するための薬剤または組成物を製造するための本発明のペプチドの使用を提供する。
さらに、本発明のペプチドの少なくとも1つを含有する薬剤または組成物は、MHCクラスII分子によって媒介される免疫応答を増強するまたは促進するのに使用することができる。
(a)本発明のペプチド、
(b)本明細書で開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド、
(c)本発明のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するAPC、および
(d)本発明のTh1細胞
の中から選択される有効成分の使用を提供する。
(a)本発明のペプチド、
(b)本明細書で開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド、
(c)本発明のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するAPC、および
(d)本発明のTh1細胞
の中から選択される有効成分を提供する。
(a)本発明のペプチド、
(b)本明細書で開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド、
(c)本発明のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するAPC、および
(d)本発明のTh1細胞
の中から選択される有効成分と医薬的または生理学的に許容される担体を製剤化する段階を含む方法または工程を提供する。
(a)本発明のペプチド、
(b)本明細書で開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド、
(c)本発明のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するAPC、および
(d)本発明のTh1細胞
の中から選択される有効成分を医薬的または生理学的に許容される担体と混合する段階を含む方法または工程も提供する。
あるいは、好ましい態様では、本発明の過程で同定されたペプチドは、HLA−A2またはHLA−A24を有する対象に適用された場合、KIF20Aに特異的なCTLを誘導することもできる。したがって、本発明のペプチドの投与を通して、Th1細胞の誘導に加えてKIF20Aを発現するがんに対するCTL応答が誘導され得ることがさらに期待される。さらに、本発明のペプチドは、KIF20A発現細胞に対するCTL応答を、そのプロセシングを介して誘導することができるだけでなく、それによって媒介されるTh1細胞誘導により、CTL応答を増強することもできる。したがって、同じ対象においてTh1細胞およびKIF20A特異的CTLの両方の誘導を達成するために、例えば、治療される対象は、配列番号:1のアミノ酸配列を有するペプチドを投与する場合は、好ましくはMHCクラスII分子としてHLA−DR4、HLA−DR15、HLA−DR53およびHLA−DP2の中から選択される少なくとも1つ、ならびにMHCクラスI分子としてHLA−A24を有する。同様に、MHCクラスII分子としてHLA−DR53および/またはDR15を、ならびにMHCクラスI分子としてHLA−A2を有する対象に配列番号:2のアミノ酸配列を有するペプチドを投与することにより、Th1細胞およびKIF20A特異的CTLの両方の誘導が対象において達成され得る。
本発明の薬剤または医薬組成物によって治療されるべきがんまたは腫瘍には、限定されないが、そのようながんの好ましい例には、例えば膀胱がん、乳がん、胆管細胞がん、食道がん、非小細胞肺がん(NSCLC)、膵がん、前立腺がん、腎がん、小細胞肺がん(SCLC)および頭頸部悪性腫瘍(HNMT)を含む、KIF20Aを発現する任意の種類のがんまたは腫瘍が含まれる。
本発明のペプチドは、薬剤もしくは医薬組成物として直接投与することができるか、または必要な場合は、従来の製剤方法によって製剤化される。後者の場合、本発明のペプチドに加えて、薬剤に通常使用される担体、賦形剤などが、特に制限されることなく適宜含まれ得る。そのような担体の例には、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液、培養液などが含まれるが、これらに限定されない。さらに、薬剤または医薬組成物は、必要に応じて、安定剤、懸濁液、防腐剤、界面活性剤などを含有し得る。本発明の薬剤または医薬組成物は抗がん目的に用いることができる。
本発明の別の態様では、本発明のペプチドはまた、医薬的に許容される塩の形態で投与し得る。好ましい塩の例には、アルカリ金属との塩、金属との塩、有機塩基との塩、有機酸(例えば酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸等)との塩、および無機酸(例えば塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸等)との塩が含まれる。本明細書で使用する場合、「医薬的に許容される塩」という語句は、化合物の生物学的有効性および特性を保持し、無機酸または無機塩基、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸、サリチル酸等との反応によって得られる塩を指す。
本発明の薬剤または医薬組成物はまた、本明細書で開示するペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現可能な形態で含有し得る。本明細書では、「発現可能な形態で」という語句は、ポリヌクレオチドが、細胞内に導入された場合、抗腫瘍免疫を誘導するポリペプチドとしてインビボで発現されることを意味する。例示的な態様では、関心対象のポリヌクレオチドの核酸配列は、ポリヌクレオチドの発現に必要な調節エレメントを含む。ポリヌクレオチドは、標的細胞のゲノムへの安定な組み込みを達成するのに必要なものを備え得る(相同組換えカセットベクターの説明に関しては、例えばThomas KR & Capecchi MR,Cell 1987,51:503−12参照)。例えば、Wolff et al.,Science 1990,247:1465−8;米国特許第5,580,859号;同第5,589,466号;同第5,804,566号;同第5,739,118号;同第5,736,524号;同第5,679,647号;および国際公開第98/04720号参照。DNAに基づく送達技術の例には、「裸のDNA」、促進(ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介性)送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介性(「遺伝子銃」)または圧力媒介性送達が含まれる(例えば米国特許第5,922,687号参照)。
