CN109908176A

CN109908176A - 免疫效应细胞和辐射联用在治疗肿瘤中的用途

Info

Publication number: CN109908176A
Application number: CN201811517548.8A
Authority: CN
Inventors: 李宗海; 周敏
Original assignee: Keji Biomedical (shanghai) Co Ltd; Shanghai Cancer Institute
Current assignee: Clegg Medical Co ltd
Priority date: 2017-12-12
Filing date: 2018-12-12
Publication date: 2019-06-21
Also published as: WO2019114762A1

Abstract

本发明涉及一种治疗肿瘤的方法。具体提供了免疫效应细胞和辐射联用在治疗肿瘤中的用途，以及对患有肿瘤的个体施用免疫效应细胞和局部辐射联合进行治疗的方法，并且该方法对所述的个体不进行淋巴细胞清除，所述免疫效应细胞包含识别所述肿瘤的肿瘤抗原的受体。经试验证实：本发明提供的治疗肿瘤的方法对实体瘤具有显著的抗肿瘤效果，在没有淋巴细胞清除预处理的情况下，不清淋CAR‑T细胞治疗联合局部放疗可以获得比清淋CAR‑T治疗更好的治疗效果，大大地提高抗肿瘤疗效。

Description

免疫效应细胞和辐射联用在治疗肿瘤中的用途

技术领域

本发明属于免疫治疗领域，具体涉及具有靶向识别肿瘤抗原且引发细胞活化的受体的免疫效应细胞和肿瘤局部辐射治疗联合应用于肿瘤治疗。

背景技术

过继免疫细胞治疗如嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞(CAR-T)治疗已经有望成为肿瘤特别是恶性肿瘤的重要治疗手段，但是所采用的免疫效应细胞仍然面临如何在体内扩增、提高抗肿瘤的活性等问题。

现有文献表明淋巴细胞清除(清淋)预处理能增加免疫效应细胞如CAR-T细胞或TIL的体内扩增以及其抗肿瘤活性，并且近来通过对大规模的 CD19-CAR-T细胞治疗血液恶性肿瘤的临床实验数据的分析发现，接受清淋预处理组对CD19-CAR-T细胞治疗的应答为88％，远远高于未接受清淋预处理组的32％(Am J Cancer Res(2016)；6(2):403-424)。在2017年上市的2个针对CD19的CAR-T细胞治疗产品(诺华制药的Kymriah和凯特制药的Yescarta (KTE-C19))的说明书上也均明确注明给予CD19-CAR-T细胞治疗前要先进行去除淋巴细胞处理(包括氟达拉滨和环磷酰胺淋巴细胞的去除淋巴细胞方案)。

然而清淋预处理也有可能影响到过继免疫细胞治疗效果，并且有可能参与形成细胞因子风暴，而且还会产生严重的骨髓抑制等毒性反应，特别是在实体肿瘤治疗中，采用清淋预处理后CAR-T细胞的疗效并不显著(Zhang et al.,“Phase I Escalating-Dose Trialof CAR-T Therapy Targeting CEA+Metastatic Colorectal Cancers”,MolecularTherapy(2017),25(5):1248-1258)，并且还有报道采用清淋预处理加ERBB2-CAR-T治疗结肠转移癌过程中出现细胞因子风暴，导致患者死亡(Molecular Therapy vol.18 no.4,843–851apr.2010)。

因此，能否找到不清淋预处理，并且能明显提高过继免疫细胞疗效的手段无疑是非常有价值的。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种肿瘤治疗方法，该方法对有癌症的个体施用免疫效应细胞和肿瘤局部辐射联合进行治疗，并且对所述的个体不进行淋巴细胞清除，所述免疫效应细胞包含识别所述肿瘤的肿瘤抗原且引发所述免疫效应细胞活化的受体。

在本发明的治疗方法中，免疫效应细胞施用和肿瘤局部辐射治疗给予时间不分先后；可以先给予肿瘤局部辐射治疗再给予免疫效应细胞施用；也可以同时给与；还可以先给予免疫效应细胞施用再给予肿瘤局部辐射治疗。本发明中，所述受体选自：嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)、 T细胞受体(T cell receptor，TCR)、T细胞融合蛋白(T cell fusionprotein， TFP)、T细胞抗原耦合器(T cell antigen coupler，TAC)或其组合。

本发明中，所述肿瘤局部辐射治疗为采用辐射治疗设备对所述肿瘤进行辐射，优选的，所述的辐射治疗设备通过产生下述任一射线对所述肿瘤进行辐射：X射线、α射线、β射线、γ射线、中子。

本发明中，所述辐射治疗设备产生X射线，所述X射线对所述的肿瘤进行至少1次辐射，或多次小剂量辐射。

本发明中，所述辐射治疗的射线剂量为介于不高于100Gy之间，优选地不高于80Gy，更为优选地为不高于70Gy。

本发明中，所述的辐射治疗的能量源位于所述个体的体内或体外。

本发明中，所述的嵌合抗原受体包括：

(i)特异性结合所述抗原的抗体或其片段、CD28或CD8的跨膜区、CD28 的共刺激信号结构域和CD3ζ；或

(ii)特异性结合所述抗原的抗体或其片段、CD28或CD8的跨膜区、 CD137的共刺激信号结构域和CD3ζ；或

(iii)特异性结合所述抗原的抗体或其片段、CD28或CD8的跨膜区、 CD28的共刺激信号结构域、CD137的共刺激信号结构域和CD3ζ。

本发明中，所述肿瘤抗原选自：促甲状腺激素受体(TSHR)；CD171；CS-1； C型凝集素样分子-1；神经节苷脂GD3；Tn抗原；CD19；CD20；CD 22；CD 30；CD 70；CD 123；CD 138；CD33；CD44；CD44v7/8；CD38；CD44v6； B7H3(CD276)，B7H6；KIT(CD117)；白介素13受体亚单位α(IL-13Rα)；白介素11受体α(IL-11Rα)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；癌胚抗原(CEA)；NY-ESO-1；HIV-1Gag；MART-1；gp100；酪氨酸酶；间皮素；EpCAM；蛋白酶丝氨酸21(PRSS21)；血管内皮生长因子受体,血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；路易斯(Y)抗原；CD24；血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；细胞表面相关的粘蛋白1(MUC1)，MUC6；表皮生长因子受体家族及其突变体 (EGFR，EGFR2，ERBB3，ERBB4，EGFRvIII)；神经细胞粘附分子(NCAM)；碳酸酐酶IX(CAIX)；LMP2；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸基路易斯粘附分子(sLe)；神经节苷脂 GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer；TGS5；高分子量黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；邻乙酰基GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体；肿瘤血管内皮标记1(TEM1/CD248)；肿瘤血管内皮标记7相关的(TEM7R)； Claudin 6，Claudin18.2、Claudin18.1；ASGPR1；CDH16；5T4；8H9；αv β6整合素；B细胞成熟抗原(BCMA)；CA9；κ轻链(kappa light chain)； CSPG4；EGP2，EGP40；FAP；FAR；FBP；胚胎型AchR；HLA-A1，HLA-A2； MAGEA1，MAGE3；KDR；MCSP；NKG2D配体；PSC1；ROR1；Sp17； SURVIVIN；TAG72；TEM1；纤连蛋白；腱生蛋白；肿瘤坏死区的癌胚变体； G蛋白偶联受体C类5组-成员D(GPRC5D)；X染色体开放阅读框 61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH glycoceramide的己糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；uroplakin 2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；pannexin 3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物基因座K9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；ETS易位变异基因6 (ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie2)；黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；p53突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；细胞凋亡的黑素瘤抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；V-myc鸟髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生的同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员 C(RhoC)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC结合因子(锌指蛋白)样 (BORIS)；由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；配对盒蛋白 Pax-5(PAX5)；proacrosin结合蛋白sp32(OYTES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚定蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤X断点2(SSX2)；CD79a； CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段 (FCAR)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有EGF样模块粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。

本发明中，所述的免疫效应细胞选自特异识别EGFR、EGFRvIII、GPC3、Claudin18.2的CAR-T细胞。

本发明中，所述的特异性识别肿瘤抗原的抗体具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

本发明中，所述的嵌合抗原受体具有SEQ ID NO:11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26所示的氨基酸序列。

本发明中，所述的免疫效应细胞施用在所述的肿瘤局部辐射治疗之后当天，或1天、2天、或3天后。

本发明所述的方法中，还包括给所述个体施用免疫检查点(immune checkpoint)抑制剂；优选地，所述免疫检查点抑制剂是生物学治疗剂或小分子；更优选地，所述免疫检查点抑制剂选自单克隆抗体、人源化抗体、全人抗体、融合蛋白或其组合。其中所述免疫检查点抑制剂针对的免疫检查点选自下述的免疫检查点蛋白质：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、 BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、 CHK 1、CHK2、A2aR和B-7家族配体或其组合；优选地，所述免疫检查点抑制剂是PD-1或PDL-1抑制剂。优选的，所述免疫检查点抑制剂与选自下述的免疫检查点蛋白质的配体相互作用：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、 B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、 CGEN-15049、CHK 1、CHK2、A2aR和B-7家族配体或其组合。

本发明中，所述免疫效应细胞选自特异识别EGFR、EGFRvIII、GPC3、Claudin18.2的CAR-T细胞，所述免疫检查点抑制剂为特异识别PD-1或PD-L1 的单克隆抗体。

本发明所述的方法中，包括在所述肿瘤局部辐射治疗之前、同时或之后，或在所述免疫效应细胞治疗之前、同时或之后，给予所述个体施用所述免疫检查点抑制剂；优选地，所述免疫效应细胞和所述免疫检查点抑制剂同时施用。

本发明中，所述方法的治疗效应通过免疫效应细胞的存在、或指示T细胞炎症的基因标记的存在或其组合预测，优选地，通过检测IFN-γ水平变化来预测。

本发明中，所述肿瘤包括：乳腺癌，血液癌症，结肠癌，直肠癌，肾细胞癌，肝癌，肺的非小细胞癌，小肠癌，食道癌，黑素瘤，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，脑胶质瘤，头颈癌，皮肤或眼内恶性黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛区癌，胃癌，睾丸癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，阴户癌，霍奇金氏病，非霍奇金淋巴瘤，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，儿童实体瘤，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾盂癌，中枢神经系统(CNS)瘤，原发性CNS淋巴瘤，肿瘤血管发生，脊椎肿瘤，脑干神经胶质瘤，垂体腺瘤，卡波西肉瘤，表皮样癌，鳞状细胞癌，T细胞淋巴瘤，环境诱发的癌症，所述癌症的组合和所述癌症的转移性病灶。

本发明中，所述的免疫效应细胞包括：T细胞、B细胞、自然杀伤(NK) 细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞或骨髓源性吞噬细胞或其组合；优选地，所述免疫效应细胞选自自体T细胞、同种异体T细胞或同种异体NK细胞，更优选地，所述T细胞为自体T细胞。

另外，本发明的目的之二在于，提供了在不清淋的情况下，将免疫效应细胞与辐射源联合应用治疗癌症的用途。

本发明的另一目的在于，提供一种肿瘤的联合治疗系统，其特征在于，所述联合治疗系统为由对患有肿瘤的个体施用免疫效应细胞和肿瘤局部放射治疗的仪器构成的联合治疗系统，并且对所述的个体不进行淋巴细胞清除，所述免疫效应细胞包含识别所述肿瘤的肿瘤抗原的受体。

在具体实施方式中，所述的放射源包括α放射源、β放射源、γ放射源和中子源等。

在具体实施方式中，所述的放射源是射线装置，该射线装置为直线加速器；优选地，所述直线加速器产生X射线和电子线。

本发明的再一个目的在于，提供免疫效应细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用，所述免疫效应细胞包含识别所述肿瘤的肿瘤抗原的受体，所述药物与肿瘤局部辐射治疗联合施用，包括同时或先后施用，患有所述肿瘤的个体接受所述免疫效应细胞和/或所述肿瘤局部辐射治疗时体内淋巴细胞数目相对于入组所述肿瘤治疗时不低于40％。

此外，本发明还提供免疫效应细胞在制备一种用于联合治疗肿瘤的方法的药物中的应用，所述方法包括肿瘤的局部辐射治疗与所述药物同时或先后使用，所述免疫效应细胞包含识别所述肿瘤的肿瘤抗原的受体，患有所述肿瘤的个体接受所述联合治疗肿瘤的方法时体内淋巴细胞数目相对于入组所述肿瘤治疗时不低于40％。

本发明的技术效果

1、提高对放疗、化疗或放化疗联合治疗不敏感的癌症患者或治疗后复发、以及对CAR-T治疗不敏感或治疗后复发的癌症患者的抗癌效果。

2、避免进行清淋预处理，从而避免了清淋预处理所引起的机体免疫系统破坏、正常组织造成的损伤等副作用。

3、不论肿瘤局部辐射治疗在施用CAR-T细胞之前还是之后都能够提高联合治疗的抗肿瘤活性；在一些实施例中，肿瘤局部辐射治疗联合CAR-T施用能到达使用清淋预处理后的CAR-T细胞的抗肿瘤效果，在一些实施例中，肿瘤局部辐射治疗联合CAR-T施用甚至优于使用清淋预处理后的CAR-T细胞的抗肿瘤效果，体现在显著抑制肿瘤生长、显著延长个体生存期等方面。在一些实施例中，先给予肿瘤局部辐射再施用CAR-T细胞能显著提高联合治疗的抗肿瘤活性，体现在能更显著的抑制肿瘤生长、延长个体生存。在一些实施例中，相对于肿瘤局部辐射治疗数天后(如间隔1天)再施用CAR-T细胞，肿瘤局部辐射治疗后短时间内(如当天)施用CAR-T细胞能显著提高联合治疗的抗肿瘤效果，体现在抑制肿瘤生长、延长个体生存期且肿瘤消退等。在一些实施例中，小剂量、多次的给与肿瘤局部辐射治疗也能够提高与 CAR-T细胞联用的抗肿瘤作用，体现在抑制肿瘤生长、延长个体生存期等。在一些实施例中，肿瘤局部辐射疗法、CAR-T细胞施用和PD-L1抗体联用具有更好的抑制肿瘤的效果。

