CN102448982B - 用于调节靶细胞上补体调节蛋白的活性的组合物和方法 - Google Patents

用于调节靶细胞上补体调节蛋白的活性的组合物和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102448982B
CN102448982B CN201080022959.5A CN201080022959A CN102448982B CN 102448982 B CN102448982 B CN 102448982B CN 201080022959 A CN201080022959 A CN 201080022959A CN 102448982 B CN102448982 B CN 102448982B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
polypeptide
ad35k
seq
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201080022959.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102448982A (zh
Inventor
A·利伯
汪宏杰
R·J·贝伦森
D·卡特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Washington
Compliment Corp
Original Assignee
University of Washington
Compliment Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Washington, Compliment Corp filed Critical University of Washington
Publication of CN102448982A publication Critical patent/CN102448982A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102448982B publication Critical patent/CN102448982B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4716—Complement proteins, e.g. anaphylatoxin, C3a, C5a
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)

Abstract

本发明涉及能够减少靶细胞上补体调节蛋白(CRP)的活性、量或密度的试剂。本发明还提供了此类试剂的鉴定方法、制备方法和用途。

Description

用于调节靶细胞上补体调节蛋白的活性的组合物和方法
交叉参考相关申请
本申请要求2009年3月31提交的美国临时申请61/165,434和2009年10月27日提交的美国临时申请61/255,450的利益，将所述临时申请通过引用整体并入本文。
政府许可权的声明
本发明是在由国立卫生研究院授予的基金号HL078836下由美国政府资助进行的。美国政府在本发明中具有一定的权利。
背景
补体系统是免疫系统的体液方面的主要效应器。补体激活的经典途径包括可溶性成分例如某些种类和亚类的抗体与体内的抗原靶的结合。此类结合的抗体的Fc区域中构象的变化将结合位点暴露给C1(以其不活动状态存在的补体系统的可溶性成分)。在稳定结合后，C1经历构象变化，从而导致C1亚成分之一的活跃蛋白酶活性。该蛋白酶活性启动补体成分之间受到高度调节的相互作用的级联。级联的结果是靶细胞上膜攻击复合物(membraneattack complex，MAC)的装配。
补体激活的相互作用的级联中的重要步骤是将成分C3转变成活性C3b的步骤，因为在该步骤中存在激活信号的大量扩增。具体地，单个C3转化酶能够将数百个C3分子转化成C3b。每一个C3b成分转而形成C5转化酶的部分，产生C5b。每一个激活的C5b分子启动MAC的形成。MAC是贯穿细胞膜以产生跨膜小孔的大分子结构。小孔破坏膜的完整性，从而允许离子和小分子自由地扩散穿过，从而导致补体依赖性细胞溶解(complement dependentcytolysis，CDC)。
单克隆抗体(mAb)已成为许多疾病的新型治疗剂的潜在强有力种类。例如，在肿瘤学领域，存在数种用于治疗癌症的市售治疗性mAb，并且目前有数百种mAb处于临床开发中(参见J.Castillo，等人，Experimental Hematology 36：755-768(2008))。许多此类治疗性mAb通过激活补体级联(从而导致MAC在转化的肿瘤细胞上装配，从而引发CDC)来起作用。该治疗方法可以是有利的，因为抗体可被特异性靶向特异于转化的肿瘤细胞的抗原，从而避免许多因既有治疗而引起的副作用。
然而，由于患病细胞通过膜补体调节蛋白(CRP)例如CD35、CD46、CD55和CD59的表达阻止通过CDC导致的杀伤的能力，治疗性mAb的治疗潜能可能是有限的(D.Gancz和Z.Fishelson，Molecular Immunology 46：2794-2800(2009)；J.Golay，等人，Blood 98：3383-3389(2001)；K.A.Gelderman等人，Laboratory Investigation：A Journal ofTechnical Methods and Pathology 82：483-493(2002)；和N.Donin等人，Clinical andExperimental Immunology 131：254-263(2003))。CD46和CD55在C3活化阶段阻断补体级联并且CD59阻止补体的MAC的装配(Z.Fishelson等人，Molecular Immunology 40：109-123(2003))。
因此，需要有减少CD35、CD46、CD55和CD59在靶细胞表面上的存在以减弱CRP介导的对补体MAC的抑制的组合物和方法。
概要
本概要被提供用以以简化形式介绍将在下文详细描述中进一步说明的概念的选择。本概要无意鉴定所述主题的主要特征，也无意用作帮助确定所述主题的范围。
本文中描述的本发明提供了能够减少靶细胞上补体调节蛋白(CRP)的活性、量或密度的组合物和试剂。本发明还提供了鉴定此类组合物和试剂的方法、其制备方法和其用途。此外，本发明还提供了增加靶细胞或组织对治疗剂介导的补体依赖性细胞溶解(CDC)和治疗剂介导的靶细胞或组织上膜攻击复合物(MAC)的装配的易感性的方法。
在一个方面，本文中描述的本发明提供了包含能够减少靶细胞表面上补体调节蛋白(CRP)的活性、量或密度的经修饰多肽的组合物，其中所述多肽包含非天然存在的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽引起CRP的内化或隔离(sequestration)。在另一个实施方案中，所述多肽结合CRP。在某些实施方案中，所述多肽以1nM或更小的解离常数(Kd)结合CRP或所述多肽以.65nM或更小的解离常数(Kd)结合CRP。在一个具体的实施方案中，所述多肽是分离的病毒蛋白质。在这样的实施方案中，所述多肽来源于腺病毒纤维钮蛋白(fiberknob protein)--例如，Ad35纤维钮蛋白。在一个相关实施方案中，所述多肽来源于在选自Asp207、Thr245、Ile256的残基和其组合上包含至少一个氨基酸置换的Ad35纤维钮蛋白。在具体的实施方案中，所述氨基酸置换为Asp207Gly、Thr245Ala、Ile256Leu或其组合。在另一个实施方案中，所述多肽小于25,000道尔顿。在另一个实施方案中，所述组合物包含所述多肽的二聚体形式、所述多肽的三聚体形式或所述多肽的同源三聚体形式。在这些实施方案中，CRP为跨膜蛋白和/或为GPI连接蛋白(GPI-linked protein)。在具体的实施方案中，CRP为CD46、CD55、CD59或CD35。在一个非常具体的实施方案中，CRP为CD46。在另一个具体的实施方案中，所述多肽结合CD46。这些实施方案中提供的组合物还能使靶细胞对抗体介导的补体依赖性细胞溶解和/或膜攻击复合物的装配敏感。在本文中描述的实施方案中，靶细胞可以是肿瘤细胞。所述肿瘤细胞可选自获自癌的细胞、获自肉瘤的细胞、获自母细胞瘤(blastoma)的细胞、获自胚细胞癌的细胞和获自血液肿瘤的细胞。所述肿瘤细胞还可选自原发性淋巴瘤细胞、Raji-Burkitt′s淋巴瘤细胞、BJAB细胞、Farage细胞、BT474细胞、HT1854细胞、LoVo细胞、HT29细胞、Mino细胞、Jurkat细胞、K562细胞、HeLa细胞、A549细胞、SKOV3细胞、HT29细胞和MDA235MB细胞。在一个具体的实施方案中，靶细胞包含实体瘤的细胞表面标志。所述实体瘤可以是乳腺、肺、结肠直肠系统、胃、前列腺、卵巢、子宫、宫颈、肾、胰腺、肝、脑、头和颈、鼻咽系统或食管的肿瘤。在另一个具体的实施方案中，靶细胞包含肉瘤的细胞表面标志。肉瘤可以是平滑肌肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤或尤因肉瘤(Ewing′ssarcoma)。在另一个具体的实施方案中，靶细胞包含血液肿瘤的细胞表面标志。血液肿瘤可以是白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。在一个更具体的实施方案中，靶细胞是B细胞，可以是正常B细胞或恶性B细胞。靶细胞可表达选自CD3、CD10、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD35、CD37、CD38、CD40、CD44、CD52、CD70、CD80、CD133、CD200、表皮生长因子受体1(EGFR)、表皮生长因子受体2(Her2/neu)、人乳脂肪球(HMFG1)、白细胞介素2受体(IL2R)、粘蛋白1和血管内皮生长因子中的一个或多个细胞标志。在一个具体的实施方案中，靶细胞表达CD20。在相关实施方案中，所述多肽还能够增加靶细胞表面上的补体激活和/或所述多肽能够增加靶细胞表面上膜攻击复合物(MAC)的装配。在其他相关实施方案中，当与基线或未修饰的多肽相比较时，所述多肽能够减少补体调节蛋白(CRP)的活性、量或密度至少25％；所述多肽能够减少补体调节蛋白(CRP)的活性、量或密度至少24小时；和/或所述多肽在约25ng/ml或更低的浓度下具有活性。在其他相关实施方案中，所述多肽不是抗体或抗体片段；所述多肽不是生长因子或细胞因子；所述多肽不结合基因的转录调控区；所述多肽不结合基因的启动子区域、增强子区域、沉默子区域(silencer region)或绝缘子区域(insulatorregion)；和/或所述多肽不结合转录因子。在其他相关实施方案中，所述多肽在长度上为至少120个氨基酸；所述多肽包含天然存在的蛋白质或蛋白质结构域的至少一个突变；所述多肽包含与天然存在的蛋白质或蛋白质结构域至少90％的氨基酸序列同源性；和/或所述多肽不是天然存在的蛋白质或蛋白质片段。在其他相关实施方案中，所述多肽被进一步修饰以减少免疫原性。所述多肽的免疫原性可通过将所述多肽偶联至烷基-PEG，通过表位去免疫化作用，通过共施用免疫抑制剂，通过加入耐受方案(tolerizing regimen)，通过糖基化所述多肽或通过共施用增强补体激活的试剂来进行减弱。在另一个实施方案中，该方面中提供的组合物包括经修饰的病毒或经修饰CRP-相互作用的微生物-例如奈瑟球菌属(Neisseria)或链球菌(Streptococcal)菌株。在一个这样的实施方案中，病毒能够与CRP相互作用并且选自腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、麻疹病毒(Edmonston株)、人疱疹病毒6、牛病毒性腹泻病毒和人柯萨奇病毒。在一个具体的相关实施方案中，该方面中提供的组合物不包括腺病毒。在另一个具体的相关实施方案中，该方面中提供的组合物包括腺病毒-例如，选自Ad11、Ad16、Ad21、Ad34、Ad35和Ad50腺病毒血清型。在一个非常具体的实施方案中，腺病毒为Ad35，并且Ad35腺病毒任选地包括突变的纤维钮蛋白。
在另一个方面，本文中描述的本发明提供了具有第一结构域和第二结构域的分离的多肽，其中所述第一和第二结构域结合CRP，其中所述第一结构域包含SEQ ID NO：15、SEQID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：31所示的氨基酸序列，并且其中X1不是天冬氨酸，X2不是苏氨酸或X3不是异亮氨酸。在一个具体的实施方案中，X1为甘氨酸或X1为谷氨酸。在另一个具体的实施方案中，X2为丙氨酸，或X2为任意非极性氨基酸。在另一个具体的实施方案中，X3为亮氨酸或任意非极性氨基酸。在一个相关实施方案中，第一结构域包含SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列，其中X1不是天冬氨酸；SEQ ID NO：26，其中X2不为苏氨酸；或SEQ ID NO：31，其中X3不为异亮氨酸。在另一个相关的实施方案中，第二结构域包含SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列，其中X1不是天冬氨酸；SEQ ID NO：26，其中X2不是苏氨酸；或SEQ ID NO：31，其中X3不是异亮氨酸。在另一个相关实施方案中，第一和第二结构域结合相同的CRP，或可选地，第一和第二结构域结合不同的CRP。在本发明的该方面中提供的实施方案中，CRP为CD35、CD46、CD55或CD59。在一个具体的实施方案中，CRP为CD46。在相关实施方案中，所述多肽引起CRP至细胞内的内化或隔离；和/或所述多肽以约1nM或更小或甚至约0.65nM或更小的解离常数(Kd)结合CRP。在一些实施方案中，所述多肽不是抗体或抗体片段。所述多肽可以是分离的、经修饰的病毒蛋白-例如，来源于腺病毒纤维钮蛋白的多肽。此类来源于腺病毒的纤维钮结构域的多肽可以例如选自Ad11、Ad16、Ad21、Ad34、Ad35和Ad50。在一个非常具体的实施方案中，所述多肽来源于在选自Asp207、Thr245、Ile256和其组合的残基上包含至少一个氨基酸置换的Ad35纤维钮结构域；或，更具体地，所述氨基酸置换为Asp207Gly、Thr245Ala、Ile256Leu或其组合。在另一个实施方案中，所述多肽低于25,000道尔顿。在其他相关实施方案中，所述提供的多肽二聚化、三聚化或甚至同源三聚化。在一个相关实施方案中，所述多肽自发地同源三聚化。三聚化的这样的多肽还可具有三聚化结构域-例如，来源于病毒蛋白质的三聚化结构域。在一个具体的实施方案中，所述三聚化结构域是噬菌体T4弹力素(fibritin)结构域或逆转录病毒纤维蛋白σ1结构域。在一个非常具体的实施方案中，三聚化结构域包含SEQ ID NO：32中所示的氨基酸序列。在本文中提供的一些实施方案中，所述三聚体具有三维结构，并且同源三聚体(homotrimer)的每一个多肽包含2个环，其中每一个环结合CRP。具体地，环之间的氨基酸序列是可置换的并且基本上不改变对CRP的结合。
在另一个方面，本文中描述的本发明提供了包含本文中描述的多肽中任一种的多肽复合物。在一个实施方案中，所述多肽结合2个或更多个CRP分子。在一个相关实施方案中，CRP为CD35、CD46、CD55或CD59。在一个具体的实施方案中，CRP为CD46。
在另一个方面，本文中描述的本发明提供了包含治疗有效量的任何本文中描述的多肽的药物组合物。在一个具体的实施方案中，药物组合物还包含第二治疗剂。在这样的实施方案中，第二治疗剂可选自蛋白质、多肽、小分子、药物、抗体、抗体片段、杂合抗体(hybrid antibody)、抗体-药物缀合物、siRNA、反义RNA、miRNA、病毒和适体；或第二治疗剂可选自细胞毒性剂、细胞抑制剂(cytostatic agent)、化疗剂(chemotherapy agent)、补体激活剂(complement activating agent)、CRP表达调节剂、放射物(radiation)、免疫调节剂、促细胞凋亡试剂、热激蛋白质的抑制剂、蛋白酶抑制剂、脱唾液酸化试剂(desialyatingagent)、MMP抑制剂和PKC抑制剂。在一个具体的实施方案中，第二治疗剂为抗体-例如，抗体选自表1中所列的那些抗体，或甚至更具体地，选自利妥昔单抗、Arzerra、爱必妥(Eribitux)、米罗他(吉妥单抗，Mylotarg)、Campath、赫赛汀和阿瓦斯丁的抗体。在一个进一步的实施方案中，修饰抗体或抗体片段以例如通过Fc修饰的方式进一步增强补体激活。在另一个实施方案中，第二治疗剂为选自LI1b，IL4和TGFb1的CRP表达调节剂。在另一个实施方案中，第二治疗剂为选自脱氧精胍菌素和geldanamyctanespimycin 17-AAG的热激蛋白抑制剂。在另一个相关的实施方案中，第二治疗剂为蛋白酶抑制剂、脱唾液酸化试剂或MMP抑制剂。在另一个相关实施方案中，第二治疗剂为选自他莫昔芬、enzastaurin和UBN-01的PKC抑制剂。在一个具体的实施方案中，第二治疗剂为化疗剂。在另一个具体的实施方案中，第二治疗剂为免疫调节剂-例如选自干扰素-α，干扰素-γ，GM-CSF、TLR激动剂、NOD受体激动剂，IL2、IL7、IL17、IL21、IL23、TNF、IMiDs、RIG-1受体激动剂、天然杀伤细胞配体、天然杀伤细胞活化剂、NKG2P配体和天然抗体的免疫调节剂。在一个非常具体的实施方案中，天然杀伤细胞活化剂为抗-CD137抗体。在另一个非常具体的实施方案中，NKG2P配体选自MICa、MICb、RAE1和ULBP1。
在另一个方面，本文中描述的本发明提供了包括将在其表面上表达CRP的靶细胞与本文中描述的任一种多肽接触的方法。在一个实施方案中，将所述多肽与靶细胞直接接触。在另一个实施方案中，所述多肽不是病毒载体的部分。在一个相关实施方案中，靶细胞与多肽的接触增加了靶细胞对利用抗体的治疗的易感性和/或增加了抗体介导的补体依赖性细胞溶解。在一个具体的实施方案中，所述抗体为单克隆抗体-例如，所述抗体选自表1中所列的抗体，或更具体地，所述抗体选自利妥昔单抗、Arzerra、爱必妥、米罗他、Campath、赫赛汀和阿瓦斯丁。本发明的该方面描述的实施方案中，靶细胞与本发明的多肽的接触可以体外、体内和/或离体的。在这些实施方案中，CRP可以为CD46、CD55、CD59或CD35，在一个具体的实施方案中，CRP为CD46。靶细胞可以为肿瘤细胞-例如，选自获自癌的细胞、获自肉瘤的细胞、获自母细胞瘤的细胞、获自胚细胞癌的细胞和获自血液肿瘤的细胞之中的肿瘤细胞。在本发明的该方面中描述的方法中，所述方法还可包括将靶细胞与第二治疗剂接触。与第二治疗剂的接触可在与本文中提供的任一种多肽接触的同时、之前或之后发生。在示例性实施方案中，第二治疗剂可选自细胞毒性剂、细胞抑制剂、化疗剂、补体激活剂、放射物、免疫调节剂、促细胞凋亡试剂、蛋白质、多肽、小分子、药物、抗体、抗体片段、杂合抗体、抗体-药物缀合物、siRNA、反义RNA、miRNA、病毒和适体。在一个具体的实施方案中，第二治疗剂为抗体-例如，选自表1中所列的抗体，或更具体地，选自利妥昔单抗、Arzerra、爱必妥、米罗他、Campath、赫赛汀和阿瓦斯丁的抗体。在一个相关的具体实施方案中，修饰抗体或抗体片段以进一步增强补体激活-例如Fc修饰。在可选择的实施方案中，第二治疗剂是化疗剂或免疫调节剂。这样的实施方案中的免疫调节剂可选自干扰素-α、干扰素-γ、GM-CSF、TLR激动剂、NOD受体激动剂、IL2、IL7、IL17、IL21、IL23、TNF、IMiD、RIG-1受体激动剂、天然杀伤细胞配体、天然杀伤细胞活化剂和天然抗体。在该方面中提供的接触方法中，细胞表面上CRP的活性、量或密度在一些实施方案中减少至少25％。
在另一个方面，本文中描述的本发明提供了治疗需要针对涉及免疫系统的病症进行治疗的受试者的方法，所述方法包括给受试者施用本文中描述的任一种药物组合物。在一些具体的实施方案中，所述病症与天然杀伤细胞、T细胞或B细胞的失调相关，所述病症为癌症、自身免疫病症、传染病或移植后病症。在一些具体的实施方案中，所述病症选自癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、母细胞瘤或胚细胞癌。
在另一个方面，本文中描述的本发明提供了包含有效地连接至调控序列的编码多肽的核酸的载体，其中所述编码的多肽能够减少靶细胞表面上的CRP的活性、量或密度，其中所述编码的多肽包含非天然存在的氨基酸序列。在一些具体的实施方案中，所述编码的多肽包含天然存在的蛋白质或蛋白质结构域的至少一个突变；所述编码的多肽包含与天然存在的蛋白质或蛋白质结构域至少90％的氨基酸序列同源性；所述编码的多肽是非天然存在的蛋白质或蛋白质片段；所述编码的多肽不是抗体、抗体片段、生长因子、细胞因子或转录调控区；和/或所述编码的多肽在长度上为至少120个氨基酸。在一个相关实施方案中，CRP为CD46、CD55、CD59或CD35，或更具体地，CRP为CD46。在相关方面中，本文中描述的本发明还提供了递送包含编码能够降低靶细胞表面上CRP活性之多肽的核酸的载体的方法，包括将靶细胞与本文中描述的任何载体接触。
在另一个方面，本文中描述的本发明提供了用于筛选能够改变CRP活性的分子的方法，所述方法包括：产生候选分子的文库；选择能够结合CRP的候选分子；和确定所述分子是否改变CRP的活性。在一个实施方案中，CRP为CD46，CD55，CD59或CD35。在一个具体的实施方案中，CRP为CD46。在一个相关实施方案中，所述分子以1nM或更小的结合亲和力结合CRP。在相关实施方案中，所述分子选自蛋白质、多肽、小分子、药物、抗体、抗体片段、杂合抗体、抗体-药物缀合物、siRNA、反义RNA、miRNA、病毒和适体。在一个具体的实施方案中，所述分子为小分子。在另一个具体的实施方案中，所述分子为多肽。在另一个实施方案中，所述分子通过CRP至细胞内的内化或隔离来修饰CRP的活性。在一个相关实施方案中，所述分子通过减少细胞表面上CRP的量或密度来修饰CRP的活性。
在另一个方面，本发明提供了包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的至少12个连续氨基酸的多肽，其中所述多肽包含选自Asp207Gly，Thr245Ala和Ile256Leu的至少一个氨基酸置换或其组合，并且其中所述多肽可形成能够结合CD46的同源三聚体。
在另一个方面，本发明提供了包含编码SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的至少40个连续氨基酸的多肽的核苷酸序列的核酸分子，其中所述多肽包括选自Asp207Gly，Thr245Ala和Ile256Leu的至少一个氨基酸置换或其组合，并且其中所述多肽可形成能够结合CD46的同源三聚体。
在另一个方面，本发明提供了用于降低CD46的细胞表面水平的组合物。根据本发明的该方面的组合物包含(a)有效地降低CD46的细胞表面水平的药剂的量，所述药剂包含多种经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽，其中所述经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽能够形成与从多个由SEQ ID NO：3组成的多肽形成的同源三聚体相比较而言具有增强的对于CD46结合的亲和力的同源三聚体；和(b)药学上可接受的载体。
在另一个方面，本发明提供了用于减少靶细胞表面上CD46的量的方法。根据本发明的该方面的方法包括将在其表面上表达CD46的靶细胞与一定量的包含多个经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽的组合物接触，其中所述经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽能够形成与从由SEQ ID NO：3组成的多肽形成的同源三聚体相比较而言具有增强的对于CD46结合的亲和力的同源三聚体。
在另一个方面，本发明提供了用于诱导表达CD46的靶细胞的细胞溶解的方法。本据本发明的该方面的方法包含(a)将在其表面上表达CD46的靶细胞与一定量的包含多种有效地减少存在于靶细胞表面上的CD46的量的经修饰腺病毒纤维钮结构域多肽的试剂接触；和(b)将按照步骤(a)处理的靶细胞与结合靶细胞表面上的抗原并且诱导细胞溶解的抗体或其片段接触。
在另一个方面，本发明提供了在有此需要的哺乳动物受试者中增强抗癌单克隆抗体的抗肿瘤作用的方法。按照本发明的该方面的方法包括(a)给所述哺乳动物受试者施用一定量的包含多种有效地减少存在于靶肿瘤细胞表面上的CD46的量的经修饰腺病毒纤维钮结构域多肽的组合物至少一次；和(b)给该受试者施用治疗有效量的抗癌抗体至少一次，其中所述抗癌抗体结合在靶肿瘤细胞上表达的非CD46细胞表面抗原。
在另一个方面，本发明提供了试剂盒，所述试剂盒包括(a)包含SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的至少12个连续氨基酸的经修饰的纤维钮结构域多肽，其中所述多肽包含至少一个选自Asp207Gly、Thr245Ala和Ile256Leu的氨基酸置换或其组合，并且其中所述多肽可形成能够结合CD46的同源三聚体；和(b)结合哺乳动物细胞表面上的抗原并且诱导细胞溶解的抗体或其片段。
在另一个方面，本发明提供了增强抗体治疗剂在治疗哺乳动物受试者的自身免疫性疾病中的效应的方法。根据本发明的该方面的方法包括(a)给所述哺乳动物受试者施用一定量的包含多种有效地减少存在于靶细胞表面上的CD46的量的经修饰腺病毒纤维钮结构域多肽的药剂至少一次；和(b)给该受试者施用治疗有效量的抗体治疗剂至少一次，其中所述抗体治疗剂结合在靶细胞上表达的非CD46细胞表面抗原。
本发明的多肽、核酸和组合物对于实施本发明的方法是有用的。
附图概述
本发明的上述方面和许多伴随的有利方面将变得更容易领会，因为当与附图结合时，通过参考下列详细描述，本发明的上述方面和许多伴随的有利方面变得更好理解，其中：
图1A是标示N末端尾部结构域(aa 1-45)、柄结构域(shaft domain)(aa 46-133)和C末端纤维钮(K)结构域(aa 134-323)的相对位置的全长野生型腺病毒血清型35(Ad 35)纤维多肽(SEQ ID NO：2)的示意图；
图1B举例说明野生型Ad35纤维多肽的钮结构域(K)(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列，其中称为″DE″(SEQ ID NO：6)、″FG″(SEQ ID NO：7)、″HI″(SEQ ID NO：8)和″IJ″(SEQ IDNO：9)的环区域加以下划线。其中已显示置换能消除CD46结合的氨基酸位置以圆圈标示，并且其中已显示置换能增强CD46结合的氨基酸位置由正方形标示；
图1C为野生型Ad35、突变型Ad35K++(Asp207Gly和Thr245Ala)和其他结合CD46的腺病毒的腺病毒钮结构域即Ad11、Ad16、Ad21、Ad34、Ad35和Ad50的氨基酸比对；
图2A图解说明在与Ad35K-279(消除CD46的结合)、Ad35K(野生型)，Ad45K++(包含Asp207Gly和Thr245Ala的双突变体)或与抗-CD46mAb一起温育后不同时间点上HeLa细胞表面上CD46的相对水平，其中通过流式细胞术分析CD46的水平，该水平表示为未处理细胞(N＞6)的CD46平均荧光强度的百分比，如实施例2中所描述的；
图2B图解说明在用重组Ad35K(野生型)或Ad35K++(包Asp207Gly和Thr245Ala的双突变体)温育后第6或48小时，HeLa细胞表面上重组Ad35纤维钮蛋白的相对水平，其中利用抗-His6标签抗体，然后利用抗小鼠抗体-Alexa Fluor 488通过流式细胞术分析所述水平，其表示为未处理细胞(N＞6)的平均荧光强度的百分比，如实施例2中所描述的；
图2C图解说明Ad35-GFP感染后HeLa细胞的转导水平，如通过在暴露于不断增加MOI的Ad35-GFP感染性病毒颗粒后24小时HeLa细胞的GFP平均荧光测量的，其中在用Ad35-GFP病毒颗粒感染前72小时用重组纤维钮蛋白Ad35K-279(消除CD46的结合)、Ad45K(野生型)或Ad45K++(包含Asp207Gly和Thr245Ala的双突变体)预温育HeLa细胞，如实施例2中所描述的；
图3图解说明在用磷酸缓冲盐溶液(PBS)、抗CD46mAb或重组纤维钮蛋白Ad35K(野生型)或Ad35K++(包含Asp207Gly和Thr245Ala的双突变体)预温育，然后用利妥昔单抗(抗CD20mAb)或达珠单抗(抗-25mAb)温育，随后利用提供补体的正常人血清(NHS)预温育后，活拉吉细胞(Raji cell)(CD20阳性，CD25阴性)的相对水平，作为补体依赖性细胞溶解(CDC)的量度，其中拉吉细胞活力水平表示为未处理细胞(N＞6)的平均活力的百分比，如实施例2中所描述的；
图4A图解说明由重组纤维钮蛋白Ad35K(野生型)或Ad35K++(包含Asp207Gly和Thr245Ala的双突变体)预温育后产生的CD20阳性细胞系BJAB、Farage和Mino中增强的利妥昔单抗介导的CDC，其中细胞活力水平表示为未处理细胞(N＞6)的平均活力的百分比，如实施例2中所描述的；
图4B图解说明在重组纤维钮蛋白Ad35K(野生型)或Ad35K++(包含Asp207Gly和Thr245Ala的双突变体)预温育后，患有B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)的患者的原代淋巴瘤细胞中增强的利妥昔单抗介导的CDC，其中细胞活力水平表示为未处理细胞(N＞6)的平均活力的百分比，如实施例2中所描述的；
图4C图解说明最抗Ad35K++/利妥昔单抗杀伤的细胞样品(CCL-3)具有最低百分比的CD20+细胞和最低CD20水平；
图4D图解说明在低至25ng/ml的剂量上看到Ad35K++对拉吉细胞的致敏效应；
图5A图解说明利用Ad35K-279(消除CD46的结合)或Ad35K++(具有增强的CD46结合的包含Asp207Gly和Thr245Ala的双突变体)的第一注射，然后PBS或利妥昔单抗(抗CD20mAb)的第二注射处理的异种移植淋巴瘤小鼠的骨髓中人CD20阳性细胞的相对水平，其中在第二注射后6小时测量CD20阳性细胞水平，其表示为骨髓中对于CD20呈阳性的细胞的百分比，如实施例3中所描述的；
图5B图解说明利用Ad35K-279(消除CD46的结合)或Ad35K++(具有增强的CD46结合的包含Asp207Gly和Thr245Ala的双突变体)的第一注射，然后PBS或利妥昔单抗(抗CD20mAb)的第二注射处理的异种移植淋巴瘤小鼠(接受Raji细胞)的Kaplan-Meier存活研究的结果，其中一组小鼠在利妥昔单抗的第一注射后48小时接受Ad35K++/利妥昔单抗的第二处理，如实施例3中所描述的；
图5C和5D图解说明通过Ad35K-279(消除CD46的结合)或Ad35K++(CD46结合增加的、包含Asp207Gly和Thr245Ala的双突变体)的第一注射，然后通过PBS或利妥昔单抗(抗-CD20mAb)的第二注射处理的异种移植淋巴瘤小鼠(接受Farage细胞)的存活研究的结果，如实施例3中所描述的；
图5E图解说明的利用Farage细胞注射的，利用Ad35K-279或Ad35K++预处理的人异种移植小鼠模型的骨髓、淋巴结或脾中人CD20阳性细胞的百分比(如利用流式细胞测量的)，然后在施用PBS或利妥昔单抗后12小时杀死如实施例3中所描述的；
图6图解说明在Ad35K++反应性抗体存在(Ad35K++接种的小鼠血清)或不存在(对照小鼠血清)的情况下，在用重组纤维钮蛋白Ad35K(野生型)或Ad35K++(CD46结合增强的、包含Asp207Gly和Thr245Ala的双突变体)预温育、然后进行利妥昔单抗处理后观察到的增强的CDC所介导之细胞杀伤效应，证明了抗Ad35K++抗体对CDC不存在抑制作用；其中细胞存活水平表示为未处理细胞(N＞6)的平均存活的百分比，如实施例4中所描述的；