本発明のペプチドおよびそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本発明のAPCおよびTh1細胞を誘導するために使用できる。本発明のAPCはまた、本発明のTh1細胞を誘導するためにも使用できる。ペプチド、ポリヌクレオチドおよびAPCは、任意の他の化合物がこれらのTh1細胞誘導能を阻害しない限り、任意の他の化合物と組み合わせて使用することができる。したがって、本発明の前記薬剤または医薬組成物のいずれかを、Th1細胞を誘導するために使用でき、それに加えて、ペプチドおよびポリヌクレオチドを含むものも、以下で論じるようにAPCを誘導するために使用できる。
本発明は、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用してAPCを誘導する方法を提供する。APCの誘導は、「VI.抗原提示細胞」の章で上述したように実施することができる。本発明はまた、Th1細胞誘導能を有するAPCを誘導するための方法も提供し、前記APCの誘導は、「VI.抗原提示細胞」、前出の項目でも言及されている。
(a)APCを本発明のペプチドとインビトロ、エクスビボまたはインビボで接触させる段階;および
(b)本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをAPCに導入する段階
の1つを含み得る方法を提供する。
あるいは、本発明は、Th1細胞誘導能を有するAPCを誘導するための方法であって、
(a)APCを本発明のペプチドと接触させる段階;および
(b)本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをAPCに導入する段階
から成る群より選択される段階を含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、APCを誘導するために製剤化される剤または組成物の製造における、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用を提供する。
好ましい態様では、本発明のペプチドは、Th1応答を誘導するだけでなく、それらをプロセシングした後にCTL応答も誘導する。したがって、好ましい態様では、本発明の方法によって調製されるAPCは、がん細胞を含む、KIF20A発現細胞に対するCTLを誘導するためにも有用であり得る。例えば、配列番号:5のアミノ酸配列を含むペプチドによって誘導する場合は、HLA−A2を発現するAPCがKIF20A特異的CTLを誘導するのに適する。あるいは、配列番号:6のアミノ酸配列を含むペプチドによって誘導する場合は、HLA−A24を発現するAPCがKIF20A特異的CTLを誘導するのに適する。
さらに、本発明は、本発明のペプチド、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは本発明のペプチドもしくはその断片を提示するAPCを用いてTh1細胞を誘導するための方法を提供する。本発明はまた、本発明のペプチドとHLAクラスII抗原の複合体を認識するT細胞受容体(TCR)サブユニットを形成することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用してTh1細胞を誘導するための方法も提供する。好ましくは、Th1細胞を誘導するための方法は、
a:CD4陽性T細胞を、HLAクラスII抗原と本発明のペプチドまたはその断片との複合体を自らの表面に提示する抗原提示細胞と接触させる段階、および
b:TCRが本発明のペプチドまたはその断片とHLAクラスII抗原の複合体を認識するまたは複合体に結合することができる、TCRサブユニットの両方をコードするポリヌクレオチドまたはTCRサブユニットの各々をコードするポリヌクレオチドをCD4陽性T細胞に導入する段階
から成る群より選択される少なくとも1つの段階を含む。
a:対象からAPCを回収する段階;
b:段階aのAPCを本発明のペプチドと接触させる段階;
c:段階bのAPCをCD4+T細胞と混合し、Th1細胞を誘導するために共培養する段階;および
d:段階cの共培養物からCD4+T細胞を回収する段階
を含み得る。
さらに、Th1細胞は、TCRが本発明のペプチドまたはその断片とHLAクラスII抗原の複合体に結合することができる、TCRサブユニットの両方をコードするポリヌクレオチドまたはTCRサブユニットの各々をコードするポリヌクレオチドをCD4陽性T細胞に導入することによって誘導できる。そのような形質導入は、「VII.T細胞受容体(TCR)」の章で上述したように実施することができる。
a:CD4陽性T細胞およびCD8陽性T細胞の両方を、本発明のペプチドと接触させたAPCと共培養する段階;ならびに
b:CD8陽性T細胞を本発明のペプチドと接触させたAPCと共培養する段階
から成る群より選択される少なくとも1つの段階を含む方法を提供する。
CTLを誘導するそのような方法では、本発明のペプチドはAPC内でプロセシングされてCTLエピトープペプチドを生成し、生成されたCTLエピトープペプチドはAPCの表面に提示される。
本発明に関連して、KIF20Aを過剰発現するがんをこれらの有効成分で治療することができる。そのようながんの例には、膀胱がん、乳がん、胆管細胞がん、食道がん、非小細胞肺がん(NSCLC)、膵がん、前立腺がん、腎がん、小細胞肺がん(SCLC)および頭頸部悪性腫瘍(HNMT)が含まれるが、これらに限定されない。したがって、有効成分を含有するワクチンまたは医薬組成物の投与の前に、治療されるがん細胞または組織におけるKIF20Aの発現レベルが同じ器官の正常細胞と比較して増大しているかどうかを確認することが好ましい。したがって、1つの態様では、本発明は、KIF20Aを(過剰)発現するがんを治療するための方法であって、
i)治療されるべきがんを有する対象から得たがん細胞または組織におけるKIF20Aの発現レベルを測定する段階;
ii)KIF20Aの発現レベルを正常対照と比較する段階;および
iii)上記(a)〜(d)から成る群より選択される少なくとも1つの成分を、正常対照と比較してKIF20Aを過剰発現するがんを有する対象に投与する段階
を含み得る方法を提供する。
本発明の方法によって治療される対象は、好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えばヒト、非ヒト霊長動物、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマおよびウシが含まれるが、これらに限定されない。