附图说明

图1A为重组载体MSCV-EGFRvIII-m28Z质粒图；图1B为小鼠清淋模型建立的检测。

图2A显示了未清淋的肿瘤局部辐射治疗与EGFRvIII-m28Z CAR-T细胞联合治疗结肠癌的体内肿瘤生长抑制结果；图2B显示了未清淋的肿瘤局部辐射治疗与EGFRvIII-m28ZCAR-T细胞联合治疗与清淋预处理施用CAR-T 细胞治疗的体内肿瘤生长抑制结果比较。

图3显示了肿瘤局部辐射治疗与EGFRvIII-m28Z CAR-T细胞联合治疗结肠癌的体内肿瘤抑制率结果。

图4A显示了未清淋的肿瘤局部辐射治疗与EGFRvIII-m28Z CAR-T细胞联合治疗小鼠结肠癌的生存期结果；图4B显示了未清淋的肿瘤局部辐射治疗与EGFRvIII-m28Z CAR-T细胞联合治疗与清淋预处理后施用CAR-T治疗结肠癌的生存期的比较。

图5显示了肿瘤局部辐射治疗与EGFRvIII-m28Z CAR-T细胞联合治疗小鼠结肠癌的血浆IFN-γ浓度检测。

图6A显示了肿瘤局部辐射治疗与EGFRvIII-m28Z CAR-T细胞联合治疗 C57BL/6小鼠原位乳腺癌的体内肿瘤生长抑制实验；图6B显示了肿瘤局部辐射治疗与EGFRvIII-m28ZCAR-T细胞联合治疗C57BL/6小鼠原位乳腺癌的生存期检测。

图7A显示了肿瘤局部辐射治疗与EGFRvIII-m28Z CAR-T细胞联合治疗 Balb/c小鼠原位乳腺癌的体内肿瘤生长抑制实验；图7B显示了肿瘤局部辐射治疗与EGFRvIII-m28ZCAR-T细胞联合治疗Balb/c小鼠原位乳腺癌的生存期检测。

图8A和B显示了肿瘤局部辐射治疗与EGFRvIII-m28Z CAR-T细胞施用间隔时间对治疗C57BL/6小鼠原位乳腺癌影响：图8A为肿瘤体积检测；图8B 为小鼠生存期检测。

图9A和B显示了小剂量、多次给与肿瘤局部辐射治疗与EGFRvIII-m28Z CAR-T细胞施用对治疗Balb/c小鼠原位乳腺癌影响：其中，图9A为肿瘤体积检测；图9B为小鼠生存期检测。

图10A和B显示了局部辐射治疗与EGFRvIII-m28Z CAR-T细胞、免疫检查点抑制剂联合应用对脑胶质瘤皮下移植瘤的抗肿瘤治疗作用：图10A为实验流程图；图10B为肿瘤生长抑制实验。

具体实施方式

本发明涉及具有靶向识别肿瘤抗原且引发细胞活化的受体的免疫效应细胞和局部辐射治疗联合应用于治疗肿瘤，应理解本发明并不限于所述的方法和实验条件，因为这样的方法和条件可以改变。

本公开内容至少部分源于下述开创性认知：连续地、以任一次序地或基本上同时地包括肿瘤局部辐射治疗和免疫效应细胞治疗的一个或多个周期和/或剂量的组合治疗方案在治疗一些受试者中的癌症中可以是更有效的，和 /或可以起始、使实现、增加、增强或延长免疫细胞的活性和/或数目，或通过肿瘤的医学有益应答。

术语“免疫效应细胞”，是指参与免疫应答，例如，促进免疫效应的细胞。免疫效应细胞的实例包括T细胞，例如，α/β的T细胞和γ/δT细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞和骨髓源性吞噬细胞。优选地，所述T细胞包括自体T细胞、异种T细胞、同种异体T细胞，所述的自然杀伤细胞是同种异体NK细胞。正如本文中使用的那样，术语“免疫效应功能或免疫效应应答”是指免疫效应细胞，例如增强或促进靶细胞的免疫攻击的功能或反应。例如，免疫效应功能或应答是指促进靶细胞的杀伤或者抑制生长或增殖的T细胞或NK细胞的属性。

术语“局部辐射治疗”或“局部辐射处理”或“局部放射治疗”在本发明中具有相同含义，当射线辐射身体某一部位，引起局部细胞的反应者称局部辐射治疗，包括例如，分次辐射治疗、非分次辐射治疗和超分次辐射治疗。局部辐射治疗还包括采用辐射治疗设备对所述肿瘤进行辐射，在具体实施方案中，所述的辐射治疗设备通过产生下述任一射线对所述肿瘤进行辐射：X 射线、α射线、β射线、γ射线、中子。还包括根据所有可利用的技术可完成的、通过电离辐射的所有抗肿瘤治疗：其非限制性列表包括：分次放射治疗、加速辐射、强度调制的放射疗法、图像引导放射治疗、外线束放射治疗、密封源放疗或近距离放射疗法、非密封源放疗、三维适形放射疗法、质子治疗等。局部辐射治疗还可以采用位于所述个体的体内的能量源进行辐射治疗。

术语“个体”和“受试者”在本文中具有同等含义，可以是人和来自其他种属的动物。

放射线的来源可以位于受试者的外部或内部。当来源位于受试者的外部时，治疗就被称为外部射线束放射治疗(external beam radiation therapy， EBRT)也称为外照射，常使用γ射线、中子、X射线等穿透力强的射线，外照射的生物学效应强。当来源位于受试者的内部时，治疗就被称为近距离放射治疗(brachytherapy，BT)，也成为内照射，其作用主要发生在放射性物质通过途径和沉积部位的组织器官，但其效应可波及全身。内照射的效应以射程短、电离强的α、β射线作用为主。

放射线是根据众所周知的标准技术，使用为此目的制造的标准的设备 (即辐射治疗设备)进行施用的。放射线的剂量取决于数目众多的因素，这些都是在本工艺中众所周知的。这类因素包括待治疗的器官、位于放射通道中的可能被不注意地不良地影响的健康器官、患者对放射治疗的耐受性、以及需要治疗的身体区域。剂量典型地为介于不高于100Gy之间，优选的，不高于80Gy，更为优选地为不高于70Gy。所用剂量可以一次性给与，也可以分为小剂量、多次给与患者。应该强调的是，本发明并不局限于任何具体的剂量。剂量将由治疗的医师根据在一个给定的情形中的具体的因素，包括上述的因素来确定。

外部放射源和进入患者的点之间的距离可以是任何在杀死目标细胞和将副作用减到最小之间获得可接受平衡的距离。典型地，外部放射源和进入患者的点之间的距离介于70至100厘米之间。

近距离放射疗法通常是通过在患者中放置一个密封放射源来进行的。典型地，放射源放置于距离待治疗组织大约0～5厘米的地方。已知的方法包括间质近距离放射疗法、腔内近距离放射疗法、表面间质近距离放射疗法。放射源可以是永久性或者临时性植入的。已经被用于永久性种植体中的一些典型的放射性原子包括碘-125和氡。已经被用于临时性种植体中的一些典型的放射性原子包括铯-137和铱-192。

近距离放射疗法的放射剂量可以与上述的在外部射线束放射治疗中所用的剂量相同。除了上述的在确定外部射线束放射治疗剂量时所要考虑的因素之外，在确定近距离放射疗法剂量时还考虑了所使用的放射活性原子的特性。

免疫效应细胞施用是在辐射治疗之前、期间、以及之后施用的，也可以结合施用，即在放射治疗之前和期间、之前和之后、期间和之后、或者在之前、期间及之后施用的。在某些实施方案中，免疫效应细胞治疗在辐射治疗之前1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、 10小时、11小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20 天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、1个月或其任何组合施用。在某些实施方案中，免疫效应细胞治疗在辐射治疗施用之后1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9 天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20 天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、1个月或其任何组合施用。

术语“辐射治疗设备”就是发出放射线的装置。根据射线装置对人体健康和环境可能造成危害的程度，从高到低将射线装置分为Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类。按照使用用途分医用射线装置和非医用射线装置。射线装置包括：1).加速电荷粒子的装置，例如：回旋加速器、电磁感应加速器以及各种加速装置等。 2).发射X射线的装置，例如X射线发生装置、X射线衍射仪、X射线荧光分析仪等。3).盛载放射性物质的装置。

常见的医用射线装置包括：医用加速器，放射治疗用，X射线电子束加速器，重离子治疗加速器，质子治疗装置，制备正电子发射计算机断层显像装置(PET)用放射性药物的加速器，其他医用加速器，X射线深部治疗机，数字减影血管造影装置，医用X射线CT机，放射诊断用普通X射线机，X射线摄影装置，牙科X射线机，乳腺X射线机，放射治疗模拟定位机，其它高于豁免水平的X射线机。

术语“治疗有效量”、“治疗有效的”、“有效量”或“以有效的量”在本文中可互换地使用，并且是指如本文中所述有效地实现特定生物学结果的化合物、制剂、物质或组合物的量，例如但不限于足以促进T细胞应答的量或剂量。当指示“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“抑制肿瘤有效量”或“治疗有效量”时，将要被施用的本发明的免疫效应细胞、免疫检查点抑制剂、治疗剂的精确数量可以由医师在考虑个体在年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及患者(受试者)的状况的情况下确定。有效量的局部辐射治疗是指但不限于与免疫效应细胞联用时能促进免疫效应细胞抗肿瘤活性增加、增强或延长；抗肿瘤免疫效应细胞或活化免疫效应细胞数目的增加；促进IFN-γ分泌；肿瘤消退、肿瘤缩小、肿瘤坏死的辐射剂量或辐射源。有效量的免疫效应细胞是指但不限于与局部辐射联用时能使免疫效应细胞抗肿瘤活性增加、增强或延长；抗肿瘤免疫效应细胞或活化免疫效应细胞数目的增加；促进IFN-γ分泌；肿瘤消退、肿瘤缩小、肿瘤坏死的免疫效应细胞的数量。

术语“不清淋”或“不进行淋巴细胞清除”，即不清除受试者体内的淋巴细胞。包括不给予淋巴细胞清除剂、全身辐射治疗或其组合或其他引起淋巴细胞数量清除的手段；以及在给予了淋巴细胞清除剂、全身辐射治疗或其组合或其他引起淋巴细胞数量清除的手段后，当受试者体内淋巴细胞清除率低于60％。

术语“淋巴细胞清除”或“清淋”即清除受试者在体内的淋巴细胞。包括给予淋巴细胞清除剂、全身辐射治疗或其组合。例如，为了增加肿瘤反应的免疫效应细胞(例如，结合EGFRvIII的CAR分子)的一个或多个细胞初始扩增和后期保持，在给予治疗有效量的CAR-T细胞或全身辐射治疗之前、同时、之后、或任一组合，可以单独或组合给予受试者一种或多种能够大幅度地清除受试者的淋巴细胞的药剂、全身辐射治疗或其组合。可以在足以实现受试者淋巴细胞清除率在60％～100％的条件下，给予清淋治疗。受试者中淋巴细胞的数量减少至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、 68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，则受试者的淋巴细胞被清除了。

淋巴细胞清除剂是抗肿瘤化学治疗剂。淋巴细胞清除剂的例子包括但不限于氟达拉滨、环磷酰胺或它们的组合。治疗医生根据待治疗的受试者能够选择具体的淋巴细胞清除剂及其适合的剂量，例如CAMPATH、抗CD3抗体、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、美法仑、环磷酰胺、氟达拉滨和全身辐射治疗。

免疫效应细胞施用是在清淋治疗之前、期间、以及之后施用的，也可以结合施用，即在清淋治疗之前和期间、之前和之后、期间和之后、或者在之前、期间及之后施用的。在某些实施方案中，清淋治疗在免疫效应细胞治疗之前1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、 10小时、11小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20 天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、1个月或其任何组合施用。在某些实施方案中，清林治疗在免疫效应细胞治疗施用之后1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、 10小时、11小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9 天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20 天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、1个月或其任何组合施用。

本文所用的“嵌合抗原受体”或“CAR”是指一组多肽，当其在免疫效应细胞中时，给所述的细胞提供针对靶细胞(通常是癌细胞)的特异性，并且具有细胞内信号产生。CAR通常包括至少一个细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞质信号传导结构域(本文中也称为“胞内信号传导结构域”)，其包括来源于如下定义的刺激性分子和/或共刺激性分子的功能信号传导结构域。在某些方面，多肽组彼此邻接。多肽组包括在存在二聚化分子时可以使多肽彼此偶联的二聚化开关，例如，可以使抗原结合结构域偶联至胞内信号传导结构域。在一个方面，刺激性分子为与T细胞受体复合体结合的ζ链。在一个方面，细胞质信号传导结构域进一步包括一种或多种来源于至少一个如下定义的共刺激性分子的功能性信号传导结构域。在一个方面，共刺激性分子选自本文所述共刺激性分子，例如4-1BB(即，CD137)、CD27和/或CD28。在一个方面，CAR包括嵌合融合蛋白，该融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含来源于刺激性分子的功能性信号传导结构域的胞内信号传导结构域。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白，该融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含来源于共刺激性分子的功能性信号传导结构域和来源于刺激性分子的功能性信号传导结构域的胞内信号传导结构域。在一个方面中，CAR包含嵌合融合蛋白，该融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含来源于一个或更多个共刺激性分子的两个功能性信号传导。本实施例选择EGFRvIII作为CAR-T细胞的靶点，为了更准确的验证小鼠体内的抗肿瘤效果，因此，选择的信号肽、跨膜区、胞内区等为鼠源的。制备的方法按照本领域常规的CAR-T细胞制备方法操作。作为示例性的，上述实施例选择鼠源的CAR，但其信号肽、铰链区、跨膜区等可以根据目的的不同选用其他种属。包括但不限于人的信号肽、铰链区、跨膜区、胞内区。抗体也可以根据不同的目的，选择针对不同靶点的鼠抗或者人源化的抗体或者全人的抗体。

