CN105420262A - pEgr-IL18-B7.2双基因共表达质粒的构建及其在联合辐射抗肿瘤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种pEgr-IL18-B7.2双基因共表达质粒的构建及其在联合辐射抗肿瘤中的应用，根据肿瘤的基因-放射治疗理论及Egr-1基因的辐射诱导表达特性，在克隆小鼠B7.2基因的基础上，构建了双基因共表达质粒pEgr-IL18-B7.2。通过双基因载体，把有抗肿瘤作用的IL18基因及共刺激分子B7-2基因转染肿瘤细胞，本发明进一步证明了低剂量辐射可以诱导辐射敏感启动子从而对多基因表达起更精细调控的作用；辐射诱导双基因的表达呈现一定的时程和量效规律。本实验还把构建的双基因质粒注射于小鼠移植的B16黑色素瘤的瘤体，配合局部放射治疗，表现了比单纯放疗更加显著的抑瘤效果。并对可能的免疫学方面机理做了初步探讨。

Description

pEgr-IL18-B7.2双基因共表达质粒的构建及其在联合辐射抗肿瘤中的应用

技术领域

本发明涉及肿瘤基因治疗技术领域，具体涉及一种pEgr-IL18-B7.2双基因共表达质粒的构建及联合辐射抗肿瘤应用。

背景技术

恶性肿瘤在当代是威胁人类健康的主要原因之一。目前，放射治疗仍然是临床治疗肿瘤的主要方法之一。放射治疗随着放射物理学及放射生物学的不断发展，几十年来其疗效已经取得到巨大提高。但放疗仍然存在其自身的缺点和困难，例如，放疗后肿瘤的复发和转移，放疗对自身正常组织的损伤等，对肿瘤患者的生存造成威胁。恶性肿瘤发生发展机制十分复杂，是一个多因素、多环节、多阶段及多基因的复杂疾病，单一疗法疗效往往欠佳，因此肿瘤综合治疗仍然是当今肿瘤防治研究的热点。近年来随着分子生物学研究的迅速发展及“人类基因组计划”的实施，基因治疗越来越受到人们的极大关注。特别是基因疗法和放射治疗联合治疗给肿瘤患者重生带来希望。

肿瘤的基因-放射治疗(gene-radiotherapy)是近年来兴起的、有效解决放射治疗和基因治疗各自的难点和薄弱环节的综合治疗肿瘤的新方法。基因-放射治疗理论的确立为肿瘤放射治疗和基因治疗的结合开辟了新途径。特别是随着功能基因组学的发展、有效治疗基因的筛查和表达调控的进一步研究，为肿瘤基因放射治疗的探索提供了科学的研究方向。

美国哈佛大学和芝加哥大学的研究者最早进行了肿瘤基因治疗联合放射治疗的实验研究，将治疗基因克隆于可被辐射诱导激活的Egr-1启动子下游，通过转染，将具辐射诱导表达特性的治疗基因转入瘤体内，在对肿瘤实施局部放疗时诱导肿瘤杀伤基因的表达，形成射线和基因对肿瘤的双重杀伤作用。一方面可以相对降低有效照射剂量，缓解正常组织的损伤；另一方面通过射线的局部照射来实现肿瘤杀伤基因的定位表达，对治疗基因的表达进行时空调控。以往的实验结果表明，下游治疗基因的选择对实现这一治疗方案，提高基因-放射治疗效果至关重要。

共刺激分子B7是参与T细胞活化的重要粘附分子，表达于大部分抗原递呈细胞表面，与T细胞表面的CD28相互作用使IL-2等淋巴因子的mRNA转录增强，为激发T细胞免疫反应提供第二信号，大多数肿瘤细胞不表达B7分子，因而逃避了免疫细胞的监视。IL-18又称干扰素γ诱生因子(IGIF)，具有抗感染、抗肿瘤、抗超敏反应等作用。目前IL-18在肿瘤治疗中的意义的研究已成为新的热点，认为IL-18通过细胞毒作用、参与粘附分子调节、抑制肿瘤血管生成等多种途径发挥其抗肿瘤作用。实践表明，单一一种基因治疗作用较弱。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供一种pEgr-IL18-B7.2双基因共表达质粒的构建及其在联合辐射抗肿瘤中的应用，本发明构建了双基因共表达质粒pEgr-IL18-B7.2，通过双基因载体，把有抗肿瘤作用的IL18基因及共刺激分子B7-2基因转染肿瘤细胞，在分子水平检测IL18及B7.2表达显著增高，表现了比单纯放疗更加显著的抑瘤效果，还可明显提高免疫力，机体抑瘤能力显著增高。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种pEgr-IL18-B7.2双基因共表达重组质粒的构建，包括以下步骤：

S1、取PIRES载体，用XbaI及SmaI酶切，另取连接B7-2基因的T载体，用PstI酶切，得到pIRES载体和B7-2基因片断，粘端补平，然后把B7-2基因连接到pIRES上，得到第一中间质粒pIRES-B7-2；