詳細には、本発明の方法に使用するプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件下、中等度にストリンジェントな条件下または低ストリンジェントな条件下でKIF20AのmRNAにハイブリダイズする。本明細書で使用する場合、「ストリンジェントな(ハイブリダイゼーション)条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる状況下では異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、短い配列よりも高温で認められる。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、規定のイオン強度およびpHで特定の配列の熱融解温度(Tm)よりも約5℃低くなるように選択される。Tmとは、(規定のイオン強度、pHおよび核酸濃度下で)標的配列に相補的なプローブの50%が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。標的配列は一般に過剰に存在するので、Tmでは、プローブの50%が平衡状態で占有される。典型的には、ストリンジェントな条件とは、塩濃度がpH 7.0〜8.3で約1.0M未満のナトリウムイオン、典型的には約0.01〜1.0Mのナトリウムイオン(または他の塩)であり、および温度が、短いプローブまたはプライマー(例えば10〜50ヌクレオチド)については少なくとも約30℃であり、より長いプローブまたはプライマーの場合は少なくとも約60℃である条件である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によっても達成し得る。
がん細胞における標的遺伝子、例えばKIF20A遺伝子の発現レベルは、標的遺伝子の対照レベル(例えば正常細胞におけるレベル)から、例えば10%、25%もしくは50%増大している場合、または1.1倍超、1.5倍超、2.0倍超、5.0倍超、10.0倍超もしくはそれ以上に増大している場合、増大していると決定され得る。
KIF20A遺伝子の発現レベルが正常対照レベルと比べて増大しているか、またはがん性対照レベルと類似/同等である場合、対象は、治療されるべきがんを有すると診断され得る。
a)治療されるべきがんを有することが疑われる対象から得たがん細胞または組織におけるKIF20Aの発現レベルを測定する段階;
b)KIF20Aの発現レベルを正常対照レベルと比較する段階;
c)KIF20Aの発現レベルが正常対照レベルと比較して増大している場合、対象を、治療されるべきがんを有すると診断する段階;および
d)段階c)において、対象が治療されるべきがんを有すると診断された場合、その対象をがん治療のために選択する段階
を含む方法を提供する。
a)治療されるべきがんを有することが疑われる対象から得たがん細胞または組織におけるKIF20Aの発現レベルを測定する段階;
b)KIF20Aの発現レベルをがん性対照レベルと比較する段階;
c)KIF20Aの発現レベルががん性対照レベルと類似または同等である場合、対象を、治療されるべきがんを有すると診断する段階;および
d)段階c)において、対象が治療されるべきがんを有すると診断された場合、その対象をがん治療のために選択する段階
を含む。
(a)KIF20A遺伝子のmRNAを検出するための試薬;
(b)KIF20Aタンパク質を検出するための試薬;および
(c)KIF20Aタンパク質の生物学的活性を検出するための試薬
の群より選択される。
本発明はさらに、本発明のペプチドに結合する抗体を提供する。好ましい抗体は、本発明のペプチドに特異的に結合し、他のペプチドには結合しない(または弱く結合する)。あるいは、抗体は、本発明のペプチドならびにそのホモログに結合する。本発明のペプチドに対する抗体は、がんの診断アッセイおよび予後判定アッセイならびに画像化法において使用され得る。同様に、そのような抗体は、KIF20Aががん患者において発現されるまたは過剰発現される限り、他のがんの治療、診断および/または予後判定において使用され得る。さらに、細胞内で発現される抗体(例えば一本鎖抗体)は、KIF20Aの発現が関与するがんを処置する際に治療的に使用され得、その例には、膀胱がん、乳がん、胆管細胞がん、食道がん、非小細胞肺がん(NSCLC)、膵がん、前立腺がん、腎がん、小細胞肺がん(SCLC)および頭頸部悪性腫瘍(HNMT)が含まれるが、これらに限定されない。
本発明によれば、本発明のポリペプチドの完全なペプチドおよび部分ペプチドは免疫化抗原として役立ち得る。適切な部分ペプチドの例には、例えば本発明のペプチドのアミノ(N)末端断片またはカルボキシ(C)末端断片が含まれる。
上記免疫細胞と骨髄腫細胞を公知の方法に従って、例えばMilstein et al.の方法(Galfre and Milstein,Methods Enzymol 73:3−46(1981))に従って融合させることができる。
本発明によるペプチドの検出または測定の方法は、ペプチドを特異的に検出または測定することができるため、この方法はペプチドを用いる様々な実験で使用することができる。
本発明はまた、本発明のペプチドをコードするヌクレオチドを導入するベクターおよび宿主細胞も提供する。本発明のベクターは、本発明のペプチドを発現するためまたは遺伝子治療のために本発明のヌクレオチドを投与するための、宿主細胞における本発明のヌクレオチド、特にDNAの担体として有用である。
細胞株および抗体
TAP欠損およびHLA−A2陽性細胞株T2をRiken Cell Bankから購入した。微量の内因性HLAクラスI分子を発現するヒトBリンパ芽球様細胞株C1RのHLA−A24形質転換体であるC1R−A2402細胞(Karaki S,et al.Immunogenetics 1993;37:139−42)は滝口雅文博士(熊本大学、熊本、日本)の厚意により贈られた。抗原提示細胞(APC)として、DR4(DRB1*04:05)、DR8(DRB1*08:03)、DR15(DRB1*15:02)、またはDR53(DRB4*01:03)のいずれかを発現するように遺伝的に操作されたマウス線維芽細胞株であるL細胞:L−DR4、L−DR8、L−DR15、またはL−DR53を使用した。
潜在的なプロミスキャスHLA−DRに結合するヒトKIF20A由来ペプチドを予測するため、コンピュータアルゴリズム(IEBD解析リソース、コンセンサス法、http://tools.immuneepitope.org/analyze/html/mhc_II_binding.html)を用いてヒトKIF20Aタンパク質のアミノ酸配列を解析した(Wang P et al.BMC Bioinformatics;11:568.,Wang P et al.PLoS Comput Biol 2008;4:e1000048)。プログラムは、タンパク質全体を包含する15アミノ酸長配列のオフセットを解析した。DRB1*04:05、DRB1*15:02またはDRB4*01:03アリルによってコードされる複数のHLAクラスII分子についてオーバーラップする高いコンセンサスパーセンタイル順位を有し、かつKIF20A由来の9merまたは10merCTLエピトープを天然に含む、25アミノ酸長の2つのペプチドを選択し、合成して、CTLエピトープを含むプロミスキャスなヘルパーT細胞エピトープを同定した(Imai K,et al.Br J Cancer;104:300−7)。CTLエピトープを含まないその他の2つのKIF20A由来のLPも合成した。