术语“刺激”是指由刺激性分子(例如，TCR/CD3复合体或CAR)与其同源配体(或在CAR的情况下为肿瘤抗原)的结合，由此介导信号转导事件(比如但不限于经由TCR/CD3复合体的信号转导或经由适合的NK受体或CAR的信号传导结构域的信号转导)而诱导的初次应答。刺激可以介导某些分子的改变的表达。

术语“刺激性分子”是指由免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞、B细胞) 表达的提供细胞质信号传导序列的分子，该信号传导序列以刺激性方式调节用于免疫细胞信号传导途径的至少一些方面的免疫细胞的活化。在一个方面，信号是通过例如TCR/CD3复合体与负载有肽的MHC分子的结合启动的初级信号，并且其导致介导T细胞应答，包括，但不限于增殖、活化、分化等。以刺激方式起作用的一级细胞质信号传导序列(也称为“一级信号传导结构域”)可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。特别地用于本发明的含有ITAM的细胞质信号传导序列的实例包括，但不限于来源于下述的那些：CD3ζ、常见的FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、 FcRβ(FcEpsilon R1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12。在本发明的特异性CAR中，在本发明的任一个或更多个CAR中的胞内信号传导结构域包括细胞内信号传导序列，例如CD3-ζ的初级信号传导序列。在本发明的特异性CAR中，CD3-ζ的初级信号传导序列是来自人或非人类种类例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等同残基。

术语“共刺激性分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，其特异性地结合共刺激配体，从而介导T细胞的共刺激反应，比如但不限于增殖。共刺激性分子为除了抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其促进有效的免疫应答。共刺激性分子包括但不限于MHC I类分子，BTLA和Toll配体受体，以及OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278) 和4-1BB(CD137)。这样的共刺激性分子的进一步实例包括CDS、ICAM-1、 GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、 NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、 IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、 CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、 NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、 CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、 SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、 LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a，以及特异性地结合CD83 的配体。

共刺激性胞内信号传导结构域可以为共刺激性分子的细胞内部分。共刺激性分子可以以下述蛋白质家族代表：TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞性活化分子(SLAM蛋白质)、和NK细胞受体。这样的分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、 GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、ICAM-1、与淋巴细胞功能相关的抗原-1(LFA-1)、CD2、CDS、CD7、CD287、LIGHT、NKG2C、NKG2D、SLAMF7、NKp80、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、B7-H3、以及特异性地结合CD83的配体等。

胞内信号传导结构域可以包括分子的全部细胞内部分或全部天然胞内信号传导结构域、或其功能片段或衍生物。

术语“4-1BB”是指具有如GenBank Accession No.AAA62478.2提供的氨基酸序列的TNFR超家族的成员，或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等的等同残基；并且“4-1BB共刺激结构域”被定义为GenBank Accession No.AAA62478.2的氨基酸残基214～255，或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等的等同残基。在一个方面，“4-1BB共刺激结构域”为来自人或者来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等的等同残基。

术语“胞内信号传导结构域”是指分子的细胞内部分。胞内信号传导结构域产生促进含有CAR的细胞例如CAR-T细胞的免疫效应子功能的信号。在例如CAR-T细胞中免疫效应子功能的实例包括细胞裂解活性和辅助活性，包括细胞因子的分泌。在一种实施方式中，胞内信号传导结构域可以包括一级胞内信号传导结构域。示例性的一级胞内信号传导结构域包括来源于负责初次刺激或抗原依赖性刺激的分子的那些。在一种实施方式中，胞内信号传导结构域可以包括共刺激细胞内结构域。

一级胞内信号传导结构域可以包括被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。含有ITAM的一级细胞质信号传导序列的实例包括，但不限于来源于下述的那些：CD3ζ、常见FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、 FcRβ(FcEpsilon R1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12。

术语“T细胞(抗原)受体(T cell receptor，TCR)”，为所有T细胞表面的特征性标志，以非共价键与CD3结合，形成TCR-CD3复合物。TCR负责识别与主要组织相容性复合体分子结合的抗原。TCR是由两条不同肽链构成的异二聚体，由α、β两条肽链组成，每条肽链又可分为可变区(V区)，恒定区 (C区)，跨膜区和胞质区等几部分；其特点是胞质区很短。TCR分子属于免疫球蛋白超家族，其抗原特异性存在于V区；V区(Vα、Vβ)又各有三个高变区CDR1、CDR2、CDR3，其中以CDR3变异最大，直接决定了TCR的抗原结合特异性。在TCR识别MHC-抗原肽复合体时，CDR1，CDR2识别和结合 MHC分子抗原结合槽的侧壁，而CDR3直接与抗原肽相结合。TCR分为两类： TCR1和TCR2；TCR1由γ和δ两条链组成，TCR2由α和β两条链组成。

术语“T细胞融合蛋白(T cell fusion protein，TFP)”，包括构成TCR的各种多肽衍生的重组多肽，其能够结合到靶细胞上的表面抗原,和与完整的 TCR复合物的其他多肽相互作用，通常同定位在T细胞表面。TFP由一个TCR 亚基与人或人源化抗体结构域组成的一个抗原结合结构域组成，其中，TCR 亚基包括至少部分TCR胞外结构域、跨膜结构域、TCR胞内结构域的胞内信号结构域的刺激结构域；该TCR亚基和该抗体结构域有效连接，其中，TCR 亚基的胞外、跨膜、胞内信号结构域来源于CD3ε或CD3γ，并且，该TFP整合进T细胞上表达的TCR。

术语“T细胞抗原耦合器(T cell antigen coupler，TAC)”，包括三个功能结构域：1肿瘤靶向结构域，包括单链抗体、设计的锚蛋白重复蛋白(designed ankyrin repeatprotein，DARPin)或其他靶向基团；2胞外区结构域，与CD3结合的单链抗体，从而使得TAC受体与TCR受体靠近；3跨膜区和CD4共受体的胞内区，其中，胞内区连接蛋白激酶LCK，催化TCR复合物的免疫受体酪氨酸活化基序(ITAMs)磷酸化作为T细胞活化的初始步骤。

术语“抗体”是指源于特异性地结合抗原的免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。抗体可以为多克隆的或单克隆的、多链或单链、或完整的免疫球蛋白，并且可以来源于天然来源或重组来源。抗体可以为免疫球蛋白分子的四聚体。

术语“抗体片段”是指保留与抗原的表位特异性地相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)的能力的抗体的至少一部分。抗体片段的实例包括，但不限于Fab，Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗体片段、二硫键-连接的Fvs(sdFv)、由VH和CH1结构域组成的Fd片段、线性抗体、单域抗体比如sdAb(VL或VH)、camelid VHH结构域、由抗体片段(例如包括在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段)形成的多特异性抗体和抗体的分离的CDR或其它表位结合片段。抗原结合片段也可以被掺入单域抗体、最大抗体、微小抗体、纳米抗体、胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双-scFv(参见，例如Hollinger和Hudson，《Nature Biotechnology》(23)：1126-1136，2005)。

术语“scFv”是指包含至少一个包括轻链的可变区抗体片段和至少一个包括重链的可变区的抗体片段的融合蛋白，其中所述轻链和重链可变区是邻接的(例如经由合成接头例如短的柔性多肽接头)，并且能够以单链多肽形式表达，且其中所述scFv保留其所来源的完整抗体的特异性。除非指定，否则如正如本文中使用的那样，scFv可以以任何顺序(例如相对于多肽的N-末端和 C末端)具有所述的VL和VH可变区，scFv可以包括VL-接头-VH或可以包括VH-接头-VL。

术语“抗体重链”是指以其天然存在的构型存在于抗体分子中且通常决定抗体所属类型的两种多肽链中较大者。

术语“抗体轻链”是指以其天然存在构型存在于抗体分子中的两种多肽链的较小者。κ(k)和λ(l)轻链是指两种主要的抗体轻链的同种型。

术语“重组抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，比如例如由噬菌体或酵母菌表达系统表达的抗体。该术语也应当解释为指已经通过合成编码抗体的DNA分子(且其中DNA分子表达抗体蛋白质)或指定抗体的氨基酸序列产生的抗体，其中所述DNA或氨基酸序列已经使用重组DNA或本领域可获得且熟知的氨基酸序列技术获得。

术语“抗原”或“Ag”是指引起免疫应答的分子。该免疫应答可以涉及抗体产生或有特异性免疫能力的细胞的活化或两者。本领域技术人员应当理解包括实际上所有蛋白质或肽的任何大分子都可以充当抗原。此外，抗原可以来源于重组或基因组DNA。当在本文中使用该术语时，本领域技术人员应当理解包括编码引起免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何 DNA，因此编码“抗原”。此外，本领域技术人员应当理解抗原无需仅通过基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用超过一个基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以不同组合排列以编码引发期望免疫应答的多肽。而且，本领域技术人员应当理解抗原根本无需由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以合成产生，或者可以来源于生物样品，或者可以是除了多肽之外的大分子。这样的生物样品可以包括，但不限于组织样品、肿瘤样品、具有其它生物组分的细胞或液体。

“肿瘤抗原”指的是特定过度增生性疾病共同的抗原。在某些方面，本发明的过度增生性病症抗原源自癌症。本发明的肿瘤抗原包括但不限于：促甲状腺激素受体(TSHR)；CD171；CS-1；C型凝集素样分子-1；神经节苷脂 GD3；Tn抗原；CD19；CD20；CD 22；CD 30；CD70；CD 123；CD 138； CD33；CD44；CD44v7/8；CD38；CD44v6；B7H3(CD276)，B7H6；KIT(CD117)；白介素13受体亚单位α(IL-13Rα)；白介素11受体α(IL-11Rα)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；癌胚抗原(CEA)；NY-ESO-1； HIV-1Gag；MART-1；gp100；酪氨酸酶；间皮素；EpCAM；蛋白酶丝氨酸 21(PRSS21)；血管内皮生长因子受体,血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；路易斯(Y)抗原；CD24；血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；细胞表面相关的粘蛋白1(MUC1)，MUC6；表皮生长因子受体家族及其突变体(EGFR，EGFR2，ERBB3，ERBB4，EGFRvIII)；神经细胞粘附分子(NCAM)；碳酸酐酶IX(CAIX)；LMP2；肝配蛋白A型受体 2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸基路易斯粘附分子(sLe)；神经节苷脂 GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer；TGS5；高分子量黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；邻乙酰基GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体；肿瘤血管内皮标记1(TEM1/CD248)；肿瘤血管内皮标记7相关的(TEM7R)； Claudin 6，Claudin18.2、Claudin18.1；ASGPR1；CDH16；5T4；8H9；αvβ6 整合素；B细胞成熟抗原(BCMA)；CA9；κ轻链(kappa lightchain)；CSPG4； EGP2，EGP40；FAP；FAR；FBP；胚胎型AchR；HLA-A1，HLA-A2；MAGEA1， MAGE3；KDR；；MCSP；NKG2D配体；PSC1；ROR1；Sp17；SURVIVIN； TAG72；TEM1；纤连蛋白；腱生蛋白；肿瘤坏死区的癌胚变体；G蛋白偶联受体C类5组-成员D(GPRC5D)；X染色体开放阅读框61(CXORF61)；CD97； CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH glycoceramide的己糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；uroplakin 2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)； pannexin 3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物基因座K9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；ETS易位变异基因6(ETV6-AML)；精子蛋白 17(SPA17)；X抗原家族成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体 2(Tie2)；黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原 -2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；p53突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；细胞凋亡的黑素瘤抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶丝氨酸 2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白 Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；V-myc鸟髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生的同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C(RhoC)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS)；由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；proacrosin结合蛋白sp32(OYTES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚定蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤X断点2(SSX2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C 型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有 EGF样模块粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。

术语“癌症”指特征在于在体外(例如经转化的细胞)或体内的过度增殖性细胞生长的广泛病症类别。可以通过本发明的方法治疗或预防的病况包括例如各种赘生物，包括良性或恶性肿瘤，各种增生等等。本发明的方法可以实现这样的病况中所牵涉的不希望有的过度增殖性细胞生长的抑制和/或逆转。癌症的具体例子包括包括但不限于：乳腺癌，血液癌症，结肠癌，直肠癌，肾细胞癌，肝癌，肺的非小细胞癌，小肠癌，食道癌，黑素瘤，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，脑胶质瘤，头颈癌，皮肤或眼内恶性黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛区癌，胃癌，睾丸癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，阴户癌，霍奇金氏病，非霍奇金淋巴瘤，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，儿童实体瘤，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾盂癌，中枢神经系统(CNS)瘤，原发性CNS 淋巴瘤，肿瘤血管发生，脊椎肿瘤，脑干神经胶质瘤，垂体腺瘤，卡波西肉瘤，表皮样癌，鳞状细胞癌，T细胞淋巴瘤，环境诱发的癌症，所述癌症的组合和所述癌症的转移性病灶。

术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指外源性核酸通过其转移或引入到宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源性核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原发性受试者细胞及其后代。