S2、分别用BamHI和XbaI酶切pIRES-B7-2质粒和KS-IL18质粒，补平粘端，再用EcoRI酶切，得到pIRES-B7-2和IL18片断，把IL18基因连接到pIRES-B7-2上，得到第二中间质粒pIRES-IL18-B7-2；

S3、用SacI酶切质粒pIRES-IL18-B7-2，补平，电泳回收，得到IL18-B7-2大片断，用EcoRV酶切质粒pcDNA3.1-Egr-1，去磷，把大片段IL18-B7-2连接到pcDNA3.1-Egr-1上，得到双基因表达质粒pcDNA3.1-Egr-IL18-B7-2，即可。

优选的，所述mIL-18和mB7-2基因分别定向克隆至IRES前后插入位点，从而使mIL-18和mB7-2基因在同一载体上获得良好相关表达。pEgr-IL18-B7.2双基因共表达重组质粒在联合辐射抗肿瘤中的应用，将所述重组质粒体外转染B16黑色素瘤细胞，经0.1～6.0Gy剂量的X射线照射后体外激活Egr-1启动子诱导mIL-18和B7-2表达。

优选的，所述X射线照射剂量为0.5～5.0Gy。

优选的，所述pEgr-IL18-B7.2双基因能够提高机体免疫活性，增强NK和CTL细胞毒效应，刺激T细胞和腹腔巨噬细胞分泌IFN-γ和TNF-α，肿瘤局部B7-2的表达增强免疫细胞对肿瘤细胞的识别杀伤能力。

(三)有益效果

本发明提供了一种pEgr-IL18-B7.2双基因共表达质粒的构建及其在联合辐射抗肿瘤中的应用，本发明以多基因表达载体为基因导入系统，把有抗肿瘤作用的IL18基因及共刺激分子B7-2基因转染肿瘤细胞，通过辐射诱导使之表达IL18及B7.2分子，增强肿瘤的免疫原性，提高机体抗肿瘤的免疫功能；通过基因-放射治疗不仅实现了放疗、免疫及基因治疗的协同作用，而且达到了对基因表达的时空调控的目的；本发明可为恶性肿瘤患者提供一个特异、靶向性的多基因联合治疗模式，并为临床应用奠定理论和实验基础。

附图说明

图1为RT-PCR扩增小鼠mB7-2的cDNA，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测得到的930bp片段图；

图2为质粒pcDNA3.1-CMV-B7-2的酶切鉴定图；

图3为质粒pcDNA3.1-Egr-B7-2的鉴定图；

图4为质粒pcDNA3.1-Egr-IL18-B7-2的鉴定图；

图5为不同剂量X射线照射8h后重组质粒转染的B16细胞表面B7.2蛋白表达变化图；

图6为不同剂量X射线照射8h后重组质粒转染的B16细胞上清中IL18表达变化图；

图7为5Gy剂量X线照射C57/BLBC小鼠接种B16细胞后长出的黑色素瘤，基因放射治疗抑瘤作用图；

图8为C57/BLBC小鼠接种B16细胞后长出的黑色素瘤，基因放射治疗后脾CTL细胞毒性活性的变化图；

图9为C57/BLBC小鼠接种B16细胞后长出的黑色素瘤，基因放射治疗后脾NK细胞毒性活性的变化。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例及附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一、材料与方法

1、主要试剂及器材

1.1试剂

1.2器材

2、仪器

3、质粒与菌种

双基因共表达质粒pIRES1neo购自BD公司，pMD18-T、pcDNA3.1(+)、pGL3-Egr1-EnhancerVector、pEgr-1由田梅博士惠赠，pBlueminusKS(-)-IL18由金光辉博士惠赠，感受态大肠杆菌DH5α由本实验室保存。

4、细胞株

B16：恶性黑色素瘤细胞，由本实验室保存，体外完全培养基传代培养。

YAC-1细胞：小鼠T淋巴瘤，由本实验室保存，体外完全培养基传代培养。

L929细胞：小鼠成纤维细胞，本实验室保存，体外完全培养基传代培养。

5、实验动物

C57BL/6J纯系小鼠，一级，雌性，体重18±2g，健康，购自北京大学医学部实验动物部。

6、照射条件

用国产X射线深部治疗机进行照射，电压200kV，电流10mA，滤板为0.5mmCu和1.0mmAL。低剂量照射时靶皮距243.7cm，剂量率12.5mGy·min-1；高剂量照射时靶皮距50cm，剂量率0.287Gy·min-1。

7、病毒及其处理

滤泡性口炎病毒(VSV)由卫生部生物制品所传代保存。

VSV增殖：待L929细胞长成单层后加入400TCID50/mlVSV病毒液(TCID:tissuecultureinfectiondoses,病毒攻击细胞发生50％病变的病毒稀释液的倒数)，设无病毒对照组，待对照瓶中L929细胞生长良好，而病毒瓶中L929细胞几乎全部发生病变时(36～48h)，将病变细胞置-20℃过夜，次日将其融解，用吸管猛烈吹打，离心3000rpm,20min,取上清，测定TCID50后于-20℃贮存备用。