图7A图解说明了在用磷酸缓冲盐溶液(PBS)、单独的利妥昔单抗、正常人血清(NHS)、Ad35K++预处理加NHS、利妥昔单抗加NHS或Ad35K++预处理加利妥昔单抗加NHS温育后，来自人外周血单个核细胞(PBMC)(来自健康供体)的培养的活CD20阳性细胞百分比，如实施例8中所描述的；
图7B图解说明在用磷酸缓冲盐溶液(PBS)、单独的利妥昔单抗、正常人血清(NHS)、Ad35K++预处理加NHS、利妥昔单抗加NHS或Ad35K++预处理加利妥昔单抗加NHS培养的活人PBMC百分比，如实施例8中所描述的；
图7C图解说明利用单独的Ad35K++、利妥昔单抗或NHS培养的原代人血管内皮细胞、角膜上皮细胞、卵巢上皮细胞或包皮成纤维细胞与PBS处理的对照细胞(N＝5)相比较的细胞存活百分比，如实施例8中所描述的；
图8A图解说明，利用人拉吉细胞注射用Ad35K-279或Ad35K++预处理的、然后在施用PBS或利妥昔单抗后12小时杀死的异种移植小鼠模型中骨髓或肠系膜淋巴结中人CD20阳性细胞的百分比(如利用流式细胞术测量的(N＝5))，如实施例9中所描述；
图8B为按照实验处理方案#1处理的异种移植模型小鼠的Kaplan-Meier存活曲线图(N＝10)，所述方案包括将拉吉细胞注射至小鼠，用Ad35K-279或Ad35K++预处理小鼠，然后施用PBS或利妥昔单抗，该曲线显示当用Ad35K++/利妥昔单抗处理小鼠时，与单独利妥昔单抗或Ad35K-279对照相比较而言，存活显著增加，如实施例9中所描述；
图8C是按照实验处理方案#2(所述实验方案包括两个循环的双Ad35K++注射及随后利妥昔单抗注射)处理的异种移植小鼠的Kaplan-Meier存活曲线，其显示与PBS处理的对照小鼠相比较而言，接受2X(利妥昔单抗加Ad35K++处理)的小鼠的长期存活，如实施例9中所描述的；
图8D图解说明与野生型Ad35K蛋白相比较而言，Ad35K++对利妥昔单抗疗法产生显著更强的增强作用；
图9A图解说明利用Ad35K++的预温育增强了Campath(抗CD52mAb)对Raji(CD52阳性)细胞的CDC介导的杀伤，如实施例10中所描述的；
图9B图解说明利用Ad35K++的预温育在Campath(抗CD52mAb)存在的情况下对Jurkat细胞(CD52阴性)的存活没有影响，如实施例10中所描述的；
图10A图解说明利用Ad35K++的预温育增强了赫赛汀(抗Her2/neumAb)对BT-474乳腺癌(Her2/neu阳性)细胞的CDC介导的杀伤，如实施例10中所描述的；
图10B图解说明利用Ad35K++的预温育在赫赛汀(抗Her2/neu mAb)存在的情况下对MDA-231细胞乳腺癌(Her2/neu阴性)的存活没有影响，如实施例10中所描述的；
图11A图解说明利用Ad35K++的预温育增强了通过爱必妥(抗EGFRmAb)产生的CDC介导的LOVO结肠癌(EGFR阳性)的杀伤，如实施例10中所描述的；
图11B图解说明Ad35K++在爱必妥(抗EGFR mAb)存在的情况下对HeLa细胞(EGFR阴性)的存活没有影响，如实施例10所描述的；
图12图解说明利用Ad35K++的预温育增强了米罗他(吉妥单抗)对AML HL60(CD33-阳性细胞)的杀伤；
图13图解说明利用Ad35K++的预温育增强Arzerra对Farage(CD20-阳性)细胞的杀伤；
图14图解说明mAb增强Ad35K++和来自不同供体(A血型和B血型)的正常人血清(NHS)增强mAb的杀伤作用
图14A图解说明利用BT474细胞进行的实验的时间轴；
图14B图解说明与PBS处理的细胞相比较而言活细胞的百分比；
图14C图解说明利用Farage细胞和Arzerra进行的实验的时间轴。图14D，图解说明在不同NHS来源存在的情况下利用Arzerra进行的Farage细胞的杀伤；
图15A举例说明在使用DNA2.0软件进行最优化之前和之后Ad35K++的DNA序列；
图15B图解说明在使用DNA2.0软件进行最优化之前和之后Ad35K++的氨基酸序列；
图15C举例说明检查Ad35K++DNA序列中不想要的基序；
图15D举例说明在IPTG诱导后包含pET29-Ad35K++的HMS174中Ad35K++的检测；
图16图解说明来自非人灵长类动物模型的数据；
图16A举例说明Ad35K++增强利妥昔单抗的体外B细胞去除效应；
图16B举例说明利用猕猴属(食蟹猴和豚尾猴)、狒狒属(橄榄狒狒(P.Anubis))和人的红细胞进行的Ad35K++血凝集测定；和
图17图解说明利用Ad35K++和利妥昔单抗在针对人CD46和CD20为双转基因的转基因C57Bl/6小鼠中进行的功效研究。
详述
除非在本文中专门定义，否则本文中使用的所有术语具有本发明所属领域内技术人员所理解的意义相同的意义。关于本领域的定义和术语，实施者具体地参考Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Press，Plainsview，New York(2001)；和Ausubel等人，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons，New York(2002)。
提供下列定义用以阐明这些术语在本说明书和权利要求B中用于描述本发明时的含义。
如本文中所使用的，术语“序列同一性”或“同一性百分比”，当用于核酸分子时，指在对齐各序列以获得最大同一性百分比并且不将任何核酸残基置换视为序列同一性的一部分后，候选核酸分子序列中与受试核酸分子序列(例如SEQ ID NO：4中所示的核酸分子序列)相同的核酸残基的百分比。为了获得最佳比对，不将缺口引入候选核酸序列。核酸序列同一性可以以下列方式测定。使用程序BLASTN 2.1版(基于Altschul等人，Nucleic AcidsResearch 25：3389-3402(1997))将受试多核苷酸分子用于搜索核酸序列数据库，例如Genbank数据库。以无缺口模式(unga pped mode)使用该程序。使用缺省过滤(Defaultfiltering)以除去因如J.C.Wootton和S.Federhen，Methods in Enzymology 266：554-571(1996)中定义的低复杂度区域而产生的序列同源性。利用BLASTN的缺省参数。
如本文中所使用的，术语“同一性百分比”或“同一性百分比的”，当与用于实施本发明的多肽结合使用时，被定义为在对齐各序列以获得最大同一性百分比后，多肽序列中与指定的多肽的氨基酸序列(例如SEQ ID NO：3的氨基酸序列)相同的氨基酸残基的百分比。当进行比较时，为了获得最佳比对，不将缺口引入生物标志序列。可以例如以下列方式测定氨基酸序列同一性。使用BLASTP程序，将多肽的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列)用于搜索蛋白质序列数据库，例如GenBank数据库。以无缺口模式使用该程序。使用缺省过滤以除去因低复杂度的区域而产生的序列同源性。利用BLASTP的缺省参数。
如本文中所使用的，如下缩写氨基酸残基：丙氨酸(Ala；A)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、精氨酸(Arg；R)、半胱氨酸(Cys；C)、谷氨酸(Glu；E)、谷氨酰胺(Gln；Q)、甘氨酸(Gly；G)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、甲硫氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)和缬氨酸(Val；V)。
如本文中所使用的，术语″亲和力″在蛋白质结合的背景中是指结合蛋白质之间的相互作用的强度。结合的强度通常由两个蛋白质之间更大的分子间力而产生并且导致它们之间更强的结合。
如本文中所使用的，缩写″Ad″是指腺病毒并且通常后跟表示腺病毒的血清型的数字。例如，″Ad35″是指腺病毒血清型35。
如本文中所使用的，术语″纤维多肽″是指由腺病毒表达的全长纤维多肽(例如，SEQ ID NO：2)，其包含N末端尾结构域、柄结构域和C末端钮结构域。纤维多肽自发地装配成称为“纤维”的同源三聚体，其在衣壳的12个顶角中每一个的基部上位于腺病毒病毒体的外部。
如本文中所使用的，术语″纤维″是指由3个单个的纤维多肽组成的同源三聚体蛋白质结构。腺病毒纤维介导与靶宿主细胞的接触和进入其中的内化。
如本文中所使用的，术语“纤维钮结构域多肽”是指能够形成结合CD46的同源三聚体的纤维多肽的C末端结构域。实例是SEQ ID NO：3所示的野生型腺病毒血清型35钮结构域，其也按缩写被称为″Ad35K多肽″。如图1B中举例说明的，纤维蛋白的C末端部分可三聚化并且形成结合CD46的纤维结构。
如本文中所使用的，术语″经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽″是指包含野生型腺病毒钮结构域的变体的多肽，其中所述经修饰的多肽包含至少一个氨基酸的添加、缺失或置换或其组合，其中所述经修饰的多肽可形成能够结合CD46的同源三聚体。优选任何置换突变是保守的，因为其最低限度地破坏生物化学性质。因此，当引入突变以置换氨基酸残基时，优选用带正电荷的残基置换带正电荷的残基(H、K和R)；优选用带负电荷的残基置换带负电荷的残基(D和E)；优选用中性极性残基置换中性极性残基(C、G、N、Q、S、T和Y)；和优选用中性非极性残基置换中性非极性残基(A、F、I、L、M、P、V和W)。
在最广泛的意义上，可基于各氨基酸的侧链的化学特征将天然存在的氨基酸分组。″疏水性″氨基酸意指Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr、Val、Ala、Cys或Pro。″亲水性″氨基酸意指Gly、Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、Arg或His。还可如下再细分氨基酸的该分组。″不带电荷的亲水性″氨基酸意指Ser，Thr，Asn或Gln。″酸性″氨基酸意指Glu或Asp。″碱性″氨基酸意指Lys，Arg或His。
经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽的实例示于SEQ ID NO：5，其为具有置换Asp207Gly和Thr245Ala的野生型腺病毒35钮结构域序列(SEQ ID NO：3)。SEQ ID NO：5中所示的具体的经修饰腺病毒纤维钮结构域多肽也以缩写″Ad35K++多肽″表示。在本文中，通过参考全长野生型腺病毒35纤维多肽序列(SEQ ID NO：2)来描述特定氨基酸置换或替换突变的位置，首先是指出在野生型序列中发现的氨基酸残基，然后是在野生型序列中指定的氨基酸位置，然后指出突变型多肽中发现的氨基酸残基。例如，术语″Asp207Gly″描述了野生型序列(SEQ ID NO：2)中氨基酸位置207上的置换，其中Asp被Gly替换。
如本文中所使用的，术语“连续的”，在多肽的氨基酸序列的背景中，是指氨基酸残基的连续排序，如它们在参照序列中显示的那样。氨基酸的连续序列在参照序列中通常不包含添加、缺失或置换。然而，当在本文中具体指定时，氨基酸的连续序列可包含置换而不破坏序列的连续性。例如，短语″SEQ ID NO：3的连续氨基酸″是指无插入、缺失或大部分置换的氨基酸残基的连续排序，如它们在SEQ ID NO：3中显示的。然而，该短语允许包含其他描述的氨基酸置换(即，Asp207Gly、Thr245Ala和Ile256Leu)而不破坏序列的连续性。
如本文中所使用的，术语″补体来源″是指包含在诱导后引起细胞溶解和细胞死亡所必需的补体系统的一些或全部单个成分的混合物，例如人血清。
如本文中所使用的，″膜攻击复合物″(″MAC″)是指插入并且破坏细胞膜的终端5个补体成分(C5-C9)的复合物。
如本文中所使用的，术语″抗体″包括来源于任何产生抗体的哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔、骆驼和灵长类动物，包括人)或者合成或重组地产生的抗体和其抗体片段，所述抗体和其片段特异性结合目的靶或其部分。示例性抗体包括多克隆、单克隆和重组抗体；多特异性抗体(例如，双特异性抗体)；人源化抗体；鼠抗体；嵌合抗体、小鼠-人、小鼠-灵长类动物、灵长类动物-人单克隆抗体；和抗独特型抗体；并且可以是任何完整分子或其片段。
如本文中所使用的，术语″抗原结合片段″是指来自全长抗体或与其相关的抗原结合区或可变区。抗体片段的举例说明性实例包括Fab、Fab′、F(ab)2、F(ab′)2和Fv片段、scFv片段、双价抗体、纳米抗体、线性抗体(linear antibody)、单链抗体分子，和从抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文中所使用的，″单链Fv″或″scFv″抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中此类结构域存在于单个多肽链中。通常，Fv多肽还包含VH与VL结构域之间的多肽连接子，其使得scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。
如本文中所使用的，″嵌合抗体″是一种重组蛋白，其中包含来源于非人种类(例如，啮齿类动物)抗体的可变结构域和互补决定区，然而所述抗体分子的其余部分来源于人抗体。
如本文中所使用的，″人源化抗体″是一种嵌合抗体，其包含符合移植入人抗体构架区的来源于非人免疫球蛋白的特定互补决定区的最小限度序列。人源化抗体通常是重组蛋白质，其中只有抗体互补决定区是非人来源的。
如本文中所使用的，术语″全身性递送″和″全身性施用″意欲包括但不限于口服途径和胃肠外途径(包括肌内(IM)，皮下、静脉内(IV)、动脉内、吸入、舌下、含服、局部、经皮、经鼻、经直肠、经阴道和有效地导致递送的试剂分散至期望治疗作用的一个或多个位置的其他施用途径。
补体调节蛋白
CD46(也称为膜辅因子蛋白MCP)、CD55(也称为衰变加速因子DAF)和CD59(也称为保护素)可互换地称为补体调节蛋白(CRPs)、膜结合补体抑制蛋白、补体调节剂等。大多数细胞通过一个或多个此类CRP而免受补体的破坏。CD46和CD55靶向C3/C5转化酶阶段上的起始途径。CD59阻断终末补体途径并且通过在MAC装配期间结合C8和C9阻止MAC形成(Meri等人，1990)。已例如在许多原发性肿瘤和肿瘤细胞系(Fishelson等人，Mol Immunol 40(2-4)：109-23(2003)；Gelderman等人，Lab Invest 82(4)：483-93(2002)；Yan等人，(2008))；自身免疫性疾病和感染性疾病中注意到CRP的过表达。
CD46：
CD46(MCP)为在有核细胞的膜上表达的1型跨膜糖蛋白。人CD46蛋白序列在本文中提供为SEQ ID NO：14，其对应于Genbank登录号ABK81636。从其细胞外氨基酸末端开始，人CD46蛋白具有4个串联的补体调控蛋白(CCP)模块：CCP1(aa 35-88)、CCP2(aa99-158)、CCP3(aa162-224)和CCP4(aa 228-283)，随后为1或2个富含高度O-糖基化丝氨酸/苏氨酸/脯氨酸(STP)的结构域、跨膜结构域和胞质尾区。4个CCP模块形成CD46的细胞外结构域的主要部分。CCP包含3个N联糖基化位点。STP结构域和细胞质尾结构域可各自经历选择性剪接，从而导致分子量在55至65kDa的范围内变化的CD46的4个主要人同种型(BC1、BC2、C1和C2)(A.Gaggar等人，Journal of Virology79：7503-7513(2005))。
CD46首先是由于其补体结合和调节性质而为人所知的(综述于M.K.Liszewski等人，Advances in Immunology 61：201-283(1996)中)。在这一点上，CD46保护细胞免受膜攻击复合物(MAC)在细胞膜上的形成。具体地，CD46结合与细胞膜相结合的补体因子C4b和C3b，并且用作辅因子通过血浆丝氨酸蛋白酶因子I使它们的蛋白水解活性失活。该相互作用由CD46CCP2、CCP3和CCP4结构域介导。蛋白质水解失活因阻止结合的补体因子的C3(C3a、C3b)和C5(C5a、C5b)转化酶活性而阻止了细胞上MAC的形成(A.Gaggar等人，Journal ofVirology 79：7503-7513(2005))。此外，两种人同种型存在CD46细胞质结构域，其在调节T细胞诱导的炎症反应中具有相反作用(J.C.Marie等人，Nature Immunology 3：659-666(2002))。
除了其在免疫应答的调控中作用外，CD46还用作多种病原体包括麻疹病毒、人类疱疹病毒6型和两种类型的细菌--产脓链球菌(Streptococcus pygogenes)和病原性淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)的受体。麻疹病毒血凝素蛋白与CD46 CCP1和CCP2相互作用。CCP2和CCP3充当人类疱疹病毒6型和链球菌的结合靶，而CCP3和STP结构域是奈瑟球菌附着所必需的(A.Gaggar等人，Journal of Virology 79：7503-7513(2005))。此外，已证明CD46是一系列人腺病毒血清型的高亲和力受体(S.Tuve等人，Journal of Virology 80：12109-12120(2006)；A.Gaggar等人，Nature Medicine9：1408-1412(2003)；和D.Sirena等人，Journal of Virology78：4454-4462(2004))。
此外，已显示CD46是一系列人腺病毒血清型的高和力受体(S.Tuve等人，Journalof Virology 80：12109-12120(2006)；A.Gaggar等人，Nature Medicine 9：1408-1412(2003)；和D.Sirena等人，Journal of Virology 78：4454-4462(2004))。
已显示CD46CCP2结构域介导对腺病毒的两个血清型-Ad11和Ad35的结合。具体地，CCP2结构域的天然构象对于Ad35附着是至关重要的，并且该结构域上氨基酸位置130至135或152至156上的置换完全消除Ad35结合。已有人提出利用CD46进行细胞附着的多种病原体就是这样做的，因为其为病原体提供了调节免疫应答的机会(R.Cattaneo，Journal ofVirology 78：4385-4388(2004))。例如，已报导利用多价抗体或利用麻疹病毒在细胞表面上进行CD46的交联可诱导以与巨胞饮(macropinocytosis)相似的过程吞噬配体，从而导致细胞表面C 46降解的伪足，这反过来保护细胞免受补体裂解(B.Crimeen-Irwin等人，Journal of Biological Chemistry 278：46927-46937(2003)；J.Schneider-Schaulies等人，Journal of Virology 70：255-263(1996))。
腺病毒是非包膜双链DNA病毒。人腺病毒已被分类成6个亚组(A至F)，包括多至51个血清型。B组腺病毒构成两个遗传簇(genetic clusters)-B1(包括血清型Ad3，Ad7，Ad16，Ad21和Ad50)和B2(包括血清型Ad11，Ad14，Ad34和Ad35)(G.Wadell等人，Annals of theNew York Academy of Sciences 354：16-42(1980))。大多数B1腺病毒主要与急性呼吸道疾病相关，并且与C组腺病毒(例如，Ad5)不同，其不建立持久性(G.Wadell，Current Topicsin Microbiology and Immunology 110：191-220(1984))。B2血清型Ad11p，Ad34和Ad35主要与肾和尿道的感染相关。B组血清型在腺病毒中是独特的，因为它们不使用柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)作为它们的主要附着受体。特别地，B2组I血清型，包括Ad16，Ad21，Ad35和Ad50，几乎只使用CD46作为受体；B2组II血清型，包括Ad3，Ad7p和Ad14，使用仍未被鉴定的受体并且不使用CD46；最后，B2组III，血清型Ad11p，使用CD46和该仍未被鉴定的受体二者(S.Tuve等人，Journal of Virology 80：12109-12120(2006))。
腺病毒病毒体是二十面体，其特征在于位于衣壳的12个顶角每一个的基部的纤维。病毒体上的纤维是由3个单个纤维多肽组成的同源三聚体结构。每一个腺病毒纤维多肽是不对称结构，其由以下所组成：N末端尾(其与衣壳的五邻体基质蛋白(penton baseprotein)相互作用并且包含将蛋白质转运至细胞核所必需的信号)、柄(其包含多个15个残基的重复单位)和包含用于受体结合的决定簇的C末端钮结构域组成(J.S.Hong andJ.A.Engler，Journal of Virology 70：7071-7078(1996))。来自所有组(无论是CAR相互作用还是B组腺病毒)的腺病毒通过纤维末端上的钮结构附着至它们的受体(A.Gaggar等人，″CD46 Is a Cellular Receptor for Group B Adenoviruses，″Journal of NatatrualMedicines 9：1408-1412(2003))。纤维多肽的三聚化是腺病毒与其受体结合所必需的(J.S.Hong和J.A.Engler，Journal of Virology 70：7071-7078(1996)；H.Wang等人，Journal of Virology 81：12785-12792(2007))。突变型Ad2纤维的研究显示所述纤维多肽的三聚化只需要C末端钮结构域的部分和柄区域的C末端的较短的部分。似乎纤维的至少N端半部分可缺失而不影响三聚化(J.S.Hong and J.A.Engler，Journal of Virology 70：7071-7078(1996))。
已测定了C组血清型Ad5(结合CAR受体)(D.Xia等人，Structure 2：1259-1270(1994))、B组血清型Ad11(结合CD46受体)(B.D.Persson等人，Nature Structural&Molecular Biology 14：164-166(2007))和B组血清型Ad35(结合CD46受体)(H.Wang等人，Journal of Virology 81：12785-12792(2007))的腺病毒钮结构域的具体结构。同源三聚体钮结构域似乎形成如三叶螺旋桨一样的结构，由此每一个叶片(即单个钮结构域)包含多个紧密堆叠的β折叠片(标记为A至J)。与CD46结构域CCP1和CCP2结合的重组Ad11纤维钮的结晶揭示纤维钮结构域的F-G、H-I和I-J环内3个至关重要的接触区(B.D.Persson等人，Nature Structural&Molecular Biology 14：164-166(2007))。该模型得到了证明Ad11病毒与CD46的结合可通过在Ad11 H-I环内引入单个氨基酸置换(Arg279Gln)而被消除的研究支持(D.J.Gustafsson等人，Journal of Virology 80：1897-1905(2006)[作者的修正，80：5101.])。
结晶和突变研究已阐明Ad35纤维钮结合CD46的关键区域，建立了Ad35纤维钮结构域CD46相互作用的模型，其中一个CD46单位在钮同源三聚体结构内的每一对纤维钮结构域之间结合(H.Wang等人，Journal of Virology 81：12785-12792(2007)，通过引用整体并入本文)。因此，单个纤维钮同源三聚体能够交联3个CD46受体。已使用特异于钮蛋白的三聚体形式的抗体(ab1187-100，批号134173；Abcam)确定了三聚化是Ad35纤维钮与可溶性CD46的结合所必需的，H.Wang等人，Journal of Virology 81：12785-12792(2007)。如H.Wang等人中所描述的，使用诱变PCR产生Ad35纤维钮突变型多肽文库以便每个纤维钮结构域多肽产生平均1或2个氨基酸突变。对文库进行三聚化和与可溶性CD46结合的双重选择。破坏三聚化的突变都不能结合CD46。鉴定了其中突变消除Ad35纤维钮结合CD46但不影响三聚化的4个残基：氨基酸位置242上的Phe、氨基酸位置279上的Arg、位置282上的Ser和位置302上的Glu。此类残基位于相应于针对Ad11纤维钮结构域报导的3个接触区的区域内。其他轮的筛选不覆盖其他区域，表明已找出了所有可检测的CD46关键相互作用区域。结晶学图像的迭加(Superimposition)显示Ad35与Ad11之间的核心结构高度相似。此外，全部Ad35突变存在于球状Ad35纤维钮结构内的暴露的环区域内，这强调了它们在受体结合中的作用。具体地，存在于F-G和H-I环中的接触残基位于Ad35单体的相对于I-J环中接触区域的对侧，表明一个CD46单位结合在两个Ad35纤维钮单体之间。这获得了表示CD46分子与Ad35纤维钮单体之间以1∶1相互作用的化学计量学数据的支持(H.Wang等人，Journal of Virology 81：12785-12792(2007))。因此，Ad35纤维钮结构域CD46相互作用不仅导致紧密结合，而且还交联数个CD46分子。
CD55：
CD55(DAF)是一种70kDa蛋白质，在人中由CD55基因编码的(Medof ME，等人(April1987)″Cloning and characterization of cDNAs encoding the complete sequence ofdecay-accelerating factor of human complement″.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84(7)：2007-11)。人CD55蛋白质序列相应于Genbank登录号AAC60633。CD55是调节细胞表面上的补体系统的70kDa膜蛋白。其阻止C3bBb复合物(旁路途径的C3转化酶)的装配或加速先形成的转化酶的解装配，从而阻止膜攻击复合物的形成。CD55糖蛋白广泛地分布在造血和非造血细胞中。所述蛋白与一些补体蛋白共有一些氨基酸重复基序和功能相似性。Osuka等人，″Molecular Cloning and Characterization of Novel Splicing Variants ofHuman Decay-Accelerating Factor，″Genomics 88(3)：316-322，September 2006；已报导了许多种在几乎所有测试的组织中表达但在它们的表达模式上有变化的剪接变体。一些变体是在糖基化后分泌的CD55的可溶性形式(M.A.Davitz等人，″Release of Decay-Accelerating Factor(DAF)From the Cell Membrane by Phosphatidylinositol-Specific Phospholipase C(PIPLC)，″Journal of Experimental Medicine 163(5)：1150-1161，May 1986)。
CD55是在自身细胞的膜中固有地起作用以防止自体C3b在它们的表面上沉积的补体调节剂(V.Nussenzweig等人，″Inhibition of Complement Activation on theSurface of Cells After Incorporation of Decay-Accelerating Factor(DAF)IntoTheir Membranes，″Journal of Experimental Medicine 160(5)：1558-1578，November1984)。其用于加速生物分子C3转化酶(级联的中心扩增酶)的衰变-分解(decay-dissociation)。(A.Nicholson-Weller等人，″Isolation of a Human ErythrocyteMembrane Glycoprotein With Decay-Accelerating Activity for C3 Convertases ofthe Complement System，″The Journal of Immunology 129(1)：184-189，July 1982；M.K.Pangburn等人，″Breakdown of C3 After Complement Activation：Identificationof a New Fragment C3g，Using Monoclonal Antibodies，″Journal of ExperimentalMedicine 156(1)：205-216，July 1982；T.Fujita等人，″The Mechansism of Action ofDecay-Accelerating Factor(DAF)：DAF Inhibits the Assembly of C3 Convertases byDissociating C2a and Bb，″Journal of Experimental Medicine 166(5)：1221-1228，November 1987)。
CD55为CD97的细胞配体(J.Hamann等人，″The Seven-Span TransmembraneReceptor CD97 Has a Cellular Ligand(CD55，DAF)，″Journal of ExperimentalMedicine 184(3)：1185-1189，September 1996)。阵发性睡眠性血红蛋白尿症(paroxysmalnocturnal hemoglobinuria)患者的红细胞缺乏CD55。此类患者的细胞不能附着至表达反受体(counterreceptor)的细胞。CD55的缺乏似乎不具有任何相关血液学异常或其他异常(D.M.Lublin等人，″Molecular Basis of Reduced or Absent Expression of Decay-Accelerating Factor in Cromer Blood Group Phenotypes，″Blood 84(4)：1276-1282，August 1994)。阵发性睡眠性血红蛋白尿症中CD55的不存在导致患病细胞上增加的C3b摄取(M.E.Medof等人，″Amelioration of Lytic Abnormalities of Paroxysmal NocturnalHemoglobinuria With Decay-Accelerating Factor，″Proceeings of the NationalAcademy of Sciences USA(PNAS)82(9)：2980-2984，May 1985)。
CD55被一些柯萨奇病毒和其他肠道病毒例如艾可病毒和柯萨奇病毒B病毒用作受体(Karnauchow TM，Tolson DL，Harrison BA，Altman E，Lublin DM，Dimock K(August1996).″The HeLa cell receptor for enterovirus 70 is decay-accelerating factor(CD55)″.J.Virol.70(8)：5143-52；Goodfellow等人，J Gen Virol 81(5)：1393-401(2000))。已在小鼠中测试了将重组可溶性CD55-Fc作为心脏损伤的抗肠道病毒疗法(Yanagawa B，Spiller OB，Choy J，Luo H，Cheung P，Zhang HM，Goodfellow IG，Evans DJ，Suarez A，Yang D，McManus BM(January 2003).″Coxsackievirus B3-associatedmyocardial pathology and viral load reduced by recombinant soluble humandecay-accelerating factor in mice″.Lab.Invest.83(1)：75-85)。