术语“特异性地结合”是指识别并且结合存在于样品中的结合配偶体(例如肿瘤抗原)蛋白质的抗体或配体，但是该抗体或配体基本上不会识别或结合样品中的其它分子。

术语“生物等同的”是指要产生与参考剂量或参考量的参考化合物、免疫效应细胞、辐照产生的效果等同的效果所需要的不同于参考化合物、免疫效应细胞、辐照的作用剂的量。

这里使用的“难治”指的是一种疾病，例如，癌症，其不应答治疗。在实施方案中，难治性癌症可以是对治疗开始前或开始时的治疗有抗性。在其他实施方案中，难治性癌症可以成为治疗期间抗性的。难治性癌症也称为抗性癌症。在本发明中，难治性癌症包括但不限于放疗不敏感、放疗后复发、化疗不敏感、化疗后复发、对CAR-T治疗不敏感或治疗后复发的癌症。难治性或复发性恶性肿瘤可以使用本文中描述的治疗方案。

如本文所用“复发的”是指在一段改进期，例如，在疗法，例如癌症疗法的先前治疗后，返回疾病(例如癌症)或疾病如癌症的体征和症状。

术语“治疗剂”，指在受试者中产生治疗应答的任何医学产品。包括但不限于免疫刺激试剂、T细胞生长因子、白介素、抗体和疫苗、化学治疗剂或其组合。

免疫刺激试剂是通过诱导免疫系统组分中任一种的活化或增加其组分中任一种的活性来刺激免疫系统的物质(药物和营养素)。免疫刺激剂包括细菌疫苗、集落刺激因子、干扰素、白介素、其它免疫刺激剂、治疗疫苗、疫苗组合和病毒疫苗。

T细胞生长因子是刺激T细胞增殖的蛋白质。T细胞生长因子的例子包括 Il-2、IL-7、IL-15、IL-17、IL21和IL-33。

白介素是首先被视为由白血细胞表达的一组细胞因子。免疫系统的功能在很大程度上取决于白介素，并且许多白介素的罕见缺陷已得到描述，全部表征自身免疫疾病或免疫缺陷。白介素中的大多数通过辅助CD4T淋巴细胞，以及通过单核细胞、巨噬细胞和内皮细胞合成。它们促进T和B淋巴细胞以及造血细胞的发育和分化。白介素的例子包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、 IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15和IL-17。

化学治疗剂包括烷化剂例如噻替派和环磷酰胺(CYTOXAN)；烷基磺酸盐类例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类例如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺类和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙撑磷酰胺、三乙撑硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥类例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、cholophosphamide、磷雌氮芥、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、松龙苯芥、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；硝基脲类(nitrosureas)例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素例如阿克拉霉素(aclacinomysins)、放射菌素、authramycin、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡奇霉素、carabicin、洋红霉素 (caminomycin)、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6- 重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、派来霉素、potfiromycin、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链唑霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物例如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫唑鸟嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物例如安西他滨、氮杂胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他宾、氟尿苷、5-FU；雄激素类例如卡鲁睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺药(anti-adrenal)例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂例如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；磷胺氮芥(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸(elformithine)；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；硝氨丙吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2－乙基肼；甲基苄肼； PSK.RTM.；丙亚胺；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2"- 三氯三乙胺；乌拉坦；长春酰胺；氮烯咪胺；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类，例如紫杉醇(TAXOLTM，Bristol-Myers Squibb Oncology， Princeton，N.J.)和多西他赛(TAXOTERETM，Rhne-Poulenc Rorer，Antony，法国)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物例如顺铂和卡铂；长春碱；曲妥珠单抗、多西他赛、铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺消灵；替尼泊苷；道诺霉素；氨喋呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸衍生物例如Targretin TM(贝沙罗汀)，PanretinTM(阿利维A酸)；ONTAKTTM(地尼白介素2)；埃斯波霉素；卡培他滨；以及上述任何一种的药物学上可接受的盐、酸或衍生物。这个定义中还包括抗激素剂，所述抗激素剂用于调节或抑制激素对肿瘤的作用，例如抗雌激素剂包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(Fareston)；以及抗雄激素剂例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及上述任何一种的药物学上可接受的盐、酸或衍生物。进一步的癌症治疗剂包括索拉非尼以及其它蛋白质激酶抑制剂例如阿法替尼、阿西替尼、贝伐珠单抗、西妥昔单抗、克唑替尼、达沙替尼、厄洛替尼、福他替尼、吉非替尼、伊马替尼、拉帕替尼、乐伐替尼、莫立替尼、尼洛替尼、帕尼单抗、帕唑帕尼、哌加他尼、兰尼单抗、鲁索利替尼、曲妥珠单抗、凡德他尼、维罗非尼、和舒尼替尼；西罗莫司(雷帕霉素)、依维莫司以及其它mTOR抑制剂。

另外的化学治疗剂的例子包括拓扑异构酶I抑制剂(例如伊立替康、托泊替康、喜树碱及其类似物或代谢产物、和多柔比星)；拓扑异构酶II抑制剂(例如依托泊苷、替尼泊苷和柔红霉素)；烷化剂(例如美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、噻替派、异环磷酰胺、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、链唑霉素、氮烯咪胺、氨甲蝶呤、丝裂霉素C和环磷酰胺)；DNA嵌入剂(例如顺铂、奥沙利铂和卡铂)；DNA嵌入剂和自由基生成剂例如博来霉素；和核苷模拟物 (例如5-氟尿嘧啶、卡培他滨、吉西他滨、氟达拉滨、阿糖胞苷、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁和羟基脲)。此外，破坏细胞复制的示例性化学治疗剂包括：紫杉醇、多西他赛和相关类似物；长春新碱、长春碱和相关类似物；沙利度胺、来那度胺和相关类似物(例如CC-5013和CC-4047)；蛋白酪氨酸激酶抑制剂(例如甲磺酸伊马替尼和吉非替尼)；蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米)； NF-κB抑制剂包括IκB激酶的抑制剂；结合在癌症中过表达的蛋白质的抗体，以及已知在癌症中上调、过表达或活化的蛋白质或酶的其它抑制剂，所述蛋白质或酶的抑制下调细胞复制。

局部辐射和免疫效应细胞治疗联合检查点抑制剂和治疗剂治疗，在治疗一些受试者中的癌症中可以是更有效的，和/或可以起始、实现、增加、增强或延长免疫细胞(包括T细胞、B细胞、NK细胞和/或其它)的活性和/或数目，或促进IFN-γ分泌，或传达通过肿瘤的医学有益应答(包括其消退、坏死或消除)。

在本发明的某些实施方案中，免疫效应细胞与检查点抑制剂同时给药，或免疫效应细胞治疗在检查点抑制剂前或后按时间顺序施用。在某些实施方案中，免疫效应细胞治疗在检查点抑制剂施用之前1小时、2小时、3小时、4 小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、1 天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、 14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、 25天、26天、27天、28天、29天、1个月或其任何组合施用。在某些实施方案中，免疫效应细胞治疗在检查点抑制剂施用之后1小时、2小时、3小时、4 小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、1 天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、 14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、 25天、26天、27天、28天、29天、1个月或其任何组合施用。在某些实施方案中，治疗剂在免疫效应细胞治疗施用之前1小时、2小时、3小时、4小时、 5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、1天、2 天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14 天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25 天、26天、27天、28天、29天、1个月或其任何组合施用。在某些实施方案中，治疗剂在免疫效应细胞治疗施用之后1小时、2小时、3小时、4小时、5 小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、1天、2天、 3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、 15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、 26天、27天、28天、29天、1个月或其任何组合施用。

术语“生物学治疗剂”或“生物药剂”指在生物源中制造或由生物源提取的任何医学产品。生物药剂不同于化学合成的药物产品。生物药剂的例子包括疫苗、血液或血液成分、过敏原、体细胞、基因疗法、组织、重组治疗性蛋白质、包括抗体治疗剂和融合蛋白、以及活细胞。生物制品可以由糖、蛋白质或核酸或这些物质的复杂组合组成，或可以是活实体例如细胞和组织。生物制品从各种天然来源(人、动物或微生物)中分离，并且可以通过生物技术方法和其它技术产生。生物学治疗剂的具体例子包括但不限于免疫刺激试剂、T细胞生长因子、白介素、抗体、融合蛋白和疫苗例如癌症疫苗。

术语“治疗”是指由于施用一种或多种疗法(例如一种或多种治疗剂比如本发明的CAR-T、局部辐射治疗)减慢或改善增生性病症的进展、严重程度和/或持续时间，或改善增生性病症的一种或多种症状(优选地，一种或多种可辨别的症状)。在特定实施方式中，术语“治疗”是指改善增生性病症的至少一种可测量的物理参数比如肿瘤生长，不必是患者可辨别的。在其它实施方案中，术语“治疗”是指通过例如稳定可辨别的症状以物理方式、通过例如稳定物理参数以生理学方式或两者抑制增生性病症的进展。在其它实施方案中，术语“治疗”是指减小或稳定肿瘤尺寸、癌细胞计数或延长个体的生存期。

术语“改善存活”指患有癌症或增殖性疾病的受试者的寿命或生活质量的增加。例如，改善存活还包括促进癌症缓解，预防肿瘤侵入，预防肿瘤复发，减缓肿瘤生长，预防肿瘤生长，减小肿瘤尺寸，并减少总癌细胞计数。

术语“治疗癌症”不意味着是绝对术语。在一些方面，本发明的方法寻求减少肿瘤尺寸或癌细胞数目，促使癌症进入缓解，或阻止癌细胞的尺寸或细胞数目的生长。在一些情况下，治疗导致改善的预后。

术语“自体的”是指来源于个体的任何物质，所述物质随后再被引入到的相同个体。

术语“同种异体的”是指来源于与将导入物质的个体相同物种的不同动物的任何物质。当一个或更多个基因座的基因不相同时，两个或多个个体被认为是彼此同种异体的。在某些方面，来自相同物种的个体的同种异体物质可以在遗传上是足够不同的而以在抗原性上相互作用。

术语“受试者”指已诊断有癌症或细胞增殖性病症的个体或受试者。

术语“肿瘤应答”指细胞应答包括但不限于触发程序性细胞死亡。

术语“抗肿瘤应答”指免疫系统应答，包括但不限于活化T细胞以攻击抗原或抗原呈递细胞。

术语“增强”指允许受试者或肿瘤细胞改善其响应本文公开的治疗的能力。例如，增强的应答可以包含应答性中5％、10％、15％、20％、25％、 30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、 85％、90％、95％或98％或更多的增加。如本文使用的，“增强”还可以指增加响应治疗例如免疫效应细胞疗法的受试者数目。例如，增强的应答可以指响应治疗的受试者总百分比，其中百分比是5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、 85％、90％、95％或98％更多。

术语“小分子”指低分子量(<900道尔顿)有机化合物，其可以帮助调节生物过程，具有在10^-9m级别上的大小。大多数药物是小分子。

免疫检查点调节免疫系统中的T细胞功能。T细胞在细胞介导的免疫中起关键作用。检查点蛋白质与特异性配体相互作用，所述特异性配体将信号发送到T细胞内，并且基本上关闭或抑制T细胞功能。癌细胞通过在其表面上驱动高水平的检查点蛋白质表达来利用这种系统，其导致在进入肿瘤微环境的 T细胞的表面上表达检查点蛋白质的T细胞的控制，因此压制抗癌免疫应答。像这样，检查点蛋白质的抑制将导致T细胞功能的恢复和针对癌细胞的免疫应答。检查点蛋白质的例子包括但不限于CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4(属于 CD2分子家族，并且在所有NK、γδ和记忆CD8+(αβ)T细胞上表达)、CD160(也称为BY55)、CGEN-15049、CHK 1和CHK2激酶、A2aR和各种B-7家族配体。

术语“PD-1抗体”指通过使PD-1激动来拮抗淋巴细胞的活性和/或增殖的抗体。术语“拮抗活性”指淋巴细胞增殖或活性中至少约10％、20％、30％、 40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的下降(或减少)。术语“拮抗”可以与术语“抑制性”和“抑制”互换使用。PD-1介导的活性可以使用如本文描述的T细胞增殖测定法进行定量测定。在一个实施方案中，抗PD-1抗体可以是新型抗原结合片段。本文公开的抗PD-1抗体能够结合包括人PD-1且拮抗PD-1，从而抑制表达PD-1的免疫细胞的功能。在一些实施方案中，免疫细胞是表达PD-1的活化淋巴细胞，例如T细胞、B细胞和/或单核细胞。

程序性细胞死亡蛋白质1(PD-1)是288个氨基酸的细胞表面蛋白质分子，在T细胞和前B细胞上表达，并且在其命运/分化中起作用。PD-1具有两种配体，PD-L1和PD-L2，其为B7家族的成员。PD-L1蛋白质响应LPS和GM-CSF 处理在巨噬细胞和树突状细胞(DC)上是上调的，并且在TCR和B细胞受体信号传导后在T细胞和B细胞上是上调的，而在静止小鼠中，PDL1mRNA可以在心脏、肺、胸腺、脾和肾中检测到。PD-1负面调节T细胞应答。

存在目前在临床试验中测试的几种PD-1抑制剂：CT-011、BMS 936558、BMS936559、MK 3475、MPDL 3280A、AMP 224、Medi 4736。

CTLA4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白质)是下调免疫系统的蛋白质受体。CTLA4在T细胞的表面上发现，其导致对抗原的细胞免疫攻击。T细胞攻击可以通过刺激T细胞上的CD28受体而开启。T细胞攻击可以通过刺激 CTLA4受体而关闭。第一类免疫疗法伊匹木单抗(Yervoy)(靶向T细胞表面上的CTLA-4的单克隆抗体)被批准用于黑素瘤的治疗。