2つのヒトKIF20A由来の短鎖ペプチド(SP)、KIF20A−A2(809−817)、CIAEQYHTV(配列番号:5)およびKIF20A−A24(66−75)、KVYLRVRPLL(配列番号:6)を合成した(純度>95%、Biomatik,Canada)。というのは、本発明者らは、これらの2つのペプチドが、腫瘍反応性およびHLA−A2(A*0201)拘束性またはHLA−A24(A*2403)拘束性ヒトCTLをそれぞれ誘導できることをすでに公表していたためである。4つのLP、KIF20A(60−84)、DSMEKVKVYLRVRPLLPSELERQED(配列番号:1);KIF20A(494−517)、TLHVAKFSAIASQLVHAPPMQLGF(配列番号:3);KIF20A(809−833)、CIAEQYHTVLKLQGQVSAKKRLGTN(配列番号:2);KIF20A(843−863)、PPGKKPFLRNLLPRTPTCQSS(配列番号:4)を合成し(純度>90%)、インビトロでKIF20A特異的ヒトCD4+T細胞を刺激するそれらの能力に関して試験した。HLA−A24(HIV−A24、RYLRDQQLL)(配列番号:7)およびHLA−A2(HIV−A2、SLYNTYATL)(配列番号:8)に結合すると報告された2つのHIVペプチドを陰性対照SPとして使用した(Tomita Y,et al.,Cancer Sci;102:697−705.;Tomita Y,et al.,Cancer Sci;102:71−8)。LPである、HLA−DR4(DRB1*0405)拘束性Th1細胞を誘導することができるWT1由来ペプチド(KRYFKLSHLQMHSRKH)(配列番号:9)(Fujiki F,et al.,J Immunother 2007;30:282−93)を陰性対照LPとして使用した。ペプチドを10μg/μLまたは20μg/μLの濃度でジメチルスルホキシドに溶解した。
6Hisタグ組換え全KIF20Aタンパク質およびCDCA1タンパク質を、それぞれのcDNA断片を保有するpET28aベクター(Novagen)を用いて大腸菌BL21株によって発現させた。CDCA1タンパク質を対照タンパク質として使用した。各々の組換えタンパク質を、HisTrap FFカラム(GE Healthcare)を製造者の使用説明書に従って用いて精製した。タンパク質の純度をSDS−PAGEによって確認した。
健常ドナーから末梢血単核細胞(PBMC)を採取し、使用するための研究プロトコルは、熊本大学の治験審査委員会によって承認された。6名の健常ドナーから、書面によるインフォームドコンセントを得た後、血液試料を採取した。本試験で検討した健常ドナーのHLA−A、DRB1およびDPB1アリルを、ポリメラーゼ連鎖反応およびアリル特異的プローブハイブリダイゼーションを用いてHLAアリルのDNAタイピングによって決定し、表1に示す。健常ボランティアからのPBMCを以前に述べられているように(Inoue M,et al.Int J Cancer;127:1393−403)単離した。CD4+T細胞を、抗CD4モノクローナル抗体(Miltenyi Biotec,Auburn,CA,USA)と結合した磁気マイクロビーズを用いて陽性選択によってPBMCから精製した。単球由来の樹状細胞(DC)を、以前に述べられているように(Harao M,et al.Int J Cancer 2008;123:2616−25)インビトロ培養によってCD14+細胞から生成し、抗原提示細胞(APC)として使用して、TAA特異的CD4+T細胞を誘導した。DC(1×104/ウェル)を10μg/mlのLPで3時間パルスし、照射して(45Gy)、その後96ウェル平底培養プレートの各ウェルにおいて5%ヒト補体除去血漿を添加したAIM−V 200μL中の自己CD4+T細胞(3×104/ウェル)と混合した。7日後、培地の半分を各培養物から取り出し、次に、ペプチド(10μg/ml)および5ng/mlのヒト組換え(hr)IL−7でパルスした、照射した(50Gy)自己PBMC(1×105)を含む新鮮培地(100μL/ウェル)を培養物に添加した。ペプチドでの2回目の刺激の2日後に、hr IL−2を10IU/mlの最終濃度で各ウェルに添加した。1週間後、各ウェル中の刺激したCD4+T細胞を、インターフェロン(IFN)−γ酵素結合免疫スポット(ELISPOT)アッセイにおいてそれらのペプチド特異性に関して分析した。コグネイトペプチドに特異的応答を示すT細胞を24ウェルプレートに移し、10IU/mlのhr IL−2および5ng/mlのhr IL−7を添加した培地中、ペプチド(10μg/ml)でパルスした照射自己PBMC(1×106/ウェル)を用いて週1回の間隔で再刺激した。一部の場合は、以前に述べられているように(Tabata H et al.Hum Immunol 1998;59:549−60)さらなる試験のためにT細胞を限界希釈によってクローン化した。
頭頸部悪性腫瘍(HNMT)を有する16名の患者から血液試料を採取した。KIF20A−LPに反応性のTh細胞の免疫応答を検討した。患者は、TAA由来のCTLエピトープペプチドでの免疫療法を受けており、2つのペプチドワクチン治験に登録された。3つのがん精巣抗原に由来する3つのHLA−A24結合短鎖ペプチド(SP)(臨床グレードの9〜10アミノ酸長ペプチド)、LY6K(LY6K−A24(177−186))、IMP−3(IMP−3−A24(508−516))およびCDCA1(CDCA1−A24(56−64))を用いたがん免疫療法のこれらの第I/II相臨床試験は、熊本大学(日本)の治験審査委員会によって審査され、承認された(Kono K et al.J Transl Med 2012;10:141.,Suda T et al.Cancer Sci 2007;10:1803−8.,Harao M et al.Int J Cancer 2008;123:2616−25)。このワクチンカクテルはKIF20A由来のSPを含まなかった。HNMTを有するすべての患者を、書面によるインフォームドコンセントを得た後、HLA−A24の存在に基づいて選択した。患者は、再発性または転移性腫瘍を有する手術不可能な進行HNMTに罹患しており、標準的な治療に抵抗性であった;これらの患者を大学病院医療情報ネットワーク臨床試験登録システム(UMIN−CTR)番号000008379(CTR−8379)の下で治験に登録した。根治的切除術を受けた患者は、UMIN−CTR番号000008380(CTR−8380)の下で治験に登録した。後者の治験では、患者を、S−1、イフォスファミドまたはドキソルビシンと組み合わせた術後ペプチドワクチンで治療した。これらの臨床試験および解析は進行中である。