CD59：
CD59为糖基化磷脂酰肌醇锚定的18-20kDa糖蛋白(GPi-锚定的)。人CD59蛋白质序列相应于Genbank登录号CAG46523。CD59在人外周血白细胞、红细胞和几种人细胞系上表达。所述蛋白也在内皮细胞上、周围神经纤维的施万细胞鞘、神经元、小神经胶质细胞、少突神经胶质细胞、星形细胞、室管膜细胞和某些上皮细胞例如唾液腺的腺泡细胞、支气管上皮、肾小管和鳞状上皮细胞上表达(Nose等人，″Tissue distribution of HRF20，a novelfactor preventing the membrane attack of homologous complement，and itspredominant expression on endothelial cells in vivo，″Immunology 70(2)：145-9，June 1990；Vedeler等人，″The expression of CD59 in normal human nervoustissue，″Immunology 82(4)：542-7，August 1994；Hideshima等人，″Expression ofHRF20，a regulatory molecule of complement activation，on peripheral bloodmononuclear cells，″Immunology 69(3)：396-401，March 1990)。
CD59也被称为保护素或人白细胞表面抗原MIC11，MIN1，MIN2，MIN3，MSK21。该蛋白已被鉴定为HRF20[同源限制因子(homologous restriction factor)-20kDa]和MACIF[膜攻击复合物抑制因子](MAC-IP，MAC-抑制蛋白)。其与小鼠Ly6抗原密切相关(Petranka等人，″Structure of the CD59-encoding gene：further evidence of a relationship tomurine lymphocyte antigen Ly-6 protein，″Proc Natl Acad Sci USA.89(17)：7876-9，September 1992)。人基因产生超过4种不同的mRNA分子(通过可选择的多聚腺苷酸化产生的)(Tone等人，″Gene structure of human CD59 and demonstration that discretemRNAs are generated by alternative polyadenylation，″J Mol Biol 227(3)：971-6，October 1992)。其他名称为H19、MIRL[反应性裂解的膜抑制剂]，P18，1F5，16.3A5，BRIC229，YTH 53.1。
CD59的功能是阻止膜攻击复合物(由激活的终末补体蛋白C5b至C9形成的)在细胞表面上的形成和保护细胞免受补体介导的细胞裂解(关于具有相似活性的因子也参见：CD55)。Acosta等人(″Molecular basis for a link between complement and thevascular complications of diabetes，″Proc Natl Acad Sci USA.97(10)：5450-5，May2000)已报导人CD59在体内是糖基化的，并且糖基化的人CD59丧失其对膜攻击复合物的形成的抑制功能。CD59的失活增加膜攻击复合物诱导的生长因子从内皮细胞的释放。
CD59在细胞膜上的表达限制了同源补体对细胞的裂解。所述蛋白可能不阻穿孔素对细胞的杀伤(Meri等人，″Human protectin(CD59)，an 18-20-kD homologouscomplement restriction factor，does not restrict perforin-mediated lysis，″JExp Med.172(1)：367-70，July 1990)。细胞保持对由IL2活化的淋巴细胞(LAK细胞)产生的细胞毒性攻击的敏感性，所述活化的淋巴细胞释放穿孔素(Okada等人，″HRF20，a membraneinhibit or of complement attack，does not protect cells from the cytotoxicreaction by lymphokine activated killer cells，″Biochem Biophys Res Commun.171(2)：717-21，September 1990)。
Hahn等人(″Overlapping but nonidentical binding sites on CD2 for CD58and a second ligand CD59，″Science 256(5065)：1805-7，June 1992)已将CD59鉴定为CD2的生理配体。CD2上用于CD59和另一种CD2配体即CD58的结合位点有重叠但不相同。CD58是人CD2的主要配体，从而在T细胞的细胞活化中起着共刺激作用。该效应牵涉共刺激抗原CD58(Menu等人，″CD59 costimulation of T cell activation.CD58 dependence andrequirement for glycosylation，″J.Immunol.153(6)：2444-56，September 1994)。人角质细胞中CD2介导的CD59刺激导致IL1-α、IL6和GM-CSF的分泌，它们可能参与角质细胞与表皮内T淋巴细胞的相互作用(Naderi等人，″CD2-mediated CD59 stimulation inkeratinocytes results in secretion of IL-1alpha，IL-6，and GM-CSF：implicationsfor the interaction of keratinocytes with intraepidermal T lymphocytes，″Int JMol Med.3(6)：609-14，June 1999)。
已显示CD59在许多恶性黑色素瘤细胞系中过表达(Simon等人，″Identificationof differentially expressed messenger RNAs in human melanocytes and melanomacells，″Cancer Res.1996 Jul 1；56(13)：3112-7 1996)。此类细胞还组成型地释放CD59的可溶性生物活性形式，该形式逆转其对补体介导的裂解的作用(Brasoveanu等人，″Melanoma cells constitutively release an anchor-positive soluble form ofprotectin(sCD59)that retains functional activities in homologous complement-mediated cytotoxicity，″J Clin Invest.100(5)：1248-55，September 1997)。这下调了人黑色素瘤细胞对同源补体的易感性(Coral等人，″Overexpression of protectin(CD59)down-modulates the susceptibility of human melanoma cells to homologouscomplement，″J Cell Physiol.185(3)：317-23，December 2000)。
许多艾可病毒使用CD59作为细胞感染的细胞受体或附着蛋白(Goodfellow等人，″Echovirus infection of rhabdomyosarcoma cells is inhibited by antiserum tothe complement control protein CD59，″J Gen Virol.81(Pt 5)：1393-401，May 2000)。
CD35：
CD35可互换地称为红细胞补体受体1(CR1)、C3b/C4b受体和免疫粘附受体，其为人基因。人CD35蛋白序列相应于Genbank登录号NM_000651.4；GI：86793108。由该基因编码的蛋白质是补体激活调节剂(RCA)家族的成员并且位于染色体1的′簇RCA′区域内。所述基因编码在红细胞、白细胞、肾小球上皮足突细胞(glomerular podocytes)和脾滤泡树突细胞上发现的单体单跨I型(single-pass type I)膜糖蛋白。Knops血型系统是位于该蛋白上的抗原的系统。所述蛋白介导与已活化补体成分的颗粒和免疫复合物的细胞结合。该蛋白表达的减少和/或其基因的突变与胆囊癌、膜毛细血管型肾小球肾炎(mesangiocapillaryglomerulonephritis)、系统性红斑狼疮和结节病相关。该基因的突变也与恶性疟原虫丛簇(rosetting)、赋予抗严重疟疾的保护作用的减少相关。已表征了编码不同同种型的选择性等位基因特异性剪接变体。其他等位基因特异性同种型包括分泌的形式已被描述，但未完全表征。
在灵长类动物中，CD35用作加工和清除接受补体调理的免疫复合物的主要系统。已显示CD35可用作补体级联的负调节剂，介导免疫粘附和吞噬作用，以及抑制经典和旁路途径。CR1分子的数量在正常个体中随红细胞的老化而减少，并且在病理状态例如全身性红斑狼疮(SLE)、HIV感染、某些溶血性贫血和其他涉及免疫复合物的病症中也减少。
本发明的组合物、多肽和方法
本文中提供了用于减少靶细胞上CRP活性的组合物和方法。这样的减少可通过下列方式来实现：减少靶细胞上活性CD46、CD55、CD59或CD35受体的数目；减少靶细胞上活性CD46、CD55、CD59或CD35受体的密度；引起靶细胞上CD46、CD55、CD59或CD35受体的隔离；引起靶细胞上CD46、CD55、CD59或CD35受体的内化；结合靶细胞上的CD46、CD55、CD59或CD 35受体；封闭靶细胞上的CD46、CD55、CD59或CD35受体；和/或减少通过靶细胞上CD46、CD55、CD59或CD35受体进行的信号转导和信号。靶细胞上CRP的活性的此种调节和减少在用于治疗包括但不限于癌症、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植相关病症的多种疗法中是有用的。本文中提供了经修饰的多肽或包含能够减少靶细胞表面上补体调节蛋白(CRP)的活性、量、密度、隔离或内化的经修饰的多肽的组合物，其中所述经修饰的多肽包含非天然存在的序列。
在一个实施方案中，本公开内容的多肽在长度上为至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、125、130、140、150、160、170、175、180、200、250、300、350、400、450个或甚至至少500个氨基酸。在一个具体的实施方案中，所述多肽在长度上为至少125个氨基酸。在一个相关实施方案中，本公开内容的多肽不是肽。在另一个相关的实施方案中，本公开内容的多肽可采取三维结构。
在一个实施方案中，本公开内容的多肽，在重量上为至少1000、2500、5000、7500、10,000、15,000、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95,000或甚至100,000道尔顿。
在一个实施方案中，本公开内容的多肽不是生长因子或细胞因子。
在一个实施方案中，本公开内容的多肽不结合转录调控区。在一个具体的实施方案中，所述多肽不结合基因的启动子区域、增强子区域、沉默子区域或绝缘子区域。在另一个具体的实施方案中，所述多肽不结合转录因子。
在一个实施方案中，本公开内容的多肽包含天然存在的蛋白质或蛋白质结构域的至少一个突变。在另一个实施方案中，所述多肽包含与天然存在的蛋白质或蛋白质结构域至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在另一个实施方案，所述多肽不是天然存在的蛋白质或蛋白质片段。
在另一个实施方案中，本公开内容的多肽具有第一结构域和第二结构域，其中所述第一结构域和第二结构结合CRP，其中所述第一结构域包含SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：31中所示的氨基酸序列，并且其中X1不是天冬氨酸，X2不是苏氨酸或X3不是异亮氨酸。在一个具体的实施方案中，X1为除了天冬氨酸外的任意氨基酸，X1为甘氨酸，或X1为谷氨酸。在另一个具体的实施方案中，X2为除了苏氨酸外的任意氨基酸，X2为丙氨酸或X2为任意非极性氨基酸。在另一个具体的实施方案中，X3为除了异亮氨酸外的任意氨基酸，X3为亮氨酸或X3为任意非极性氨基酸。在一个相关实施方案中，所述第一结构域包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列，其中X1不是天冬氨酸；SEQ IDNO：26，其中X2不是苏氨酸；或SEQ ID NO：31，其中X3不是异亮氨酸。在另一个相关的实施方案中，所述第二结构域包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列，其中X1不是天冬氨酸；SEQ IDNO：26，其中X2不是苏氨酸；或SEQ ID NO：31，其中X3不是异亮氨酸。
SEQ ID NO：15至SEQ ID NO：31的描述
SEQ ID NO：1.
(AD35纤维钮结构域的DE环的氨基酸序列)
DSSGNLLTX1ESDLKIPL
其中X1为任意氨基酸；
其中X1为D(野生型)；
其中X1为G(突变型)；或
其中X1为E(保守置换)
SEQ ID NO：16.
(AD35纤维钮结构域的DE环的部分氨基酸序列)
GNLLTX1ESDLK
其中X1为任意氨基酸；
其中X1为D(野生型)；
其中X1为G(突变型)；或
其中X1为E(保守置换)
SEQ ID NO：17.
(AD35纤维钮结构域的DE环的部分氨基酸序列)
NLLTX1ESDL
其中X1为任意氨基酸；
其中X1为D(野生型)；
其中X1为G(突变型)；或
其中X1为E(保守置换)
SEQ ID NO：18.
(AD35纤维钮结构域的DE环的部分氨基酸序列)
LLTX1ESD
其中X1为任意氨基酸；
其中X1为D(野生型)；
其中X1为G(突变型)；或
其中X1为E(保守置换)
SEQ ID NO：19.
(AD35纤维钮结构域的DE环的部分氨基酸序列)
LTX1ES
其中X1为任意氨基酸；
其中X1为D(野生型)；
其中X1为G(突变型)；或
其中X1为E(保守置换)
SEQ ID NO：20.
(AD35纤维钮结构域的DE环的部分氨基酸序列)
TX1E
其中X1为任意氨基酸；
其中X1为D(野生型)；
其中X1为G(突变型)；或
其中X1为E(保守置换)
SEQ ID NO：21.
(AD 35纤维钮结构域的DE环的部分氨基酸序列)
GNLLTX1ES
其中X1为任意氨基酸；
其中X1为D(野生型)；
其中X1为G(突变型)；或
其中X1为E(保守置换)
SEQ ID NO：22.
(AD 35纤维钮结构域的DE环的部分氨基酸序列)
GNLLTX1
其中X1为任意氨基酸；
其中X1为D(野生型)；
其中X1为G(突变型)；或
其中X1为E(保守置换)
SEQ ID NO：23.
(AD35纤维钮结构域的FG环的氨基酸序列)
TSETVASSKAFMPSTTAYPFNTX2TRDSENYIHGX3
其中X2为任意氨基酸；
其中X2为T(野生型)；
其中X2为A(突变型)；
其中X2为C，G，N，Q，S或Y；或
其中X2为F，I，L，M，P，V或W
其中X3为任意氨基酸；
其中X3为I(野生型)
其中X3为L(突变型)
其中X3为A，F，M，P，V或W
SEQ ID NO：24.
(AD35纤维钮结构域的FG环的部分氨基酸序列)
FNTX2TRDSENYIHGX3
其中X2为任意氨基酸；
其中X2为T(野生型)；
其中X2为A(突变型)；
其中X2为C，G，N，Q，S或Y；或
其中X2为F，I，L，M，P，V或W
其中X3为任意氨基酸；
其中X3为I(野生型)
其中X3为L(突变型)
其中X3为A，F，M，P，V或W
SEQ ID NO：25.
(AD35纤维钮结构域的FG环的部分氨基酸序列)
FNTX2TRD
其中X2为任意氨基酸；
其中X2为T(野生型)；
其中X2为A(突变型)；
其中X2为C，G，N，Q，S或Y；或
其中X2为F，I，L，M，P，V或W
SEQ ID NO：26.
(AD35纤维钮结构域的FG环的部分氨基酸序列)
NTX2TR
其中X2为任意氨基酸；
其中X2为T(野生型)；
其中X2为A(突变型)；
其中X2为C，G，N，Q，S或Y；或
其中X2为F，I，L，M，P，V或W
SEQ ID NO：27.
(AD35纤维钮结构域的FG环的部分氨基酸序列)
TX2T
其中X2为任意氨基酸；
其中X2为T(野生型)；
其中X2为A(突变型)；
其中X2为C，G，N，Q，S或Y；或
其中X2为F，I，L，M，P，V或W
SEQ ID NO：28.
(AD35纤维钮结构域的FG环的部分氨基酸序列)
X2TRDSENYIHGX3
其中X2为任意氨基酸；
其中X2为T(野生型)；
其中X2为A(突变型)；
其中X2为C，G，N，Q，S或Y；或
其中X2为F，I，L，M，P，V或W
其中X3为任意氨基酸；
其中X3为I(野生型)；
其中X3为L(突变型)；或
其中X3为A，F，M，P，V或W
SEQ ID NO：29.
(AD35纤维钮结构域的FG环的部分氨基酸序列)
TRDSENYIHGX3
其中X3为任意氨基酸；
其中X3为I(野生型)；
其中X3为L(突变型)；或
其中X3为A，F，M，P，V或W
SEQ ID NO：30.
(AD35纤维钮结构域的FG环的部分氨基酸序列)
YIHGX3
其中X3为任意氨基酸；
其中X3为I(野生型)；
其中X3为L(突变型)；或
其中X3为A，F，M，P，V或W
SEQ ID NO：31.
(AD35纤维钮结构域的FG环的部分氨基酸序列)
HGX3
其中X3为任意氨基酸；
其中X3为I(野生型)；
其中X3为L(突变型)；或
其中X3为A，F，M，P，V或W
在另一个相关实施方案中，所述第一和第二结合域结合相同的CRP，或可选择地所述第一和第二结构域结合不同CRP。在本发明的该方面中提供的实施方案中，CRP为CD 35、CD46、CD55或CD59。在一个具体的实施方案中，CRP为CD46。在相关实施方案中，所述多肽引起CRP至细胞中的内化或隔离；和/或所述多肽以约1nM或更小的或甚至约.65nM或更小的解离常数(Kd)结合CRP。在一些实施方案中，所述多肽不是抗体或抗体片段。所述多肽可以是分离的经修饰的病毒蛋白质，例如来源于腺病毒纤维钮蛋白的多肽。来源于腺病毒的纤维钮结构域的此类多肽可以例如选自Ad11、Ad16、Ad21、Ad34、Ad35和Ad50。在一个非常具体的实施方案中，所述多肽来源于Ad35纤维钮结构域，并且包含在选自Asp207、Thr245、Ile256中的残基上的至少一个氨基酸置换或其组合；或更具体地所述氨基酸置换为Asp207Gly、Thr245Ala、Ile256Leu或其组合。在另一个实施方案中，所述多肽少于25,000道尔顿。
本文中提供的多肽可以二聚化、三聚化、同源二聚化或同源三聚化。在一个实施方案中，所述多肽自发地二聚化、同源二聚化、三聚化或同源三聚化。二聚体、三聚体、同源二聚体或同源三聚体可具有三维结构，其中各单体包含具有结合CRP的亲和力的两个环。环之间的序列可以是可置换的并且不降低对CRP的结合。
在一个相关实施方案中，本文中提供了包含非天然存在的序列的单体多肽，所述单体多肽在二聚化或三聚化之后能够结合补体调节蛋白(CRP)。可按照本领域技术人员已知的方法确定二聚体，三聚体，同源二聚体和同源三聚体形成。例如，多肽的三聚化可通过一些标准包括在蔗糖梯度中的沉降、对胰蛋白酶蛋白水解的抗性和聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率来评估(Hong和Engler，Journal of Virology 70：7071-7078(1996))。
本发明的多肽还可包含三聚化结构域。在一个实施方案中，所述三聚化结构域来源于病毒蛋白质。例如，所述三聚化结构域为细菌噬菌体T4弹力素(fibritin)结构域或逆转录病毒纤维蛋白σ1结构域。在一个实施方案中，所述三聚化结构域包含氨基酸序列：GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID NO：32)。
同样地，本文中还提供了包含至少1个、2个、3个或更多个本文中描述的任何多肽的多肽复合物。在一个实施方案中，所述多肽复合物可结合两个或更多个CRP分子。CRP可以是CD35、CD46、CD55或CD59。在一个具体的实施方案中，CRP为CD46。
在一个实施方案中，本公开内容的多肽复合物在重量上为至少1000、2500、5000、7500、10,000、15,000、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95,000或甚至100,000道尔顿。
在一个具体的实施方案中，如实施例1中所描述的，与野生型Ad35纤维钮结构域多肽相比较，Ad35纤维钮结构域内的特定氨基酸置换(即，突变的或经修饰的Ad35纤维钮结构域多肽)增强同源三聚体纤维钮结构域多肽对CD46的结合亲和力。如实施例2中所显示的，将细胞与突变型Ad35纤维钮结构域多肽接触诱导了CD46-Ad35纤维钮复合物的内化，从而减少细胞表面上CD46的大量存在。此外，与对于野生型Ad35纤维钮结构域多肽所观察到的相比较，具有增强的对CD46的结合亲和力的突变型Ad35纤维钮结构域多肽(Asp207Gly和Thr245Ala)引起细胞表面CD46的更多减少，并且这种减少持续更长时间。如实施例2和3中所显示的，表面CD46水平的短暂降低导致肿瘤细胞对由抗癌mAb产生的CDC敏感性。这种致敏效应对于具有增强的对CD46结合的突变型Ad35纤维钮结构域多肽是最大的，然后是野生型Ad35纤维钮结构域多肽，其两者都具有比抗CD46mAb的致敏效应更大的效应。如实施例3中所显示的，在体内观察到该致敏作用的疗效，其中接受淋巴瘤异体移植物的小鼠在mAb治疗之前接受突变型Ad35纤维钮结构域多肽的致敏处理后，在它们的骨髓中具有更低水平的淋巴瘤细胞和延长的存活期。如实施例2中进一步所显示的，由突变型Ad35纤维钮结构域多肽诱导的CD46的表面水平的降低减少了Ad35-GFP载体的细胞感染性。因此，突变型Ad35纤维钮结构域多肽(例如，Ad35K++)的高亲和力和它们交联几个CD46分子的能力一起导致短暂的CD46内化，这继而使淋巴瘤细胞在体外和在淋巴瘤的体内动物模型中对利妥昔单抗介导的CDC敏感。
靶细胞表面上CRP活性的减少
所述多肽、二聚体或三聚体与CRP的结合可根据本领域技术人员已知的方法来确定。例如，与CD46，CD55，CD59或CD35的结合可通过简单的western印迹或Wang，H.，等人，Journal of Virology 81：12785-12792(2007)及实施例1(对于CD46)中描述的表面等离子体共振测定来确定。例如，可按照本领域技术人员公知的方法例如实施例1中描述的表面等离子体共振来定量同源三聚体对于CD46的结合亲和力。
因此，在一个实施方案中，提供了包含非天然存在的氨基酸序列和至少2个能够结合CRP的结构域的经修饰多肽。所述多肽本身可结合CRP，或可二聚化，三聚化，同源二聚化或同源三聚体化以结合CRP。所述多肽还可以是可结合CRP的蛋白质复合物的部分。本文中提供了包含非天然存在的氨基酸序列的经修饰多肽、包含此类经修饰多肽的二聚体或三聚体，或者包含两个或更多个此类经修饰多肽的多肽复合物，其中所述经修饰的多肽、二聚体、三聚体或复合物可以以与未修饰的野生型或亲本多肽相比较而言更大的亲和力(例如为至少1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、23、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、500或至少约1000倍)结合CRP。因此，CRP对所述经修饰的多肽、二聚体、三聚体或复合物的解离常数(Kd)不超过10nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1.5nM、1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.65nM、0.63nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.25nM、0.2nM、0.15nM、0.1nM、0.05nM、0.01nM、0.005nM、0.001nM、0.0005nM或0.0001nM。在一个具体的实施方案中，如实施例1中所描述的，经修饰的纤维钮结构域多肽和CD46的Kd为.63nM。
因此，在一个实施方案中，本文中提供的经修饰多肽能够形成三聚体或同源三聚体，所述三聚体结合在靶细胞表面上表达的CRP(CD46、CD55、CD59或CD35)并且诱导CRP至细胞内的内化。在另一个实施方案中，本文中提供的经修饰多肽能够形成三聚体或同源三聚体，所述三聚体结合在靶细胞表面上表达的CRP(CD46、CD55、CD59或CD35)并且诱导CRP的隔离。在另一个实施方案中，本文中提供的经修饰的多肽能够形成三聚体或同源三聚体，所述三聚体结合在靶细胞表面上表达的CRP(CD46、CD55、CD59或CD35)并且减小靶细胞上CRP受体的密度。在另一个相关的实施方案中，本文中提供的经修饰的多肽能够形成三聚体或同源三聚体，所述三聚体结合在靶细胞表面上表达的CRP(CD46、CD55、CD59或CD35)并且减少靶细胞上CRP的活性。
在一个实施方案中，与经修饰的多肽一起温育或与其接触引起至少5％的细胞表面CRP水平的下降，优选至少10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％的细胞表面CRP水平的下降。
在另一个实施方案中，与经修饰的多肽一起温育或与其接触引起至少5％的细胞表面上CRP密度的减小，优选至少10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％的细胞表面上CRP密度的减小。
在另一个实施方案中，与经修饰的多肽一起温育或与其接触引起至少5％的细胞表面上CRP活性的减少，优选至少10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％的细胞表面上CRP活性的减少。
在另一个实施方案中，与经修饰的多肽一起温育或与其接触引起至少5％的细胞表面上CRP隔离或内化的增加，优选至少10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％的细胞表面上隔离或内化的增加。
在一些实施方案中，在细胞表面CRP水平恢复至温育前水平之前，通过与经修饰的多肽温育产生的细胞表面CRP水平的下降，细胞表面上CRP密度的减小，靶细胞表面上CRP活性的减小，CRP内化的增加，CRP隔离的增加持续至少2小时、4小时、6小时、8小时、10小时，优选持续至少12小时、24小时、36小时、48小时、72小时或96小时。
在一个示例性实施方案中，包含SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的至少12个连续氨基酸的经修饰纤维钮结构域多肽包含促进CD46结合的支架基序。
经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽
在一个示例性实施方案中，经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽被用于减小细胞表面上CD46的活性。图1A是以SEQ ID NO：2(其由以SEQ ID NO：1提供的cDNA编码)提供的全长野生型腺病毒血清型35(Ad35)纤维多肽的示意图，其显示N末端尾结构域(aa 1-45)、柄结构域(aa 46-133)和C末端纤维钮(K)结构域(aa 134-323)的相对位置。先前已确定除了钮结构域(aa 134-323)外，柄结构域的C末端最末部分(aa 123-133)是纤维三聚化所必需的。Hong和Engler，J.Virology 70：7071-7078(1996)。因此，如图1B中所显示的，包含柄结构域的11氨基酸部分(aa 123-133)和完整钮结构域(aa 134-323)的野生型Ad35多肽提供为SEQID NO：3。本文中公开了相对于SEQ ID NO：2的第一氨基酸残基按顺序编号的氨基酸置换(图1A中显示的)。因此，存在于SEQ ID NO：3中的第一氨基酸残基相应于全长纤维多肽(SEQID NO：2)的氨基酸123。该编号方案也用于只包含SEQ ID NO：2的亚部分或变异的多肽序列中相应的氨基酸位置，以使序列的相对位置与全长序列相通。
如本文中所使用，纤维多肽(SEQ ID NO：2)的钮结构域(SEQ ID NO：3)中的下列氨基酸置换：氨基酸残基207(其中Asp被Gly替代)、氨基酸残基245(其中Thr被Ala替代)以及氨基酸残基256(其中Ile被Leu替代)单个地或组合地导致经修饰Ad35纤维钮结构域多肽对于CD46的结合亲和力增强。参见表2和实施例1。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的至少12个连续氨基酸的经修饰纤维钮结构域多肽，其中所述多肽包含选自Asp207Gly、Thr245Ala和Ile256Leu的至少一个氨基酸置换或其组合，并且其中所述多肽可形成能够结合CD46的同源三聚体。
如本文中所使用的，术语″SEQ ID NO：3的连续氨基酸″是指氨基酸残基如它们出现在SEQ ID NO：3中一样的连续排序，而无插入、缺失或大多数的置换。然而，该短语允许掺入描述的氨基酸置换(即，Asp207Gly、Thr245Ala、Ile256Leu)。因此，在一个示例性实施方案中，所述多肽可包含SEQ ID NO：3的至少残基1-12(相应于SEQ ID NO：2，氨基酸残基123-135)和一个或多个如下置换：位置85上的Gly置换(相应于SEQ ID NO：2的位置207上的Asp)；位置120上的Thr置换(相应于SEQ ID NO：2的位置245上的Ala)；和/或位置134上的Ile置换(相应于SEQ ID NO：2的位置134上的Leo)。
在一些实施方案中，所述经修饰的纤维钮结构域多肽包含SEQ ID NO：3的至少20、至少30、至少40、至少50、至少100、至少200或至少300个连续氨基酸并且还包含选自Asp207Gly，Thr245Ala和Ile256Leu的氨基酸置换的至少一个置换。
在一些实施方案中，所述经修饰的纤维钮结构域多肽包含SEQ ID NO：3的至少12至约20个连续氨基酸，包括选自Asp207Gly、Thr245Ala和Ile256Leu的氨基酸置换的至少一个置换。
在其他实施方案中，所述经修饰的纤维钮结构域多肽包含SEQ ID NO：3的至少20至约50个连续氨基酸，包括至少一个选自Asp207Gly、Thr245Ala和Ile256Leu的氨基酸置换。
在其他实施方案中，所述经修饰的纤维钮结构域多肽包含SEQ ID NO：3的至少50至约100个连续氨基酸，包括选自Asp207Gly、Thr245Ala和Ile256Leu的氨基酸置换的至少一个置换。
在其他实施方案中，所述经修饰的纤维钮结构域多肽包含SEQ ID NO：3的约100个至全部连续氨基酸，包括选自Asp207Gly、Thr245Ala和Ile256Leu的氨基酸置换的至少一个置换。
在一个实施方案中，所述经修饰的纤维钮结构域多肽包含SEQ ID NO：3的至少40个连续氨基酸，其中所述多肽包含Asp207Gly和Thr245Ala。在一个实施方案中，所述多肽包含具有置换Asp207Gly和Thr245Ala的SEQ ID NO：3，如SEQ ID NO：5中所示的，其由SEQ IDNO：4所示的cDNA编码.