8、分子生物学实验方法

8.1引物设计及合成

根据小鼠B7-2的cDNA序列设计PCR引物(由TaKaRa公司合成)。

B7-2：有义链引物：5’-AACTTACGGAAGCACCCACG–3’

反义链引物：5’-CTCTCACTGCCTTCACTCTGC-3’

8.2脾细胞总RNA的提取及质量鉴定

取健康6周龄的昆明小鼠脾脏，于RPMI1640培养液(无FBS)中用毛玻璃研磨洗2次，取2×106脾细胞，用RNA提取试剂盒说明书提取小鼠脾细胞总RNA。紫外分光光度计测定RNA纯度及含量，A260与A280比值在1.8～2.0之间，基本无蛋白质污染。RNA经甲醛变性琼脂糖凝胶电泳后，28S与18S区带清晰集中，28S与18S比值大于2，则表明RNA样品未降解。

8.3RT-PCR法钓取B7-2全长序列

参照TaKaRaone-stepRNAPCRkit试剂盒说明书，以2μg总RNA为模板进行RT-PCR，循环参数为：50℃15min，94℃2min，(94℃30Sec，60℃30Sec，72℃1min)25个循环，72℃10min。

8.4RT-PCR产物鉴定及测序

0.8％的琼脂糖凝胶电泳，以DNAMarker比较特异片段长度，收取930bp大小的基因片段，与pMD18-T载体连接，以ABI自动测序仪对克隆片段进行双向测序分析。根据RT-PCR法获得的mIL-18cDNA序列，推导出其相应的蛋白质序列，并通过BLAST方法与数据库中的序列进行同源性比较。

8.5重组表达载体构建

8.5.1转化

8.5.1.1大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙)

以无菌接种环刮取冻存于-70℃冰箱的大肠杆菌菌种，划线接种于不含氨苄青霉素(Amp)的LB琼脂平板，37℃培养16h左右；挑取单一菌落接种到100mlLB培养基中，37℃150r/min振摇培养至OD600＝0.4～0.6；在无菌条件下将细菌培养液转移到两个无菌、冰预冷的聚丙烯离心管中(以下操作均需无菌)，冰浴10min，培养物冷却到0℃；4℃、4000r/min离心10min，弃上清；以10ml冰预冷的75mmol/LCaCl2,10mmol/LtrisCl(pH6.5)溶液重悬每管沉淀，冰浴10min；4℃、4000r/min离心10min，收集菌体，经2ml冰预冷的含15％(v/v)甘油的CaCl2重新悬浮菌体，将感受态细胞分装于无菌微量离心管中，每管200μl；标明菌株，体积和日期，置-70℃冰箱冻存备用。

8.5.1.2质粒转化

将适量质粒(质粒<1ug，连接产物<20μl，DNA<50ng)加入200μl感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；42℃水浴热冲击90sec，冰浴冷却2min；加到200μl37℃预热的LB培养基中，37℃150r/min振摇培养50min，取培养液均匀涂于含Amp(50μg/ml)的LB琼脂平板，37℃培养14～16h后，出现转化菌落。

8.5.2质粒扩增

8.5.2.1质粒的小量制备(碱裂解法)

挑取单个转化菌落，接种到2ml含Amp(50μg/ml)的LB培养液中，37℃180r/min振摇培养12～16h；将1.5ml转入微量离心管中，12000r/min离心30sec，弃上清；以200μl冰预冷的溶液I(50mmol/L葡萄糖；25mmol/LTris.Cl，pH8.0；10mmol/LEDTA，pH8.0)重悬沉淀；加入200μl新配制的溶液II(0.2mol/LNaOH，1％SDS)，颠倒数次混匀，加入200μl用冰预冷的溶液III(3molKAc,5mol冰乙酸)，颠倒混匀，4℃1200r/min离心10min，取上清，分别用等量饱和酚/氯仿/异戊醇/(25:24:1)，氯仿/异戊醇(24:1)，各抽取一次；加2倍体积冷无水乙醇，混合均匀，置-20℃30min，4℃12000r/min离心10min，弃上清，沉淀用70％冷乙醇洗涤抽干。以20μl含终浓度20μl/mlRNA酶(无DNA酶)的TE(10mmol/LTris.Cl，pH8.0，下同)溶解沉淀，并于37℃水浴中作用30min，琼脂糖凝胶电泳检查或-20℃保存。