ペプチドおよびタンパク質でパルスしたAPCに対するTh細胞の免疫応答を、以前に述べられているように(Tomita Y et al.Cancer Sci;102:697−705)IFN−γ ELISPOTアッセイ(Human IFN−γ ELISPOTキット、BD Biosciences)によって評価した。簡単に述べると、ペプチドでパルスしたPBMC(3×104)での刺激後の3×104のバルクCD4+T細胞、またはHLA−DRを発現するペプチドでパルスしたL細胞(5×104/ウェル)での刺激後の1×104のバルクCD4+T細胞当たりの、IFN−γを産生するペプチド特異的CD4+T細胞の頻度を分析した。ペプチドでパルスしたT2細胞(2×104/ウェル)またはC1R−A2402細胞(2×104/ウェル)での刺激後の1×105のCTL当たりの、IFN−γを産生する細胞の頻度も分析した。あるいは、タンパク質をロードした5×103のDCを2×104 CD4+T細胞クローン/ウェルと共培養した。タンパク質をロードした成熟DCを、以前に述べられているように(Harao M,et al.Int J Cancer 2008;123:2616−25)ポジティブ単離したCD14+細胞(0日目)から調製した。5日目に、組換えKIF20A(50μg/ml)およびOK432の存在下でDCを培養した。タンパク質をロードした成熟DCを7日目に回収し、洗浄して、IFN−γ ELISPOTアッセイにおける刺激物質として使用した。抗原提示に関与する拘束HLA分子を決定するため、抗原誘導性IFN−γ産生のブロッキングを、抗HLA−DR mAb(L243、Biolegend)、抗HLA−DP mAb(B7/21、abcam)、抗ヒトHLA−DQ mAb(SPV−L3、abcam)または抗HLAクラスI mAb(W6/32、abcam)を添加することによって検査した。すべてのmAbを5μg/mlの最終濃度で使用した。IFN−γ ELISPOTアッセイのすべての評価は2連または3連で実施し、結果は平均値に対応した。
KIF20Aに対するウサギポリクローナル抗体(A300−879A、Bethyl Laboratories,Montgomery,TX,USA)を用いたKIF20Aの免疫組織化学染色を以前に述べられているように実施した(Imai K et al.Br J Cancer 2011;104:300−7.Yamashita J et al.Acta Derm Venereol 2012;92:593−7.Yoshitake Y,et al.Clin Cancer Res 2004;10:6437−48)。
T細胞(1×104/ウェル)を、96ウェル培養プレートにおいてKIF20A(60−84)の存在下で自己PBMC(3×104/ウェル)と共に、またはKIF20A(809−833)の存在下でL−DR53(5×104)と共に培養した。20時間後、培養上清を採取し、サイトカイン(IFN−γ、TNF−α、GM−CSF、MIP1β、IL−2、IL−4、およびIL−17)レベルを、Bio−Plexシステム(Bio−Rad)を製造者の使用説明書に従って使用して測定した。
ペプチドで刺激された脱顆粒CD4+Tリンパ球を同定するため、細胞表面に露出されたCD107aをフローサイトメトリによって分析した。(Rubio V et al.Nat Med 2003;9:1377−82;Betts MR,et al.J Immunol Methods 2003;281:65−78)簡単に述べると、CD107a動員アッセイを以前に述べられているように実施した。(Tomita Y et al.Cancer Sci.)KIF20A由来ペプチドまたは対照ペプチド(1μg/ml)を刺激剤として添加し、FITC標識抗ヒトCD107a mAbまたはFITC標識アイソタイプ対照マウスIgG1およびモネンシンを各ウェルに添加した。細胞を37℃で5時間培養した。培養後、ペプチドで刺激したTh細胞をPE結合抗ヒトCD4抗体(eBioscience,San Diego,CA)で染色し、フローサイトメトリ(FACScan;BD Biosciences)によって分析した。
KIF20A(60−84)LPまたはKIF20A(809−833)LP特異的Thクローンを生成した、HLA−A2+/DR53+/DP2+ドナー(HD1)から得たPBMCを24ウェルプレートに播種した(3×106/ウェル)。7日間の培養後、以下のものを添加した:最終容量2mLの、組換えヒト(rh)IL−2(20U/mL)およびSP単独(KIF20A−A2(809−817)SP、20μg/mL)、またはSP+LP(KIF20A(60−84)LPもしくはKIF20A(809−833)LP、20μg/mL)、またはSP+LP+Thクローン(5×105細胞/ウェル)。組換えヒトIL−15(5ng/mL)を9日目に添加した。11日目に、HLA−A*02:01/KIF20A−A2(809−817)複合体のPE標識テトラマーおよびFITC標識抗ヒトCD8 mAbで細胞を染色した。データの取得はFACSCalibur(BD Biosciences)で実施し、FlowJoソフトウェア(Tree Star,Ashland,OR)を用いてデータファイルを解析した。
KIF20A(60−84)LPでの刺激によるHLA−A24陽性ドナーからのKIF20A−A24(66−75)SP特異的CTLの誘導をインビトロで評価するため、PBMC(24ウェルプレートで2×106/ウェル)を、いずれのサイトカインも添加せずにKIF20A由来のLP(7μM)と共に2週間インキュベートした。0日目と7日目に、KIF20A由来のLP(7μM)を添加し、次にLPでのインビトロ刺激の14日目に、細胞を回収して、FITC標識抗ヒトCD8 mAbと組み合わせてHLA−A*24:02/KIF20A−A24(66−75)ペプチド複合体のPE標識テトラマーで染色し、フローサイトメトリによって分析した。
KIF20A(809−833)LPによるインビトロでのKIF20A−A2(809−817)SP反応性CTLの刺激を評価するため、KIF20A(809−833)LPまたはHLA−A2陽性ドナーから単離したプロミスキャスなLPロードDCでの刺激後の、IFN−γを産生するKIF20A−A2(809−817)SP特異的バルクCTLの数をELISPOTアッセイによって計数した。インビトロでのKIF20A−A2(809−817)SP反応性ヒトCTLの誘導を、以前に報告されているように実施した(Tomita Y,et al.Cancer Sci;102:71−8)。LPをロードした成熟DCを、ポジティブ単離したCD14+細胞から調製した(0日目)。CD14+細胞をhr IL4(10ng/ml)およびGM−CSF(100ng/ml)の存在下で培養した。KIF20A(809−833)LP(50μg/ml)およびOK432を5日目に添加した。LPをロードした成熟DCを7日目に回収し、洗浄して、ELISPOTアッセイにおけるAPCとして使用した。