在一个方面，检查点抑制剂是生物学治疗剂或小分子。在另一个方面，检查点抑制剂是单克隆抗体、人源化抗体、全人抗体、融合蛋白或其组合。在一个进一步方面，检查点抑制剂抑制检查点蛋白质，其可以是CTLA-4、 PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、 VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK 1、CHK2、A2aR、B-7家族配体或其组合。在一个另外方面，检查点抑制剂与可以是下述的检查点蛋白质的配体相互作用：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、 HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、 CHK 1、CHK2、A2aR、B-7家族配体或其组合。在一个方面，治疗剂是免疫刺激试剂、T细胞生长因子、白介素、抗体、疫苗、化疗药物或其组合。

在一个进一步方面，在局部辐射治疗之前、同时或之后施用免疫检查点抑制剂，或在免疫效应细胞治疗之前、同时或之后施用免疫检查点抑制剂。

检查点抑制剂包括以统计上显著的方式阻断或抑制免疫系统的抑制途径的任何试剂。这样的抑制剂可以包括小分子抑制剂，或可以包括结合且阻断或抑制免疫检查点受体的抗体或其抗原结合片段，或者结合且阻断或抑制免疫检查点受体配体的抗体。可以被靶向用于阻断或抑制的举例说明性检查点分子包括但不限于CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、 HVEM、GAL9、LAG3、TIM3、VISTA、KIR、2B4(属于CD2分子家族，并且在所有NK、γδ和记忆CD8+(αβ)T细胞上表达)、CD160(也称为BY55)、 CGEN-15049、CHK 1和CHK2激酶、A2aR和各种B-7家族配体。B7家族配体包括但不限于B7-1、B7-2、B7-DC、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H5、 B7-H6和B7-H7。检查点抑制剂包括抗体或其抗原结合片段、其它结合蛋白、生物学治疗剂或小分子，其结合且阻断或抑制下述中的一种或多种的活性： CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、 KIR、2B4、CD160和CGEN-15049。举例说明性免疫检查点抑制剂包括曲美木单抗(CTLA-4阻断抗体)、抗OX40、PD-L1单克隆抗体(抗B7-H1； MEDI4736)、MK-3475(PD-1阻断剂)、Nivolumab(抗PD1抗体)、CT-011(抗 PD1抗体)、BY55单克隆抗体、AMP224(抗PDL1抗体)、BMS-936559(抗PDL1 抗体)、MPLDL3280A(抗PDL1抗体)、MSB0010718C(抗PDL1抗体)和Yervoy/ 伊匹木单抗(抗CTLA-4检查点抑制剂)。检查点蛋白质配体包括但不限于 PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、CD28、CD86和TIM-3。

用于本发明的方法中的合适抗CTLA-4拮抗试剂包括但不限于抗CTLA4 抗体、人抗CTLA4抗体、小鼠抗CTLA4抗体、哺乳动物抗CTLA4抗体、人源化抗CTLA4抗体、单克隆抗CTLA4抗体、多克隆抗CTLA4抗体、嵌合抗 CTLA4抗体、MDX-010(伊匹木单抗)、曲美木单抗、抗CD28抗体、抗 CTLA4adnectin、抗CTLA4结构域抗体、单链抗CTLA4片段、重链抗CTLA4 片段、轻链抗CTLA4片段、激动共刺激途径的CTLA4的抑制剂、在PCT公开号WO2001/014424公开的抗体、在PCT公开号WO2004/035607中公开的抗体、在美国公开号2005/0201994中公开的抗体、以及在授权的欧洲专利号EP 1212422B1中公开的抗体。另外的CTLA-4抗体在美国专利号5,811,097、 5,855,887、6,051,227和6,984,720；PCT公开号WO01/14424和WO 00/37504；以及美国公开号2002/0039581和2002/086014中描述。可以用于本发明的方法中的其它抗CTLA-4抗体包括例如公开于下述中的那些：WO98/42752；美国专利号6,682,736和6,207,156；Hurwitz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 95(17):10067-10071(1998)；Camacho等人，J.Clin.Oncology，22(145):Abstract No.2505(2004)(抗体CP-675206)；Mokyr等人，Cancer Res.， 58:5301-5304(1998)，以及美国专利号5,977,318、6,682,736、7,109,003和7,132,281。

另外的抗CTLA4拮抗剂包括但不限于下述：能够破坏CD28抗原结合其同源配体的能力，抑制CTLA4结合其同源配体的能力，经由共刺激途径加强 T细胞应答，破坏B7结合CD28和/或CTLA4的能力，破坏B7活化共刺激途径的能力，破坏CD80结合CD28和/或CTLA4的能力，破坏CD80活化共刺激途径的能力，破坏CD86结合CD28和/或CTLA4的能力，破坏CD86活化共刺激途径的能力，以及破坏一般而言共刺激途径的活化的任何抑制剂。这种必要性包括共刺激途径的CD28、CD80、CD86、CTLA4以及其它成员的小分子抑制剂；针对共刺激途径的CD28、CD80、CD86、CTLA4以及其它成员的抗体；针对共刺激途径的CD28、CD80、CD86、CTLA4以及其它成员的反义分子；针对共刺激途径的CD28、CD80、CD86、CTLA4以及其它成员的adnectin，共刺激途径的CD28、CD80、CD86、CTLA4以及其它成员的RNAi抑制剂(单链和双链两者)，以及其它抗CTLA4拮抗剂。

在一个方面，治疗由临床结果；通过T细胞的抗肿瘤活性增加、增强或延长；与治疗前的数目相比较，抗肿瘤T细胞或活化T细胞数目的增加，促进 IFN-γ分泌,或其组合决定。在另一个方面，临床结果是肿瘤消退；肿瘤缩小；肿瘤坏死；通过免疫系统的抗肿瘤应答；肿瘤扩大，复发或扩散或其组合。在一个另外方面，治疗效应通过T细胞的存在、指示T细胞炎症的基因标记的存在，促进IFN-γ分泌,或其组合预测。

在一个方面，本文描述的方法用于治疗癌症。具体地，本文描述的方法可以用于减小实体瘤的尺寸，或减少癌症的癌细胞数目。本文描述的方法可以用于减慢癌细胞生长的速率。本文描述的方法可以用于停止癌细胞生长的速率。

如本文公开的免疫效应细胞、治疗剂、检查点抑制剂、生物学治疗剂或药物组合物可以通过各种途径施用于个体，包括例如经口或肠胃外，例如静脉内、肌内、皮下、眶内、囊内、腹膜内、直肠内、脑池内、瘤内、鼻内 (intravasally)、皮内或者分别使用例如皮肤贴片或透皮离子电渗疗法通过皮肤的被动或促进吸收。治疗剂、检查点抑制剂、生物学治疗剂或药物组合物还可以施用于病理状况的部位，例如静脉内或动脉内进入供应肿瘤的血管内。

在实践本发明的方法中待施用的试剂总量可以作为单一剂量以推注或通过在相对短时间段的输注，施用于受试者，或可以使用分级治疗方案进行施用，其中在延长时间段施用多个剂量。本领域技术人员将知道治疗受试者中的病理状况的组合物的量取决于许多因素，包括受试者的年龄和一般健康、以及施用途径和待施用的治疗次数。考虑到这些因素，技术人员将根据需要调整具体剂量。一般而言，最初，使用I期和II期临床试验测定组合物的配制以及施用途径和频率。

范围：在整个公开中，本发明的各个方面都可以以范围形式存在。应当理解，范围形式的描述仅仅为方便和简洁起见，而不应当被看作是对本发明的范围不可改变的限制。因此，范围的描述应当被认为特别地公开了所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。例如，范围的描述比如从1至6就应当被认为具体地公开了子范围比如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单独数值，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3、和6。作为另一个实例，范围比如95-99％的同一性包括具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的范围，并且包括子范围比如96～99％、96～98％、96～97％、97～99％、 97～98％和98～99％的同一性。不考虑范围的宽度，这均适用。

根据本公开内容，本领域技术人员应了解在所公开的具体实施方案中可以作出许多变化或改变，并且仍获得相同或相似结果，而不背离本发明的精神和范围。本发明在范围上并不受限于本文描述的具体实施方案(其仅预期作为本发明的各方面的举例说明)，并且功能等价的方法和组分在本发明的范围内。事实上，本发明的各种修饰加上本文显示且描述的那些，根据前述描述对于本领域技术人员将变得明显。

本发明的示例性的抗原受体，包括CAR，以及用于工程改造和将受体导入细胞中的方法，参考例如中国专利申请公开号CN107058354A、 CN107460201A、CN105194661A、CN105315375A、CN105713881A、 CN106146666A、CN106519037A、CN106554414A、CN105331585A、 CN106397593A、CN106467573A、CN104140974A、国际专利申请公开号WO2017186121A1、WO2018006882A1、WO2015172339A8、 WO2018018958A1中公开的那些。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，《分子克隆实验指南(第三版)》(科学出版社，2002)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 CAR-T细胞的构建和小鼠清淋模型的建立

(1)CAR-T细胞的构建

作为示例性的，本实施例采用靶向EGFRvIII的二代CAR，为了动物实验的需要，本实施例采用鼠的基因序列构建CAR的跨膜域和胞内域。

将小鼠CD8α信号肽的编码序列(SEQ ID NO：1)，即能识别人活化的 EGFR、也能识别人EGFRvIII的单抗抗体的编码序列(SEQ ID NO：2)，鼠 CD8α铰链区及跨膜区的编码序列(SEQ ID NO：3)，鼠CD28胞内域的编码序列(SEQ ID NO：4)，鼠CD3ζ胞内域的编码序列(SEQID NO：5)依次连接，通过体外基因合成的方法获得EGFRvIII-m28Z基因片段，并用MluⅠ和SalⅠ双酶切位点置换逆转录病毒载体MSCV-IRES-GFP(购自Addgene)中的IRES-GFP片段，获得重组载体MSCV-EGFRvIII-m28Z(或者命名为 MSCV-EGFRvIII-mCD28Z)(图1A)。

用重组载体MSCV-EGFRvIII-m28Z感染293T细胞，得到包装后的逆转录病毒。感染方法为本领域表达嵌合抗原受体的T细胞制备过程中常规的感染方法。

取Balb/c小鼠的脾脏T淋巴细胞，将纯化的小鼠CD3⁺T淋巴细胞按1：1 的体积比加入Dynabeads Mouse T-activator CD3/CD28(Thermo Fisher)，PBS 清洗一次，活化，放培养箱培养，培养基为RPMI 1640完全培养基。

将活化24h的小鼠脾脏T淋巴细胞接种于retronectin(Takara T100A)包被的12孔板中，加入逆转录病毒感染过夜，得到小鼠的EGFRvIII-m28Z CAR-T细胞。

(2)小鼠清淋模型的建立

Balb/c小鼠是免疫系统正常的小鼠。给予Balb/c小鼠5Gyγ射线全身辐照，辐照后第14天，小鼠下颌采血50μl至抗凝管，加入PerCP Cy5.5标记的抗小鼠 CD3的流式抗体，室温孵育1小时，加入450μl红细胞裂解液，十分钟后，BD 流式分析仪检测CD3阳性率。

实验结果：未处理的对照小鼠CD3阳性细胞比例为31.6％，经过辐照后的小鼠CD3阳性细胞比例为5.7％。与未处理的对照小鼠相比较，经过辐照后的小鼠CD3阳性细胞比例明显降低，约82％(P<0.05，t-test)(图1B)。说明5Gyγ射线能有效清除绝大部分CD3阳性细胞。

实施例2肿瘤局部辐射治疗与EGFRvIII-m28Z CAR-T细胞联合应用对结肠癌皮下移植瘤的抗肿瘤治疗作用

由于EGFR287-302表位仅在EGFRvIII或过表达EGFR的肿瘤中才暴露，而在正常组织中该表位隐匿(Gan HK et al.,Targeting of a conformationally exposed,tumor-specific epitope of EGFR as a strategy for cancer therapy.Cancer Res,2012,72(12):2924-2930.)。所以利用分子生物学常规手段建立过表达嵌合有人EGFR第287-302位氨基酸表位的去掉鼠EGFR第2-7号外显子的小鼠 EGFR的CT26细胞模型(CT26-EGFRvIII)。CT26细胞购自美国模式培养物保藏所(ATCC CRL-2638)。

(1)小鼠结肠癌模型的建立及分组治疗：

首先将小鼠分为两组：不清淋组及清淋组。

不清淋组：6周龄的雌性Balb/c小鼠(购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司)皮下接种3×10⁵CT26-EGFRvIII细胞，接种当天记为Day0，肿瘤接种后第13天(Day13),肿瘤体积为150～250mm³,分为5组(每组6只)，分别为：

UT(未处理)细胞组(UT)：Day13尾静脉输注5×10⁶未处理的小鼠T细胞；

2个单独治疗组：(1)肿瘤局部辐射治疗组(X-ray)：Day13肿瘤局部接受10Gy X-ray辐射；(2)EGFRvIII-m28Z CAR-T细胞组(EGFRvIII-m28Z): Day13尾静脉输注5×10⁶EGFRvIII-m28Z CAR-T细胞；

2个联合组：(1)EGFRvIII-m28Z CAR-T+肿瘤局部辐射治疗组 (EGFRvIII-m28Z+X-ray):Day13尾静脉输注5×10⁶EGFRvIII-m28Z CAR-T 细胞，间隔1天即Day15肿瘤局部接受10Gy X-ray辐射；(2)肿瘤局部辐射治疗+EGFRvIII-m28Z CAR-T组(X-ray+EGFRvIII-m28Z):Day13肿瘤局部接受10Gy X-ray辐射，间隔1天Day15尾静脉输注5×10⁶EGFRvIII-m28Z CAR-T细胞。

清淋组：6周龄的雌性Balb/c小鼠采用5Gy γ射线全身辐照后，当天皮下接种3×10⁵CT26-EGFRvIII细胞,接种当天记为Day0；肿瘤接种后第13天 (Day13),肿瘤体积为150～250mm³，将清淋组荷瘤小鼠再各分为3组(每组6 只)分别为：