8.5.2.2质粒的大量制备

将含有目的质粒的细菌接种于100ml含Amp(50μg/ml)LB培养液中，37℃250r/min振摇培养16～18h；冰浴10min,4℃4000r/min离心10min，弃上清，沉淀用20ml预冷的特殊TE(STE,10mmol/L,Tris.Cl,pH8.0；50mmol/LEDTA,pH8.0)洗涤一次，4000r/min离心10min，弃上清；用4ml预冷的溶液I重悬沉淀，加8ml新配的溶液II充分混匀，冰浴10min后，加6ml预冷的溶液III终止反应，冰浴10min，4℃7000r/min离心15min；取上清，加0.6倍体积的异丙醇，室温作用30min；4℃7000r/min离心15min，弃上清，以适量TE(pH8.0)溶解沉淀后，加等体积的氯化锂充分混匀，8000r/min离心15min，取上清；加2倍体积的100％冷乙醇，-20℃沉淀30min，4℃12000r/min离心10min，弃上清，沉淀用70％冷乙醇洗涤并抽干；以适量TE(pH8.0)溶解沉淀后，加无DNA酶的RNA酶(10mg/ml)至终浓度20μg/ml，37℃作用30min；加等体积13％聚乙二醇溶液(PEG8000，2.5mol/NaCl)，4℃静置过夜；4℃12000r/min离心10min，弃上清；加400μlTE(pH8.0)溶解沉淀，用等体积的酚，酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，氯仿/异戊醇(24:1)各抽取一次，加0.1倍体积3MNaAc(pH5.2)，2倍体积100％冷乙醇，混匀后-20℃静止30min以上，4℃12000r/min离心10min，弃上清，沉淀用70％冷乙醇洗涤并抽干，溶于适量TE(PH8.0)中，-20℃保存。

8.5.2.3质粒DNA的定量

以TE(pH8.0)为空白对照，紫外线可见分光光度计测定波长260nm和280nm下的核酸溶液光密度(OD)值，OD260＝1相当于含质粒大约50μg/ml，双链DNA纯品的OD260/OD280值为1.8，如样品OD260/OD280值明显低于1.8，则可能有蛋白质或酚污染，需要进一步纯化。

8.5.3琼脂糖凝胶电泳

用0.5×TBE电泳缓冲液(0.045mol/Ltris-硼酸，0.001mol/LEDTA)配1％(w/v)琼脂糖凝胶溶液，微波炉加热至琼脂糖完全溶解后，加EB(10mg/ml)至终浓度0.5μg/ml、混匀；倒入封固好的胶模中，插入相应的梳子，梳子距底板1.0mm左右，待胶完全凝固，小心移去梳子，将凝胶放入装有0.5×TBE电泳缓冲液的电泳槽中，取适量DNA样品在封口膜上与适量体积加样缓冲液(0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青FF，40％蔗糖)混匀，用微量加样器将样品加到梳孔中，以5v/cm的电压电泳，当溴酚蓝电泳至适当位置，在长波紫外灯下观察结果和拍照。

8.5.4限制性内切酶酶切反应

8.5.4.1单酶切反应

将1μg质粒与适量水混匀，加入2～3单位限制性内切酶及2μl相应的10×限制性内切酶反应缓冲液，反应体系为20μl，轻弹管壁混匀并离心，置最适反应温度恒温2～3h，琼脂糖凝胶电泳检查。对大量质粒DNA的酶切反应，相应扩大限制性内切酶用量和反应体系，取少量反应液电泳检查，完全酶切后，-20℃保存，以备进一步鉴定或回收片段之用。

8.5.4.2双酶切反应

选择反应活性等于或接近的同一缓冲系统中进行双酶切反应，若温度或缓冲系统不同，则按先低温后高温，先低盐后高盐的顺序进行；或第一酶切反应完成后，酚/仿抽提，乙醇沉淀后，再进行第二酶切反应。

8.5.5DNA片段回收

用琼脂糖凝胶电泳将目的DNA与其它DNA尽可能分开，用干净的手术刀切下含所要回收DNA的琼脂块，放入1.5ml离心管中；每100mg琼脂糖凝胶中或100μl的DNA溶液中加入400μlBindingBuffer，置于60℃水浴中10min，使凝胶彻底融化；将融化的胶溶液转移到套放于2ml收集管的UNIQ-10柱中，室温放置2min，8000rpm室温离心1min，取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中废液，将UNIQ-10柱放回收集管中，加入500μlWashsolution，10,000rpm室温离心15sec；将UNIQ-10柱放入新的洁净1.5ml离心管中，在柱膜中央加30μlElutionBuffer，室温放置2min，10,000rpm离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段。

8.5.6连接反应

8.5.6.1DNA片段的3’凹端补平

在9μl反应体系中，加入1.7mmol/ldNTP1μl、0.1％BSA1μl和T4DNAPolymeraseBuffer1μl，先在70℃进行5min保温后，移入37℃恒温箱中，加入1μlT4DNAPolymerase，37℃反应5min，剧烈震荡使酶失活。

8.5.6.2线性质粒DNA末端去磷酸化

在50μl反应体系中，分别加入完全消化的质粒DNA约1～20pmol，5μl10×CIAP缓冲液和1μlCIAP，混匀后至37℃水浴30min；补加1μlCIAP，1μlCIAP缓冲液，8μl水，55℃水浴45min；加0.5mol/LEDTA(pH8.0)至终浓度5mmol/L，终止反应；75℃水浴灭活10min；反应降至室温后，用等量酚/仿抽提，乙醇沉淀，以10μlTE(pH8.0)溶解后，置-20℃保存。

8.5.6.3粘端连接

取0.5μg回收的载体DNA，加3～5倍摩尔量的外源DNA片段，3μl10×T4DNALigaseBuffer，最后加入1μlT4DNALigase，反应体系为30μl，混匀并离心，16℃连接16h，取15μl连接反应液转化E.coli感受态细胞。