HNMTを有する患者または健常ドナーからの新鮮PBMCを、5%ヒト補体除去血漿を添加した最終容量2mlのAIM−V中、KIF20A(60−84)LPとKIF20A(809−833)LP(各々10μg/mL)の混合物と共に37℃で培養した(2×106細胞/ウェル、24ウェルプレート);rhIL−2およびrhIL−7の両方を0日目と2日目に添加した。1週間の細胞培養後、PBMCを回収し、洗浄して、KIF20A(60−84)LP、KIF20A(809−833)LPまたは対照LPと共にELISPOTプレートで(1×105細胞/ウェル)18時間培養した。スポット形成細胞/105細胞として表したKIF20A−LP特異的Th細胞の数を、対照値(バックグラウンド)を差し引いた後に算出した。IFN−γスポットの平均数が15より多くかつバックグラウンドの2倍を上回る場合は、応答を陽性と採点した。患者の細胞に関するELISPOTアッセイは、使用可能な細胞の数が限られていたため、1連、2連または3連のウェルで実施した。
この試験は、探索的研究の原則(exploratory research principles)の下で活動する研究室で行い、研究プロトコルを用いて実施した。本発明者らは、ヒトT細胞アッセイに関する枠組みを報告した「T細胞アッセイについての最小限情報(Minimal Information About T−cell Assay)」(MIATA)の推奨(Britten CM et al.,Immunity 2012;37:1−2)に同意する。
データは、両側スチューデントt検定(棒グラフ)またはノンパラメトリックのマン−ホイットニーU検定(散布点グラフ)によって比較した。すべての検定についてP値<0.05の差を統計的に有意とみなした。
KIF20AのCTLエピトープを含む潜在的なプロミスキャスHLAクラスII結合ペプチドの予測および選択
KIF20Aの潜在的なプロミスキャスHLAクラスII結合Th細胞エピトープを同定するため、本発明者らは、最初に、図1Aおよび表2に示すコンピュータアルゴリズム(Wang P,et al.BMC Bioinformatics;11:568.14.;Wang P,et al.PLoS Comput Biol 2008;4:e1000048)を用いることによってKIF20Aのアミノ酸配列を検討した。興味深いことに、KIF20Aタンパク質配列の2つの領域(KIF20A(60−84)およびKIF20A(809−833))が、コンピュータアルゴリズムによって潜在的なプロミスキャスHLAクラスII結合ペプチドであると予測され、ならびにこれらの両方がCTLエピトープに非常に近位であることが見出された(図1B)。それゆえ、本発明者らは、複数の高頻度のHLAクラスII分子、HLA−DR4、HLA−DR15およびHLA−DR53についてオーバーラップする高いコンセンサスパーセンタイル順位を有し、かつHLA−A2またはHLA−A24拘束性CTLによって認識される天然の9merまたは10merペプチドを含む、2つの候補LP(KIF20A(60−84)およびKIF20A(809−833))をその後の分析のために選択し、合成した。CTLエピトープを含まないが、複数のHLAクラスII分子についてオーバーラップする高いコンセンサスパーセンタイル順位を有する、その他の2つのLPであるKIF20A(494−517)およびKIF20A(843−863)も合成し、これらのLPがKIF20A特異的Th細胞を生成することができるかどうかを評価した。
本発明者らはまた、CTLエピトープを含まない他の2つの選択した合成LP、KIF20A(494−517)およびKIF20A(843−863)がKIF20A特異的Th細胞を生成することができるかどうかも評価した。これら2つのLPは、2名の健常ドナーからHLA−DR拘束性およびペプチド特異的Th細胞を誘導することができた(図2D、E)。
KIF20Aペプチド誘導性Th細胞をさらに特徴づけるため、本発明者らは、Bio−Plexシステムにより、コグネイトペプチドでのKIF20A特異的バルクCD4+Th細胞株の刺激に応答したいくつかのサイトカインを測定した。ドナーHDK1からの2つのKIF20A特異的バルクTh株は、コグネイトペプチドでパルスしたPBMC(KIF20A(60−84))またはL−DR53(KIF20A(809−833))での再刺激により、大量のIFN−γ、TNF−α、GM−CSF、MIP1βおよびIL−2を産生したが、IL−4およびIL−17の産生はより少なく、Th1の分極特性を示した(図3A)。
興味深いことに、抗ウイルス性CD4+エフェクターおよび腫瘍浸潤性リンパ球について示されたように(Casazza JP,et al.J Exp Med 2006;203:2865−77;Attig S,et al.Cancer Res 2009;69:8412−9;Widenmeyer M,et al.Int J Cancer;131:140−9)、細胞傷害性マーカーCD107aも、コグネイトペプチドで刺激したKIF20A特異的バルクTh細胞株上で検出することができた(図3B)。全体として、これらのデータは、KIF20A特異的Th細胞がヘルパー機能および直接の細胞傷害活性を及ぼすことができることを示唆し、これらはどちらもがん免疫療法アプローチのために好都合である。
本発明者らは、自己DCがKIF20Aタンパク質を取り込み、プロセシングして、KIF20A由来ペプチド特異的Th1細胞クローンを刺激することができるかどうかを評価することへと進んだ。KIF20A(60−84)LPをロードした成熟DCを調製し、IFN−γ ELISPOTアッセイにおけるAPCとして使用した。図4Aに示すように、HLA−DR15拘束性KIF20A(60−84)反応性Th細胞クローンは、KIF20Aタンパク質をロードしたDCを効率的に認識し、IFN−γを特異的に産生したが、対照タンパク質をロードしたDCまたはタンパク質をロードしていないDCは認識しなかった。加えて、DCによって提示される天然にプロセシングされたKIF20A抗原を認識するこのTh細胞クローンの能力は、抗HLA−DR抗体によって有効にブロックされたが、対照抗HLAクラスI抗体ではブロックされず、エピトープがHLA−DR15分子を介して提示されることを確認した。HLA−DP2拘束性およびKIF20A(60−84)反応性Th細胞クローンを用いて同様の分析を実施した。このTh細胞クローンは、KIF20Aタンパク質ロードDCを特異的に認識し、Th細胞クローンのIFN−γ産生は抗HLA−DP mAbの添加によって有意に阻害されたが、抗HLAクラスI mAbでは阻害されず、HLA−DP2拘束性Th細胞エピトープも、DCにおいてKIF20Aタンパク質から天然にプロセシングされることを示唆した(図4B)。