在另一个实施方案中，所述经修饰的纤维钮结构域多肽包含SEQ ID NO：6，SEQ IDNO：7，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的至少一个。SEQ ID NO：6为Ad35纤维钮结构域中DE环区域的连接Dβ折叠片与Eβ折叠片的氨基酸序列，并且相应于SEQ ID NO：2的从氨基酸位置199至氨基酸位置215的连续氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽包含含有氨基酸置换Asp207Gly的SEQ ID NO：6(DE环)。
SEQ ID NO：7为Ad35纤维钮结构域中FG环区域的连接Fβ折叠片与Gβ折叠片的氨基酸序列，并且相应于SEQ ID NO：2的从氨基酸位置223至氨基酸位置256的连续氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽包含含有氨基酸置换Thr245Ala和/或Ile256Leu之一或任一个的SEQ ID NO：7(FG环)。
SEQ ID NO：8为Ad35纤维钮结构域中HI环区域的连接Hβ折叠片与Iβ折叠片的氨基酸序列，相应于SEQ ID NO：2的从氨基酸位置276至氨基酸位置287的连续氨基酸序列。SEQID NO：9为Ad35纤维钮结构域中IJ环区域的连接Iβ折叠片与Jβ折叠片的氨基酸序列，相应于SEQ ID NO：2的从氨基酸位置297至氨基酸位置313的连续氨基酸序列。在一些实施方案中，所述经修饰的纤维钮结构域多肽是包含SEQ ID NOS：5、6、7和8以形成结合CD46的结合结构域的支架多肽。
Ad35纤维钮结构域的晶体学分析已帮助证实了FG环(SEQ ID NO：9)和HI环(SEQID NO：9)与IJ环(SEQ ID NO：9)中的接触区域相比较而言位于Ad35纤维钮结构域的对侧上(Wang等人，Journal of Virology 81：12785-12792(2007))。这些环内的氨基酸残基对于CD46结合是非常重要的事实暗示着一个CD46单位在两个Ad35纤维钮结构域之间(即，一个纤维钮结构域的FG和HI环与另一个纤维钮结构域的IJ环之间)结合。此外，Wang等人，Journal of Virology 82：10567-10579(2008)和实施例1中描述的结果支持由SEQ IDNOS：6和7包含的突变序列对于增强与CD46的结合的重要性。晶体学分析表明DE环(SEQ IDNO：6)中位置207上的Asp被Gly置换允许DE和HI环接近CD46。这是因为在结合中，离氨基酸位置207最近的CD46R-基团是疏水性Ile残基(Ile13)。疏水性Gly对极性Asp的置换可允许CD46HI环移至更接近Ile13残基。类似地，针对FG环(SEQ ID NO：7)内氨基酸位置245上的Thr引入疏水性Ala可能允许位置246上的Thr移至更接近CD46上位置46的Tyr。因此，FG环能够移至更接近CD46。
在一个实施方案中，所述经修饰的纤维钮结构域多肽包含与SEQ ID NO：3至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一或与其完全同一的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述经修饰的纤维钮结构域多肽包含突变型Ad35纤维钮结构域多肽的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含位置207上的氨基酸置换(其中Asp被Gly替换)和位置245上的置换(其中Thr被Ala替换)，如SEQ ID NO：5所示的。钮结构域中这2个置换的组合导致突变型Ad35纤维钮结构域多肽(在本文中也称为Ad35K++)，所述多肽三聚体化以形成同源三聚体钮结构，所述结构对于结合CD46的亲和力是由野生型Ad35纤维钮结构域多肽(SEQ ID NO：3)(在本文中也称为Ad35K)形成的同源三聚体钮结构的亲和力的23.2倍，如表2和实施例1中所显示的。
根据本发明的该方面，所述经修饰的纤维钮结构域多肽能够形成可结合在细胞表面上表达的CD46的同源三聚体钮结构。同源三聚体的形成自发地发生，并且不需要各纤维多肽的完整性。如由Hong和Engler，Journal of Virology 70：7071-7078(1996)(通过引用并入本文)所显示的，Ad2纤维蛋白的完整N端半部分的缺失不影响同源三聚化。因此，至多纤维蛋白的C端半部分对于三聚化是足够的。具体地，研究人员发现C端上的小缺失(SEQ IDNO：2 aa 123-134)破坏三聚化，然而保留残基电荷的选择的添加或置换导致相对稳定的同源三聚体。因此，纤维三聚化可利用完整的纤维钮结构域和柄的至少正好C端氨基酸(SEQID NO：2 aa 123-134)来实现。
可根据本领域技术人员公知的方法确定同源三聚体形成。例如，纤维钮蛋白的三聚化可通过一些标准包括在蔗糖梯度中的沉降、对胰蛋白酶蛋白水解的抗性和聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率来评估(Hong和Engler，Journal of Virology 70：7071-7078(1996))。关于电泳迁移率，纤维钮结构域同源三聚体是非常稳定的复合物，并且当在SDS-PAGE之前未煮沸样品时，其跑在与三聚体的分子量一致的分子量上。然而，在煮沸后，三聚体结构被破坏，蛋白质随后跑在与蛋白质单体一致的大小上。纤维钮蛋白的三聚化也可使用兔多克隆抗His6-HRP抗体来进行确定，如Wang，H.，等人，Journal of Virology 81：12785-12792(2007)和实施例1中所描述的。
可根据本领域技术人员熟知的方法确定同源三聚体与CD46的结合。例如，可通过简单的western印变或如Wang，H.，等人，Journal of Virology 81：12785-12792(2007)和实施例1中描述的表面等离子体共振测定确定与CD46的结合。此外，可按照本领域技术人员公知的方法例如实施例1中描述的表面等离子体共振测定定量同源三聚体对于CD46的结合亲和力。
通常可按照本领域技术人员公知的方法确定同源三聚体的形成。例如，可根据一些标准包括在蔗糖梯度中的沉降、对胰蛋白酶蛋白水解的抗性和聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率(Hong和Engler，Journal of Virology 70：7071-7078(1996))来评估多肽的三聚化(Hong和Engler，Journal of Virology 70：7071-7078(1996))。关于电脉迁移率，纤维钮蛋白同源三聚体是非常稳定的复合物，并且当在SDS-PAGE之前未煮沸样品时，其跑在与三聚体的分子量一致的分子量上。然而，在煮沸后，三聚体结构被破坏，蛋白质随后跑在与蛋白质单体一致的大小上。纤维钮蛋白的三聚化也可使用兔多克隆抗His6-HRP抗体来进行确定，如Wang，H.，等人，Journal of Virology 81：12785-12792(2007)和实施例1中所描述的。
在一个具体的实施方案中，如实施例2中所描述的，经修饰的Ad35纤维钮结构域多肽(例如，Ad35K++)与细胞膜上表达的CD46的结合诱导纤维钮结构域多肽/CD46复合物至细胞内部的内化，如实施例2中所描述的。图2A举例说明了在加入20μg/ml PBS(对照)、野生型Ad35K(野生型)、Ad35K++(SEQ ID NO：5)或抗CD46mAb后在不同时间点上HeLa细胞上CD46的细胞表面水平。在15分钟后，与Ad35K++接触的细胞与用PBS处理的细胞相比较而言在其表面上具有约70％的CD46水平降低。Ad35K++引起CD46水平的最大下降以及最慢恢复至温育前水平。相反地，用抗CD46mAb处理的细胞只显示约30％的细胞表面CD46水平下降，并且更快地回复至温育前水平。
图2B举例说明流式细胞术研究结果，显示细胞结合的Ad35K和Ad35K++的减少，其表明纤维钮结构域多肽随CD46一起被内化。免疫荧光研究表明在将细胞与Ad35K和Ad35K++接触后30分钟，在次级内体/溶酶体中检测到纤维钮结构域多肽和CD46。此外，在将细胞与纤维钮结构域多肽接触后第12小时，用Ad35K++处理的细胞主要显示细胞质CD46染色，其强度表明CD46在溶酶体中降解。与实施例2的结果相似，对于下列淋巴瘤/白血病细胞：拉吉、Jurkat、K562、Mo7e、Mino和Farage以及对于下列实体瘤细胞：A549(肺)，SKOV3(卵巢)，HT29(结肠)和MDA235MB细胞(乳腺)观察到Ad35K++介导的表面CD46水平的降低。与这些结果相一致，如图2C中显示的，在将细胞与Ad35纤维钮或Ad35K++接触后72小时尝试用Ad35-GFP(为了进行感染需要表面CD46)感染细胞导致相对抗性的细胞，这表明表面CD46的不存在。对其他肿瘤细胞系例如红白血病Mo7e细胞和B淋巴瘤拉吉细胞进行的相似CD46流式细胞术和Ad35-GFP测定产生相似的结果。
鉴定能够减少靶细胞表面上CRP的活性、量或密度的分子
在一个实施方案中，提供了用于筛选能够改变CRP活性的分子或化合物的方法。所述方法包括产生候选分子文库，选择能够结合CRP的候选分子，并且确定所述分子是否改变CRP的活性。CRP可以为CD46、CD55、CD59或CD35。在一个具体的实施方案中，CRP为CD46。在一个实施方案中，所述分子例如以1nM或更小的结合亲和力结合CRP。待筛选的分子可选自蛋白质、多肽、小分子、药物、抗体、抗体片段、杂合抗体、抗体-药物缀合物、siRNA、反义RNA、miRNA、病毒和适体。在一个示例性实施方案中，所述分子是小分子。在另一个示例性实施方案中，所述分子是多肽。在相关实施方案中，所述分子通过CRP至细胞内的内化或隔离，或通过减少细胞表面上CRP的量或密度来改变CRP的活性。
可通过针对测试分子筛选表达CRP的细胞群或分级分离的细胞来鉴定能够改变CRP的活性或结合CRP的分子。可使用结合至基质例如阵列或多个颗粒的已知组成的不同测试化合物分离或鉴定新型分子，所述基质可允许只使用一小部分空间充分获取大量的化学/结构空间样本。由于基质表面上每一种测试化合物的组成是已知的，因此这构成了对亲和成分(affinity element)的筛选。例如，测试化合物阵列在基质可定址位置上在指定的位置上包含测试化合物，并且可用于鉴定CRP的一种或多种结合剂。所述测试化合物基于核心序列或结构的较小变化可以是无关的或相关的。不同测试化合物可包括给定的测试化合物的变体(例如多肽同种型)、结构或组成上无关的测试化合物或其组合。
测试化合物可以是小分子、药物、类肽、多糖、有机化合物、无机化合物，聚合物、脂质、核酸、多肽、抗体、抗体片段、杂合抗体、抗体-药物缀合物、siRNA、反义RNA、miRNA、病毒、适体、蛋白质、多糖或其他化合物。测试化合物可以是天然的或合成的。测试化合物可包含基于任何数目的连接(例如，酰胺、酯、醚、硫醇、自由基加成、金属配合等)或连接的组合、树枝状结构、环状结构、空腔结构或用作在其上进行特定加成的支架的其他结构(具有多个附近连接位置)的线性或分支异聚体化合物或由其组成。可使用本领域内的标准方法将此类测试化合物点在基质上或原位合成。此外，可将测试化合物组合点样或原位合成以检测有用的相互作用例如协同结合。
在一个实施方案中，所述测试化合物可以是具有已知氨基酸序列的多肽。例如，可将可溶性CRP用于载玻片上的打点阵列(spotted array)，所述阵列包含数个至1,000,000个具有可变氨基酸的长度的测试多肽。可将多肽通过C端连接至表面。多肽的序列可随机地从19种氨基酸(不包括半胱氨酸)产生。结合反应可包括非特异性竞争剂例如过量的用另一种染料标记的细菌蛋白质以便可测定对于每一种多肽结合靶的特异性比率。可选择具有最高特异性和结合的多肽。每一个点上多肽的身份是已知的，从而可被容易地鉴定。
可通过肽阵列鉴定用作CRP活性的调节剂的抗体或合成抗体。另一个方法是使用通过抗体噬菌体展示的合成抗体产生。将抗体(例如，Fab)的M13噬菌体文库在噬菌体颗粒上展示为与外壳蛋白的融合物。每一个噬菌体颗粒展示唯一抗体并且也封装包含所述编码DNA的载体。可构建高度多样性的文库，所述文库表现为噬菌体库，其可用于结合固定抗原的抗体选择。通过固定的抗原保留结合抗原的噬菌体，并且通过洗涤除去非结合噬菌体。可通过感染大肠杆菌(Escherichia coli)宿主扩增保留的噬菌体库，并且可将所述扩增的噬菌体库用于额外轮的选择以最终获得以结合抗原的克隆为主的群体。在该阶段，可分离单相克隆，将其经历DNA测序以解码展示的抗体的序列。通过使用噬菌体展示和本领域内已知的其他方法，可产生对于CRP的高亲和力设计者抗体。
还可使用基于珠粒的测定鉴定能够结合或以其它方式调节CRP的活性的新型试剂。
CRP结合剂或调节剂也可以是新型适体。可使用配体指数富集的系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)(SELEX)(Tuerk&Gold，Science 249：505-510，1990；Ellington&Szostak，Nature 346：818-822，1990)(例如美国专利No.5,270,163中描述的)鉴定靶的适体。可将核酸的文库与靶CRP接触，将特异性结合至靶的此类核酸从文库中不特异性结合所述靶的其余核酸分离。扩增分离的核酸以产生配体富集的库。多轮的结合、分离和扩增(即，选择)导致一种或多种具有所需活性的适体的鉴定。也可使用改进的方法，例如美国专利公开案No.20090264508中描述的激光SELEX或deSELEX。
用于减少靶细胞表面上CRP的活性、量或密度的经修饰多肽的鉴定
蛋白质工程的进展和强大文库选择技术的可获得性使得能够开发许多设计用于实际上结合任何选择的蛋白质靶的变通蛋白质支架。支架文库基于展示不同结合特征的蛋白质构象基序。类型可包括α-Sandwich、α-Barrel、三螺旋束、重复蛋白质、肽结合剂、小支架、呈递限制性肽的支架(Scaffolds presenting constrained peptide)、具有固有荧光的支架(Scaffolds with intrinsic fluorescence)、具有内在酶促活性的支架、蛋白酶抑制剂和二硫键合的支架(Binz，H.K.和Pluckthun，A.，″Engineered Proteins as SpecificBinding Reagents，″Current Opinion in Biotechnology 16：459-469(2005))。通常，可产生如上文中描述的噬菌体展示选择以产生已知蛋白质结合基序的许多变体。可选择结合特定靶的特定变异并且进行测序。在这方面，可将候选多肽的一个或多个结构域例如腺病毒钮结构域序列整合入所选择的支架基序，可利用技术例如噬菌体展示选择产生变体的文库，可使用本文的实施例中描述的示例性测定法就CRP(CD46、CD655或CD59)结合和疗效评估可选择的支架的功效。
可使用对于本领域技术人员来说是常规的重组表达方法产生经修饰的多肽。例如，可以通过克隆编码具有或不具有整合入表达载体例如pQE-30Xa表达载体(Qiagen)的His标签的Ad35K++(SEQ ID NO：4)的cDNA序列来产生包含SEQ ID NO：5(Ad35K++)的重组Ad35纤维钮结构域多肽。在转化入大肠杆菌后，通过加入异丙基-α-D-硫代-半乳糖苷(IPTG)来诱导蛋白质表达，随后如由制造商所建议的纯化蛋白质，用因子Xa蛋白酶降解。在降解后，使用Xa清除树脂(Removal Resin)除去因子Xa蛋白酶。随后使用Ni-NTA亲和层析捕获和除去已切割的His6标记的肽和未降解的His6标记的蛋白质，如制造商的说明书中所描述的。
在一个实施方案中，本文中提供了鉴定可结合CRP的多肽的方法，其包括如下步骤：将三维分子建模算法用于CRP的原子坐标以确定CRP的结合结构域的空间坐标；和针对CRP结合结构域的空间坐标电子筛选存储的一组候选多肽的空间坐标以鉴定可结合CRP的多肽。
在另一个实施方案中，本文中提供了鉴定可结合CRP的多肽的方法，其包括如下步骤：提供CRP和候选多肽的晶体结构；将CRP和候选多肽的晶体结构叠加；和确定候选多肽与CRP之间是否存在结构基础亲和力。
在另一个实施方案中，本文中提供了用于筛选能够结合CRP的高亲和力多肽的方法，所述方法包括：产生候选多肽的文库；选择能够同源三聚化的候选多肽；选择能够结合CRP的可溶形式的候选多肽；和鉴定能够以.65nM或更小的结合亲合力结合CRP的那些多肽。
在另一个方面，本发明提供了编码包含突变的经修饰多肽的分离核酸分子。对于Ad35纤维钮蛋白，所述突变选自Asp207Gly、Thr245Ala和Ild245Leu。按照全长纤维多肽(SEQ ID NO：2)的第一氨基酸残基依顺序给Ad35纤维钮结构域(SEQ ID NO：3)中的突变编号。
在一些实施方案中，提供了核酸。在一个示例性实施方案中，所述核酸还包含编码肽区域SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的核苷酸序列。如上文中所描述的，这些肽片段分别相应于Ad35纤维钮结构域多肽的DE环、FG环、HI环和IJ环。在一个实施方案中，提供了编码结合CD46的支架蛋白并且包含由间隔核酸残基分隔的编码肽区域SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的核酸序列的核酸分子。
在一个实施方案中，所述分离的核酸编码突变型Ad35纤维钮结构域(Ad35K++Asp207Gly和Thr245Ala)，如SEQ ID NO：5中所示的。本领域技术人员理解由于遗传密码的简并性，多肽序列的每一个氨基酸可由多个已知的三核苷酸密码子单位编码。编码每一个氨基酸的各种密码子是公知的。这样，多肽例如SEQ ID NO：5可预测地由许多核酸编码，每一个核酸在它们的序列中具有独特的变异。因此，可预期核酸的多样性：通过遗传密码的简并性，全都编码SEQ ID NO：5的多肽。在另一个实施方案中，所述核酸包含SEQ ID NO：4。
在另一个方面，提供了包含编码本文中描述的多肽的核酸的表达载体。表达载体是用于将基因引入靶细胞，使得细胞能够从所述基因产生大量稳定的信使RNA(mRNA)的构建体。商购可得的表达载体的非限定性实例包括pQE100(Qiagen，Valencia，CA)，如实施例1中使用的。表达载体包含编码多肽的核酸，所述多肽包含SEQ ID NO：3的至少12个连续氨基酸并且包括选自Asp207Gly、Thr245Ala和Ild245Leu的氨基酸置换中的至少一个置换。
无论载体的来源如何，本领域技术人员应理解，包含所述核酸的表达载体也具有有效地连接至所述核酸序列的表达控制序列。这样的表达控制序列可包括使得宿主细胞转录机器能够或促进其产生所述核酸的mRNA拷贝的启动子或增强子序列。具体地，所述启动子序列为细胞的RNA聚合酶提供了附着至被靶向以转录成mRNA的基因附近的DNA序列的位点。优选实施方案包括允许产生大量mRNA(这转而使得细胞翻译机器能够产生大量由所述核酸编码的多肽)的此类启动子或增强子区域。这样的表达控制序列的非限定性实例是lac操纵子，其包含启动子和阻抑子序列。所述阻抑子序列可被乳糖类似物例如异丙基-α-D-硫代-半乳糖苷(IPTG)阻遏，从而允许操纵子的启动子元件促进基因转录。
本领域技术人员还应理解，所述表达载体可包含选择标记，例如赋予包含该载体和表达该抗性标记基因的细胞对抗生素试剂的抗性的基因。借助于该抗性标记基因，可将成功地接受所述载体和表达由其编码的基因的细胞与未接受所述载体的细胞分离开。此类选择标记的非限定性实例是赋予对抗生素例如卡那霉素或氨苄青霉素的抗性的基因。
在另一个方面，提供了用包含编码上述多肽的核酸的载体转染的培养细胞。在这方面，当完整细胞的转录机器能接触核酸模板进行mRNA的产生时，细胞被载体成功转染。促进载体转染进入细胞的方案在本领域内是公知的。
在一个其他实施方案中，本发明包括用上述载体稳定转染的培养细胞的后代。这样的后代可包含载体的拷贝而无需经历转染方案，并且能够在表达控制序列的控制下转录载体中包含的核酸。
利用用表达载体转染的培养细胞产生大量多肽的技术在本领域内是公知的。Wang，H.，等人，Journal of Virology 81：12785-12792(2007)(通过引用并入本文)提供了这样的技术的非限定性实例。简而言之，使用包括与靶基因克隆位点相邻的lac操纵子的表达载体。所述载体序列还在目的基因的N端编码6个His残基重复基序。在转染入大肠杆菌细胞后，可用浓度为1mM的IPTG进行温育来诱导基因的表达。在足够长的时间例如5小时后，收获细胞，使用缓冲液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，10mM咪唑)裂解细胞，然后在冰上用1mg/ml溶菌酶温育30分钟并且进行超声处理。通过离心除去细胞碎片，将上清液与Ni-次氮基三乙酸(NTA)琼脂糖珠在4℃下一起温育3小时。NTA琼脂糖结合His标签，促进蛋白质纯化。收集珠粒，用50mM NaH2PO4，300mM NaCl，60mM咪唑和20％甘油洗涤。利用50mM NaH2PO4，300mMNaCl，250mM咪唑和20％甘油从NTA珠粒洗脱重组蛋白。
减少靶细胞表面上CD46的量的方法
在另一个方面，本发明提供了用于减少靶细胞表面上CD46的量的方法。所述方法包括将在其表面上表达CD46的靶细胞与一定量的包含多种经修饰腺病毒纤维钮结构域多肽的组合物接触，其中所述经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽能够形成同源三聚体，所述同源三聚体与从由SEQ ID NO：3(野生型Ad35纤维钮)组成的多肽形成的同源三聚体相比较而言具有增强的对于CD46结合的亲和力。本文中描述了本发明的方法所使用的经修饰腺病毒35纤维钮结构域多肽。可使用常规诱变和筛选方法，例如实施例1中描述的方法，从任何腺病毒血清型衍生本发明该方面的方法中所使用的另外的经修饰腺病毒纤维钮结构域多肽，所述腺病毒血清型能够通过其纤维钮结构域结合CD46。例如，B组血清型11、16、21、34、35和50产生可结合CD46的纤维钮结构域多肽。此外，还涉及可充分修饰来自腺病毒纤维多肽的识别CAR受体的钮结构域以使得三聚体钮结构能够结合CD46。
可通过多种公知的方法进行CRP结合。关于CRP结合，示例性方法详细地描述于实施例1中，其中建立纤维钮结构域突变体文库，就强CD46结合筛选文库。简而言之，利用编码野生型腺病毒纤维钮结构域多肽序列作为模板实施随机诱变PCR。将扩增产物克隆进入表达载体，然后转化进入细胞，随后将所述细胞铺板于琼脂平板上。在诱导蛋白质表达后，将细菌菌落转移至滤膜，通过按顺序与可溶性CD46、抗CD46mAb和标记的抗Ig抗体进行温育来在所述滤膜上显现CD46结合。随后可容易地测定来自显示最强结合信号的集落的DNA，从而鉴定有利的突变。用于鉴定增强突变的其他高通量选择策略在本领域内是已知的。例如，可对大量变体(接近108)有效地实施噬菌体展示和肽展示选择。可将显示增强的结合能力的多肽变体物理连接至编码它们的基因，从而使得能够容易地确定有利突变的序列(论述于Clackson，T.，and Wells，J.A.，″In Vitro Selection From Protein and PeptideLibraries，″TIbTech，12：173-184(1994)中)。产生经修饰腺病毒纤维钮结构域多肽的其他方法包括利用标准技术操纵编码野生型纤维钮的DNA，例如限制性消化和基于合理设计的突变。优选多肽的人工合成也被涉及。
在其中经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽来源于腺病毒血清型35的实施方案中，本文中描述的经修饰Ad35K多肽在根据本发明该方面的方法的实施中是有用的。在该方法的一些实施方案中，所述经修饰的腺病毒多肽包含SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的至少12个连续氨基酸残基，其中所述多肽包含选自Asp207Gly、Thr245Ala和Ile256Leu的至少一个氨基酸置换或其组合。
为了促进从单个多肽形成的同源三聚体结合CD46的能力，所述同源三聚体优选形成具有紧密堆积的β折叠片的纽结构。在一个优选实施方案中，所述多肽包含相应于β折叠片(I-J)并且保留β折叠片二级结构的序列。在另一个实施方案中，所述多肽包含相应于F-G、H-I和I-J环的序列，所述序列连接β折叠片并且提供与CD46的接触点。图1B举例说明纤维钮结构域序列内的示例性β折叠片环结构域。
在一些实施方案中，所述经修饰的纤维钮结构域多肽包含与SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％或甚至至少80％的同一性(例如，至少85％、至少90％、至少95％或至少100％同一)的序列，并且还包含相应于SEQ ID NO：2氨基酸207(其中Asp被Gly替换)和SEQ ID NO：2氨基酸245(其中Thr被Ala替换)的氨基酸。整合进入所述经修饰的纤维钮结构域多肽的这些序列可以以任何顺序放置。在优选实施方案中，这些序列被展示β折叠片二级结构的多肽结构域分隔。
根据本发明的该方面的方法，从所述经修饰纤维钮结构域多肽形成的同源三聚体与CD46的结合诱导CD46至细胞内的内化。检测CD46的内化的示例性方法描述于实施例2中。根据提供的方法，将靶细胞与包含经修饰的纤维钮结构域多肽的组合物接触，所述经修饰纤维钮结构域多肽包含的量和所接触的时间足以引起与将靶细胞与对照(例如PBS)接触相比较而言至少40％的细胞表面上CD46水平的下降。在优选实施方案中，细胞表面上的CD46水平的降低为至少50％，优选60％，更优选70％，更优选80％。在其他实施方案中，将靶细胞与充足的包含所述经修饰纤维钮结构域多肽的组合物接触引起与由野生型纤维钮结构域多肽或抗CD46mAb在相同条件下引起的减少相比较而言更大的细胞表面CD46的减少。
将细胞与能够减少CRP活性的多肽接触
可使用在细胞表面上表达CD46、CD55、CD59或CD35(CRP)的任何靶细胞(包括存在于哺乳动物受试者的体内或组织培养物中的靶细胞)实施所述方法。在一些实施方案中，如在本文中更详细描述的，所述靶细胞是癌细胞或肿瘤细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞易受附着至CD46、CD55、CD59或CD35的病原体例如腺病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、瘟病毒(pestivirus)、艾可病毒和柯萨奇病毒B病毒、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)和淋病奈瑟球菌感染。本文中提供的方法减少由需要CD46、CD55、CD59或CD35结合和附着至所述细胞的病原体产生的感染。由于靶细胞上CD46、CD55、CD59或CD35的减少的细胞表面水平，所述病原体具有减少的附着和侵入细胞的机会，因为靶细胞经历更少的病原体附着和与其的接触。
在一个示例性实施方案中，如实施例2中所描述的，与未处理的对照细胞相比较，利用重组Ad35K++(SEQ ID NO：5)预处理的细胞中CD46的下调降低了通过Ad35-GFP病毒体进行的感染的GFP转导水平。
关于在哺乳动物受试者中接触靶细胞，试剂的施用方法描述于下文中。关于接触体外培养的细胞，将试剂呈递至培养细胞的方法是常规的并且对于本领域技术人员来说是已知的。
包含修饰多肽的组合物的具体量将根据本领域技术人员理解的许多因素而变化。此类因素包括靶细胞的来源、CD46、CD55、CD59或CD35在靶细胞表面上的表达谱、细胞的生长环境和可及性、试剂的效力和稳定性以及同源三聚体多肽对于CD46、CD55、CD59或CD35的结合亲和力。
可将培养的、体内或离体细胞与范围在至少0.001、0.0025、0.005、0.0075、0.01、0.025、0.05、0.075、0.1、0.25、0.5、0.75、1、2,5、5、7,5、10、12,5、15、17.5、20和25μg/ml的培养基内浓度的任何经修饰多肽接触。
作为一个非限定实例，如实施例2中所描述的，可将培养的细胞与范围在0.025至25μg/ml培养基之间的浓度的经修饰纤维钮结构域多肽接触。
在一些实施方案中，CD46，CD55，CD59或CD35从靶细胞表面的内化在将靶细胞与包含经修饰多肽的试剂接触约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、45、60、75或长至120分钟的时间内是可检测的。在一些实施方案中，CD46、CD55、CD59或CD35的细胞表面水平仅在24小时后，优选36小时后，更优选48小时后，更优选72或甚至96小时后回复至接触前的细胞表面水平，或温育前水平。用于检测细胞表面标志例如CD46、CD55、CD59或CD35的方法在本领域内是公知的，例如流式细胞术和荧光染色。用于检测CD46的细胞表面水平的示例性方法描述于实施例3中。
用于在表达CRP的靶细胞中诱导细胞溶解的方法
在另一个方面，本发明提供了用于在其表面上表达CD46、CD55、CD59或CD35的靶细胞中诱导细胞溶解的方法。根据本发明的该方面的方法包括(a)将在其表面上表达CD46、CD55、CD59或CD35的靶细胞与一定量的包含有效地减少存在于所述靶细胞表面上的CD46、CD55、CD59或CD35的量的多种经修饰多肽的试剂接触；和(b)将按照步骤(a)处理的靶细胞与结合靶细胞表面上的抗原并且诱导细胞溶解的抗体或其片段接触。
已显示CD46、CD55、CD59或CD35的细胞表面表达保护细胞免受补体依赖性细胞溶解的破坏。根据本发明的该方面的方法，靶细胞上细胞表面CD46、CD55、CD59或CD3水平的降低使细胞对通过诱导补体依赖性细胞溶解(CDC)的试剂例如抗体或其片段产生的细胞溶解敏感。在一个示例性实施方案中，如实施例2中描述的和图2中举例说明的，与包含所述经修饰腺病毒纤维钮结构域多肽Ad35K++(SEQ ID NO：5)的组合物接触的细胞经历达到70％的表面CD46水平的降低，持续至少48小时。
作为CD46，CD55，CD59或CD35的补体抑制剂功能的减少的结果，靶细胞变得对结合靶细胞表面上的抗原或以其它方式诱导细胞溶解的试剂敏感。结合靶细胞或以其它方式诱导细胞裂解的试剂可被认为是第二治疗剂(能够减少CRP的活性的经修饰多肽为第一治疗剂)并且可以是本领域内已知的具有这类作用的任何试剂。