8.5.6.4平端连接

取0.1μl平末端去磷后的载体DNA，加入5～8倍量的平端目的DNA片段，3μl10×T4DNALigaseBuffer，加入1μlT4DNALigase，反应体系为30μl，混匀并离心，16℃连接20～24h，取20μl连接反应液转化E.coli感受态细胞。

8.5.7重组子的鉴定

8.5.7.1重组子的快速鉴定

用无菌牙签挑取氨苄青霉素抗性菌落，涂抹于对应编号的氨苄LB平板上，37℃16～20小时培养，再用无菌牙签挑取相应编号的菌苔到微量离心管中，每管加入30μl1×裂解缓冲液(100mmol/LNAOH，5mmol/LEDTApH8.0，0.5％(W/V)SDS，0.025％溴酚蓝，5％甘油)，在旋涡振荡器上剧烈振荡，室温放置5分钟，进行DNA电泳。当溴酚蓝指示剂泳至凝胶全长的2/3时，置紫外灯下观察质粒大小。比对照载体质粒大的即为快速鉴定的阳性重组子。

8.5.7.2重组子的酶切筛选和鉴定

将连接产物转化DH5α，均匀涂于含相应抗生素的琼脂板，37℃培养12～16h，分别取单菌落于2ml含相应抗生素的LB培养液中，小量制备质粒DNA。选择1～2种合适的限制性内切酶单独或组合消化，琼脂糖凝胶电泳分析，所有的酶切结果与预计完全相同者，即为目的重组质粒。

9、目的基因的表达

9.1转染

质粒转染细胞采用脂质体转染法(按照说明书推荐的方法进行)，细胞用含10％小牛血清的培养基培养，5×105个细胞/孔接种6孔板；次日细胞达50～80％的融合时，在无菌玻璃试管中制备下列溶液，溶液A：将5μg质粒DNA溶于100μl无血清培养基中，溶液B：5μl(10μg)lipofectAmine溶于100μl无血清培养基中；合并溶液A和溶液B，轻轻混合，置室温45min。弃去细胞培养液，用无血清培养基洗涤细胞2次；加0.8ml无血清培养基至lipofectAmine/DNA混合物中，混匀后，小心滴加至细胞上；37℃5％CO2培养箱培养5h，补加1ml含20％小牛血清的完全培养基继续培养18h，弃去转染液，加2ml完全培养基，继续培养，进行下一步实验。

9.2流式细胞术检测细胞膜表面mB7-2蛋白质表达

以胰酶消化单层贴壁细胞，PBS洗细胞，1500rpm离心5分钟，重复2次，加到预冷的70％乙醇中4℃过夜固定。上机检测前，以PBS洗细胞，1500rpm离心5分钟，重复2次，洗去乙醇，每份样品加第一抗体50μl(1:100稀释)，4℃闭光反应45分钟，PBS洗2次，1500rpm离心5分钟；加入第二抗体Goatanti-rabbitIgG-FITC50μl(1:100稀释，)4℃闭光反应45分钟，PBS洗2次；加PBS100μl。每一样品均设非特异对照组，以PBS代替一抗，其余步骤同上，第一、二抗体均为用前现配。采用美国B-D公司生产的FACScan流式细胞仪进行检测，激发光源为15mW氩离子激光，波长488nm。应用间接荧光法进行检测，FACS软件收集细胞，Lysis软件分析处理数据，记录阳性细胞百分率，减去非特异对照值。

9.3ELISA法检测细胞上清中mIL-18蛋白质表达

按BDMouseIL-18set试剂盒说明书进行操作：每孔加100μl稀释的捕获抗体，4℃过夜，用PBS洗液(含0.1％Tween-20)洗3次；200μl封闭液室温封闭1h，PBS洗液洗3次；稀释标准品，每管浓度各为2000pg/L、1000pg/L、500pg/L、250pg/L、125pg/L、62.5pg/L、31.25pg/L，标准品和样品每孔各加100μl，室温放置2h，PBS洗液洗5次；加100μl/孔抗小鼠IL-18检测抗体，室温放置1h，用PBS洗5次；加辣根过氧化物酶链亲和素，室温放置30min，PBS洗7次；TMB室温显色30min,用50μl2mol/LH2SO4终止反应，用酶标光度计测A450nm和A570nm吸光度值，A450nm-A570nm，以减去本底,用CurveExpert1.3软件绘制标准曲线，计算转染细胞的IL-18分泌量。

9.4动物模型的建立

9.4.1接种肿瘤和动物分组

于小鼠右后肢皮下接种肿瘤细胞5×105个/100μl，待肿瘤直径达5～8mm左右时将动物随机分组。治疗组和空白质粒对照组分别于肿瘤内注射质粒(每次注射质粒量均为50μg/100μl)，对照组于瘤内注射等体积0.9％的生理盐水。

9.4.2肿瘤测量、体积和相对生长速率的计算

用游标卡尺测量小鼠皮下肿瘤，隔日测量一次，分别量取肿瘤的长径(L)和短径(W)，根据公式V＝L×W2/2计算肿瘤体积。肿瘤相对生长速率＝生长后体积V2/初次测量体积V1。