UT(未处理)细胞组(UT(Lymphodeletion)):Day13尾静脉输注5×10⁶未处理的小鼠T细胞，

肿瘤局部辐射治疗组(X-ray(Lymphodeletion)):Day13肿瘤局部接受 10Gy X-ray辐射，

EGFRvIII-m28Z CAR-T细胞组(EGFRvIII-m28Z(Lymphodeletion)): Day13尾静脉输注5×10⁶EGFRvIII-m28Z CAR-T细胞。

(2)观察记录肿瘤大小，参照对照UT组计算肿瘤抑制率。持续观察并测量小鼠肿瘤体积变化。瘤体积计算公式为：肿瘤体积＝(肿瘤长×肿瘤宽²) /2。开始治疗后第8天(Day21)取小鼠血浆检查IFN-γ的浓度。

肿瘤局部辐射治疗与EGFRvIII-m28Z CAR-T联合在小鼠结肠癌模型中的抗肿瘤作用如图2A-4B所示。

由图2A可知，未清淋小鼠中，X-ray与CAR-T联合组(EGFRvIII-m28Z+X-ray、X-ray+EGFRvIII-m28Z)肿瘤体积明显小于单 CAR-T细胞治疗组(EGFRvIII-m28Z)的肿瘤体积(P<0.05,Two way ANOVA)。由图2B可知，未清淋小鼠的X-ray与CAR-T联合组 (EGFRvIII-m28Z+X-ray、X-ray+EGFRvIII-m28Z)肿瘤体积与清淋预处理后施用CAR-T细胞治疗组(EGFRvIII-m28Z(Lymphodeletion))的肿瘤体积无明显差异。上述结果说明CAR-T细胞治疗联合肿瘤局部辐射治疗能达到清淋预处理后施用CAR-T细胞治疗组的抗肿瘤效果。

由图3可知，在肿瘤接种后的第23天(Day23)，未清淋小鼠CAR-T细胞治疗组(EGFRvIII-m28Z)的肿瘤抑制率为35.98％±18.15％， X-ray+EGFRvIII-m28Z联合组肿瘤抑制率为92.44％±2.24％， EGFRvIII-m28Z+X-ray联合组肿瘤抑制率为75.06％±13.06％，而清淋预处理后施用CAR-T细胞治疗组(EGFRvIII-m28Z(Lymphodeletion))的肿瘤抑制率为77.85％±17.92％。未清淋小鼠联合组(EGFRvIII-m28Z+X-ray、 X-ray+EGFRvIII-m28Z)肿瘤抑制率高于未清淋小鼠CAR-T细胞治疗组 (EGFRvIII-m28Z)的肿瘤抑制率(P<0.001,One way ANOVA)，未清淋小鼠联合组(EGFRvIII-m28Z+X-ray、X-ray+EGFRvIII-m28Z)肿瘤抑制率与清淋预处理后施用CAR-T细胞治疗组(EGFRvIII-m28Z(Lymphodeletion)) 抑制率无明显差别。上述结果说明CAR-T细胞治疗联合肿瘤局部辐射治疗效果能达到清淋预处理后施用CAR-T细胞治疗组的抗肿瘤效果。

由图4A可知，在未清淋治疗组中，联合治疗组中X-ray+EGFRvIII-m28Z 组生存期最长(P<0.05,Log-rank test)，显著高于EGFRvIII-m28Z CAR-T组、 X-ray组。图4B中未清淋小鼠中X-ray+EGFRvIII-m28Z组小鼠生存期相对于未清淋EGFRvIII-m28Z+X-ray组以及清淋预处理后施用CAR-T细胞治疗组 (EGFRvIII-m28Z(Lymphodeletion))更长(P<0.05,Log-rank test)。

到治疗后的44天为止，未清淋小鼠中X-ray+EGFRvIII-m28Z组6只小鼠中有4只小鼠肿瘤消失。未清淋小鼠中EGFRvIII-m28Z+X-ray的6只小鼠中也有1 只小鼠肿瘤消失，而清淋预处理后施用CAR-T细胞治疗组中没有小鼠肿瘤消失。

上述结果说明清淋预处理并非提高CAR-T细胞治疗效果所必需。CAR-T 细胞治疗联合肿瘤局部辐射治疗效果能达到清淋预处理后施用CAR-T细胞治疗组的抗肿瘤效果，如对肿瘤生长的抑制没有统计学差异，并且肿瘤局部辐射与CAR-T细胞施用的先后顺序不影响联合治疗的抑制肿瘤生长作用。但是在对荷瘤小鼠的生存期的影响，CAR-T细胞治疗联合肿瘤局部辐射治疗明显优于清淋预处理后施用CAR-T细胞治疗组，其中以X-ray+EGFRvIII-m28Z 组对生存期的影响尤为显著。

实施例3肿瘤局部辐射治疗与EGFRvIII-m28Z CAR-T联合治疗小鼠结肠癌模型中的IFN-γ浓度检测

取实施例2中的开始治疗后第8天(Day21)的小鼠血浆50μl，用联科生物公司的ELISA试剂盒测定血液中的干扰素γ的水平，结果如图5所示，未清淋小鼠联合组中EGFRvIII-m28Z+X-ray组与清淋预处理后施用CAR-T治疗组相比没有显著性差异，而X-ray+EGFRvIII-m28Z组干扰素γ的浓度最高，高于清淋预处理后施用CAR-T治疗组(P<0.05,Oneway ANOVA)。上述结果说明CAR-T细胞治疗联合肿瘤局部辐射治疗能促进干扰素γ的分泌，其促进水平能达到清淋预处理后施用CAR-T细胞治疗组的水平，其中 X-ray+EGFRvIII-m28Z组干扰素γ的水平显著高于清淋预处理后施用CAR-T 细胞治疗组的水平。上述说明清淋预处理并非提高CAR-T细胞治疗效果所必需。不清淋情况下施用CAR-T细胞联合肿瘤局部辐射治疗可以获得和清淋预处理后施用CAR-T治疗组一样的抗肿瘤效果，并且先进行肿瘤局部辐射再施用CAR-T细胞，即X-ray+EGFRvIII-m28Z还能显著高于清淋预处理后CAR-T 细胞治疗组的抗肿瘤治疗效果。

实施例4肿瘤局部辐射治疗和EGFRvIII-m28Z CAR-T细胞联合应用对小鼠原位乳腺癌的抗肿瘤治疗作用

利用分子生物学常规手段建立过表达嵌合有人EGFR第287-302位氨基酸表位的小鼠EGFR的小鼠乳腺癌细胞E0771细胞模型(E0771-EGFR)。小鼠乳腺癌细胞E0771由美国贝勒医学院馈赠。

(1)C57BL/6小鼠原位乳腺癌模型的建立及分组：

取6-8周龄C57BL/6小鼠(购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司)，将 1×10⁶E0771-EGFR细胞接种于小鼠右侧第四乳腺脂肪垫内构建小鼠原位乳腺癌模型,接种当日记为Day0。接种后第14天(Day14),肿瘤长至200～300 mm³，将荷瘤小鼠分为5组(每组6只)：

UT(未处理)细胞组(UT):Day14尾静脉输注5×10⁶未处理的小鼠T细胞；

2个单独治疗组：(1)肿瘤局部辐射治疗组(X-ray):Day14肿瘤局部接受10Gy X-ray辐射；

(2)EGFRvIII-m28Z CAR-T细胞组(EGFRvIII-m28Z):Day14尾静脉输注5×10⁶EGFRvIII-m28Z CAR-T细胞；

2个联合组：(1)EGFRvIII-m28Z CAR-T+肿瘤局部辐射治疗组 (EGFRvIII-m28Z+X-ray):Day14尾静脉输注5×10⁶EGFRvIII-m28Z CAR-T 细胞，间隔1天即Day16肿瘤局部接受10Gy X-ray辐射；

(2)肿瘤局部辐射治疗+EGFRvIII-m28Z CAR-T组 (X-ray+EGFRvIII-m28Z):Day14肿瘤局部接受10Gy X-ray辐射，间隔1天即Day16尾静脉输注5×10⁶EGFRvIII-m28Z CAR-T细胞。

(2)观察记录肿瘤大小，参照对照UT组计算肿瘤抑制率。持续观察并测量小鼠肿瘤体积变化。瘤体积计算公式为：肿瘤体积＝(肿瘤长×肿瘤宽²) /2。记录小鼠生存期，结果如图6A和B所示。

如图6A所示，在肿瘤接种后的第34天(Day34)，EGFRvIII-m28Z组肿瘤抑制率是41.74％±13.29％，EGFRvIII-m28Z+X-ray组肿瘤抑制率是 81.77％±12.62％，X-ray+EGFRvIII-m28Z组肿瘤抑制率是80.85％±17.82％。相对于EGFRvIII-m28Z组，不管是EGFRvIII-m28Z+X-ray组还是 X-ray+EGFRvIII-m28Z组都显著抑制肿瘤生长(EGFRvIII-m28Z vs. X-ray+EGFRvIII-m28Z P<0.01，One way ANOVA；EGFRvIII-m28Z vs. EGFRvIII-m28Z+X-rayP<0.05,One way ANOVA)。

如图6B所示，相对于EGFRvIII-m28Z组，不管是EGFRvIII-m28Z+X-ray 组还是X-ray+EGFRvIII-m28Z组都显著延小鼠长生存期(EGFRvIII-m28Z vs. X-ray+EGFRvIII-m28ZP＝0.0409，Log-rank test；EGFRvIII-m28Z vs. EGFRvIII-m28Z+X-rayP＝0.0279，Log-rank test)。

上述结果显示，不论肿瘤局部辐射治疗在CAR-T施用之前还是之后都能够提高联合治疗的抗肿瘤活性，体现在抑制肿瘤生长、延长个体生存期等。而肿瘤局部辐射治疗是在CAR-T细胞施用之前还是之后对联合治疗的效果影响不大。

实施例5肿瘤局部辐射治疗和EGFRvIII-m28Z CAR-T细胞联合应用对小鼠原位乳腺癌的抗肿瘤治疗作用

利用分子生物学常规手段建立过表达嵌合有人EGFR第287-302位氨基酸表位的小鼠EGFR的小鼠乳腺癌细胞4T1细胞模型(4T1-EGFR)。4T1细胞购自中国科学院细胞库(TCM32)。(1)Balb/c小鼠原位乳腺癌模型的建立及分组治疗：

取6-8周龄Balb/c小鼠(购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司)，将 5×10⁵4T1-EGFR细胞接种于小鼠右侧第四乳腺脂肪垫内构建小鼠原位乳腺癌模型，接种当日记为Day0。接种后第15天(Day15),肿瘤长至100～200mm³，将荷瘤小鼠分为5组(每组6只)：

UT(未处理)细胞组(UT):Day15尾静脉输注5×10⁶未处理的小鼠T细胞；

2个单独治疗组：(1)肿瘤局部辐射治疗组(X-ray):Day15肿瘤局部接受10Gy X-ray辐射；(2)EGFRvIII-m28Z CAR-T细胞组(EGFRvIII-m28Z): Day15尾静脉输注5×10⁶EGFRvIII-m28Z CAR-T细胞；

2个联合组：(1)EGFRvIII-m28Z CAR-T+肿瘤局部辐射治疗组 (EGFRvIII-m28Z+X-ray):Day15尾静脉输注5×10⁶EGFRvIII-m28Z CAR-T 细胞，间隔1天即Day17肿瘤局部接受10Gy X-ray辐射；(2)肿瘤局部辐射治疗+EGFRvIII-m28Z CAR-T组(X-ray+EGFRvIII-m28Z):Day15肿瘤局部接受10Gy X-ray辐射，间隔1天即Day17尾静脉输注5×10⁶EGFRvIII-m28Z CAR-T细胞。

(2)观察记录肿瘤大小，参照对照UT组计算肿瘤抑制率。持续观察并测量小鼠肿瘤体积变化。瘤体积计算公式为：肿瘤体积＝(肿瘤长×肿瘤宽²) /2。记录小鼠生存期，结果如图7A和B所示。

如图7A所示，在肿瘤接种后的第29天(Day29)，EGFRvIII-m28Z组肿瘤抑制率是1.05％±8.37％，EGFRvIII-m28Z+X-ray组肿瘤抑制率是 57.17％±4.24％，X-ray+EGFRvIII-m28Z组肿瘤抑制率是77.22％±11.71％。相对于EGFRvIII-m28Z细胞组，不管是EGFRvIII-m28Z+X-ray组还是 X-ray+EGFRvIII-m28Z组都显著抑制肿瘤生长(EGFRvIII-m28Z vs. X-ray+EGFRvIII-m28Z,P<0.001,One way ANOVA；EGFRvIII-m28Z vs.EGFRvIII-m28Z+X-ray,P<0.001,One way ANOVA)

如图7B所示，相对于EGFRvIII-m28Z组，不管是EGFRvIII-m28Z+X-ray 组还是X-ray+EGFRvIII-m28Z组都显著延小鼠长生存期(EGFRvIII-m28Z vs. EGFRvIII-m28Z+X-ray,P＝0.0012,Log-rank test；EGFRvIII-m28Z vs. X-ray+EGFRvIII-m28Z,P＝0.0005,Log-rank test)。

上述结果显示，不论肿瘤局部辐射治疗在CAR-T之前还是之后给与都能够提高联合治疗的抗肿瘤活性，体现在抑制肿瘤生长、延长个体生存期等。而肿瘤局部辐射治疗是在CAR-T细胞施用之前还是之后对联合治疗的效果影响不大。