在一些实施方案中，第二治疗剂选自蛋白质、多肽、小分子、药物、抗体、抗体片段、杂合抗体、抗体-药物缀合物、siRNA、反义RNA、miRNA、病毒和适体。在其他实施方案中，第二治疗剂选自细胞毒性剂、细胞抑制剂、化疗剂、补体激活剂、CRP表达的调节剂、放射物、免疫调节剂、促细胞凋亡试剂、热激蛋白质的抑制剂、蛋白酶抑制剂、去涎酸化试剂、MMP抑制剂和PKC抑制剂。
在另一个实施方案中，第二治疗剂为选自LI1b，IL4和TGFb1的CRP表达的调节剂；选自脱氧精胍菌素和geldanamyctanespimycin17-AAG的热激蛋白抑制剂；蛋白酶抑制剂、去涎酸化试剂或MMP抑制剂；选自他莫昔芬、enzastaurin和UBN-01的PKC抑制剂；化疗剂；或免疫调节剂。免疫调节剂的实例包括例如干扰素-α、干扰素-γ、GM-CSF、TLR激动剂、NOD受体激动剂、IL2、IL7、IL17、IL21、IL23、TNF、IMiD、RIG-1受体激动剂天然杀伤细胞配体/激活剂、NKG2P配体(例如MICa、MICb、RAE1和ULBP1)和天然抗体。天然细胞活化剂可以是抗CD137抗体。在一些实施方案中，所述试剂可以是凝集素或补体系统的可溶性成分例如C4b和C3b。
如上文中所描述的，在一些实施方案中，诱导CDC的第二治疗剂为抗体或其片段。所述抗体可选自表1中所列的抗体，或更具体地可以是利妥昔单抗、Arzerra、米罗他、Campath、赫赛汀和阿瓦斯丁。还可修饰(例如利用Fc修饰)抗体或抗体片段以进一步增强补体激活。
诱导CDC的抗体或其片段能够(i)结合细胞表面抗原例如癌症标志，和(ii)募集补体。因此，本发明的方法所使用的抗体片段通常保留抗原结合结构域和负责与补体相互作用的区域，所述结构域和区域在本领域内是已知的。例如，已显示对于CDC的诱导比较重要的抗体的区域包括Fc区域的特定部分，尤其是铰链结构域(Dall′Acqua，W.，等人，TheJournal of Immunology 177：1129-1138(2006))和/或CH2结构域(Idusogie，E.E.，等人，The Journal of Immunology 166：2571-2575(2001))。作为另外的实例，抗体工程研究已鉴定了Fc区域的CH2结构域中的增强利妥昔单抗结合C1q和介导CDC的能力的残基(Wang，S.Y.，等人，Expert Opin.Biol.Ther.8：759-768(2008))。
在一个实施方案中，靶细胞可与能结合所述细胞并且诱导补体依赖性细胞溶解的试剂例如抗体连续接触，包括在将所述细胞与包含经修饰多肽的组合物接触之前和之后。在另一个实施方案中，可在一个同时的步骤中实施所述方法。在这一点上，可将包含经修饰多肽的组合物和结合靶细胞并且诱导补体依赖性细胞溶解的试剂(例如，抗体)基本上同时与靶细胞接触。在另一个实施方案中，将靶细胞与试剂接触，所述试剂在将靶细胞与包含经修饰多肽的组合物接触(步骤a)后约10分钟至72小时内结合靶细胞并且诱导补体依赖性细胞溶解(步骤b)。例如，可在实施步骤a后约15分钟至48小时，优选在步骤a后约15分钟至12小时实施步骤b。在一个优选实施方案中，在步骤a后约8小时实施步骤b。
细胞溶解可通过引入上文中描述的抗体依赖性补体途径发生。在优选实施方案中，所述试剂是单克隆抗体(mAb)，例如表1的示例性抗体，已知其特异性结合靶细胞上的细胞表面标志，例如细胞的表面疾病标志。根据本文中提供的方法，由抗体依赖性补体信号转导激活的肿瘤细胞溶解还可牵涉效应细胞的参与。除了起始细胞表面上MAC形成外，补体信号转导级联的诱导也产生在募集能够诱导癌细胞的细胞介导细胞溶解的效应细胞中有用的趋化试剂。具体地，补体成分C3a和C5a的释放导致将细胞例如NK细胞引入肿瘤的梯度。此外，沉积在肿瘤细胞表面上的iC3b分子激活效应细胞表面上的补体受体3(CR3)，并且在酵母细胞壁α-葡聚糖存在的情况下诱导CR3依赖性细胞毒性，从而提供激活抗肿瘤细胞的细胞毒性机制的潜在方法，所述细胞毒性机制对于酵母和真菌通常是保守的(Adams，G.P.和Weiner，L.M.，Nature Biotechnology 23：1147-1157(2005))。
根据本发明的该方面的方法，靶细胞的直接环境包含足以在诱导后引起细胞溶解的补体效应子系统的全部必需成分。如本文中所使用的术语″补体源″是指包含在诱导后引起细胞溶解和细胞死亡所必需的补体系统的一些或全部各成分的混合物。补体系统成分在本领域内是已知的，所述成分中的一些描述于本文中。此外，众所周知，从脊椎动物例如人或其他哺乳动物收获的血清是所有补体的成分的来源。在一些实施方案中，所述方法包括为靶细胞提供补体源，例如先前收获的血清。可按照本领域内已知的方法例如通过注射或输注补体成分来施用补体系统的成分。在其他实施方案中，可任选地将血浆与存在于组织培养基中的靶细胞接触，如实施例3中所举例说明的。在其他实施方案中，补体成分由所述细胞存在于其中的生物体提供。
在其中由本方法的使用者给靶细胞提供补体源的实施方案中，基于具体情况，提供补体源的时间安排可以是可变的。在一些实施方案中，可在实施步骤b之前将靶细胞与补体源接触。在其他实施方案中，可在实施步骤b的同时将靶细胞与补体源接触。在其他实施方案方案中，可在实施步骤b之后将靶细胞与补体源接触。在优选实施方案中，可在步骤b实施的30分钟内为靶细胞提供补体源。
在一些实施方案中，所述方法使靶细胞对由特异性结合异常增殖细胞例如癌细胞的细胞表面标志的mAb诱导的CDC敏感。在本说明书中，术语癌细胞的使用是指展示失调或不受控制的细胞分裂并且在本领域内已被详尽表征的细胞。癌细胞可以是存在于动物受试者的体内的细胞，或可选择地，是人工培养物中的在适当培养条件下展示无限细胞分裂能力的转化细胞。潜在的癌细胞类型包括癌(来源于上皮细胞)、肉瘤(来源于结缔组织或间充质细胞)、淋巴瘤和白血病(来源于造血细胞)、母细胞瘤(其来源于未成熟细胞或胚胎细胞)或胚细胞癌。在其他实施方案中，所述靶细胞是癌症的体外模型，其对于本领域技术人员来说显然是已知的。非限定性实例包括：Raji-Burkitt′s淋巴瘤细胞(Lapalombella，R.，等人，″A Novel Raji-Burkitt′s Lymphoma Model for Preclinical and MechanisticEvaluation of CD52-Targeted Immunotherapeutic Agents，″Clinical CancerResearch 14：569-578(2008))、BJAB细胞(EBV-阴性Burkitt′s淋巴瘤)、Farage细胞(非何杰金氏B细胞淋巴瘤)、Mino细胞(套细胞淋巴瘤)、Jurkat细胞、562、HeLa(宫颈)、A549(肺)、SKOV3(卵巢)、HT29(结肠)、MDA265MB(乳腺)。
增强抗癌mAb在哺乳动物受试者中的抗肿瘤效应的方法
FDA批准的用于恶性血液病的mAb中包括利妥昔单抗(也称为美罗华和利妥昔单抗)，其目前用于治疗B细胞非何杰金淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、毛细胞白血病和慢性淋巴细胞白血病。利妥昔单抗是抗CD20的人源化未缀合IgG1mAb。CD20在正常B淋巴细胞和B细胞淋巴瘤的表面上表达，但不在造血干细胞、祖B细胞和浆细胞上表达。体外和体内研究已显示利妥昔单抗可有效地在B细胞淋巴瘤细胞上诱导CDC(Di Gaetano，N.，等人，J.Immunol 171：1581-1587(2003)；Golay，J.，等人，Haematologica 91：176-183(2006)；Reff，M.E.，等人，Blood 83：435-445(1994)；Bellosillo，B.，等人，Blood 98：2771-2777(2001)；以及，vander Kolk，L.E.，等人，British Journal of Haematology 115：807-811(2001))。利妥昔单抗通过CD20与淋巴瘤细胞的结合导致经典补体途径的激活，从而最终导致MAC的形成(DiGaetano，N.，等人，J.Immunol 171：1581-1587(2003))。对于奥法木单抗(ofatumumab，也称为HuMax CD20；Arzerra)(抗CD20mAb)(Castillo，J.，Winer，E.，&Quesenberry，P.，Experimental Hematology 36：755-768(2008))、用于治疗慢性淋巴细胞白血病的阿仑珠单抗(抗CD52mAb)(Zent，C.S.，等人，Leukemia Research(2008))、用于治疗急性髓样白血病(AML)的吉姆单抗(抗CD 33mAb)(Castillo，J.，Winer，E.，&Quesenberry，P.，Experimental Hematology 36：755-768(2008))已报导了CDC在肿瘤细胞杀伤中的相似作用。
还可施用利妥昔单抗以治疗自身免疫性疾病，例如包括但不限于自身免疫性溶血性贫血、类风湿关节炎和自身免疫性神经学障碍(德维克病、重症肌无力、自身免疫性神经病(autoimmune neuropathies)和炎性肌病)。
在另一个方面，本发明提供了增强抗癌单克隆抗体在有此需要的哺乳动物受试者中的抗肿瘤效应的方法。根据本发明的该方面的方法包括(a)给所述哺乳动物受试者施用一定量的包含多种有效地减少靶肿瘤细胞表面上存在的CD46，CD55，CD59或CD35的量的经修饰多肽的组合物至少一次；和(b)给所述受试者施用治疗有效量的抗癌抗体至少一次，其中所述抗癌抗体结合靶肿瘤细胞上表达的非CD46，CD55，CD59或CD35细胞表面抗原。
如本文中所描述的，包含多种经修饰多肽的试剂使靶细胞对由特异性结合靶细胞(例如存在于哺乳动物受试者例如人的体内的癌细胞)的细胞表面标志的mAb诱导的CDC敏感。潜在的癌症类型包括癌(来源于上皮细胞)、肉瘤(来源于结缔组织或间充质细胞)、淋巴瘤和白血病(来源于造血细胞)、母细胞瘤(其来源于未成熟细胞或胚胎细胞)或胚细胞癌。
在一些实施方案中，所述mAb特异性结合恶性血液病例如白血病(包括但不限于急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性髓细胞性白血病(AML)、慢性粒细胞白血病(CML)和毛细胞白血病)的细胞表面标志。CLL亚型包括前体B急性淋巴细胞白血病(precursor B acute lymphoblastic leukemia)、前体T急性淋巴细胞白血病(precursor T acute lymphoblastic leukemia)、Burkitt′s白血病和急性双表型白血病。CLL亚型包括B细胞幼淋巴细胞白血病。AML亚型包括急性早幼粒细胞白血病、急性粒细胞白血病、急性粒-单核细胞白血病和急性巨核母细胞白血病。CML亚型包括慢性单核细胞白血病。其他恶性血液病除了非何杰金淋巴瘤以外还包括多发性骨髓瘤、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症、何杰金氏淋巴瘤，包括套细胞淋巴瘤、大细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、NK/T淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、粘膜相关性淋巴样组织(mucosa-associated lymphoidtissue)(MALT)淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。
在一些实施方案中，所述mAb特异性结合实体瘤例如乳腺癌，肺癌，结直肠癌，胃癌，前列腺癌，卵巢癌，子宫癌，宫颈癌，肾癌，胰腺癌，肝癌，脑癌，头颈癌，鼻咽癌和食管癌的细胞表面标志。在一些实施方案中，所述mAb特异性结合肉瘤例如平滑肌肉瘤，纤维肉瘤，横纹肌肉瘤和尤因肉瘤的细胞表面标志。在一些实施方案中，所述mAb特异性结合血液肿瘤例如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤的细胞表面标志。
癌细胞与它们所源自的细胞相比较而言通常高度异常。通常地，癌细胞展示许多对于所述细胞类型、细胞的环境是不适当的或在生物体发育的其他阶段中正常存在的罕见细胞表面抗原。可选择地，细胞表面蛋白表达的水平在癌细胞中可能发生了改变。因此，存在可独特地鉴定来自正常细胞的癌细胞的不同细胞表面标志。按照提供的方法，细胞疾病的标志包括癌细胞的标志。癌细胞标志可包括病毒相关蛋白、以增加的水平在癌细胞上表达的已改变自身肿瘤抗原、只在癌细胞上表达的肿瘤特异性抗原(包括自身分子的突变形式)。在优选实施方案中，所述标志的表达水平在癌细胞中高于在正常细胞中，并且更优选，所述标记几乎只在癌细胞中表达。癌症靶细胞的有用的细胞表面标志的非限定性实例包括：CD3、CD10、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD35、CD37、CD38、CD40、CD44、CD52、CD70、CD80、CD133、CD200、表皮生长因子受体1(EGFR)、表皮生长因子受体2(Her2/neu)、人乳脂肪球蛋白1(humanmilk fat globule 1，HMFG1)、白细胞介素2受体(IL2R)、粘蛋白1和血管内皮生长因子。
单克隆抗体已作为有前景的抗癌治疗剂的种类出现。归功于它们特异性结合癌细胞特征性的标志的能力，mAb使得能够将患者自己的免疫系统靶向癌细胞的破坏。在本文中提供的方法中有用的单克隆抗体通常被修饰以包含人Fc结构域，从而减少抗体的免疫原性和增强募集人免疫效应子系统的能力。预期当此类方法用于非人受试者时，可修饰抗体的Fc结构域以匹配受试者。可将人抗体的不同同种型用作抗癌治疗性mAb的骨架。通常，IgM是用于补体激活的最有效同种型，然而其尚未被广泛用于临床肿瘤学中，因为其不容易从血管结构外渗(Adams，G.P.和Weiner，L.M.，″Monoclonal Antibody Therapy of Cancer，″Nature Biotechnology 23：1147-1157(2005))。因此，IgM同种型的适用范围可能更加局限于恶性血液病。IgG1和IgG3同种型在导向CDC上都非常有效。有用的抗癌mAb抗体的非限定性实例列于表1中，并且进一步描述于Campoli，M.，等人，Principles&Practice ofOncology 23(1&2)：1-19(2009)(通过引用并入本文)中。
表1：用于癌症治疗的肿瘤-抗原特异性mAb
*目前FDA批准用于指定的疾病
**FAP是属于在肉瘤细胞系上发现的丝氨酸蛋白酶基因家族的II型膜结合糖蛋白。
***CanAg是在大多数胰腺、胆道癌和结直肠癌上发现的细胞相关粘蛋白(MUC1)的糖形式。
任何抗体在细胞上诱导CDC的能力依赖于其募集C1q(补体的第一成分的组分)的能力。C1q结合Ig分子的CH2结构域。可将增强它们募集补体的功效并且在靶细胞上诱导CDC的修饰整合入mAb。例如，已在CH2结构域内鉴定了增强利妥昔单抗的CDC诱导的2个残基(Idusogie，E.E.，等人，The Journal of Immunology166：2571-2575(2001))。具体地，Idusogie等人显示氨基酸位置K326和E333上的置换增强了C1q结合抗体，从而导致增加的CDC活性。在DAll′Acqua，W.等人，The Journal of Immunology177：1129-1138(2006)中，研究者从事与补体激活相互作用的情形下人IgG1铰链区的功能特征的系统性分析。设计靶向突变以增加或减少铰链区的柔性，或增加或减少铰链的长度。研究者发现，中间铰链的刚性丧失对于C1q结合是不利的，然而上铰链刚性的丧失几乎不具有或不具有影响。此外，在上铰链中鉴定了增强补体固定的几个置换，表明该铰链的有影响的作用。
在一些实施方案中，包含多种经修饰多肽的试剂还包含增强抗癌单克隆抗体的功效的其他分子或结构域。例如，其他分子或结构域可减少免疫原性。在一个实施方案中，所述试剂还包含一个或多个聚乙二醇(PEG)链。缀合至治疗性多肽的PEG链可提供多种有利方面，例如增加的大小以减少肾中试剂过滤，遮蔽抗原性表位，因PEG疏水性而增加试剂的可溶性和减少试剂对于蛋白水解酶和抗体的可及性。因此，可通过经PEG化以增加试剂在体内的保留，减少试剂的免疫原性和增加试剂的稳定性来增强治疗。PEG化化学法正在完善中，并且多种具有不同属性的PEG链是已知的。还已知进行PEG化同时保持试剂的活性的策略。关于综述，参见Veronese，F.M.和Pasut，G.，Drug Discovery Today 10：1451-1458(2005)。
施用的剂量和途径
可在施用治疗性抗体例如抗癌抗体之前、同时或之后给受试者施用包含多种经修饰多肽的试剂。
可改变相对于包含多种经修饰多肽的试剂而言抗癌抗体的施用时间点以获得最大抗肿瘤效应。这可例如通过施用包含经修饰的多肽，定期收获靶细胞和测定CRP的细胞表面水平来确定。对于CD46，该方法的实例描述于实施例3中。理想地，在确保其与靶细胞的接触相应于表面CD46最低水平的时间施用抗癌mAb。例如，在每一次施用包含经修饰多肽的组合物之前、同时、之后施用所述抗癌mAb。在一些实施方案中，可在施用所述试剂之前，例如在施用所述试剂之前达到5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、10小时、12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、40小时、42小时、48小时、54小时、60小时、66小时、72小时、78小时、84小时、90小时或甚至达到96小时施用抗癌mAb。在这一点上，施用的时间点可考虑抗癌mAb的半衰期。例如，已知利妥昔单抗具有约40小时的半衰期。因此，可能不会在施用利妥昔单抗后超过40小时才施用包含经修饰多肽的试剂。
在其他实施方案中，可在施用所述试剂的同时或之后达到96小时，例如在施用所述试剂后约10分钟至72小时，或施用所述试剂后达到5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、10小时、12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、40小时、42小时、48小时、54小时、60小时、66小时、72小时、78小时、84小时、90小时或甚至达到96小时才施用所述抗癌mAb。例如在每一次施用包含经修饰多肽的组合物后约5小时至48小时施用所述抗癌mAb。
时间安排的非限定性实例举例说明于实施例2中，其中在施用包含经修饰的纤维钮结构域多肽(Ad35K++，SEQ ID NO：5)的组合物后8小时给细胞施用利妥昔单抗。另一个非限定性实例举例说明于实施例3中，其中在施用包含经修饰的纤维钮结构域多肽(Ad35K++)的组合物后10小时给小鼠施用利妥昔单抗。
施用所述试剂和抗体的途径和方法是可变的，且可针对待治疗的病症进行适当地定制。施用可以是全身性的或局部的。施用的全身性途径包括肌内、皮下、静脉内、动脉内、吸入、舌下、含服、局部、经皮肤、经鼻、经直肠和经阴道途径。
包含经修饰多肽的组合物的有效剂量取决于此类因素如受试者年龄、体重、身高、性别、一般医疗状况和医疗史而变化。本文中提及的示例性剂量以mg/千克接受剂量的受试者的剂量提供。作为举例说明，包含经修饰的多肽的组合物可以0.01至250mg/kg，优选0.1至10mg/kg和更优选0.10至0.5mg/kg的剂量范围施用。批准的抗癌mAb的剂量可由医生容易地鉴定。例如，许多抗癌mAb的剂量可在2-250mg/kg有需要受试者的范围内变化。然而，利用用于治疗CLL的利妥昔单抗(抗CD20mAb)的实验性治疗包括达到2250mg/kg(O′Brien，S.M.，等人，Journal of Clinical Oncology 19：2165-2170(2001))。
可重复包含经修饰多肽的组合物的施用以增强治疗结果。后续施用的时间安排可以是可变的。在一个实施方案中，在允许CD46、CD55、CD59或CD35水平返回至存活细胞上的先前水平的足够时间后进行包含经修饰多肽的组合物的后续施用。在一个示例性实施方案中，基于关于Ad35++的体外数据，该时间期限可以是先前施用包含经修饰腺病毒纤维钮结构域多肽的组合物后超过48小时。在另一个实施方案中，所述时间期限为在先前施用包含经修饰多肽的组合物后72小时或甚至更长时间。在其他实施方案中，任何后续施用的时间安排由本方法所使用的mAb的已建立的给药方案来确定。
在所述方法的一些实施方案中，进行包含经修饰多肽的组合物的多次施用而不在受试者中诱导干扰所述方法的抗肿瘤效应的不利免疫反应。根据这样的实施方案，包含经修饰腺病毒纤维钮结构域多肽的组合物缺乏被受试者的免疫系统识别的T或B细胞表位，从而不能在第二次或随后的施用后刺激任何免疫反应，或针对所述经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽产生的抗体不减少治疗的功效。如实施例4中所描述的，重组的经修饰腺病毒纤维钮结构域多肽(Ad35K++)的静脉内施用在哺乳动物受试者中不导致抗所述重组多肽的任何可检测的抗体。
如实施例6中所描述的，可预测经修饰重组纤维钮蛋白的潜在表位。可按照本领域内公知的方法将此类潜在表位的氨基酸残基经历定向诱变以试图减少所述多肽的免疫原性。例如，可给具有免疫能力的动物施用变体，并且可容易地测定所产生的抗体滴度。在另一个方法中，如本文中所描述的，可就免疫原性的不存在选择诱变文库中产生的变体。
为了减少免疫原性，抗癌和其他治疗性mAb的设计相当先进。大多数可获得的mAb包含不刺激免疫反应的人Fc结构域。嵌合mAb通常由融合至人恒定区的鼠可变区(其识别靶)组成，所述人恒定区帮助避免针对所述mAb的人免疫反应。此类抗体通常约65％为人的。可通过只使用鼠高变区产生人源化mAb，导致约95％为人抗体的抗体。最后，可在转基因小鼠或噬菌体展示文库中产生人单克隆抗体。
药物组合物
在另一个方面，本发明提供了用于减少CD46、CD55、CD59或CD35的活性、细胞表面水平或密度的组合物。根据本发明的该方面，所述组合物包含(a)一定量的有效地减少CD46、CD55、CD59或CD35的细胞表面水平的试剂，所述组合物包含多种经修饰的多肽，其中所述经修饰的多肽能够形成与从未修饰的多肽(例如由SEQ ID NO：3(野生型Ad35纤维钮结构域)组成的那些未修饰多肽)形成的同源三聚体相比较而言具有增强的对于CD46、CD55、CD59或CD35结合的亲和力的同源三聚体；和(b)药学上可接受的载体。可以以治疗有效剂量给有此需要的受试者施用包含经修饰多肽的组合物以治疗或减轻与CD46、CD55、CD59或CD35的细胞表面表达相关的病症。
治疗有效剂量是指包含经修饰多肽的、足以导致所述病症的症状减轻的组合物的量。本文中描述了包含经修饰多肽的示例性组合物。在一些实施方案中，所述组合物还包含至少一种诱导补体依赖性细胞溶解的试剂，例如抗癌抗体或其片段，如本文中所描述的。
包含经修饰多肽的组合物的毒性和治疗功效可利用使用实验动物模型(例如实施例3中描述的鼠异种移植淋巴瘤模型)的标准制药方法来测定，其中将3x106个Raji细胞注射入免疫缺陷CB17SCID小鼠的尾静脉。通过使用此类动物模型，可使用标准方法测定NOAEL(无观察到的不利效应水平)和MED(最小有效剂量)。NOAEL与MED效应之间的剂量比是治疗比，其表示为比率NOAEL/MED。展示大治疗比或指数的、包含经修饰多肽的组合物是最优选的。获自细胞培养测定和动物研究中的数据可用于配制许多用于人的剂量。包含经修饰多肽的组合物的剂量优选在包括几乎无或无毒性的MED的循环浓度范围内。取决于所使用的剂型和所使用的施用途径，剂量可在该范围内变化。
对于任何化合物制剂，可使用动物模型估计治疗有效剂量。例如，可在动物模型中配制剂量以获得包括MED的循环血浆浓度。还可例如通过高效液相色谱测量血浆中包含经修饰多肽的组合物的定量水平。
一般地，施用的包含所述组合物的药物组合物的剂量可取决于此类因素如受试者的年龄、体重、身高、性别、一般医疗状况和先前医疗史而变化。作为举例说明，可以以约0.01至250.0mg/kg，优选0.1至10.0mg/kg，更优选0.10至0.5mg/kg受试者体重的剂量范围施用包含经修饰的腺病毒纤维钮结构域多肽例如Ad35K++(SEQ ID NO：5)的组合物。
包含经修饰的多肽的组合物和相关方法在给定的受试者中的治疗功效和适当的剂量可按照本领域技术人员公知的测定法来测定。例如，如实施例3中所描述的，可在施用包含经修饰的多肽的组合物后利用动物模型来实施利用流式细胞术进行的靶癌细胞的存活研究和定量。包含经修饰的多肽的组合物在人受试者中的治疗功效可利用肿瘤学中公知的测定法来测定。例如，可通过体格检查和放射性研究(包括但不限于CT扫描、X射线、MRI和超声的使用)来定量监控肿瘤损伤的尺寸。血液和骨髓中的肿瘤细胞可利用常规显微镜术和/或免疫学方法来定量。可就癌症标志的存在和/或水平监测血清。表示癌症的血清标志的实例包括多发性骨髓瘤中的单克隆抗体spike、卵巢癌中的CA-125、睾丸癌中的甲胎蛋白水平和绒毛膜癌中的人绒毛膜促性腺激素。也可就疾病的指示剂监测尿，例如尿中轻链的存在和/或水平可指示多发性骨髓瘤。
类似地，如实施例4中所描述的，可利用实验室动物模型例如CD46转基因C57Bl/6小鼠品系MCP8B就重复施用的潜能评估本文中描述的试剂。可在按照本领域内已知的标准接种方案接受试剂后，就针对本文中所述试剂的免疫反应的产生评估具有免疫能力的动物。此外，可针对人血清测定试剂以确定抗试剂抗体的存在。优选地，包含经修饰多肽的组合物引发最低限度的或不引发患者的免疫反应。然而，无论抗体如何产生，优选的包含经修饰多肽的组合物将在重复施用后保持降低CD46、CD55、CD59或CD35的细胞表面水平的能力。
药物载体
通常，与任何其他选择的治疗剂组合提供的包含经修饰多肽的组合物适合包含在药学上可接受的载体中。所述载体是无毒性的、生物相容性的并且被选择以不会不利地影响包含经修饰多肽的组合物(和与其组合的任何其他治疗剂)的生物活性。肽的示例性药学上可接受的载体描述于属于Yamada的美国专利No.5,211,657中。可将本发明中有用的所述包含经修饰多肽的组合物配制成以固体、半固体、凝胶、液体或气体形式存在的制剂，例如片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、软膏、溶液、栓剂、吸入剂和注射剂，从而允许口服、胃肠外或手术施用。
用于通过可注射的、输注或灌洗和局部递送进行胃肠外递送的适当载体包括蒸馏水、生理磷酸缓冲盐溶液、正常或乳酸盐林格溶液、葡萄糖溶注、Hank′s溶液或丙二醇。此外，无菌的非挥发油可用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可使用任何生物相容性油，包括合成的单甘油酯-或甘油二酯。此外，脂肪酸例如油酸可用于制备可注射剂。可将载体和试剂混合为液体、悬浮液、可聚合的或不可聚合的凝胶、糊剂或油膏。
载体还可包括维持(即延长、延迟或调节)试剂的递送或增强治疗剂的递送、摄取、稳定性或药代动力学的递送媒介物。这样的递送媒介物可包括(以非限定性的实例)微粒、微球体、纳米球或由蛋白质组成的纳米颗粒、脂质体、碳水化合物、合成有机化合物、无机化合物、聚合或共聚合水凝胶和多聚体胶束。合适的水凝胶和胶束递送系统包括国际公开案No.WO 2004/009664A2中公开的PEO∶PHB∶PEO共聚物和共聚物/环糊精复合物以及美国公开案No.2002/0019369A1中公开的PEO和PEO/环糊精复合物。可在期望作用的位置局部或皮下或肌内注射此类水凝胶以形成持续释放储库(depot)。
关于鞘内(IT)或脑室内(ICV)递送，可将适当的无菌递送系统(例如，液体；凝胶、悬浮液等)用于施用所提供的试剂和组合物。为了口服施用非肽能试剂，可在惰性填充剂或稀释剂例如蔗糖、玉蜀黍淀粉或纤维素中运载包含经修饰多肽的组合物。
本发明的组合物还可包含生物相容性赋形剂例如分散剂或湿润剂、悬浮剂、稀释剂、缓冲剂、渗透促进剂、乳化剂、粘合剂、增稠剂、调味剂(用于口服施用)。
更具体地，对于包含经修饰多肽的组合物，可以以注射剂量的化合物在生理上可接受的稀释剂和药物载体中的溶液或悬浮液胃肠外施用示例性制剂，所述药物载体可以是无菌液体例如水、油、盐水、甘油或乙醇。此外，辅助物质例如湿润剂或乳化剂、表面活性剂、pH缓冲物质等可存在于包含经修饰的多肽的组合物中。药物组合物的其他成分包括油类(例如动物、植物或合成来源的)，例如大豆油和矿物油。通常，二醇类例如丙二醇或聚乙二醇是用于可注射液的优选液体载体。
还可以以贮库注射剂(depot injection)或植入制剂的形式施用包含经修饰多肽的组合物，所述制剂可以配制成例如允许所述活性剂的持续或脉冲式释放。
递送
取决于施用的局部或全身性模式对于待治疗的状况是否是最适合的，可以以许多方式施用包含经修饰多肽的药物组合物。
如本文中所使用的，术语“全身性递送”和“全身性施用”意欲包括但不限于口服和胃肠外途径，包括肌内(IM)、皮下、静脉内(IV)、动脉内、吸入、舌下、含服、局部、经皮肤、经鼻、经直肠、经阴道和有效地导致递送的试剂分散至期望治疗作用的单个或多个位置的其他施用途径。用于本组合物的全身性递送的优选途径包括静脉内、肌内、皮下和吸入途径。应理解，可部分地考虑试剂对与给定施用途径相关的代谢转化途径的易感性来确定用于本发明具体组合物中的选定试剂的具体全身性施用途径。例如，可最合适地通过除了口服外的途径施用肽能试剂。
可利用任何适当的方法将包含经修饰多肽的组合物递送至有此需要的受试者。递送此类试剂的方法包括通过口服、经肺、胃肠外(例如，肌内、腹膜内、静脉内(IV)或皮下注射)、吸入(例如通过细粉制剂)、经皮肤、经鼻、经阴道、经直肠或舌下施用途径进行的施用，并且可配制在适合于各施用途径的剂型中。
以代表性实例为例，可通过将包含经修饰多肽的组合物施用于能够吸收多肽的身体膜例如鼻、胃肠道和直肠的膜来将其引入活体。通常将所述多肽与渗透促进剂结合施用于吸收膜。(参见，例如，Lee，V.H.L.，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Sys.5：69，1988；Lee，V.H.L.，J.Controlled Release 13：213，1990；Lee，V.H.L.，Ed.，Peptide and ProteinDrug Delivery，Marcel Dekker，New York(1991)；DeBoer，A.G.，等人，J.ControlledRelease 13：241，1990.)。例如，STDHF是夫西地酸的合成衍生物(在结构上与胆汁盐相似的甾族表面活性剂)，并且已被用作用于经鼻递送的渗透促进剂。(Lee，W.A.，Biopharm.22，Nov./Dec.1990.)