9.5免疫学指标检测

9.5.1脾脏单细胞悬液的制备

断头处死小鼠，无菌条件下取出脾脏，置于含RPMI1640培养基的平皿中；毛玻片研磨，200目尼龙网过滤制成单细胞悬液，1500rpm离心5min；弃上清，用Hank’s液洗涤细胞两次；重悬于含10％小牛血清的RPMI1640培养基中，计数，调至2×107个细胞/ml，备用。

9.5.2脾细胞特异性CTL细胞毒活性检测

取体外传代处于对数生长期的B16细胞2×106，加入740kBq/20μl的3H-TdR,混匀后置37℃5％CO2条件下培养4h，每0.5h振荡1次，标记后用Hank’s液充分洗涤细胞三次，洗去游离的3H-TdR，计数后调细胞浓度至4×105个细胞/ml。于96孔板中每孔加100μl(2×106个细胞)脾细胞，50μl(2×104个细胞)3H-TdR标记的靶细胞，双复孔，设自发释放对照孔，37℃5％CO2条件下培养18h后收集细胞于玻璃纤维滤膜上，烤干，液闪测cpm值,按下列公式计算特异性CTL杀伤活性。CTL杀伤活性＝(1-实验孔cpm/自发释放孔cpm)×100％。

9.5.3脾脏NK细胞毒活性检测

取处于对数生长期的Yac-1细胞2×106个，加入740kBq/20μl的3H-TdR,混匀后置37℃5％CO2条件下培养4h，每0.5h振荡1次，标记后用Hank’s液充分洗涤细胞三次，洗去游离的3H-TdR，计数后调细胞浓度至4×105个细胞/ml。于96孔培养板中每孔加入100μl(2×106个细胞)脾细胞，50μl(2×104个细胞)3H-TdR标记的靶细胞，双复孔，设自发释放对照孔，37℃5％CO2条件下培养18h后收集细胞于玻璃纤维滤膜上，烤干，液闪测cpm值,按下列公式计算特异性NK杀伤活性。NK杀伤活性＝(1-实验孔cpm/自发释放孔cpm)×100％

9.5.4IFN-γ的诱生和活性检测

在24孔培养板中每孔加0.5ml(1×107个细胞)脾细胞和20μg/ml的ConA0.5ml，在37℃5％CO2条件下培养48h后收集上清待测。

采用细胞病变效应抑制法检测IFN-γ活性。于96孔培养板中每孔加入稀释的待测上清50μl，细胞对照孔和病毒对照孔各加等量培养液，加入L929细胞50μl/孔(4×104个细胞)，37℃5％CO2条件下培养24h后弃上清，加入VSV病毒液(250TCID50)100μl/孔，细胞对照孔加入等量培养液，继续培养36～48h(细胞对照孔细胞状态良好，病毒对照孔细胞几乎全部发生病变)，弃上清，加入50μl/孔结晶紫染液，37℃孵育0.5h后用自来水轻轻冲去染料，自然干燥后每孔加入100μl脱色液，10min后用酶联免疫检测仪测各孔OD值(540nm)。

9.5.5腹腔巨噬细胞(MФ)TNF-α的诱生及活性检测

处死小鼠后无菌条件下剪开腹部皮肤，将腹膜剪一小口，用5ml1640培养液冲洗腹腔，吸出大量含腹腔MФ的渗出液,置于10ml离心管中，用Hank’s液充分洗涤细胞二次，计数后调细胞浓度至2×106个细胞/ml。

于24孔培养板中每孔加1.0ml(2×106个细胞)腹腔MФ，37℃5％CO2条件下培养2h。Hank’s液充分洗涤三次，弃去未粘附细胞，贴壁的细胞即为腹腔MФ。加入含脂多糖(LPS)20μg/ml的培养液1.0ml，37℃5％CO2条件下培养40h，吸出培养上清即含TNF-α，-20℃保存待测。

L929体外杀伤法检测TNF-α活性。于96孔培养板中加入TNF-α上清100μl/孔(双复孔)及100μl(2×104个细胞)L929细胞，设单纯细胞对照孔。37℃，5％CO2条件下培养16h，用Hank’s液充分洗涤三次，加入50μl/孔结晶紫染液，37℃孵育0.5h后用自来水轻轻冲去染料，自然干燥后加入脱色液100μl/孔，10min后用酶联免疫检测仪测各孔OD值(540nm)。按下述公式计算各孔细胞死亡率来判断TNF-α活性。细胞死亡率＝(1-实验组OD值/对照组OD值)×100％10、统计学方法，数据以SPSS软件进行t检验。

二、实验结果

1、重组质粒的构建

1.1小鼠B7.2基因的扩增：RT-PCR扩增小鼠mB7-2的cDNA根据GeneBank中的mB7-2的cDNA序列设计PCR引物：有义链引物5’-AACTTACGGAAGCACCCACG–3’；反义链引物：5’-CTCTCACTGCCTTCACTCTGC-3’。用RNA提取试剂盒，按说明书方法提取小鼠脾细胞总RNA，测OD260/OD280确定其浓度和纯度。取2(g作逆转录模板，按试剂盒说明书方法进行RT-PCR反应，循环参数为：50℃15min，94℃2min，(94℃30Sec，60℃30Sec，72℃1min)25个循环，72℃10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳可见一930bp片段，结果见图1。