实施例6肿瘤局部辐射治疗和EGFRvIII-m28Z CAR-T细胞联合应用对小鼠原位乳腺癌的抗肿瘤治疗作用

(1)C57BL/6小鼠原位乳腺癌模型的建立及分组治疗：

取6-8周龄C57BL/6小鼠(购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司)，将 8×10⁵E0771-EGFR细胞接种于小鼠右侧第四乳腺脂肪垫内构建小鼠原位乳腺癌模型，接种当日记为Day0。接种后第17天(Day17),肿瘤体积为约 100-200mm³，将荷瘤小鼠分为3组(每组6只)；

UT(未处理)细胞组(UT):Day17尾静脉输注1×10⁷未处理的小鼠T细胞；

X-ray+EGFRvIII-m28Z CAR-T组1:Day17肿瘤局部接受10Gy X-ray辐射，且辐射后当天即Day17尾静脉输注1×10⁷EGFRvIII-m28Z CAR-T细胞；

X-ray+EGFRvIII-m28Z CAR-T组2:Day17肿瘤局部接受10Gy X-ray辐射，间隔1天即Day19尾静脉输注1×10⁷EGFRvIII-m28Z CAR-T细胞；

(2)观察记录肿瘤大小，参照对照UT组计算肿瘤抑制率。持续观察并测量小鼠肿瘤体积变化。瘤体积计算公式为：肿瘤体积＝(肿瘤长×肿瘤宽²) /2。记录小鼠生存期，结果如图8A和B所示。

如图8A所示，在肿瘤接种后的第34天(Day34)，X-ray+EGFRvIII-m28Z CAR-T组1肿瘤抑制率是91.16％±6.56％，X-ray+EGFRvIII-m28Z CAR-T组2 肿瘤抑制率是50.99％±43.27％。相对于X-ray+EGFRvIII-m28Z CAR-T组2， X-ray+EGFRvIII-m28Z CAR-T组1能显著抑制肿瘤生长 (X-ray+EGFRvIII-m28Z CAR-T组1vs.X-ray+EGFRvIII-m28Z CAR-T组2 P<0.05,t-test)。

如图8B所示，相对于X-ray+EGFRvIII-m28Z CAR-T组2， X-ray+EGFRvIII-m28ZCAR-T组1能显著延小鼠长生存期 (X-ray+EGFRvIII-m28Z CAR-T组1vs.X-ray+EGFRvIII-m28Z CAR-T组2 P＝0.0494，Log-rank test)。并且，X-ray+EGFRvIII-m28Z CAR-T组1中5只小鼠肿瘤消失，而X-ray+EGFRvIII-m28Z CAR-T组2中仅3只小鼠肿瘤消失。

上述结果显示，相对于肿瘤局部辐射治疗后几天(如间隔1天)给与 CAR-T治疗，肿瘤局部辐射治疗后短时间内(如当天)给与CAR-T治疗能显著提高联合治疗的抗肿瘤活性，体现在抑制肿瘤生长、延长个体生存期且肿瘤消退等。

实施例7肿瘤局部辐射治疗和EGFRvIII-m28Z CAR-T细胞联合应用对小鼠原位乳腺癌的抗肿瘤治疗作用

(1)Balb/c小鼠原位乳腺癌模型的建立及分组治疗：

取6-8周龄Balb/c小鼠(购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司)，将 5×10⁵4T1-EGFR细胞接种于小鼠右侧第四乳腺脂肪垫内构建小鼠原位乳腺癌模型，接种当日记为Day0。接种后第14天(Day14),肿瘤长至100～200mm³，将荷瘤小鼠分为4组(每组6只)：

肿瘤局部辐射治疗组(X-ray):Day14肿瘤局部接受3Gy X-ray辐射，每天一次，连续3天；

EGFRvIII-m28Z CAR-T细胞组(EGFRvIII-m28Z):Day14尾静脉输注 5×10⁶EGFRvIII-m28Z CAR-T细胞；

X-ray+EGFRvIII-m28Z:Day14肿瘤局部接受3Gy X-ray辐射，每天一次，连续3天，在第3天辐射结束的当天(Day16)尾静脉输注5×10⁶EGFRvIII-m28Z CAR-T细胞。

(2)观察记录肿瘤大小，参照对照UT组计算肿瘤抑制率。持续观察并测量小鼠肿瘤体积变化。瘤体积计算公式为：肿瘤体积＝(肿瘤长×肿瘤宽²) /2。记录小鼠生存期，结果如图9A和B所示。

如图9A所示，在肿瘤接种后的第33天(Day33)，EGFRvIII-m28Z组肿瘤抑制率是26.02％±7.92％，X-ray+EGFRvIII-m28Z组肿瘤抑制率是 50.69％±4.29％。相对于EGFRvIII-m28Z组，X-ray+EGFRvIII-m28Z组显著抑制肿瘤生长(EGFRvIII-m28Z vs.X-ray+EGFRvIII-m28Z P<0.01，Two way ANOVA)。

如图9B所示，相对于EGFRvIII-m28Z组，X-ray+EGFRvIII-m28Z CAR-T 组显著延小鼠长生存期(EGFRvIII-m28Z vs.X-ray+EGFRvIII-m28Z P＝0.0386,One way ANOVA)。

上述结果显示，小剂量、多次的给与肿瘤局部辐射治疗也能够提高与CAR-T细胞联合治疗的抗肿瘤活性，体现在抑制肿瘤生长、延长个体生存期等。

实施例8肿瘤局部辐射治疗与EGFRvIII-m28Z CAR-T细胞、免疫检查点抑制剂联合应用对脑胶质瘤皮下移植瘤的抗肿瘤治疗作用

采用小鼠脑胶质瘤细胞系GL261细胞(购自上海瑞鹿生物有限公司)，利用分子生物学常规手段建立过表达嵌合有人EGFR第287-302位氨基酸表位的小鼠EGFR的GL261细胞模型，得到GL261-EGFR细胞。

(1)C57BL/6小鼠脑胶质瘤皮下移植瘤模型的建立及分组治疗：

将1×10⁷GL261-EGFR细胞混合20％的Matrigel皮下注射到6-8周龄 C57BL/6小鼠(购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司)后腿上,接种当日记为Day0，接种后第7天(Day7),肿瘤长至300-500mm³，分7组(每组10只)，实验流程图见图10A：

UT(未处理)细胞组(UT):Day7尾静脉输注2×10⁶未处理的小鼠T细胞；

单独治疗组：(1)肿瘤局部辐射治疗组(X-ray)：Day7肿瘤局部接受2Gy X-ray辐射；(2)EGFRvIII-m28Z CAR-T细胞组(EGFRvIII-m28Z)：Day7尾静脉输注2×10⁶EGFRvIII-m28Z CAR-T细胞；(3)PD-L1抗体组(PD-L1)： Day7、Day9、Day11分别腹腔注射抗PD-L1的抗体(Tecentriq)，每日一次，每次200μg；

联合组：(1)EGFRvIII-m28Z CAR-T+PD-L1抗体组 (EGFRvIII-m28Z+PD-L1)：Day7尾静脉输注2×10⁶EGFRvIII-m28Z CAR-T 细胞；Day7、Day9、Day11分别腹腔注射抗PD-L1的抗体(Tecentriq)，每日一次，每次200μg；(2)肿瘤局部辐射治疗+EGFRvIII-m28Z CAR-T组(X-ray+EGFRvIII-m28Z)：Day7肿瘤局部接受2Gy X-ray辐射；Day9尾静脉输注2×10⁶EGFRvIII-m28Z CAR-T细胞；(3)肿瘤局部辐射治疗+PD-L1抗体+EGFRvIII-m28Z CAR-T组(X-ray+PD-L1+EGFRvIII-m28Z)：Day7肿瘤局部接受2Gy X-ray辐射，当天(Day7)腹腔注射抗PD-L1的抗体(Tecentriq) 200μg；Day9尾静脉输注2×10⁶EGFRvIII-m28Z CAR-T细胞，当天(Day9) 腹腔注射抗PD-L1的抗体(Tecentriq)200μg；Day11腹腔注射抗PD-L1的抗体(Tecentriq)200μg。

(2)观察记录肿瘤大小，参照对照UT组计算肿瘤抑制率。持续观察并测量小鼠肿瘤体积变化。瘤体积计算公式为：肿瘤体积＝(肿瘤长×肿瘤宽²) /2。结果如图10B所示，在肿瘤接种后的第13天(Day13)，EGFRvIII-m28Z 组肿瘤抑制率是5.79％±6.40％，X-ray+EGFRvIII-m28Z组肿瘤抑制率是 30.84％±3.95％，X-ray+PD-L1+EGFRvIII-m28Z组肿瘤抑制率是 43.26％±14.51％。X-ray+EGFRvIII-m28Z组和X-ray+PD-L1+EGFRvIII-m28Z 组相对于EGFRvIII-m28Z组有更好的抑制肿瘤生长的效果(EGFRvIII-m28Z vs.X-ray+EGFRvIII-m28Z P<0.01,One way ANOVA；EGFRvIII-m28Z vs. X-ray+PD-L1+EGFRvIII-m28Z P<0.0001,One way ANOVA)。 X-ray+PD-L1+EGFRvIII-m28Z组相对于X-ray+EGFRvIII-m28Z组有相对较高的肿瘤抑制率(P<0.05,t-test)。上述结果说明PD-1通路的阻断能进一步提高肿瘤局部辐射和CAR-T细胞联合治疗的抑制肿瘤生长的效果。

在上述实施例中，仅仅是作为示例性的，采用了靶向EGFRvIII的鼠抗 (SEQ IDNO：2)、鼠的跨膜域和胞内域等制备的CAR-T，当应用于人体治疗时，常用的可以选择人CD8α信号肽的编码序列(SEQ ID NO：6)、人CD8α铰链区及跨膜区的编码序列(SEQ ID NO：7)、人的CD28跨膜域的编码序列 (SEQ ID NO：10)、人CD28胞内域的编码序列(SEQ ID NO：8)、人CD3ζ胞内域的编码序列(SEQ ID NO：9)进行制备。示例性的，所采用的靶向 EFGRvIII的嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO：20、21、22任一所示。

可替换的，采用的CAR可以是靶向其他抗原的，如GPC3(示例性的，靶向GPC3的嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO：11、12、13、14、15 任一所示)；CLD18A2(示例性的，靶向CLD18A2的嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO：16、17、18、19任一所示)；间皮素(示例性的，靶向间皮素的嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO：23、24、25、26任一所示)。

序列表

<110> 科济生物医药（上海）有限公司上海市肿瘤研究所

<120>免疫效应细胞和辐射联用在治疗肿瘤中的用途

<160> 26

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 81

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

atggcctcac cgttgacccg ctttctgtcg ctgaacctgc tgctgctggg tgagtcgatt 60

atcctgggga gtggagaagc t 81

<210> 2

<211> 720

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

gacatcctga tgacccaatc tccatcctcc atgtctgtat ctctgggaga cacagtcagc 60

atcacttgcc attcaagtca ggacattaac agtaatatag ggtggttgca gcagagacca 120

gggaaatcat ttaagggcct gatctatcat ggaaccaact tggacgatga agttccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tggagccgat tattctctca ccatcagcag cctggaatct 240

gaagattttg cagactatta ctgtgtacag tatgctcagt ttccgtggac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatcaa acgtggtgga ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt 360

ggcggatcgg ccgatgtgca gcttcaggag tcgggaccta gcctggtgaa accttctcag 420

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aacactaggt acaacccatc tctcaaaagt cgaatctcta tcactcgaga cacatccaag 600

aaccaattct tcctgcagtt gaattctgtg actattgagg acacagccac atattactgt 660

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<210> 3

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<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

actactacca agccagtgct gcgaactccc tcacctgtgc accctaccgg gacatctcag 60

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<210> 4

<211> 123

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

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<212> DNA

<213> Homo sapiens

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<210> 11

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<212> PRT

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<400> 11

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr

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Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

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Gly Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ala Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ala Arg Phe Tyr Ser Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr

130 135 140

Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val

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His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly

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Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly

180 185 190

Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

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Gln Ser Ile Tyr Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu

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Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro

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Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

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Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser

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Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala

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Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg

370 375 380

Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu

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Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr

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Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly

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Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln

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Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln

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Ala Leu Pro Pro Arg

465

<210> 12

<211> 466

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ala Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ala Arg Phe Tyr Ser Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

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Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

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Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr

130 135 140

Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val

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His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly

165 170 175

Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly

180 185 190

Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

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Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser

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Gln Ser Ile Tyr Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu

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Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro

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Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu

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Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu

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Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys

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Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly

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Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu

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Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly

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Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser

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Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro

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Pro Arg

465

<210> 13

<211> 511

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

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Gly Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ala Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ala Arg Phe Tyr Ser Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

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Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

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Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr

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Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val

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His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly

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Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly

180 185 190

Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

195 200 205

Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser

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Gln Ser Ile Tyr Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu

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Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro

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Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

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Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser

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Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly

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Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys

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Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val

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Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn

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Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val

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Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln

435 440 445

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

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Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

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<210> 14

<211> 469

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

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Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

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Asn Ala Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

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Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

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65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn

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Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

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Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

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Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe

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Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

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Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly

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Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr

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Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln

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465

<210> 15

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15

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65 70 75 80

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Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

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Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

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Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe

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Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

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Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly

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Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys

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Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn

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Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val

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Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

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Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

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Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

485 490 495

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

500 505 510

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<211> 473

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Ile Lys Pro Ser Gln

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Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

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165 170 175

Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr

180 185 190

Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

195 200 205

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Tyr Tyr Cys Gln Asn Ala Tyr Ser Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly

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Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

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275 280 285

Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala

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Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg

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Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro

325 330 335

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355 360 365

Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu

370 375 380

Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly

385 390 395 400

Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln

405 410 415

Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr

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Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp

435 440 445

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450 455 460

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

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Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly

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Tyr Asn Trp His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

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Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

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Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu

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<212> PRT

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Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Ile Trp His Ser Gly

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245 250 255

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275 280 285

Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val

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Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser

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Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser

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420 425 430

Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg

435 440 445

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Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