要約すると、全体的な結果は、Th細胞エピトープ、KIF20A(60−84)およびKIF20A(809−833)がKIF20Aタンパク質からDCによって天然にプロセシングされ、DCの細胞表面でHLAクラスII分子によって提示されることを示す。
次に、KIF20A−A24(66−75)SP特異的CD8+T細胞の増殖を刺激するKIF20A(60−84)LPの能力を検討した。7μMのKIF20A(60−84)LPでのPBMCの2回の刺激は、テトラマー標識によって測定した場合、培養ウェルの大部分において7μMのKIF20A−A24(66−75)SPでのPBMCの刺激と同様にHLA−A24拘束性KIF20A−A24(66−75)SP特異的CD8+T細胞の増殖を誘導した(図5A)。CD8+テトラマー+細胞の絶対数も、KIF20A−A24(66−75)SPでのPBMCの刺激と同様にKIF20A(60−84)LPでのPBMCの刺激によって有意に増加した(図5B)。重要な点として、KIF20A(60−84)LPで刺激したPBMCの培養ウェルのKIF20A−A24(66−75)SP特異的IFN−γ産生が検出された(図5C)。
本発明者らはまた、KIF20A−LPがKIF20A−A2(809−817)SP特異的CTLの誘導を増強することができるかどうかを試験した。HLA−A2+/DP2+/DR53+ドナー(HDK1)からのPBMCをKIF20A−A2(809−817)SP単独(SP)で刺激した場合、KIF20A−A2(809−817)SP特異的テトラマー+細胞の頻度はCD8+T細胞の0.24%であった(データは示していない)。SP培養物へのKIF20A(60−84)LPの添加(SP+LP)は、テトラマー+細胞の頻度のわずかな上昇を誘導した。これに対し、PBMCをKIF20A−A2(809−817)SP、KIF20A(60−84)LPおよびKIF20A(60−84)LP特異的Thクローン(SP+LP+Thクローン)で共刺激した場合、KIF20A−A2(809−817)SP特異的CTLの頻度は0.87%に有意に上昇した(データは示していない)。
図7A〜Bに示すように、KIF20A−A2(809−817)SPを包含する、KIF20A(809−833)LP単独(LP)、またはSP培養物へのKIF20A(809−833)LPの添加(SP+LP)は、KIF20A−A2(809−817)SP特異的CTLの頻度のわずかな上昇を誘導した。他方で、KIF20A(809−833)LP特異的Thクローンは、KIF20A−A2(809−817)SPなしでLPおよびThクローンの両方をPBMCに添加した場合(LP+Thクローン)、KIF20A(809−833)LPに応答して速やかに増加し、その後KIF20A−A2(809−817)SP特異的CTLの頻度の上昇は検出できなかった。本発明者らはまた、KIF20A−A2(809−817)SP、KIF20A(809−833)LPおよびKIF20A(809−833)LP特異的Thクローン(SP+LP+Thクローン)でのPBMCの刺激が、KIF20A−A2(809−817)SP特異的テトラマー+T細胞の誘導を最も強力に増強することを認めた。これらの結果は、活性化Th1細胞がKIF20A−A2(809−817)SPの存在下でKIF20A特異的CTLの誘導を増強したことを示す。
次に、本発明者らは、KIF20A(809−833)LPがインビトロでLPロードDCによってKIF20A−A2(809−817)SP特異的CTLを刺激することができるかどうかを評価した。これを確認するため、本発明者らは、以前に述べられているように(Tomita Y,et al.Cancer Sci;102:71−8)KIF20A−A2(809−817)SPでの刺激によってHLA−A2陽性ドナーに由来する末梢血CD8+T細胞からKIF20A−A2(809−817)SP特異的CTLを生成した。生じたCTL株におけるKIF20A−A2(809−817)SPに特異的なCD8+T細胞の頻度をIFN−γ ELISPOTアッセイによって検査した(図6A)。
インビボでKIF20A−A24(66−75)SP特異的CTLをプライミングするKIF20A(60−84)LPの能力をエクスビボIFN−γ ELISPOTアッセイによって検討した。HLA−A24 TgmをKIF20A(60−84)LPで3回免疫した。KIF20A(60−84)LPでワクチン接種したHLA−A24 TgmのCD8+T細胞は、KIF20A−A24(66−75)SPでパルスしたBM−DCでの刺激に応答してIFN−γを産生した(図6C)。これらの結果は、KIF20A(60−84)LPの取込み後、APCがインビトロおよびインビボでKIF20A−A24(66−75)SP特異的CTLをクロスプライミングすることを示唆する。
我々の知る限りでは、HNMTにおけるKIF20A発現を検討した試験はない。KIF20A発現の免疫組織化学分析をHNMTの56症例(扁平上皮がん39例、腺様嚢胞がん14例、骨肉腫2例、および血管肉腫1例の組織標本)に関して実施した。39例の頭頸部扁平上皮がんのうち26例(67%)、14例の腺様嚢胞がんのうち4例(29%)、および2例の骨肉腫のうち1例(50%)はKIF20Aの陽性発現を示した。良性腫瘍試料では染色は検出されなかった。
最も魅力的なワクチン化合物は、治療的CD4+およびCD8+応答を誘導することができるTAAの配列に対応する合成LPであると考えられる(Kenter GG,et al.N Engl J Med 2009;361:1838−47;Melief CJ and van der Burg SH.Nat Rev Cancer 2008;8:351−60)。これらのLPの注射後、患者のDCがLPを取り込み、プロセシングして、様々なHLAクラスI分子およびHLAクラスII分子に関連するすべての可能なCTLエピトープおよびThエピトープをそれぞれ提示と考えられる。したがって、本発明者らは、がん免疫療法のための理想的なペプチドワクチンは、集団における高頻度のHLAによって拘束されるCTLおよびTh1細胞の両方を誘導することができる単一ポリペプチドであるべきだと考えた。
この試験において、本発明者らは、プロミスキャスなHLAクラスII拘束性Th1細胞によって認識されるCTLエピトープを含む2つのKIF20A由来のLPを同定したが、LPによって誘導されるこれらのTh1細胞は、樹状細胞(DC)の存在下で組換えKIF20Aタンパク質に応答し、このTh1細胞エピトープがDCにおいて天然にプロセシングされ得ることを指し示した。興味深いことに、CTLエピトープを含むこれらのTh1エピトープはKIF20A特異的CTLを刺激することができ、CTLエピトープを含むこれらのLPがインビトロヒト培養系においてKIF20A特異的CTLに交差提示されたことを示唆した。