1.2.重组质粒的构建与鉴定

1.2.1真核表达质粒pcDNA3.1-CMV-B7-2的构建

分别用XbaI和PstI酶切pMD-18T-B7-2,粘端补平得到B7-2片段，再用EcorV和XbaI酶切pcDNA3.1载体，把B7-2片段连接到载体上得到真核表达质粒pcDNA3.1-CMV-B7-2，质粒pcDNA3.1-CMV-B7-2的酶切鉴定，见图2所示。

1.2.2包含单基因B7-2的辐射诱导表达质粒的构建

分别用XbaI和PstI酶切pMD-18T-B7-2,粘端补平得到B7-2片段，再用EcorV和XbaI酶切pcDNA3.1-Egr载体，把B7-2片段连接到载体上得到真核表达质粒pcDNA3.1-Egr-B7-2，质粒pcDNA3.1-Egr-B7-2的鉴定，如图3所示。

1.2.3包含单基因IL18的辐射诱导表达质粒的构建

分别用EcoRV和NotI酶切pcDNA3.1-Egr和KS-IL18,电泳回收得到pcDNA3.1-Egr载体和IL18片断。再把IL18片段连接到pcDNA3.1-Egr载体上得到真核表达质粒pcDNA3.1-Egr-IL18，质粒pcDNA3.1-Egr-IL18的鉴定，如图3所示。

1.2.4包含B7-2及IL18的双基因辐射诱导表达质粒的构建

第一步，取PIRES载体，用XbaI及SmaI酶切；另取连接B7-2基因的T载体，用PstI酶切，得到pIRES载体和B7-2基因片断，粘端补平。然后把B7-2基因连接到pIRES上，得到第一中间质粒pIRES-B7-2；

第二步，分别用BamHI和XbaI酶切pIRES-B7-2质粒和KS-IL18质粒，补平粘端，再用EcoRI酶切，得到pIRES-B7-2和IL18片断。把IL18基因连接到pIRES-B7-2上，得到第二中间质粒pIRES-IL18-B7-2；

第三步，用SacI酶切质粒pIRES-IL18-B7-2，补平，电泳回收，得到IL18-B7-2大片断；用EcoRV酶切质粒pcDNA3.1-Egr-1，去磷。把大片段IL18-B7-2连接到pcDNA3.1-Egr-1上，得到双基因表达质粒pcDNA3.1-Egr-IL18-B7-2，质粒pcDNA3.1-Egr-IL18-B7-2的鉴定，如图4所示。

2、重组质粒的辐射诱导表达特性

2.1X射线照射后重组质粒转染的B16细胞上清中mIL-18分泌和

细胞表面B7-2表达变化

2.1.1重组质粒转染B16细胞

24孔培养板中接种B16细胞2×105/孔，当培养板中的B16细胞达到70％融合时，用4μg脂质体包裹2μg重组质粒转染培养细胞。

2.1.2X射线照射后重组质粒转染的B16细胞表面B7.2蛋白表达变化

分别转染pEgr-B7.2和pEgr-IL18-B7.2重组质粒后24h照射。分别经0Gy、0.1Gy、0.5Gy、2.0Gy、5.0GyX射线照射后8h收集细胞，用FITC标记的抗体染色后，经流式细胞仪检测，结果见图5。从图5中可以看出，B16细胞转染pEgr-B7.2和pEgr-IL18-B7.2重组质粒后经不同剂量X射线照射，照射组细胞表面B7.2表达均比未照组明显增高(p<0.05),并且其表达量随照射剂量增高而增高。

2.1.3X射线照射后重组质粒转染的B16细胞上清中IL18表达变化将包含IL18基因的质粒pEgr-IL18和pEgr-IL18-B7-2分别转染体外培养的小鼠黑色素瘤B16细胞，24h后各组分别给予0Gy、0.1Gy、0.5Gy、2Gy及5Gy照射，于照射后8h一起收集细胞的上清液，用ELISA法测定上清中IL18含量。结果见图6。从图6中可以看出，B16细胞转染pEgr-IL18和pEgr-IL18-B7.2重组质粒后经不同剂量X射线照射，照射组mIL-18表达均比未照组明显增高(p<0.05)，并且其分泌量随照射剂量增高而增高。由于Egr-1为血清刺激因子，因此在含血清的培养基中有基础表达。