可将包含经修饰多肽的组合物与另一种分子例如脂质结合引入以保护所述多肽免受酶促降解。例如，聚合物尤其是聚乙二醇(PEG)的共价连接已被用于保护某些蛋白质在体内免受酶促水解，从而延长半衰期(Veronese，F.M.和G.Pasut，″PEGylation，successfulapproach to drug delivery，″Drug Discovery Today 10：1451-1458，(2005))。已报导了用于蛋白质递送的许多聚合物系统(Bae，Y.H.，等人，J.Controlled Release 9：271，1989；Hori，R.，等人，Pharm.Res.6：813，1989；Yamakawa，I.，等人，J.Pharm.Sci.79：505，1990；Yoshihiro，I.，等人，J.Controlled Release 10：195，1989；Asano，M.，等人，J.ControlledRelease 9：111，1989；Rosenblatt，J.，等人，J.Controlled Release 9：195，1989；Makino，K.，J.Controlled Release 12：235，1990；Takakura，Y.，等人，J.Pharm.Sci.78：117，1989；Takakura，Y.，等人，J.Pharm.Sci.78：219，1989)。
最近，已开发了具有提高的血清稳定性和循环半衰期的脂质体(参见，例如，属于Webb的美国专利No.5,741,516)。此外，已综述了脂质体和脂质体样制剂作为潜在药物载体的多种方法(参见，例如，属于Szoka的美国专利No.5,567,434；属于Yagi的美国专利No.5,552,157；属于Nakamori的美国专利No.5,565,213；属于Shinkarenko的美国专利No.5,738,868；和属于Gao的美国专利No.5,795,587)。
可以以经确定以维持治疗效应的所需水平的间隔定期地全身性施用本文中提供的组合物。例如，可以例如通过静脉内注射每2至4周或以不太频繁的间隔施用组合物。给药方案由医生通过考虑可影响试剂组合的作用的多个因素来确定。此类因素包括待治疗病症的进展程度、患者的年龄、性别和体重以及其他临床因素。每种试剂的剂量可随包含经修饰多肽(其包含在组合物中)的组合物以及任何药物递送媒介物(例如，持续释放递送媒介物)的存在和性质而变化。此外，可针对施用的频率和所递送试剂的药物代谢动力学行为的变化而调整剂量的量。
在另一个方面，本发明提供了试剂盒，其包括(a)包含非天然存在的氨基酸序列的经修饰多肽并且其中所述多肽可任选地形成能够结合D46、CD55、CD59或CD35的二聚体或三聚体；和(b)结合哺乳动物细胞表面上的抗原并且诱导细胞溶解的抗体或其片段。用于试剂盒的经修饰多肽在本文中进行了描述，例如，包含SEQ ID NO：5的经修饰纤维钮结构域多肽。用于试剂盒的示例性抗体或其片段也描述于其中，例如如表1中提供的。
在一个具体的实施方案中，本发明提供了试剂盒，所述试剂盒包括(a)含有SEQ IDNO：3所示氨基酸序列的至少12个连续氨基酸的经修饰纤维钮结构域多肽，其中所述多肽包括选自Asp207Gly，Thr245Ala和Ile256Leu的至少一个氨基酸置换或其组合，并且其中所述多肽可形成能够结合CD46的同源三聚体；和(b)结合哺乳动物细胞表面上的抗原并且诱导细胞溶解的抗体或其片段。本文中描述了用于试剂盒中的经修饰纤维钮结构域多肽，例如，包含SEQ ID NO：5的经修饰纤维钮结构域多肽。本文中也描述了用于试剂盒中的示例性抗体或其片段，例如如表1中提供的抗体或其片段。
在另一个方面，本发明提供了增强抗体治疗剂在治疗哺乳动物受试者中自身免疫性疾病中的效应的方法。根据本发明该方面的方法包括：(a)给哺乳动物受试者施用一定量的包含多种有效地减少存在于靶细胞表面上的CD46、CD55、CD59或CD35的量或密度的经修饰多肽的试剂至少一次；和(b)给受试者施用治疗有效量的抗体治疗剂至少一次，其中所述抗体治疗剂结合在靶细胞上表达的非CD46、CD55、CD59或CD35细胞表面抗原。在本文中描述了本发明方法的该方面中使用的经修饰多肽。可使用常规诱变和筛选方法例如实施例1中描述的方法衍生本发明的该方面中使用的其他经修饰多肽。
根据本发明的该方面的方法，靶细胞上细胞表面CD46、CD55、CD59或CD35水平的降低使靶细胞例如B细胞或T细胞对由诱导补体依赖性细胞溶解(CDC)的抗体治疗剂(例如抗体或其片段)诱导的细胞溶解敏感。如实施例8中所描述的，Ad35K++显示增强利妥昔单抗对原代B细胞的细胞溶解。如实施例8中进一步显示的，外周血单个核细胞(PBMC)的Ad35K++(SEQ ID NO：5)处理可触发CD46从细胞表面的去除。
如本文中所使用的，包含多种经修饰多肽(例如多种经修饰的纤维钮结构域多肽)的组合物使靶细胞对由mAb诱导的CDC敏感，所述mAb特异性结合靶细胞例如存在于哺乳动物受试者例如人的体内的T细胞或B细胞的细胞表面标志。根据本发明的该方面的方法可用于使用试剂增强所使用的抗体治疗剂治疗自身免疫性疾病例如本文中命名的疾病的治疗效应，所述试剂结合B细胞上的细胞表面抗原(例如，CD20)或结合T细胞上的细胞表面抗原(例如，CD25或CD4)。
本发明的该方面的方法可用于通过去除靶B和/或T细胞治疗自身免疫性疾病，例如类风湿关节炎、糖尿病、甲状腺的病症、多发性硬化、移植器官的抗体介导的排斥、特发性膜性肾病、银屑病、免疫异常性神经病(dysimmune neuropathy)(即，慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病，多肌炎，皮肌炎，多病灶运动神经病或单克隆丙种球蛋白病)，重症肌无力，无菌硬脑脊膜炎(aseptic pachymeningitis)，炎性肠病和自体免疫溶血性贫血(AIHA)。
例如，利妥昔单抗(抗CD20mAb)已被用于治疗下列自身免疫性疾病：类风湿关节炎(Owczarczyk，K.，等人，Ann Rheum Dis67：1648-1649(2008)；多发性硬化症(Petereit，H.，等人，Mult Scler 15：189-192(2009)；移植器官的抗体介导的排斥(Yang，Y.W.，等人，ExpClin Transplant 6：211-214(2008)；特发性膜性肾病(Kuppachi，S.，等人，J.Nephrol 22(4)：561-4(2009)；免疫异常性神经病(Argyriou，A.A.，Mol Med 15(7-8)：283-7(2009)；重症肌无力(Nelson，P.P.，等人，J Clin Neuromuscul Dis 10(4)：170-7(2009)；多肌炎，皮肌炎，无菌硬脑脊膜炎(Schmid，L.，等人Arthritis Rheum 60(6)：1632-4(2009)；和自体免疫溶血性贫血(AIHA)(Annicchiarico，B.E.，等人，Transplant Proc.41(4)：1380-2(2009)。
已知淋巴组织增殖性和自体免疫性疾病共有单克隆失调和B淋巴细胞存活优势(参见Castillo，J.，等人，Expert Opin Investig Drugs 18(4)：491-500(2009)。已知CD20在B淋巴细胞中表达，并且用结合CD20的单克隆抗体例如利妥昔单抗调节B细胞已被用于治疗淋巴组织增殖性疾病和自体免疫性疾病。本领域技术人员应理解，施用包含多种经修饰多肽的组合物以使靶B细胞对由特异性结合靶细胞的B细胞表面标志(例如，CD20)的mAb诱导的CDC敏感的本文中描述的方法不限于利妥昔单抗(抗CD20)治疗，并且可用于使细胞对其他抗CD20mAb例如奥法木单抗(ofatumumab，抗CD20mAb，否则称为Arzerra，GlaxoSmithKline)(如表1中显示的)情形下的CDC敏感。
本领域技术人员也应理解，本文中描述的方法可用于使T细胞对由特异性结合靶T细胞的T细胞表面标志(例如，CD25或CD4)诱导的CDC敏感，这可通过但不限于使用daclizimab(抗CD25mAb)或扎木单抗(抗-CD4mAb)来实现，如表1中进一步显示的。
下列实施例仅举例说明目前涉及的用于实施本发明的最好模式，但不应当解释为限定本发明。全部文献引用明确地通过引用并入。
实施例1
本实施例描述了对于结合CD46具有增加的亲和力的突变型Ad35纤维钮蛋白的产生。
Ad35纤维钮突变体文库的产生
按照由Wang，H.，等人Journal of Virology 81：12785-12792(2007)先前描述的方案对编码腺病毒35纤维钮结构域的DNA(SEQ ID NO：1)进行随机诱变PCR。具体地，使用引物P1(5′-TTTAAGGATCCGGTGACATTTGTATAAAGGATAG-3′)(SEQ ID NO：10)和P2(5′-TATATAAGCTTAGTTGTCGTCTTCTGTAAT-3′)(SEQ ID NO：11)，通过PCR扩增Ad35野生型DNA(SEQID NO：1)来获得相应于全长序列的氨基酸123至320的编码Ad 35纤维钮蛋白结构域的核酸序列。
将PCR产物克隆入具有N末端His6标签的pQE30(Qiagen，Valencia，CA)以用于在大肠杆菌中表达。
进行随机诱变PCR，对其进行最优化以获得每纤维钮结构域多肽平均1或2个氨基酸突变。使用下列试剂进行PCR：20fmoles的pQE-Ad35钮DNA模板，30pmol的PCR引物Pmut1(5′-CGTCAGCACGGATCCGGTGACATTTGTATAAAGGATAGTATTAACACCTTATGGACTGGA-3′)(SEQ IDNO 12)，30pmol的PCR引物Pmut2(5′-CCAAGCTCAGCTAATTAAGCTTAGTTGTCGTC-3′)(Seq ID No13)，10X诱变缓冲液(2.5μl，3.5μl，5μl或10μl；70mM MgCl2，500mM KCl，100mM Tris[pH8.3，于25℃下]和0.1％[wt/vol]明胶)，10μl 5mM MnCl2，10μl脱氧核苷三磷酸混合物(2mMdGTP，2mM dATP，10mM dCTP和10mM dTTP)以及5个单位的Taq聚合酶(Promega，Madison，WI)。将所述试剂混合100μl的终体积。循环条件为94℃进行1分钟，45℃进行1分钟和72℃进行1分钟，进行30个循环。纯化突变的PCR产物(645bp)，用适当的限制性内切酶消化，将其克隆进入pQE100载体(Qiagen)。
就具有增加的对于CD46的结合亲和力的突变体筛选Ad35纤维钮突变体文库
将Ad35纤维钮突变体质粒文库转化入大肠杆菌细胞宿主菌株M15，将其涂平板于具有卡那霉素和氨苄青霉素的Luria-Bertani琼脂平板(主平板(master plate))上。每个15cm Petri板培养约800到约1000个集落。在生长过夜后，将0.45μm孔径的Durapore滤膜(Millipore，Billerica，MA)置于菌落的顶部。剥开膜并且使菌落面向上方小心地放置在浸渍在补充有抗生素和1mM IPTG(异丙基-α-D-硫代半乳吡喃糖苷)的Luria-Bertani培养基中的两张Whatman3MM纸上以诱导转基因蛋白质在菌落中表达。在于室温(RT)下温育20分钟后，将具有菌落的滤膜置于硝酸纤维素滤膜和浸渍在天然裂解缓冲液(20mM Tris-Cl，pH8，300mM NaCl，50mM MgCl2，0.1mg/ml溶菌酶，0.75mg/ml DNA酶1和一半的完全无EDTA蛋白酶抑制剂混合物片剂/10ml[Roche，Palo Alto，CA])的Whatman 3MM纸顶部。冻融″滤纸夹心(filters andwich)″4次，在-80℃下进行10分钟和在30℃下进行10分钟。从夹心取下硝酸纤维素膜，在4℃下用TBS(10mM Tris-Cl，pH 7.5，150mM NaCl)中的3％牛血清白蛋白封闭过夜。随后将膜与如先前在Wang，H.，等人，Journal of Virology 81：12785-12792(2007)中所描述产生的TBS和3％乳中的可溶性重组CD46(sCD46)于RT下一起温育1小时，随后在TBS-0.05％Tween20(TBS-T)缓冲液中洗涤3次，进行10分钟。随后用TBS和3％乳中的抗CD46抗体(克隆J4.48；Fitzgerald，Concord，MA)(1∶50稀释)在RT下温育印迹1小时，然后于TBS-T缓冲液中洗涤3次，进行10分钟。为了使结合可视，用TBS和3％乳中的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Ig)-辣根过氧化物酶(BD Pharmingen，San Jose，CA)(1∶1,000稀释)在RT下温育印迹一小时，洗涤，然后置于ECL底物(Pierce，Rockford，IL)。在铺平板的10,000个菌落中，从原始主平板挑拣20个具有最强的CD46结合的菌落。测定来自此类菌落的质粒DNA序列。在20个挑拣且经测序的菌落中，16个菌落包含7个不同的纤维钮序列，编码残基Asp270，Thr245或Ile256处的单个或组合氨基酸置换，如下文表2中显示的。
表面等离子体共振(SPR)分析
在大肠杆菌中产生由各突变DAN序列编码的重组Ad35纤维钮突变蛋白，利用氮川三乙酸镍亲和层析纯化。通过如Wang，H.，等人Journal of Virology 81：12785-12792(2007)中描述的Western印迹分析验证纯化的重组纤维钮蛋白与可溶性CD46的结合(数据未显示)。简而言之，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离重组纤维钮蛋白，随后将其转移至硝酸纤维素膜上。将蛋白质样品加载在上样缓冲液(50nMTris-Cl，pH 8.0，100mM二硫苏糖醇，2％十二烷基硫酸钠，10％甘油，0.2％溴酚蓝)中，煮沸和不煮沸。用sCD46，随后用抗CD46抗体温育印迹，如上文在筛选Ad35纤维钮突变文库的内容中所述使结合可视。所有大肠杆菌中产生的重组突变纤维钮蛋白自发地形成三聚体，如在非变性条件下利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析确定的和通过兔多克隆抗His6-HRP抗体(ab1187-100，批号134173；Abcam，Cambridge，MA)的结合验证的(数据未显示)，所述重组突变纤维钮蛋白只有作为三聚体才识别Ad35纤维钮(参见Wang，H.，等人，Journal of Virology81：12785-12792(2007))。
各重组突变纤维钮蛋白对sCD46的结合亲和力通过将表面等离子体共振与野生型Ad35纤维钮蛋白和包含导致CD46结合消除的Arg279Cys置换的Ad35纤维钮蛋白相比较来进行确定，如先前在Wang，H.，等人，Journal of Virology 81：12785-12792(2007)中所描述的。简而言之，按照制造商的说明书，使用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin试剂盒(Pierce)生物素化Ad35纤维钮蛋白。通过手工注射将生物素化的产物偶联至链霉抗生物素包被的传感芯片(Biacore，Piscataway，NJ)，直至获得共振单位(RU)的所需值。在活化表面上方注射不同浓度的sCD46，直至获得期望的表面密度。随后用1M乙醇胺(pH 8)猝灭活化的偶联表面上的反应性位点，进行3至5分钟。每一个分析物浓度使用2个重复注射，在1Hz收集所有数据。在Biacore T100仪上以30μl/ml的流速于HBS-EP(Biacore)中进行所有分析。为了完全除去剩余量的结合至传感器芯片表面的sCD46，在每一循环后通过注射10mM甘氨酸-HCl，pH3再生传感器芯片表面。使用Biacore T100评估软件进行数据处理和动力学分析。
野生型纤维钮蛋白(SEQ ID NO：3)的KD(平衡解离常数)为14.64nM，而具有单个氨基酸置换Asp207Gly，Thr245Ala和Ile256Leu的纤维钮突变体的KD分别为1.77，7.64和10.96nM，如下文表2中显示的。这可翻译成为野生型纤维钮蛋白的亲和力的8.3倍、1.9倍和1.3倍的亲和力。大部分鉴定的纤维钮突变体包含上文所列的置换的2个或3个置换。最高亲和力(KD为0.63；为野生型Ad35的23.2倍)是具有双Asp207Gly，Thr245Ala置换的纤维钮突变体(即，多肽SEQ ID NO：5)的纤维钮突变体的亲和力。已鉴定的具有多个突变的纤维钮突变体中有2个具有置换Asn217Asp或Thr226Ala；然而，当单个地分析时，这些置换对纤维钮亲和力没有影响(数据未显示)。野生型和所有纤维钮突变体的结合速率常数和解离速率常数示于表2中。所有测试的纤维钮蛋白的结合动力学是相当的。然而，解离速率常数与纤维钮亲和力反相关。这表明具有更高亲和力的纤维钮蛋白突变体比野生型Ad35纤维钮蛋白更慢地从CD46解离。
表2：Ad35纤维钮突变体a的表面等离子共振(SPR)分析
aKa，结合速率常数(kon)；Kd，解离速率常数(Koff)；KD，平衡解离速率常数。
b参照各蛋白质中包含的突变列出除了野生型外的Ad35纤维钮突变体，其中所述第一氨基酸残基相应于指定位置处的野生型残基并且所述第二氨基酸残基相应于突变多肽中的置换残基。
突变型Ad35纤维钮结构域多肽与CD46之间的相互作用的建模
为了试图理解纤维钮突变体对CD46的亲和力增加的结构基础，将Ad35纤维钮蛋白的晶体结构与CD46的晶体结构迭合。先前已获得野生型Ad35纤维钮蛋白的晶体结构(参见Wang等人J.Virol.81：12785-12792(2007))，按照相同的方案产生新产生的突变体的晶体结构。具体地，在大肠杆菌中产生N末端His6标记的突变型Ad35纤维钮蛋白，利用氮川三乙酸镍层析和凝胶过滤层析纯化，针对20mMTris-HCl(pH 8.0)，200mM NaCl和5mM二硫苏糖醇进行透析。使用NeXtal DWBlock结晶筛查套件使蛋白质结晶。晶体在21℃下于30％聚乙二醇1000和0.2M MgBr2(pH 8.0)中生长。使用ADSC Quantum charged-coupled-device检测器从台湾同步辐射研究中心束线(beam line)BL13B1和BL13C1收集本地数据集，利用HKL2000软件(Otwinowski，Z.和W.Minor，pp.307-326)进行处理。于Carter，C.和Sweet，R.(eds.)Methods in Enzymology：Macromolecular Crystallography，Academic Press，SanDiego，CA.(1997))中。使用Ad3头(蛋白质数据库[PDB]条目1h7z)作为搜索模型，利用Open-EPMR程序(Kissinger，C.，等人，Acta CrystallographerD57：1474-1479(2001))通过分子置换解析结构。使用O程序(Jones，T.，等人，Acta Crytallographer A47：110-119(1991))重建模型，使用CNS程序，利用最大似然靶和自动重量最优化(automatic weightoptimization)(Brunger，A.，等人，Acta CrytallographerD54：905-921(1998))进行精细化。从Persson，等人，Nat.Struct.Mol.Biol.14：164-166(2007)获得CD46的晶体结构。
关于Asp207Gly突变体，CD46的疏水性Ile13残基是离Asp207最近的氨基酸R基，其羟基离最近的Ile甲基为5.93和4.4埃。然而不希望受任何特定理论束缚，Asp207Gly置换可使Ad35DE环(SEQ ID NO：6)能够将CD46更接近Ile13，因为与极性Asp残基不同，甘氨酸是疏水性的(不存在侧链)。因此，HI环(SEQ ID NO：8)也可更接近CD46。
关于Thr245Ala突变体，原始Ad35-CD46结合模型显示Ad35Thr246残基与CD46Tyr67残基相互作用并且对于结合是非常重要的。在该构象中，邻接Thr245残基的Ad35羟基相对接近主链羰基和CD46残基Thr64的R基团羟基(4.35和5.21埃)以及相对接近CD46残基Glu63的R基团羰基和羟基(4.46和5.76埃)。虽然残基Thr245的羟基的接近程度不足以与这些基团的任何基团形成强氢键，但基团的接近可能影响该区域中的环构象。再次地，不希望受任何特定理论束缚，该位置上疏水性丙氨酸的引入(Thr245Ala)可使Thr246-对-Tyr67的相互作用更强，因为FG环(SEQ ID NO：7)可移至更接近CD46。
关于Ile256Leu突变体，Ad35残基Ile256朝向G折叠片的中央中的纤维三聚体中央核心定向，并且其疏水性R基团与H折叠片内Asn271的侧链中的极性羧基最近。然而，再次地，不希望受任何特定理论束缚，所述模型表明Leu256的甲基比Ile256的甲基更接近Asn271，即使Ile256Leu突变体中亮氨酸的旋转还不清楚。增加的排斥可能推动G与H折叠进一步分离。然而不希望受任何特定理论束缚，据认为包含Ile256Leu突变的Ad35纤维钮蛋白对于CD46的更高亲和力可能归因于纤维钮三聚体的增加的稳定性。
概括地，鉴定到了对于CD46的亲和力增加的重组纤维钮突变蛋白。
实施例2
本实施例证明用突变型Ad35K++(Asp207Gly和Thr245Ala)温育肿瘤细胞从肿瘤细胞表面除去了CD46。
原理
几个临床前研究已显示可利用CD55和/或CD59封闭抗体使肿瘤细胞对利妥昔单抗诱导的补体依赖性细胞溶解(CDC)敏感(Ziller，F.，等人，European Journal ofImmunology 35：2175-2183(2005)；和Guo，B.，等人，Clinical Immunology 128：155-163(2008))。然而，除了阻断补体激活外，CD55和CD59还参与T细胞活化(Hamann，J.，等人，European Journal of Immunology 28：1701-1707(1998)；Deckert，M.，Kubar，J.和Bernard，A.，J.Immunol.148：672-677(1992))。这可为失去这两种蛋白质的肿瘤细胞在逃避免疫介导的破坏中提供选择优势，并且可解释CD55和CD59为何通常不存在于肿瘤上(Hara，T.，等人，Br.J.Haematol.82：368-373(1992))。现有提出单独的CD46可保护肿瘤细胞免受补体裂解(Madjd，Z.，等人，Cancer Immunol.Immunother.54：149-156(2005))。与该理论相一致，使用抗有义寡核苷酸减少CD46的表达能够使肿瘤细胞对利妥昔单抗诱导的CDC敏感，从而证明了CD46在保护肿瘤细胞抗CDC中的主要作用(Zell，S.，等人，Clinicaland Experimental Immunology 150：576-584(2007))。CD46以高水平在许多恶性肿瘤上均匀表达(Rushmere，N.K.，等人，International Journal of Cancer 108：930-936(2004)；Varela，J.C.，等人，International Journalof Cancer 123：1357-1363(2008))，包括恶性血液病(Hara，T.，等人，Br.J.Haematol.82：368-373(1992))。
进行实验以确定对于CD46具有增强的亲和力的突变型Ad35纤维钮蛋白(Ad35K++)是否可下调肿瘤细胞上的CD46并且使肿瘤细胞对CDC易感。
材料和方法
纤维钮蛋白的产生：对CD46具有增加的亲和力的重组经修饰Ad35纤维钮蛋白选自如实施例1中描述的大肠杆菌表达文库。在大肠杆菌中产生具有6个连续组氨酸残基(6-HIS)的N末端标签的重组突变纤维钮蛋白，利用如实施例1中描述的Ni-NTA琼脂糖层析纯化。将纤维钮蛋白对20mM Hepes，200mM NaCl，17％甘油进行透析。使用来自CapeCod Inc.(E.Falmouth，MA)的Limulus Amebocyte Lysate测试试剂盒进行内毒素测试。
细胞：将细胞系293(Microbix，Toronto，Ontario，Canada)和HeLa(美国典型培养物保藏中心，ATCC)培养在补充有10％胎牛血清(FBS)和2mM L-谷氨酰胺，100个单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中。将Raji(人Burkitt′s淋巴瘤)(ATCC CCL-86)、Mino(套细胞淋巴瘤)(ATCC CRL-300)、Farage(非何杰金氏B细胞淋巴瘤)(ATCC CRL-2630)和BJAB细胞(EBV-阴性Burkitt′s淋巴瘤)(获自Edward A.Clark，University of Washington)培养在补充10％FBS和L-谷氨酰胺/(Pen-Strep)的RPMI中。
在获得知情同意书后，从患者的外周血获得原发性慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)细胞。CLL的诊断基于淋巴细胞的免疫表型、形态学以及疾病的临床表现。通过在淋巴细胞分离剂(Lymphoprep)(Nycomed Pharm，Oslo，Norway)上离心来分离单个核细胞。平均96％(范围91-98％)的来自CLL患者的分离细胞属于白血病克隆，如在流式细胞检测分析中通过CD5，CD19和CD20的共表达确定的。将解冻的B-CLL细胞培养在含有10％FCS，2mM丙酮酸钠，2mM Hepes，100μM 2-巯基乙醇，100个单位/ml青霉素，100μg/ml链霉素，2mM L-谷氨酰胺的RPMI1640培养基中。在解冻后2天，将CLL细胞用于实验。
抗体：利妥昔单抗获自Genentech，Inc.(South San Francisco，CA)。达克珠单抗获自Roche Pharmaceuticals(Nutley，NJ).FITC-小鼠抗人CD20(克隆2H7)和FITC-小鼠抗人CD46(克隆E4.3)获自BDPharmingen(San Jose，CA)。PE缀合的CD46抗体(克隆E4.3)获自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)。未缀合的CD46封闭抗体(克隆MEM-258)获自AbD Serotec(Raleigh，NC)。抗His标签抗体(小鼠单克隆IgG1，#34660)获自Qiagen(Valencia，CA)。
CD46细胞表面水平的测量：如下测量细胞表面上CD46的水平。在冰上冷冻悬浮细胞(Mo7e、Raji等)45分钟，随后在冰上用20μg/ml重组野生型Ad35纤维钮蛋白(称为野生型Ad35K)、具有Asp207Gly和Thr245Ala置换的突变型Ad35纤维钮蛋白(称为Ad35K++)或小鼠抗人CD46抗体(MEM-258，AbD Serotec)于100μl体积中温育1小时。随后，用含有2％FBS的冷PBS洗涤细胞2次，用新鲜培养基在37℃下温育。在指定的时间点上，洗涤细胞，在冰上于100μl体积中将细胞与藻红蛋白(PE)-缀合的抗人CD46抗体(克隆E4.3，Santa CruzBiotechnology Inc.，Santa Cruz，CA)以1∶20一起温育1小时。在3次洗涤后，立即利用流式细胞仪(下文中描述的)分析PE平均荧光强度。洗涤用20μg/ml Ad35K，Ad35K++或抗CD46抗体温育的HeLa细胞，将其转移至37℃进行指定的时期。在温育后，利用依地酸(versene)分散HeLa细胞，如下所述利用流式细胞术分析。
免疫荧光法：按照制造商的方案用Cy3荧光染料(Amersham CyTM Bis-ReactiveDye，GE Healthcare，Little Chalfont，United Kingdom)标记重组纤维钮蛋白Ad35K(野生型)和Ad35K++突变型蛋白。在实验前一天将肿瘤细胞(2x104个细胞/孔)于标准培生长养基中接种在8室载玻片中。第二天，用PBS洗涤细胞，在37℃下将其与20μg/ml Cy3-Ad35纤维钮蛋白于200μl培养基中一起温育一小时。用PBS洗涤细胞2次，将其移至37℃/5％CO2培养箱中。在指定的时间点上，用PBS洗涤细胞，用冷固定液(丙酮和甲醇1∶1)于4℃下固定15分钟。首先用2％脱脂牛奶温育固定的细胞20分钟以阻止抗体的非特异性结合。加入单克隆抗CD46抗体(1∶100，Fitzgerald，Concord，MA)，在4℃下温育过夜。在用PBS洗涤2次后，将细胞与Alexa Fluor 488-缀合的山羊抗小鼠IgG(1∶200，Molecular Probes，Eugene，OR)一起温育30分钟。在洗涤后，用含有DAPI的Vectashield(Vector Laboratories，Inc.，Burlingame，CA)封片。在Zeiss META共聚焦显微镜上使用40X油镜照相。