485 490 495

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85 90 95

Ala Ser Ser Arg Ser Gly Thr Thr Val Val Asn His Asp Ala Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr

130 135 140

Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile

145 150 155 160

Thr Cys Arg Ala Ser Gln Val Ile Ser Arg Ala Leu Ala Trp Tyr Gln

165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly

225 230 235 240

Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

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275 280 285

Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala

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Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg

305 310 315 320

Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro

325 330 335

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405 410 415

Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr

420 425 430

Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp

435 440 445

Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala

450 455 460

Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

465 470

<210> 25

<211> 470

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

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20 25 30

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50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Ser Arg Ser Gly Thr Thr Val Val Asn His Asp Ala Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr

130 135 140

Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile

145 150 155 160

Thr Cys Arg Ala Ser Gln Val Ile Ser Arg Ala Leu Ala Trp Tyr Gln

165 170 175

Gln Thr Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn

180 185 190

Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

195 200 205

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr

210 215 220

Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly

225 230 235 240

Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

245 250 255

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

260 265 270

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

275 280 285

Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

290 295 300

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg

305 310 315 320

Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln

325 330 335

Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu

340 345 350

Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

355 360 365

Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

370 375 380

Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

385 390 395 400

Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu

405 410 415

Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile

420 425 430

Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr

435 440 445

Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met

450 455 460

Gln Ala Leu Pro Pro Arg

465 470

<210> 26

<211> 515

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 26

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Ser Arg Ser Gly Thr Thr Val Val Asn His Asp Ala Phe Asp

100 105 110

Ile Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr

130 135 140

Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile

145 150 155 160

Thr Cys Arg Ala Ser Gln Val Ile Ser Arg Ala Leu Ala Trp Tyr Gln

165 170 175

Gln Thr Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn

180 185 190

Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

195 200 205

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr

210 215 220

Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly

225 230 235 240

Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

245 250 255

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

260 265 270

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

275 280 285

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290 295 300

Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg

305 310 315 320

Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro

325 330 335

Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro

340 345 350

Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu

355 360 365

Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu

370 375 380

Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys

385 390 395 400

Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln

405 410 415

Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu

420 425 430

Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly

435 440 445

Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu

450 455 460

Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys

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Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu

485 490 495

Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu

500 505 510

Pro Pro Arg

515

Claims

1.治疗肿瘤的方法，其特征在于，对患有肿瘤的个体施用免疫效应细胞和肿瘤局部辐射治疗联合进行治疗,并且对所述的个体不进行淋巴细胞清除，所述免疫效应细胞包含识别所述肿瘤的肿瘤抗原的受体。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，免疫效应细胞施用和肿瘤局部辐射治疗给予时间不分先后；可以先给予肿瘤局部辐射治疗再给予免疫效应细胞施用；也可以同时给与；还可以先给予免疫效应细胞施用再给予肿瘤局部辐射治疗。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述受体选自：嵌合抗原受体(ChimericAntigen Receptor，CAR)、T细胞受体(T cell receptor，TCR)、T细胞融合蛋白(T cellfusionprotein，TFP)、T细胞抗原耦合器(T cell antigen coupler，TAC)或其组合。

4.如权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述局部辐射治疗为采用辐射治疗设备对所述肿瘤进行辐射，

优选的，所述的辐射治疗设备通过产生下述任一射线对所述肿瘤进行辐射：X射线、α射线、β射线、γ射线、中子。

5.如权利要求1至4任一所述的方法，其特征在于，所述辐射治疗设备产生X射线。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述X射线对所述的肿瘤进行至少1次辐射，或多次小剂量辐射。

7.如权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述辐射治疗的射线剂量为介于不高于100Gy之间，优选地不高于80Gy，更为优选地为不高于70Gy。

8.如权利要求1至7任一所述的方法，其特征在于，所述的辐射治疗的能量源位于所述个体的体内或体外。

9.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的嵌合抗原受体包括：

(i)特异性结合所述抗原的抗体或其片段、CD28或CD8的跨膜区、CD28的共刺激信号结构域和CD3ζ；或

(ii)特异性结合所述抗原的抗体或其片段、CD28或CD8的跨膜区、CD137的共刺激信号结构域和CD3ζ；或

(iii)特异性结合所述抗原的抗体或其片段、CD28或CD8的跨膜区、CD28的共刺激信号结构域、CD137的共刺激信号结构域和CD3ζ。

10.如权利要求1-9任一所述的方法，其特征在于：

所述肿瘤抗原选自：促甲状腺激素受体(TSHR)；CD171；CS-1；C型凝集素样分子-1；神经节苷脂GD3；Tn抗原；CD19；CD20；CD 22；CD 30；CD 70；CD 123；CD 138；CD33；CD44；CD44v7/8；CD38；CD44v6；B7H3(CD276)，B7H6；KIT(CD117)；白介素13受体亚单位α(IL-13Rα)；白介素11受体α(IL-11Rα)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；癌胚抗原(CEA)；NY-ESO-1；HIV-1Gag；MART-1；gp100；酪氨酸酶；间皮素；EpCAM；蛋白酶丝氨酸21(PRSS21)；血管内皮生长因子受体,血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；路易斯(Y)抗原；CD24；血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；细胞表面相关的粘蛋白1(MUC1)，MUC6；表皮生长因子受体家族及其突变体(EGFR，EGFR2，ERBB3，ERBB4，EGFRvIII)；神经细胞粘附分子(NCAM)；碳酸酐酶IX(CAIX)；LMP2；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸基路易斯粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer；TGS5；高分子量黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；邻乙酰基GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体；肿瘤血管内皮标记1(TEM1/CD248)；肿瘤血管内皮标记7相关的(TEM7R)；Claudin 6，Claudin18.2、Claudin18.1；ASGPR1；CDH16；5T4；8H9；αvβ6整合素；B细胞成熟抗原(BCMA)；CA9；κ轻链(kappa light chain)；CSPG4；EGP2，EGP40；FAP；FAR；FBP；胚胎型AchR；HLA-A1，HLA-A2；MAGEA1，MAGE3；KDR；MCSP；NKG2D配体；PSC1；ROR1；Sp17；SURVIVIN；TAG72；TEM1；纤连蛋白；腱生蛋白；肿瘤坏死区的癌胚变体；G蛋白偶联受体C类5组-成员D(GPRC5D)；X染色体开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH glycoceramide的己糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；uroplakin 2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；pannexin 3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物基因座K9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；ETS易位变异基因6(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie2)；黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；p53突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；细胞凋亡的黑素瘤抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；V-myc鸟髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生的同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C(RhoC)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS)；由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；proacrosin结合蛋白sp32(OYTES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚定蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤X断点2(SSX2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有EGF样模块粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。

11.如权利要求1-10任一所述的方法，其特征在于，所述的免疫效应细胞选自特异识别EGFR、EGFRvIII、GPC3、Claudin18.2的CAR-T细胞。

12.如权利要求1-11任一所述的方法，其特征在于，所述的特异性识别肿瘤抗原的抗体具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

13.如权利要求3-11任一所述的方法，其特征在于，所述的嵌合抗原受体具有SEQ IDNO:11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26所示的氨基酸序列。

14.如权利要求1-13任一所述的方法，其特征在于，所述的免疫效应细胞施用在所述的肿瘤局部辐射治疗之后当天，或1天、2天、或3天后。

15.如权利要求1-14任一所述的方法，其特征在于，还包括给所述个体施用免疫检查点(immune checkpoint)抑制剂；优选地，所述免疫检查点抑制剂是生物学治疗剂或小分子；更优选地，所述免疫检查点抑制剂选自单克隆抗体、人源化抗体、全人抗体、融合蛋白或其组合。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂针对的免疫检查点选自下述的免疫检查点蛋白质：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK 1、CHK2、A2aR和B-7家族配体或其组合；优选地，所述免疫检查点抑制剂是PD-1或PDL-1抑制剂。

17.如权利要求15或16所述的方法，其特征在于，所述免疫检查点抑制剂与选自下述的免疫检查点蛋白质的配体相互作用：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK 1、CHK2、A2aR和B-7家族配体或其组合。

18.如权利要求15-16任一所述的方法，其特征在于，所述免疫效应细胞选自特异识别EGFR、EGFRvIII、GPC3、Claudin18.2的CAR-T细胞，所述免疫检查点抑制剂为特异识别PD-1或PD-L1的单克隆抗体。

19.如权利要求15-18任一所述的方法，其特征在于，包括在所述肿瘤局部辐射治疗之前、同时或之后，或在所述免疫效应细胞治疗之前、同时或之后，给予所述个体施用所述免疫检查点抑制剂；优选地，所述免疫效应细胞和所述免疫检查点抑制剂同时施用。

20.如权利要求1-19任一所述的方法，其特征在于，所述方法的治疗效果通过免疫效应细胞的存在、或指示T细胞炎症的基因标记的存在或其组合预测，优选地，通过检测IFN-γ水平变化来预测。

21.如权利要求1-20任一所述的方法，其特征在于，其中所述肿瘤包括：乳腺癌，血液癌症，结肠癌，直肠癌，肾细胞癌，肝癌，肺的非小细胞癌，小肠癌，食道癌，黑素瘤，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，脑胶质瘤，头颈癌，皮肤或眼内恶性黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛区癌，胃癌，睾丸癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，阴户癌，霍奇金氏病，非霍奇金淋巴瘤，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，儿童实体瘤，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾盂癌，中枢神经系统(CNS)瘤，原发性CNS淋巴瘤，肿瘤血管发生，脊椎肿瘤，脑干神经胶质瘤，垂体腺瘤，卡波西肉瘤，表皮样癌，鳞状细胞癌，T细胞淋巴瘤，环境诱发的癌症，所述癌症的组合和所述癌症的转移性病灶。

22.如权利要求1-21任一所述的方法，其特征在于，所述的免疫效应细胞包括：T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞或骨髓源性吞噬细胞或其组合；优选地，所述免疫效应细胞选自自体T细胞、同种异体T细胞或同种异体NK细胞，更优选地，所述T细胞为自体T细胞。

23.免疫效应细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述免疫效应细胞包含识别所述肿瘤的肿瘤抗原的受体，所述药物与肿瘤局部辐射治疗联合施用，包括同时或先后施用，患有所述肿瘤的个体接受所述免疫效应细胞和/或所述肿瘤局部辐射治疗时体内淋巴细胞数目相对于入组所述肿瘤治疗时不低于40％。

24.如权利要求23所述的应用，其特征在于，所述受体选自：嵌合抗原受体(ChimericAntigen Receptor，CAR)、T细胞受体(T cell receptor，TCR)、T细胞融合蛋白(T cellfusionprotein，TFP)、T细胞抗原耦合器(T cell antigen coupler，TAC)或其组合。

25.如权利要求23或24所述的应用，其特征在于，所述局部辐射治疗为采用辐射治疗设备对所述肿瘤进行辐射，

26.如权利要求23至25任一所述的应用，其特征在于，所述辐射治疗设备产生X射线。

27.如权利要求26所述的应用，其特征在于，所述X射线对所述的肿瘤进行至少1次辐射，或多次小剂量辐射。

28.如权利要求23-27任一所述的应用，其特征在于，所述辐射治疗的射线剂量为介于不高于100Gy之间，优选地不高于80Gy，更为优选地为不高于70Gy。

29.如权利要求23至28任一所述的应用，其特征在于，所述的辐射治疗的能量源位于所述个体的体内或体外。

30.如权利要求24所述的应用，其特征在于，所述的嵌合抗原受体包括：

31.如权利要求23-30任一所述的应用，其特征在于，所述的免疫效应细胞选自特异识别EGFR、EGFRvIII、GPC3、Claudin18.2的CAR-T细胞。

32.如权利要求23-31任一所述的应用，其特征在于，所述的特异性识别肿瘤抗原的抗体具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

33.如权利要求24-32任一所述的应用，其特征在于，所述的嵌合抗原受体具有SEQ IDNO:11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26所示的氨基酸序列。

34.如权利要求23-33任一所述的应用，其特征在于，所述药物施用在所述的肿瘤局部辐射治疗之后当天，或1天、2天、或3天后。

35.如权利要求23-34任一所述的应用，其特征在于，还包括给所述个体施用免疫检查点(immune checkpoint)抑制剂；优选地，所述免疫检查点抑制剂是生物学治疗剂或小分子；更优选地，所述免疫检查点抑制剂选自单克隆抗体、人源化抗体、全人抗体、融合蛋白或其组合。

36.如权利要求35所述的应用，其中所述免疫检查点抑制剂针对的免疫检查点选自下述的免疫检查点蛋白质：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK 1、CHK2、A2aR和B-7家族配体或其组合；优选地，所述免疫检查点抑制剂是PD-1或PDL-1抑制剂。

37.如权利要求23-36任一所述的应用，其特征在于，其中所述肿瘤包括：乳腺癌，血液癌症，结肠癌，直肠癌，肾细胞癌，肝癌，肺的非小细胞癌，小肠癌，食道癌，黑素瘤，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，脑胶质瘤，头颈癌，皮肤或眼内恶性黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛区癌，胃癌，睾丸癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，阴户癌，霍奇金氏病，非霍奇金淋巴瘤，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，儿童实体瘤，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾盂癌，中枢神经系统(CNS)瘤，原发性CNS淋巴瘤，肿瘤血管发生，脊椎肿瘤，脑干神经胶质瘤，垂体腺瘤，卡波西肉瘤，表皮样癌，鳞状细胞癌，T细胞淋巴瘤，环境诱发的癌症，所述癌症的组合和所述癌症的转移性病灶。

38.如权利要求23-37任一所述的应用，其特征在于，所述的免疫效应细胞包括：T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞或骨髓源性吞噬细胞或其组合；优选地，所述免疫效应细胞选自自体T细胞、同种异体T细胞或同种异体NK细胞，更优选地，所述T细胞为自体T细胞。