3、肿瘤基因放射治疗的抑瘤效应探讨

3.1重组质粒联合放疗的抑瘤作用

在各组C57/BLBC小鼠右后肢皮下分别接种5×105个B16细胞，一周后所有小鼠先后长出黑色素瘤，用游标卡尺每隔2日测量肿瘤长径和短径，计算肿瘤体积，绘制肿瘤相对生长速率曲线。待肿瘤长到直径0.5cm时，各组小鼠分别给予肿瘤内注射脂质体包裹的各种质粒(对照组及单纯放疗组除外)，24h后放疗各组给予肿瘤局部5Gy深部X线照射，1次/2日，共3次。最后得到肿瘤相对生长速率曲线。治疗开始第8天(治疗结束第1天)开始5Gy单纯放疗组和基因联合5Gy放疗组的肿瘤生长明显比对照组缓慢；从第10天开始双基因联合放疗组的肿瘤生长速度明显低于对照组和单纯放疗组(p<0.05)，并且第14到16天单基因联合放疗组肿瘤生长较单纯放疗组缓慢(p<0.05)；第12到16天双基因联合放疗组肿瘤生长速度慢于单基因联合放疗组(p<0.05)。(见表1、图7)。由于第12天后对照组及单纯基因治疗组动物死亡较多，所以未进行统计。

表15Gy剂量X线照射C57/BLBC小鼠接种B16细胞后长出的黑色素瘤，基因放射治疗抑瘤作用

n＝10，*p<0.05vscontrol；#p<0.05vs5Gy；&p<0.05vspEgr-IL18+5GyorpEgr-B7.2+5Gy

A：ControlB:pEgr-B7.2C:pEgr-IL18D:pEgr-B7.2+5GyE:pEgr-IL18-B7.2+5GyF:pEgr-IL18+5GyG:5Gy

4、肿瘤基因治疗抑瘤免疫学机制的探讨

本发明研究设对照组、单纯5Gy放疗组、单纯双基因治疗组、双基因联合5Gy放疗组，每组5只小鼠。治疗组肿瘤内注射20μg质粒+40μg脂质体/100μl，对照组于瘤内注射等体积0.9％的生理盐水，注入质粒后24小时开始进行放疗，隔日一次，共三次。分别于末次照射后1d、3d杀鼠，检测NK活性、CTL活性、IFN-γ分泌活性和TNF-α水平的变化，如图8、图9和表2、表3所示。照射结束后第1天及第3天，pEgr-IL18-B7.2联合5Gy放疗组的脾脏NK活性和CTL活性均比对照组或单纯5Gy照射组显著增高(p<0.05)。单纯基因治疗组的上述免疫学指标也有上升趋势，可能是由于Egr-1启动子受到体内氧化代谢产物的刺激而被激活，诱导了下游基因IL18和B7.2的表达，进而带动了全身免疫系统的激活(见表2、3和图8、9)。

表2C57/BLBC小鼠接种B16细胞后长出的黑色素瘤，基因放射治疗后脾CTL细胞毒性活性的变化

n＝5,*p<0.05；**p<0.01vscontrol/5Gy

表3C57/BLBC小鼠接种B16细胞后长出的黑色素瘤，基因放射治疗后脾NK细胞毒性活性的变化

n＝5,*p<0.01vsControl/5Gy

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (5)

1.一种pEgr-IL18-B7.2双基因共表达重组质粒的构建，其特征在于，包括以下步骤：

S1、取PIRES载体，用XbaI及SmaI酶切，另取连接B7-2基因的T载体，用PstI酶切，得到pIRES载体和B7-2基因片断，粘端补平，然后把B7-2基因连接到pIRES上，得到第一中间质粒pIRES-B7-2；

S2、分别用BamHI和XbaI酶切pIRES-B7-2质粒和KS-IL18质粒，补平粘端，再用EcoRI酶切，得到pIRES-B7-2和IL18片断，把IL18基因连接到pIRES-B7-2上，得到第二中间质粒pIRES-IL18-B7-2；

S3、用SacI酶切质粒pIRES-IL18-B7-2，补平，电泳回收，得到IL18-B7-2大片断，用EcoRV酶切质粒pcDNA3.1-Egr-1，去磷，把大片段IL18-B7-2连接到pcDNA3.1-Egr-1上，得到双基因表达质粒pcDNA3.1-Egr-IL18-B7-2，即可。

2.根据权利要求1所述的pEgr-IL18-B7.2双基因共表达重组质粒的构建，其特征在于，所述mIL-18和mB7-2基因分别定向克隆至IRES前后插入位点，从而使mIL-18和mB7-2基因在同一载体上获得良好相关表达。

3.一种如权利要求1或2所述的pEgr-IL18-B7.2双基因共表达重组质粒在联合辐射抗肿瘤中的应用，其特征在于，将所述重组质粒体外转染B16黑色素瘤细胞，经0.1～6.0Gy剂量的X射线照射后体外激活Egr-1启动子诱导mIL-18和B7-2表达。

4.根据权利要求3所述的pEgr-IL18-B7.2双基因共表达重组质粒在联合辐射抗肿瘤中的应用，其特征在于，所述X射线照射剂量为0.5～5.0Gy。

5.根据权利要求3所述的pEgr-IL18-B7.2双基因共表达重组质粒在联合辐射抗肿瘤中的应用，其特征在于，所述pEgr-IL18-B7.2双基因能够提高机体免疫活性，增强NK和CTL细胞毒效应，刺激T细胞和腹腔巨噬细胞分泌IFN-γ和TNF-α，肿瘤局部B7-2的表达增强免疫细胞对肿瘤细胞的识别杀伤能力。