流式细胞术：通过用依地酸处理分散HeLa细胞，用冰冷洗涤缓冲液(含有2％FBS的PBS)洗涤3次。用洗涤缓冲液洗涤生长在悬浮液中的淋巴瘤细胞3次。洗涤后，将2x105个细胞重悬浮于100μl洗涤缓冲液中，在冰上用特异性抗体温育1小时。随后洗涤细胞2次，利用流式细胞术以一式二份进行分析。
Ad35感染研究：先前已描述了Ad35-GFP载体(Gao，W.和Gambotto，A.，in press(2008))。在CsCl梯度中通过超速离心纯化Ad35-GFP。病毒颗粒对噬斑形成单位的比率为15∶1。为了进行转导研究，将2x105个HeLa细胞在室温下与PBS或20μg/ml Ad35K(野生型)、突变型Ad35K-279(减少的CD46结合)或突变型Ad35K++(增加的CD46结合)纤维钮蛋白于200μl培养基中一起温育1小时。用PBS洗涤细胞2次，将其与新鲜培养基于37℃下一起温育。在72小时的温育后，用Ad35-GFP以25、50、100、200、400和800pfu/细胞的MOI感染细胞。在感染后2小时洗涤含有病毒的培养基。在感染后24小时，利用流式细胞术分析GFP表达。
体外存活力测定：将5x104个Raji细胞/孔以一式三份涂铺在具有补充有10％热灭活FBS的RPMI的96孔板中，用(1)PBS、(2)25μg/mlCD46抗体(MEM-258，Serotec)、(3)25μg/ml突变型Ad35纤维钮Arg279Cys、(4)25μg/ml野生型Ad35K或(5)25μg/ml对于CD46具有高亲和力的突变型Ad 35K++预温育。8小时后，将15μg/ml利妥昔单抗加入细胞，在室温下温育30分钟。将正常人血清(NHS)作为补体源加入，将细胞在37℃下再温育另外3小时以进行裂解(将总体积加至150μl)。使用下列NHS稀释度；对于Raji(5％NHS)，对于BJAB(20％NHS)，对于Farage(10％NHS)，以及对于原代B-CLL细胞(25％NHS)。在台盼蓝染色后计数每个孔中的活细胞数。以一式三份处理各样品，每一个孔计数4次。进行3个独立研究。
Western印迹：将重组纤维钮蛋白或六邻体(0.5ug/泳道)在上样缓冲液(50mMTris-HCl，pH 6.8，100mM二硫苏糖醇，2％十二烷基硫酸钠，10％甘油，0.2％溴酚蓝)中上样而无变性。将Ad5病毒颗粒(1x109vp/泳道)在Laemmli缓冲液中煮沸5分钟。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质。用考马斯亮蓝染色凝胶，将其转移至硝酸纤维素膜上。用人或小鼠血清(1∶100稀释于PBS中)温育滤膜。用山羊抗人IgG-辣根过氧化物酶(HRP)(Millipore，Billerica，MA)显现人IgG的结合。用PBS和3％奶粉中的山羊抗小鼠IgG-HRP(BDPharmingen)(1∶1000)在RT下检测小鼠IgG的结合，进行1小时。在TBS-T缓冲液中洗涤滤膜3次进行10分钟，然后将其经历增强化学发光底物(Pierce，Rockford，IL)处理。
结果
用突变型Ad35K++(Asp207Gly和Thr245Ala)温育肿瘤细胞从肿瘤细胞的表面除去了CD46
在加入20μg/ml重组Ad35K(野生型；SEQ ID NO：3)或Ad35K++突变型(Asp207Gly+Thr245Ala；SEQ ID NO：5)纤维钮蛋白至培养基后的不同时间点上，使用流式细胞术，利用不干扰Ad35纤维钮蛋白与CD46之间相互作用的抗CD46抗体测量HeLa细胞表面上的CD46水平。如图2A中显示的，在加入Ad35K或Ad35K++后15分钟内，与PBS处理的对照细胞相比较，CD46水平下降约70％。对于消除了CD46结合的Ad35纤维钮蛋白(突变型Ad35K-279)未观察到CD46水平的下降(参见Wang，H.，等人，Journal of Virology 81：12785-12792(2007))。相反地，如图2A中进一步显示的，与抗CD46mAb一起温育只导致30％的CD46水平下降，然后更快速地回复至温育前水平。此外，该观察到的30％的CD46水平下降可能部分由“效应器”与“检测器”抗CD46mAb之间的干扰引起，尽管它们针对不同的表位。除了表面CD46的减少外，在流式细胞术研究中观察到更少的细胞结合的Ad35K(野生型)和Ad35K++突变型纤维钮蛋白，如图2B中所显示的，这表明CD46与Ad35纤维钮被一起摄取。对于Ad35K-279未发现细胞结合的信号(数据未显示)。
关于CD46和突变型Ad35纤维钮蛋白的免疫荧光研究还确证了以下发现，即与用Ad35K-279温育的细胞相比较而言，Ad35K(野生型)和Ad35K++突变型处理的细胞中存在更少的表面CD46。已观察到，在加入重组纤维钮蛋白后30分钟，在细胞内部发现Ad35K++比Ad35更多(数据未显示)。利用标志组织蛋白酶B的抗体在晚期内体/溶酶体中检测到与CD46在一起的Ad35K(野生型)和Ad35K++突变型蛋白(数据未显示)。在加入重组纤维钮蛋白后12小时，用Ad35K++处理的细胞主要显示细胞质CD46染色，而总体CD46信号似乎比用重组Ad35K++突变体温育前更少，这表明内化的CD46/Ad35K++复合物在溶酶体中降解(数据未显示)。
除了使用抗CD46mAb评估重组Ad35纤维钮蛋白对表面CD46水平的影响的流式细胞术研究外，利用表达GFP的Ad35载体(Ad35-GFP)实施使用CD46作为感染的结合受体的转导研究。先前的研究已显示，利用包含Ad35纤维的载体进行的转导与细胞表面上CD46的密度直接相关(Anderson，等人，Cancer Res.64：4919-4926(2004))。用重组Ad35纤维钮蛋白和抗CD46mAb温育HeLa细胞。72小时后，当CD46配体在细胞表面上不再可被检测到时，用不断增加的MOI的Ad35-GFP感染细胞。如图2C中显示的，用Ad35K++温育的HeLa细胞变得相对抗大范围MOI(5至1,000pfu/细胞)内的Ad35-GFP感染。在用突变型Ad35K++处理的细胞中，GFP表达水平为用Ad35K-279温育的细胞的千分之一以下。
除了HeLa细胞外，还对其他肿瘤细胞系(包括红白血病Mo7e细胞和B淋巴瘤Raji细胞)进行CD46流式细胞术和Ad35-GFP转导研究。在分析的所有细胞系中，在用Ad35K(野生型)或Ad35K++突变型蛋白温育后，观察到CD46从细胞表面的短暂去除(数据未显示)。
用突变型Ad35k++(Asp207gly和Thr245ala)温育淋巴瘤细胞使它们对利妥昔单抗介导的补体依赖性细胞溶解敏感
利用已建立的和原代的B细胞淋巴瘤培养物进行研究，以测试利用Ad35K(野生型)或Ad35K++突变型蛋白的温育是否可使它们对利妥昔单抗介导的补体依赖性细胞溶解(CDC)易感。利用Raji细胞，一种CD20阳性人Burkitt′s淋巴瘤细胞系，进行初步实验。流式细胞术研究显示这些细胞的细胞表面上存在高且相对均匀的CD46水平，表明对CDC的潜在抗性。值得注意地，Raji细胞上的CD20水平变化更大(约2个数量级)。如图3中显示的，用利妥昔单抗，然后用正常人血清(NHS)(作为补体源)温育Raji细胞导致在3个小时内约70％的Raji细胞杀伤。值得注意的是，剩余的活Raji细胞的CD20水平为对照群体(无利妥昔单抗或无NHS)的平均CD20荧光水平的约1/50以下(数据未显示)。为了测试利妥昔单抗介导的CDC对CD20-阳性淋巴瘤细胞的特异性，使用结合CD25(其不在Raji细胞上表达)的人源化mAb达克珠单抗(数据未显示)。当与NHS组合时未观察到该抗体介导的显著细胞杀伤(图3)。此外，观察到用利妥昔单抗/NHS温育HeLa细胞(其不表达可检测的CD20表面水平)不导致显著的细胞杀伤(数据未显示)。
为了测试利妥昔单抗介导的CDC的功效是否可通过Ad35K++介导的CD46的内化增强，用Ad35K-279突变体(结合减少)、Ad35K(野生型)和Ad35K++突变体(结合亲和力增加)温育Raji细胞8小时。如图3中显示的，与单独的利妥昔单抗/NHS相比较，利用野生型Ad35K和突变型Ad35K++的预处理分别增强利用利妥昔单抗/NHS的细胞杀伤约2和10倍。在低至25ng/ml的浓度下观察到Ad35K++的致敏效应，在25ng/ml至25μg/ml范围内的浓度导致相似的对CDC致敏的水平。Ad35K-279对利妥昔单抗/NHS介导的杀伤没有影响。利用抗CD46mAb预温育Raji细胞、然后用利妥昔单抗/NHS温育导致了比利用Ad35K(野生型)或Ad35K++突变体(抗CD46mAb对Ad35K：p＝0.024)的预温育显著更低的利妥昔单抗介导的细胞杀伤。与Ad35K和Ad35K++相比较，抗CD46mAb没能力增强利妥昔单抗介导的CDC可能是由于mAb不能交联几个CD46分子的结果。利用CD46配体(抗CD46mAb、Ad35K或Ad35K++)和NHS(单独地或与达克珠单抗组合)一起温育Raji细胞导致约30％的细胞存活率降低，这很可能是CD46被封闭时CDC的结果(图3)。
为了将这些发现扩展至其他CD20阳性细胞系，对下列CD20阳性细胞进行另外的实验：BJAB(EBV阴性Burkitt′s淋巴瘤)、Farage(非何杰金氏B细胞淋巴瘤)和Mino(套细胞淋巴瘤)。如图4A中显示的，当用Ad35K++预温育细胞时，发现测试的所有CD20阳性细胞系具有显著的利妥昔单抗/NHS介导的细胞杀伤增加。
还测试了来自B-CLL患者的原代淋巴瘤细胞。原代淋巴瘤细胞上的CD20表面水平变化比在已建立的细胞系上更大(数据未显示)。CD20水平似乎决定原代淋巴瘤培养物对由利妥昔单抗/NHS诱导的杀伤的敏感性。例如，表达低水平CD20的CCL-3细胞相对地抗由利妥昔单抗/NHS诱导的杀伤，而表达更高水平CD20的CCL-pII细胞对由利妥昔单抗/NHS引起的杀伤更易感。总体来说，如图4B中显示的，用Ad35K++突变体蛋白预温育CLL细胞显著增加了原代和建立的CD20阳性淋巴瘤细胞中利妥昔单抗介导的杀伤。这些结果证明重组Ad35K++突变体可用于减少质膜上的CD46水平，从而增加肿瘤细胞对CDC介导的抗癌mAb疗法的易感性，同时也减少细胞对由需要CD46进行附着的病原体引起的攻击的易感性。
图4C显示正常PBMC、来自B-CLL患者的原代淋巴瘤细胞和Raji细胞上的CD20和CD46的水平。使用PE缀合的小鼠抗人CD20mAb(克隆2H7)和FITC-缀合的小鼠抗人CD46mAb(克隆E4.3)进行流式细胞术。显示了代表性样品。所述附图图解说明了对Ad35K++/利妥昔单抗杀伤最具抗性的细胞样品(CCL-3)具有最低百分比的CD20+细胞和最低CD20水平。
图4D图解说明Ad35K++纤维钮浓度对利妥昔单抗介导的CDC的效应。所述图显示在低至25ng/ml的剂量上可观察到Ad35K++的致敏效应。实验条件如上所述。测试的Ad35K++浓度在0.025mg/ml(4.63x105个三聚体纤维钮分子/细胞或9.3个三聚体纤维钮分子/CD46分子)至25mg/ml的范围内。
实施例3
本实施例显示，利用突变型Ad35K++(Asp207Gly和Thr245Ala；SEQ ID NO：5)蛋白预处理提高了利妥昔单抗在异种移植小鼠淋巴瘤模型中的抗肿瘤功效。
材料和方法
重组纤维钮蛋白的产生：如实施例1和2中所述产生对CD46的亲和力增加的重组Ad35突变型纤维钮蛋白。关于体内研究，使用具有低于0.25EU/ml内毒素的重组Ad35K(野生型；SEQ ID NO：3)和Ad35K++(Asp207Gly和Thr245Ala；SEQ ID NO：5)突变型蛋白的制剂。
细胞：如实施例2中所述维持Raji细胞。
动物研究：按照由University of Washington提供的机构指导方针进行牵涉动物的全部实验。将小鼠圈养在无特殊病原体的设施中。为了建立异种移植淋巴瘤模型，将200μl PBS中的3.5x106个Raji细胞注射入免疫缺陷型CB17SCID-beige小鼠的尾静脉。在14天后，静脉内注射200μl PBS中的50μg重组Ad35K-279突变型(CD46结合降低)或Ad35K++突变型(CD46结合增加)纤维钮蛋白。此后10小时通过尾静脉注射利妥昔单抗(50μg，于200μlPBS中)或PBS。在第一实验中，在利妥昔单抗或PBS注射后7小时处死小鼠，从股骨冲洗出骨髓细胞。为了利用流式细胞术分析骨髓中的人CD20阳性细胞，用Fc-block(抗CD16/CD32，BDBiosciences)预处理1x106个骨髓细胞15分钟，随后在4℃下用20μl FITC缀合的抗CD20抗体(克隆3H7，BD Pharmingen)温育1小时。在第二实验中，作为Kaplan-Meiers存活研究的终点，就后腿瘫痪的发作评估小鼠。关于存活研究，用Raji细胞注射小鼠，如上所述利用重组Ad35K-279突变型或Ad35K++突变型纤维钮蛋白，然后用利妥昔单抗或PBS处理小鼠。
为了建立第二淋巴瘤异种移植物模型，将5x106个人Farage细胞(CD20+)静脉内注射入CB17SCID/beige小鼠。在利用Farage细胞注射后21天，静脉内注射200μl PBS中的50μg重组Ad35K-279突变体(CD46结合减少)或Ad35K++突变体(CD46结合增加)纤维钮蛋白。之后通过尾静脉注射利妥昔单抗(50μg，于200μl PBS中)或PBS，就后腿瘫痪的发作观察小鼠。
结果
Ad35K++的静脉内注射可被良好耐受
先前由其他研究人员使用hCD20-转基因小鼠进行的研究已显示利妥昔单抗疗法可被良好耐受。此处，以50μg/小鼠(2.5mg/kg)的剂量将重组突变型Ad35K++蛋白静脉内注射入具有免疫能力的CD46转基因C57Bl/6小鼠(品系MCP8B)(Marie，J.C.，等人，NatureImmunology 3：659-666(2002))或免疫缺陷型CB17 SCID/beige小鼠。Ad35K++注射不引起动物外观或行为的变化(数据未显示)。在Ad35K++注射后6小时和6天时血细胞计数和主要血清酶的分析未显示异常性(数据未显示)。在尸检时(注射(p.i.)后14天)，在任何分析的器官(脑、肺、心脏、肝、肾、肠、骨髓)中未发现病理学或组织学变化。这些结果显示Ad35K++的静脉内注射在小鼠中被良好耐受，在施用的剂量下未观察到任何不利效应。在Ad35K++注射后补体对正常细胞的破坏的不存在最可能是因补体封闭系统(complement blocksystem)的冗余导致的。
利用突变型Ad35K++蛋白的预处理提高了利妥昔单抗的体内抗肿瘤功效
为了建立异种移植淋巴瘤模型，将人Raji细胞(CD20+)静脉内注射入CB17SCID/beige免疫缺陷型小鼠。在注射Raji细胞后不同的时间点上，处死小鼠，利用针对人CD20的流式细胞术就Raji细胞的存在分析外周血细胞、脾细胞和骨髓细胞。在所有时间点未在脾细胞和白细胞中观察到显著量的hCD20阳性细胞。然而，在骨髓中，在Raji细胞注射后，hCD20阳性细胞的百分比从注射后第10天的20％增加至注射后第14天的约75％。在Raji细胞注射后第15/16天，小鼠发生后腿瘫痪，这是在Kaplan-Meier存活研究中作为终点的一种症状。
在为评估Ad35K++作为治疗剂而进行的研究中，在注射Raji细胞后14天，小鼠接受50μg的Ad35K++突变型蛋白(增加的CD46结合)或50μg的Ad35K-279突变体(减少的CD46结合)。10小时后，通过尾静脉注射PBS或50μg利妥昔单抗的疗法。6小时后处死一组小鼠，并且基于骨髓中hCD20阳性细胞的百分比测量各种处理对于体内杀死Raji细胞的效力，如图5A中显示的。与Ad35K-279处理的对照小鼠相比较，当单独地注射突变型Ad35K++蛋白或利妥昔单抗时未观察到显著的治疗效应。然而，如图5A中显示的，利用突变型Ad35K++蛋白预处理、然后施用利妥昔单抗的组合导致骨髓中hCD20阳性细胞的显著减少。这些发现在存活研究中得到确认。如图5B中显示的，与单独的利妥昔单抗或模拟物处理相比较时，当利用Ad35K++/利妥昔单抗预处理时，存活率显著增加(利妥昔单抗对Ad35K++/利妥昔单抗：p＝0.0050；Ad35K-279对Ad35K++/利妥昔单抗：p＝0.0016)。对照(Ad35K-279)与单独的Ad35K++组之间的存活率无差异(数据未显示)。有趣地，单独的利妥昔单抗不产生体内治疗效应(Ad35K-279对利妥昔单抗：p＝0.1289)，这与体外观察的相反。利妥昔单抗的效应可能是剂量依赖性的，并且在更高剂量上可能更强。
重要的是，Ad35K++的预注射极大地提高了以与用于人患者的剂量(其可从2变化至250mg/kg)相等的剂量注射的利妥昔单抗的抗肿瘤功效。为了进一步增加该方法的治疗功效，在利妥昔单抗的第一注射后72小时开始第二轮Ad35K++/利妥昔单抗(图5B)。如在第一轮的治疗中一样，将Ad35K++突变型纤维钮蛋白静脉内注射入小鼠，然后在10小时后通过尾静脉注射利妥昔单抗。如图5B中显示的，与单独利妥昔单抗治疗的16.5天相比较，Ad35K++突变体蛋白和利妥昔单抗的重复注射使存活中值增加至24天。
为了建立第二淋巴瘤异种移植模型，将5x106个人Farage细胞(CD20+)静脉内注射入CB17SCID/beige免疫缺陷型小鼠。注射后23天观察到病态的发作，在脾和肝中检测到肿瘤损害。为了评估Ad35K++作为治疗剂在该模型中的功效，在注射Farage细胞后21天，小鼠接受50μgAd35K++突变型蛋白(增加的CD46结合)或50μg的Ad35K-279突变型(消除CD46结合)。10小时后，通过尾静脉注射PBS或50μg利妥昔单抗的疗法。如图5C和5D中显示的，与单独的利妥昔单抗或模拟处理相比，当在利妥昔单抗处理之前用Ad35K++预处理小鼠时存活率显著增加(p＜0.001)。在对照(Ad35K-279)与单独的Ad35K++组之间存活率无差异(图5D)。如在Raji细胞异种移植物模型的情形中一样，单独的利妥昔单抗疗法在体内不产生治疗效应(p＝0.145)。
图5E图解说明如通过流式细胞术测量的，在施用PBS或利妥昔单抗后12小时处死的经处理小鼠的骨髓、肠系膜淋巴结或脾中人CD20阳性细胞的百分比。Ad35K++和利妥昔单抗的组合导致骨髓、淋巴节和脾中人CD20阳性细胞的显著减少(P＜.03)，n＝7。
概而言之，本实施例的结果证明了与单独利用利妥昔单抗的处理相比较，利用Ad35K++突变型蛋白预处理、然后利用利妥昔单抗处理增加了肿瘤细胞的杀伤。
Ad35K++在免疫缺陷型小鼠中显著增加抗肿瘤功效这一事实表明免疫细胞不参与利妥昔单抗/补体介导的肿瘤杀伤。该结果表明Ad35K++/利妥昔单抗处理在免疫抑制小鼠中是有效的，这预测了免疫抑制患者中抗肿瘤效应的功效，避免了关于产生抗病毒Ad35K++蛋白的中和抗体的潜在问题，从而允许重复治疗周期。此外，在这一点上，在动物模型中已显示，在免疫抑制后，溶瘤腺病毒载体的重复注射是有效的并且增加病毒治疗的抗肿瘤功效(Thomas，M.A.，等人，Mol.Ther.16：1665-1673(2008))。
在使用CB17SCID-beige小鼠的Raji细胞异种移植淋巴瘤模型中产生剂量反应。可通过定量异种移植物CB17SCID-beige小鼠的外周血和淋巴结中的人淋巴瘤细胞来进一步分析突变型Ad35K++/利妥昔单抗施用的治疗效应。
本领域技术人员应理解，本文中描述的施用Ad35K++以使细胞对CDC敏感的方法不限于CD20/利妥昔单抗处理，其可用于使细胞对其他抗癌mAb情形下的CDC敏感。例如，Ad35K++可用于使表达CD52的肿瘤细胞对阿仑珠单抗(Campath)(用于治疗慢性淋巴细胞白血病的抗CD52mAb)敏感。在另一个实例中，Ad35K++可用于使表达CD33的肿瘤细胞对吉妥珠单抗(用于治疗急性髓细胞性白血病的抗CD33mAb)敏感。
实施例4
本实施例描述了重组野生型Ad35纤维钮蛋白(SEQ ID NO：3)和突变型Ad35K++(Asp207Gly和Thr245Ala；SEQ ID NO：5)在人癌症患者中的免疫原性的分析。
材料和方法
就与重组Ad35K(野生型)蛋白或重组Ad35K++(Asp207Gly和Thr245Ala)突变型蛋白反应的抗体的存在情况分析20个人癌症患者的血清。
人研究
如下就与重组Ad35K(野生型)蛋白或重组Ad35K++突变型蛋白反应的抗体的存在情况测试20个人癌症患者的血清。通过PAG电泳分离重组(非变性的)Ad5六邻体，Ad5纤维钮，Ad35K和Ad35K++以及变性的Ad5病毒体，将印迹的蛋白与人血清一起温育。随后利用抗人IgG-HRP检测Ad特异性抗体在血清中的存在。
结果
表3概述了为测量Ad特异性抗体在人血清中的存在情况而进行的实验的Western印迹分析结果。
表3：Ad35纤维钮与癌症患者的血清的免疫反应性
如上文表3中所显示的，在所测试的20个癌症患者的血清中未检测到与Ad35K或Ad35K++反应的抗体。在另一方面，大部分所测试的人血清样品确实含有特异于Ad5六邻体、Ad5纤维钮和Ad5五邻体的抗体。该结果并不令人惊讶。虽然绝大多数人具有抗Ad5的中和抗体(Sumida，S.M.，等人，Journal of Immunology 174：7179-7185(2005))，但只有少于10％的人具有抗Ad35的中和抗体(Nwanegbo，E.，等人，Clin.Diagn.Lab.Immunol.11：351-357(2004)；Abbink，P.，等人，Journal of Virology 81：4654-4663(2007)；Reddy，P.S.，等人，Virology 311：384-393(2003)。
实施例5
本实施例描述了通过重复注射重组蛋白并且在注射后分析抗Ad35K++抗体的存在情况来分析野生型Ad35纤维钮蛋白(SEQ ID NO：3)和重组突变型Ad35K++(Asp207Gly和Thr245Ala；SEQ ID NO：5)在具有免疫能力的小鼠中的免疫原性。
小鼠研究：
关于利用重组Ad35纤维钮蛋白的免疫研究，5只具有免疫能力的CD46转基因C57Bl/6小鼠(品系MCP8B)(Marie，J.C.，等人，Nature Immunology 3：659-666(2002))在第0天接受50μg重组Ad35K++蛋白或Ad35K蛋白的单一静脉内注射(治疗方案)或在第0、3和6天接受总共3次5μg重组Ad35K++蛋白或Ad35K蛋白的皮下注射(接种方案)。4周后从小鼠收集血清，如实施例2中所述，利用Western印迹就Ad特异性抗体分析血清。按照由Universityof Washington提供的机构指导方针进行所有牵涉动物的实验。
结果
表4概述了为测量单次静脉内注射或一系列3次皮下注射Ad35K或Ad35K++后小鼠血清中Ad35K或Ad35K++特异性抗体特异性抗体的存在情况而进行的实验的Western印迹分析结果。
表4：在注射入小鼠后Ad35纤维钮蛋白的免疫反应性
如上文表4中所显示的，在血清中检测到与Ad35K++反应的抗体，并且在更低的程度下在接受3次重组蛋白的皮下注射的小鼠中检测到与Ad35K反应的抗体；然而，当静脉内注射重组Ad35K++或Ad35K蛋白时未观察到可检测的抗体。这可能是因为在静脉内注射后抗原呈递细胞对重组蛋白(Ad35K++或Ad35K)的低效摄取所致。
表5显示Ad35K++注射后的血液学参数。用50mg Ad35K++静脉内注射雄性和雌性CD46转基因小鼠(MCP8B株)，在16和48小时后分析血液样品。显示了与模拟物处理的动物相比较而言2个测量的平均值。在小鼠中，CD46的同源物只在睾丸中表达。因此，以与人相似的模式和水平表达huCD46的转基因小鼠可能是用于安全研究的更好模型。将治疗研究中所用的相同剂量Ad35K++静脉内注射入huCD46转基因的具有免疫能力的C57Bl/6小鼠(MCP-8B株)。Ad35K++注射后6和48小时的血细胞计数和其他血液学参数的分析未显示异常(表5)。尸检时(注射后第14天)，在所有分析的器官(脑、肺、心脏、肝、肾、肠、骨髓)中未发现病理学或组织学变化。
表5：Ad35K++注射后的血液学参数
此外，为了确定实施例2中描述的测定中抗Ad35K++抗体的存在对细胞杀伤的作用，将来自已接种的或首次接受试验的小鼠的血清与Ad35K++一起用于利妥昔单抗介导的CDC测定中。如图6中显示的，无论抗Ad35K++抗体是否存在，都观察到Ad35K++在使细胞对CDC介导的细胞杀伤敏感中的相同刺激效应。虽然不希望受任何特定理论束缚，但据认为这可能因Ad35K++与CD46的相互作用具有非常高的亲和力并且不能被在皮下Ad35K++注射的小鼠中产生的多克隆抗Ad35K++抗体破坏的事实而导致。
实施例6
本实施例描述了用于减小经修饰Ad35K纤维钮蛋白的免疫原性以确保重复施用在哺乳动物受试者中的安全性和功效的方法。
原理
如上文实施例5中所指出的，在利用Ad35K++相对Ad35K诱导的抗体的水平之间观察到差异，如表4中显示的。虽然不希望受任何特定理论束缚，但据认为Ad35K纤维钮蛋白的少许改变导致了免疫原性的丧失或减小。先前已报导Ad5纤维钮内的表位是构象表位(Gahery-Segard，H.，等人，Journal of Virology 72：2388-2397(1998))。也已表明由Ad纤维钮中暴露的表面环的变化引起的构象改变可能是病毒逃避抗体中和的有效方式(Pache，L.，等人，Journal of Virology 82：7923-7931(2008))。因此，可使用本领域内已知的常规方法降低重组Ad35突变型蛋白的免疫原性，如下文中详细描述的。
表位建模
使用MacVector 6.5.3软件包，基于Kyte-Doolittle和Hopp-Wood算法(Kyte和Doolittle，1982；Hopp和Woods，1981)对Ad35K++的抗原性/亲水性特征建模。已使用ProPred-I和-II(Singh，H.和Raghava，G.P.S.，″ProPred1：Prediction of PromiscuousMHC Class-I Binding Sites，″Bioinformatics 19：1009-1014(2003)；Singh，H.和Raghava，G.P.S.，″ProPred：Prediction of HLA-DR Binding Sites，″Bioinformatics17：1236-37(2001))预测了MHC I类和II类结合区域。
使用如其他地方描述的商购可得的定向诱变PCR试剂盒将相应的突变引入所述蛋白质(Wang等人，Journal of Virology82：10567-10579(2008))。
低免疫原性突变体的产生
通过产生如实施例1中所述的随机突变体文库，将随机突变引入编码AD35K++(SEQID NO：3，由SEQ ID NO：4编码的)的核酸。就CD46结合位点的保留和对抗Ad35K++抗体的低反应性选择所得的印迹。具体地，用已知具有Ad35K中和抗体的受试者的血清温育印迹。利用抗人FC HRP使中和抗体的结合可视。选择不与中和抗体结合的菌落。随后就结合CD46的能力分析来自所选择的菌落的纯化纤维钮蛋白。随后如实施例2和3中所描述的，将所述测定中鉴定的重组Ad35K突变型蛋白与利妥昔单抗结合施用至淋巴瘤细胞，在患者血清存在的情况下评估突变体的功效。通过如实施例5中所描述的，在具有免疫能力的小鼠中重复皮下注射所述突变蛋白质来确认所选择的突变型Ad35K重组体的免疫原性降低。
实施例7
本实施例描述了用于通过修饰以包含聚乙二醇链来增强重组突变型Ad35K的治疗潜能的方法。
方法
通过将100μg纯化的重组蛋白质与0.1mM磷酸钾缓冲液(10mMK2PO4，150mM NaCl，1mM MgCl2，5％[w/v]蔗糖；pH 7.8)中的10mg/ml甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺基丙酸酯(mPEG SPA，MW 5000；Nektar Therapeutics，Huntsville，AL)或Sunbright ME-050HC(MW5000；NOF，Tokyo，Japan)混合来将聚乙二醇链加至重组修饰的Ad35K蛋白，例如Ad35K++。在于室温下温育1小时后，利用赖氨酸猝灭反应。通过凝胶过滤层析(Sephadex G50；GEHealthcare Bio-Sciences，Piscataway，NJ)除去过量赖氨酸和非反应性PEG分子。就CD46结合和增强由利妥昔单抗诱导的CDC的能力评估所得的PEG化Ad35K++，如实施例2中所描述的。此外，通过存活研究和通过定量异种移植CB17SCID-beige小鼠的外周血和淋巴结中的人淋巴瘤细胞来评估牵涉PEG化Ad35K++/利妥昔单抗的疗法的体内功效，如实施例3中所描述的。