結論として、本発明者らは、KIF20A特異的Th1細胞だけでなくKIF20A特異的CTLも増殖させ、活性化するために良好なツールとなる、CTLエピトープを含むKIF20A由来のヘルパーペプチドを初めて同定した。これらの所見は、今後、様々な種類のがんを有する患者のためのKIF20Aペプチドに基づく免疫療法の臨床試験に寄与するであろう。
さらに、好ましい態様では、本発明のペプチドはまた、Th1細胞だけでなく、KIF20A発現細胞に対するCTLも誘導することができる。本発明のそのようなペプチドはまた、KIF20Aに関連する疾患、例えばがん、より詳細には膀胱がん、乳がん、胆管細胞がん、食道がん、非小細胞肺がん(NSCLC)、膵がん、前立腺がん、腎がん、小細胞肺がん(SCLC)および頭頸部悪性腫瘍(HNMT)の治療のためにも有用であり得る。
Claims (17)
- 配列番号:11のアミノ酸配列の一部を含む30アミノ酸以下の単離されたペプチドであって、
(a)配列番号:1、2、3または4のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列;および
(b)(a)のアミノ酸配列において1または2個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含み、Tヘルパー1型(Th1)細胞を誘導する能力を有する、ペプチド。 - 前記ペプチドが少なくとも2種類のMHCクラスII分子に結合する能力を有する、請求項1に記載の単離されたペプチド。
- 前記MHCクラスII分子が、HLA−DR4、HLA−DR15、HLA−DR53およびHLA−DP2から成る群より選択される、請求項2に記載の単離されたペプチド。
- KIF20A特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)誘導能を有する配列番号:1または2のアミノ酸配列を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の単離されたペプチド。
- (a)配列番号:1、2、3および4から成る群より選択されるアミノ酸配列;および
(b)(a)のアミノ酸配列において1または2個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列
から成る群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項1に記載の単離されたペプチド。 - 配列番号:1、2、3および4から成る群より選択されるアミノ酸配列からなる請求項1に記載のペプチド。
- 請求項1から6のいずれか一項に記載のペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
- (i)Th1細胞、
(ii)CTL、
(iii)Th1細胞を誘導する能力を有する抗原提示細胞(APC)、および
(iv)CTLを誘導する能力を有するAPC
から成る群より選択される細胞の少なくとも1つを誘導するための組成物であって、請求項1から6のいずれか一項に記載の1つもしくは複数のペプチド、またはそれらをコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む、組成物。 - (a)請求項1から6のいずれか一項に記載の1つまたは複数のペプチド;
(b)請求項7に記載の1つまたは複数のポリヌクレオチド;
(c)請求項1から6のいずれか一項に記載のペプチドを自らの表面に提示する1つまたは複数のAPC;
(d)請求項1から6のいずれか一項に記載のペプチドを自らの表面に提示するAPCを認識する1つまたは複数のTh1細胞;および
(e)前記(a)から(d)の任意の2つまたはそれ以上の組合せ
から成る群より選択される少なくとも1つの有効成分を含有し、ならびに
(i)がんの治療、
(ii)がんの予防、
(iii)がんにおける術後再発の予防、および
(iv)前記(i)から(iii)の任意の2つまたはそれ以上の組合せ
から成る群より選択される目的のために製剤化されている、医薬組成物。 - MHCクラスII分子としてHLA−DR4、HLA−DR15、HLA−DR53およびHLA−DP2から成る群より選択される少なくとも1つを有する対象への投与用に製剤化されている、請求項9に記載の医薬組成物。
- CTL誘導能を有する1つまたは複数のペプチドをさらに含有する、請求項8または9に記載の医薬組成物。
- MHCクラスII分子によって媒介される免疫応答を増強するための組成物であって、
(a)請求項1から6のいずれか一項に記載の1つまたは複数のペプチド;
(b)請求項7に記載の1つまたは複数のポリヌクレオチド;
(c)請求項1から6のいずれか一項に記載のペプチドを自らの表面に提示する1つまたは複数のAPC;
(d)請求項1から6のいずれか一項に記載のペプチドを自らの表面に提示するAPCを認識する1つまたは複数のTh1細胞;および
(e)前記(a)から(d)の任意の2つまたはそれ以上の組合せ
から成る群より選択される少なくとも1つの有効成分を含有する、組成物。 - Th1細胞を誘導する能力を有するAPCを誘導するための方法であって、APCを請求項1から6のいずれか一項に記載のペプチドとインビトロで接触させる段階を含む方法。
- Th1細胞をインビトロで誘導するための方法であって、
(a)CD4陽性T細胞を、MHCクラスII分子と請求項1から6のいずれか一項に記載のペプチドとの複合体を自らの表面に提示するAPCと共培養する段階;および
(b)T細胞受容体(TCR)サブユニットの両方をコードするポリヌクレオチド、またはTCRサブユニットの各々をコードするポリヌクレオチドをCD4陽性T細胞に導入する段階であって、ここでTCRが、細胞表面に提示されるMHCクラスII分子と請求項1から6のいずれか一項に記載のペプチドとの複合体に結合することができる、段階
から成る群より選択される段階を含む方法。 - CTLをインビトロで誘導するための方法であって、
(a)CD4陽性T細胞およびCD8陽性T細胞の両方を、請求項4または5に記載のペプチドと接触させたAPCと共培養する段階;ならびに
(b)CD8陽性T細胞を、請求項4または5に記載のペプチドと接触させたAPCと共培養する段階
から成る群より選択される段階を含む方法。 - MHCクラスII分子と請求項1から6のいずれか一項に記載のペプチドとの複合体を自らの表面に提示する、単離されたAPC。
- APCの表面に提示された請求項1から6のいずれか一項に記載のペプチドを認識する、単離されたTh1細胞。
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