实施例8
本实施例描述了Ad35K++对外周血单个核细胞(PBMC)的效应。
A.Ad35K++的预温育对正常人PBMC，从正常人PBMC分选的CD20阳性细胞和一系列原代人细胞培养物的效应
方法
使用FACS从来自3个健康供体混合的人PBMC分选CD20阳性细胞。将CD20阳性细胞培养3天。用Ad35K++(25μg/ml)处理、然后在8小时后用利妥昔单抗(15μg/ml)和NHS(25％的终浓度)处理总共1x105个CD20阳性细胞或PBMC(未分选的，培养3天)。在加入NHS后4小时，基于台盼蓝排除计数活细胞。以PBS处理细胞的细胞存活率作为100％。
还对一系列原代人细胞培养物(包括血管内皮细胞、角膜上皮细胞、卵巢表面上皮细胞和包皮成纤维细胞)进行体外研究。用Ad35K++(25μg/ml)、然后在8小时后用利妥昔单抗(15μg/ml)和NHS(20％的终浓度)处理总共1x105个细胞。在加入NHS后4小时，洗涤细胞，在加入染色剂后30分钟利用WST-1细胞增殖测定(可从Roche商购获得，Cat No.11 644 807001)测量存活率。以PBS处理的细胞的细胞存活率作为100％。
结果
图7A图解说明在用磷酸缓冲盐溶液(PBS)、单独的利妥昔单抗、正常人血清(NHS)、Ad35K++预处理加NHS、利妥昔单抗加NHS或Ad35K++预处理加利妥昔单抗加NHS温育后来自人PBMC的培养的活CD20阳性细胞百分比。如图7A中显示的，当与PBS处理的对照相比较时，利妥昔单抗杀伤15％的细胞，NHS至利妥昔单抗的添加使死亡的CD20+细胞的百分比增加至35％(p＜0.05)。如图7A中进一步显示的，利用Ad35K++的预温育导致约75％的原代人CD20+细胞的利妥昔单抗/NHS介导的杀伤。如图7A中进一步显示的，单独NHS温育的细胞的细胞存活率没有变化。单独Ad35K++预处理不杀伤CD20阳性PBMC(数据未显示)。如图7A中显示的，Ad35K++预处理和NHS的组合导致细胞存活率的非显著下降(p＝0.12)。
图7B图解说明利用磷酸缓冲盐溶液(PBS)，单独的利妥昔单抗、正常人血清(NHS)、Ad35K++预处理加NHS，利妥昔单抗加NHS或Ad35K++预处理加利妥昔单抗加NHS培养的活人PBMC的百分比。如图7B中显示的，在用利妥昔单抗/NHS和Ad35K++/利妥昔单抗/NHS温育后未观察到细胞存活率的显著降低。
如图7C中显示的，对于用单独的Ad35K++、利妥昔单抗或NHS温育的血管内皮细胞、角膜上皮细胞、卵巢上皮细胞或包皮成纤维细胞，与PBS处理的对照细胞(N＝5)相比较，细胞存活率没有显著差异。值得注意地，Ad35K++/NHS和Ad35K++/利妥昔单抗/NHS导致细胞存活率的不显著下降，这可能是因为这些细胞类型不表达CD20所致。在用利妥昔单抗、Ad35K++/NHS或Ad35K/利妥昔单抗/NHS温育CD20阴性转化细胞系例如HeLa(宫颈癌)，Mo7e(红白血病)，BT474(乳腺癌)，SK-BR-3(乳腺癌)，A549(肺癌)和HT-29(结肠癌)细胞后获得相似数据(数据未显示)。
总得来说，所述体外研究显示原代CD20阳性PBMC、原代B-CLL细胞和淋巴瘤细胞系的Ad35K++预温育增加了利妥昔单抗(抗Cd20mAb)的细胞毒性。相反地，没有观察到显著Ad35K++介导的补体介导的原代CD20阴性细胞杀伤。
B.正常PBMC、来自B-CLL患者的原代淋巴瘤细胞和Raji细胞的CD20和CD46水平
使用流式细胞术测定正常PBMC、来自B-CLL患者的原发性淋巴瘤细胞和Raji细胞的CD20和CD46水平。使用PE-缀合的小鼠抗人CD20mAb(克隆2H7，BD Pharmingen FrankinLakes，NJ)和FITC-缀合的小鼠抗人CD46mAb(克隆E4.3，Santa Cruz Biotechnology，SantaCruz，CA)实施流式细胞术。结果示于下文表6中。
表6：流式细胞术分析的结果
如上文表6中显示的，流式细胞术研究显示原代慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)细胞和测试淋巴瘤细胞上CD46有高的且相对均匀的水平。如上文实施例2中描述的，用Ad35K++预温育B-CLL细胞显著增加了利妥昔单抗/NHS处理的功效。值得注意的是，最抗Ad35K++/利妥昔单抗杀伤的细胞是CCL-3(参见图4B)，所述CCL-3与来自其他B-CLL患者的其他原代细胞相比较而言也具有最低百分比的CD20阳性细胞和最低CD20水平。
C.Ad35K++介导CD46从正常人PBMC的表面去除
方法：用磷酸缓冲盐溶液(PBS)或Ad35K++(10ug/ml)温育来自3个健康供体的混合人PBMC(如上所述的)12小时。随后使用PE-标记的抗CD46抗体，通过FACS分析CD46表达。
结果：已测得用PBS温育的PBMC的平均荧光强度值为563(+/-23)。用Ad35K++温育的PBMC的平均荧光强度值显著降低至286(+/-16)。因此，这些结果证明了用Ad35K++温育PBMC引起表面CD46水平降低。
讨论：如上所述，CD20在成熟人B细胞上表达。此实施例显示，利妥昔单抗/NHS杀伤原代CD20阳性PBMC，并且该细胞溶解通过利用Ad35K++预温育细胞得到增强。在临床环境中考虑该副作用是非常重要的。在另一个方面，Ad35K++对原代B细胞的利妥昔单抗杀伤的增强效应具有实际意义，因为利妥昔单抗目前被用于患者以治疗自身免疫性疾病(Owczarczyk，K.，等人Ann Rheum Dis.67：1648-1649(2008)；Petereit，H.，等人Mult.Scler.15：189-192(2009))，并且也被用于患者治疗移植物的急性抗体介导的排斥(Yang，Y.W.，等人，Exp Clin Transplant 6：211-214(2008)。
然而，关于PBMC和CD20阴性原代人细胞的研究显示，利用Ad35K++/NHS的温育只引起最低程度的毒性，即管已显示PBMC的Ad35K++治疗触发了CD46从细胞表面的去除。值得注意地，与Raji细胞相反，人PBMC表达高水平的两种其他膜补体调控蛋白CD55和CD59，其可保护它们免受CDC破坏。此外，原代细胞上CD46的密度比淋巴瘤细胞上的低至少一个数量级，如上文表6中显示的。如本实施例中进一步描述的，在利用Ad35K++温育后，PBMC的平均CD46荧光强度只降低1.97(+/-0.21)倍，然而在Raji细胞上降低7.54(+/-0.35)倍。也值得注意地，本实施例中描述的体外测定使用的Ad35K++浓度(25ug/ml＝5x108个Ad35K++纤维钮分子/细胞)是在体内静脉内Ad 35K++注射后不可能获得的量。[注意0.025ug/ml Ad35K++等同于4.63x105个三聚体纤维钮分子/细胞或9.3个三聚体纤维钮分子/个CD46分子]。
实施例9
本实施例举例说明Ad35K++疗法在异种移植淋巴瘤模型中提高利妥昔单抗在体内的抗肿瘤功效。
方法：
1.实验方案#1：
为了建立异种移植淋巴瘤模型，将3x106个人淋巴瘤Raji细胞(CD20阳性)通过尾静脉注射注射至免疫缺陷型CB17-SCID/beige小鼠中。14天后，当对照小鼠发生第一临床症状时，用50ug(2.5mg/kg)Ad35K-279(突变型阴性对照)或50ug(2.5mg/kg)Ad35K++静脉内注射动物。10小时后通过尾静脉静脉内提供利妥昔单抗(50ug)或PBS。在实验方案#1中，12小时后处死小鼠，就人CD20阳性细胞分析组织以基于骨髓和淋巴结中人CD20阳性细胞的百分比确定Ad35K-279、Ad35K++、利妥昔单抗和Ad35K++/利妥昔单抗对Raji细胞杀伤的效应。
Raji(CD20阳性细胞)的测量：
在静脉内Raji细胞注射后14天，处死小鼠，收获股骨、脾和肠系膜淋巴结，利用针对人CD20的流式细胞术和免疫荧光显微镜检查就Raji细胞的存在分析外周白细胞、脾细胞、来自肠系膜淋巴结的细胞和骨髓细胞。利用FITC标记的抗CD20抗体，通过免疫荧光显微镜分析淋巴结和脾切片。对于骨切片，使用″Klear Mouse DAB检测试剂盒″(Golden BridgeInternational Inc.，Mukilteo WA)。通过用相应的同种型匹配抗体(阴性对照)和特异于人线粒体标志(阳性对照)染色来确认染色的特异性。
结果
在静脉内Raji细胞注射后第14天，测得人CD20阳性Raji细胞主要见于骨髓和淋巴结中，并且在脾中非常稀少(数据未显示)。人CD20阳性细胞的百分比从Raji细胞注射后第10天的20(+/-4)％(骨髓)和5(+/-1.2)％(淋巴结)分别增加至注射后第14天的75(+/-6)％和42(+/-4)％。在Raji细胞注射后第15或16天，小鼠发生后腿瘫痪，一种在后来用作Kaplan-Meier存活研究终点的症状。
图8A图解说明如通过流式细胞术(N＝5)测量的，在施用PBS或利妥昔单抗后12小时处死的经处理小鼠的骨髓或肠系膜淋巴结中人CD20阳性细胞的百分比。如图8A中显示的，与Ad35K-279处理的对照小鼠相比较，当单独注射Ad35K++或利妥昔单抗后未观察到人CD20阳性细胞数目的显著减少。相反地，Ad35K++和利妥昔单抗的组合导致骨髓和淋巴结中人CD20阳性细胞的显著减少(p＜0.03)。
图8B举例说明按照实验方案#1(N＝10)处理的小鼠的Kaplan-Meier存活。根据图8A中显示的发现，与单独的利妥昔单抗或Ad35K-279对照相比较，当用Ad35K++/利妥昔单抗处理小鼠时，存在存活率的显著增加。存活率的差异是显著的(利妥昔单抗对Ad35K++/利妥昔单抗：p＝0.0050)；(Ad35K-279对Ad35K++/利妥昔单抗：p＝0.0016)。在对照(PBS或Ad35K-279)与单独的Ad35K++组之间存活率没有显著差异。
应当指出，单独的利妥昔单抗在2.5mg/kg的剂量上不产生显著的体内治疗效应(Ad35K-279对利妥昔单抗：p＝0.1289)。如下进行利妥昔单抗剂量反应研究。如对于实验方案#1所描述的用Raji细胞注射小鼠。两周后，静脉内施用PBS或不同剂量的利妥昔单抗(50ug、100ug和250ug/小鼠，以200ul的总体积)。监测存活率(后腿瘫痪的发作)(N＝7)。确得利妥昔单抗剂量增加至12.5mg/kg导致治疗功效(数据未显示)。
2.实验方案#2：
测试第二实验方案，发现其使得用Raji淋巴瘤细胞移植的小鼠能够长期存活。如下进行第二实验方案：
为了建立异种移植淋巴瘤模型，通过尾静脉注射将3x106个人淋巴瘤Raji细胞(CD20阳性)注射入免疫缺陷型CB17-SCID/beige小鼠。13天后，以6小时的间隔通过两次50μg(2.5mg/kg)Ad35K++的静脉内注射开始第一治疗周期。在第二次Ad35K++注射后6小时，小鼠接受利妥昔单抗(50μg)的静脉内注射。36小时后开始第二治疗周期，所述第二治疗周期与第一治疗周期相同(即，间隔6小时的两次50μg(2.5mg/kg)Ad35K++的静脉内注射)。第二Ad35K++注射后6小时，小鼠接受利妥昔单抗(50μg)的静脉内注射。后腿瘫痪的发作在存活研究中用作终点。
结果
图8C是根据处理方案#2处理的小鼠的Kaplan-Meier存活研究，其显示接受一个处理周期(1x：利妥昔单抗加Ad35K++)的小鼠或接受两个处理周期(2x：利妥昔单抗加Ad35K++)或对照处理：1x利妥昔单抗、2x利妥昔单抗、2x Ad35K++或PBS小鼠的存活率(通过后腿瘫痪的发作测量的)。如图8C中显示的，处理方案#2使得利用Raji淋巴瘤细胞移植的小鼠能够长期存活，所述处理方案#2包括两个两次Ad35K++注射然后利妥昔单抗施用的周期。值得注意的是，在对照小鼠死亡之前在恰好晚期(即，3天)开始处理。如图8C中显示的，利用2x(利妥昔单抗加Ad35K++)的处理方案处理的具有Raji淋巴瘤的小鼠中有60％存活长于44天(随访的时间)。相反地，全部PBS处理的对照小鼠在Raji细胞移植后16天内死亡。
图8D是Kaplan-Meier存活研究中野生型Ad35K与Ad35K++钮结构域在利妥昔单抗疗法的促进上的比较。在Raji细胞植入后第14天，小鼠接受50mg Ad35K或Ad35K++的静脉内注射。10小时后，注射50mg利妥昔单抗，监测后腿瘫痪的发作。(N＝5，p＝0.0079)。所述图显示与野生型Ad35K蛋白相比较，Ad35K++对利妥昔单抗疗法产生显著更强的增强作用。
讨论
本实施例中描述的结果证明了与利用单独的利妥昔单抗处理的动物相比较，利妥昔单抗加Ad35K++获得更优的抗肿瘤效应和动物存活率。Ad35K++/利妥昔单抗处理在免疫缺陷型小鼠中的治疗功效表明T和B细胞未参与肿瘤细胞杀伤。这表明Ad35K++/利妥昔单抗法在免疫抑制患者(即，接受化学疗法的患者)中也是有效的。值得注意地，通常在临床上使用利妥昔单抗与骨髓抑制性(myeloreductive)化学疗法的组合，已显示所述组合延长非何杰金氏淋巴瘤(NHL)患者的无进展生存期(progression-free survival)(Wang，M.，等人，.Cancer113：2734-2741(2008))。然而，化学疗法也与白细胞减少和对感染的易感性相关，从而需要增强利妥昔单抗的功效而无需免疫抑制的方法。
临床前研究显示，利妥昔单抗活性的抗淋巴瘤效应在缺乏C1q的C57Bl/6小鼠中被完全消除，从而证明了补体激活在小鼠的利妥昔单抗疗法中的作用(DiGaetano，N.，等人，JImmunol 171：1581-1587(2003))。已良好地确定了CDC通过其增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的能力、免疫效应细胞趋化性和抗肿瘤T细胞反应的活化而在介导利妥昔单抗的功效中起作用(Wang，S.Y.，等人，Expert Opin Biol Ther 8：759-768(2008))。此外在这一点上，应指出目前正在开发具有增强的激活CDC的能力的mAb(参见Idusogie，E.E.，等人，J Immunol 166：2571-2575(2001)，例如奥法木单抗(ofatumumab)，另一种CD20特异性mAb(Arzerra)(Maloney，D.G.，等人，Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2007：226-232)。此外，对于用于治疗慢性淋巴细胞白血病的阿仑珠单抗(抗CD52mAb)(Zent，C.S.，等人，Leuk Res 2008)；对于用于治疗AML的吉姆单抗(抗CD33mAb)(Castillo，J.，等人，Exp Hematol36：755-768(2008)；以及对于用于治疗结肠癌的帕尼单抗和西妥昔单抗(抗EGFR mAb)(Dechant，M.，等人，Cancer Res 68：4998-5003(2008)已报导了CDC在肿瘤细胞杀伤中的作用。总的说来，这表明除了与利妥昔单抗组合外，基于Ad35K++的佐剂方法对于mAb疗法是有用的，如在实施例10中进一步表明的。
概括地说，本临床前研究和实施例3中描述的体内研究显示了利用Ad 35K++增强基于利妥昔单抗和其他单克隆抗体的抗肿瘤疗法的功效和安全性。
实施例10
本实施例显示利用突变型Ad35K++(Asp207Gly和Thr245Ala)预温育肿瘤细胞使得所述肿瘤细胞对Campath/阿仑珠单抗，赫赛汀，爱必妥(Erbitux)，米罗他(Mylotary)，Arzerra和利妥昔单抗介导的补体依赖性细胞溶解敏感。
原理：进行实验以确定对于CD46具有增强的亲和力的突变型Ad35纤维钮蛋白(Ad35K++)是否可下调下列细胞上的CD46：Raji(CD52阳性)、BT-474(Her2/Neu阳性)LOVO(EGFR阳性)、CD33+细胞和CD20+、以及是否使所述细胞对由Campath/阿仑珠单抗(抗CD52)、赫赛汀(抗Her2/neu)、爱必妥(抗EGFR)、米罗他(抗CD33)、Arzerra(抗CD20)和利妥昔单抗(抗CD20)介导的补体依赖性细胞溶解易感。
材料和方法
纤维钮蛋白的产生：对CD46具有增强的亲和力的重组修饰Ad35纤维钮蛋白选自如实施例1中描述的大肠杆菌表达文库。在大肠杆菌中产生具有6个连续组氨酸残基(6-HIS)的N末端标签的重组突变纤维钮蛋白，如实施例1中描述的利用Ni-NTA琼脂糖层析纯化所述蛋白。将纤维钮蛋白对20mM Hepes，200mM NaCl，17％甘油进行透析。使用来自Cape CodInc.(E.Falmouth，MA)的Limulus Amebocyte Lysate测试试剂盒进行内毒素测试。
细胞系：
将Raji(CD52阳性)(人Burkitt′s淋巴瘤)(ATCC CCL-86)培养在补充有10％FBS和L-谷氨酰胺/(Pen-Strep)的RPMI中。
将Jurkat(CD52阴性)培养在补充有10％FBS，Pen-strep的RPMI中。
将BT-474(Her2/Neu阳性)(人乳腺癌)培养在补充有10％FCS，Pen-strep的ATCChybrid Care培养基(Cat#46-X)。
将MDA-231(Her2/neu阴性)(人乳腺癌)培养在补充有10％FCS，Pen-strep的DMEM中。
将LOVO(EGFR阳性)(人结肠癌)培养在补充有10％FCS，Pen-strep的DMEM中。
将HeLa(EGFR阴性)(美国典型培养物保藏中心，ATCC)培养在补充有10％胎牛血清(FBS)和2mM L-谷氨酰胺，100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中。
抗体：
用于治疗慢性淋巴细胞白血病的Campath/阿仑珠单抗(抗CD52)获自Genzyme。用于治疗乳腺癌的赫赛汀/曲妥珠单抗(抗Her2/neu)，获自Genentech。用于治疗结肠癌的爱必妥/西妥昔单抗(抗EGFR)获自Amgen。米罗他、Arzerra和利妥昔单抗也获自商业来源。
体外活力测定：
1.Campath/阿仑珠单抗(抗CD52)
将5x104个细胞/孔的Raji(CD52阳性)或Jurkat细胞(CD52阴性)以一式三份涂铺在具有补充有10％热灭活FBS的RPMI的96孔板中，用(1)PBS、或(2)25μg/ml对于CD46具有高亲和力的突变型Ad35K++(Asp207Gly和Thr245Ala)预温育。
8小时后，将15μg/ml Campath(抗CD52)mAb加入细胞，在室温下温育30分钟。将正常人血清(NHS)(25％终浓度的NHS)作为补体源加入，将细胞在37℃下再温育另外4小时以进行裂解。在台盼蓝染色后计数每个孔中的活细胞数。以一式三份进行各样品，计数每一个孔4次。进行3个独立研究。以未处理细胞的细胞存活率作为100％。
2.赫赛汀/曲妥珠单抗(抗Her2/neu)
将5x104个细胞/孔的BT-474(Her2/neu阳性)或MDA-231(Ner2/neu阴性)以一式三份涂铺在具有补充有10％热灭活FBS的RPMI的96孔板中，用(1)PBS或(2)25μg/ml对于CD46具有高亲和力的突变型Ad35K++(Asp207Gly和Thr245Ala)预温育。
8小时后，将15μg/ml赫赛汀(抗Her2/neu)mAb加入细胞，在室温下温育30分钟。将正常人血清(NHS)(25％终浓度的NHS)作为补体源加入，将细胞在37℃下再温育另外4小时以进行裂解。在台盼蓝染色后计数每个孔中的活细胞数。以一式三份进行各样品，计数每一个孔4次。进行3个独立研究。以未处理细胞的细胞存活率作为100％。
3.爱必妥/西妥昔单抗(抗EGFR)
将5x104个细胞/孔的LOVO(EGFR阳性)或HeLa(EGFR阴性)细胞以一式三份涂铺在具有补充有10％热灭活FBS的RPMI的96孔板中，用(1)PBS或(2)25μg/ml对于CD46具有高亲和力的突变型Ad35K++(Asp207Gly和Thr245Ala)预温育。
8小时后，将15μg/ml爱必妥(抗EGFR)mAb加入细胞，在室温下温育30分钟。将正常人血清(NHS)(25％终浓度的NHS)作为补体源加入，将细胞在37℃下再温育另外4小时以进行裂解。在台盼蓝染色后计数每个孔中的活细胞数。以一式三份进行各样品，计数每一个孔4次。进行3个独立研究。以未处理细胞的细胞存活率作为100％。
结果
如图9A中显示的，利用Ad35K++的预温育增强了Raji细胞的由Campath(抗CD52mAb)诱导的CDC介导的杀伤，所述Raji细胞为CD52阳性的。相反地，如图9B中显示的，利用Ad35K++的预温育在Campath存在的情况下对Jurkat细胞(CD52阴性)不具有作用。
如图10A中显示的，利用Ad35K++的预温育增强了BT-474细胞的由赫赛汀(抗Her2/neu mAb)诱导的CDC依赖性和非依赖性杀伤，所述BT-474细胞为Her2/neu阳性的。相反地，如图10B中显示的，利用Ad35K++的预温育在赫赛汀存在的情况下对MDA-231细胞(Her2/neu阴性)不具有作用。
如图11A中显示的，利用Ad35K++的预温育增强了BT-474细胞的由爱必妥(抗EGFRmAb)诱导的CDC依赖性杀伤，所述BT-474细胞为EGFR阳性的。相反地，如图11B中显示的，利用Ad35K++的预温育在爱必妥存在的情况下对HeLa细胞(EGFR阴性)不具有作用。
因此，这些结果表明本文中描述的施用Ad35K++以使细胞对CDC敏感的方法不限于CD20/利妥昔单抗处理，其可用于使细胞对其他抗癌mAb例如抗CD52mAb、抗Her2/neu mAb和抗EGFR mAb情形下的CDC敏感。
如图12和图13中显示的，利用Ad35K++的预温育分别增强了由米罗他和Arzerra诱导的杀伤。
如图14A中的时间轴所显示的，用Ad35K++或对照蛋白质温育BT474(乳腺癌肿瘤细胞)细胞。11个小时后，向细胞中加入赫赛汀mAb，在室温下温育。30分钟后，加入正常人血清(NHS)，3小时后基于台盼蓝排除计数活细胞。图14B中显示了在两种不同的血清样品(左图为来自供体1的血清；右图为来自供体2的血清)存在的情况下BT474细胞的杀伤。显示了在两种不同血清样品存在的情况下针对PBS(模拟)、赫赛汀/NHS和赫赛汀/Ad35K++/NHS的细胞的百分比细胞存活率。
如图14C中的时间轴所显示的，用Ad35K++或对照蛋白质温育的CD20阳性Farage非何杰金淋巴瘤细胞(NHL细胞)。11个小时后，向细胞中加入Ofatumumab(Arzerra)，在室温下温育。30分钟后，加入正常人血清(NHS)，3小时后基于台盼蓝排除计数活细胞。图14D中显示了在两种不同的血清样品(左图为来自A血型供体1的血清；右图为来自AB血型供体2的血清)存在的情况下CD204阳性FarageNHL细胞的杀伤。显示了在两种不同血清样品存在的情况下针对PBS(模拟物)、Arzerra/NHS、Arzerra/Ad35K++/NHS的细胞的百分比细胞存活率。对于不同NHS样品(包括AB血清)，Ad35K++增强了mAb-触发的CDC。
两个供体都具有抗Ad35中和抗体(滴度1∶16)，但Ad35++效应仍然显著。
实施例11
利用DNA2.0软件最优化AD35++的序列，如图15A和图15B中显示的。除了密码子用法和RNA结构的最优化外，可就不想要的基序(图15C)检查Ad35K++DNA序列。利用PAGE分离细菌裂解物，对其进行印迹分析。用可溶性重组CD46温育滤膜，然后利用抗CD46抗体(克隆J4.48；Fitzgerald，Concord，MA)和山羊抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)-辣根过氧化物酶(HRP)(BD Pharmingen，San Jose，CA)温育滤膜。图15C显示，除了密码子用法和RNA结构的最优化外，还就不想要的基序检查了Ad35K++DNA序列。
为了检测所述最优化的蛋白质是否结合CD46，从新制划线平板挑拣pET29a-Ad35K++或pQE30-Ad35K++的菌落，将其在30℃下于4ml LB培养基中培养14小时。将IPTG加至1mM的终浓度，在剧烈振荡下于37℃再温育培养物另外8小时。随后通过离心沉淀细菌，重悬浮于350ul裂解缓冲液(50mM NaH2PO4，200mM NaCl，10mM咪唑，pH8.0)中，将其经历超声处理。将20ul蛋白质上清液与上样缓冲液(Tris，50mMDTT，1％SDS(1∶1)(未煮沸)混合，然后加载在5-15％PAA凝胶上。在印迹后，依次用可溶性CD46、小鼠抗CD46mAb(克隆J4.48；Fitzgerald，Concord，MA)和山羊抗小鼠IgG-HRP温育滤膜。图15D显示在IPTG诱导后含有pET29-Ad35K++的HMS174中Ad35K++的检测。
实施例12
接着，如图16中所显示的，检查非人灵长类动物模型。图16A显示B细胞体外去除。具体地，从成束猴、豚尾猴和狒狒纯化PBMC，将其培养1天。使用(交叉反应性)抗人CD20-PE抗体分选CD20+细胞。对于CDC测定，用25ug/ml Ad35K++或PBS温育CD20+细胞12小时。加入利妥昔单抗(15ug/ml)或PBS，30分钟后加入NHS(最终20％)。在3小时的温育后基于台盼蓝排除计数细胞存活率。N＝8图16B显示Ad35K++血凝集测定。具体地，将系列稀释度的Ad35K++蛋白与1％红细胞一起温育，1小时后评估血凝集。
在所有哺乳动物中，只有NHP以与人相似的模式表达CD46。与人相反，NHP在红细胞上具有CD46。
在体外，利妥昔单抗消除了所有测试的NHP种类的CD20+B细胞(食蟹猴，豚尾猴和猎神狒狒(Papio anubis))，并且Ad35K++显著促进该过程。
Ad35K++使来自狒狒(猎神狒狒)的红细胞凝集，但不会使来自人和来自短尾猿种类(包括食蟹猴和豚尾猴)的红细胞凝集。
综观来说，这些结果表明食蟹猴和和豚尾猴是研究Ad35K++/利妥昔单抗法以及能够调节靶细胞表面上CRP的活性或减少其存在的多肽与选择的治疗性抗体组合的其他组合的功效和安全性的模型。
实施例13
用同基因38C13骨髓瘤细胞静脉内注射对于人CD46和CD20双重转基因的C57Bl/6小鼠，所述骨髓瘤细胞以在人骨髓瘤细胞上发现的水平异位表达人CD46和CD20(图17，下图)。PBS-注射的小鼠在注射38C13细胞后第17天变得垂死，肿瘤细胞定位于骨髓、脾、淋巴结和肝中。在治疗实验中，荷瘤小鼠静脉内接受2mg/kg Ad35K++或PBS。10小时后，用利妥昔单抗(2mg/kg)注射小鼠，监测存活率(N＝5)(图17，下图)。
虽然已举例说明和描述了本发明的实施方案，但应理解可在其中进行各种变化而不背离本发明的精神和范围。

Claims (13)

1.能够三聚化并且减少靶细胞表面上CD46的活性、量或密度的经修饰多肽，其中所述多肽的序列是SEQ ID NO:3的Ad35纤维钮序列的突变体，并且其中所述多肽在207、245和/或256位存在至少一个氨基酸置换，其中所述至少一个氨基酸置换选自Asp207Gly、Thr245Ala和Ile256Leu或其组合。
2.权利要求1的多肽，其中所述多肽以0.65nM或更小的解离常数(Kd)结合CD46。
3.权利要求1的多肽，其中所述靶细胞为肿瘤细胞。
4.权利要求1的多肽，其中所述靶细胞为表达CD20的B细胞。
5.权利要求1的多肽，其中所述多肽能够减少CD46的活性、量或密度至少24小时。
6.药物组合物，其中包含治疗有效量的权利要求1至5中任一项所述多肽和药学上可接受载体。
7.权利要求6的药物组合物，其中还包含诱导补体依赖性细胞溶解的第二治疗剂。
8.权利要求7的药物组合物，其中所述诱导补体依赖性细胞溶解的第二治疗剂包含抗体或其片段。
9.权利要求6的药物组合物，其中还包含选自下述的第二治疗剂：细胞毒性剂、细胞抑制剂、化疗剂、补体激活剂、补体调节蛋白表达的调节剂、放射物、免疫调节剂、促细胞凋亡试剂、热激蛋白质的抑制剂、蛋白酶抑制剂、去涎酸化试剂、MMP抑制剂和PKC抑制剂。
10.一种载体，其中包含编码权利要求1－5中任一项的多肽的核酸。
11.一种核酸分子，其中包含编码权利要求1－5中任一项的多肽的核苷酸序列，所述多肽包含经修饰纤维钮结构域多肽，所述纤维钮结构域多肽包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的至少40个连续氨基酸。
12.降低CD46的细胞表面水平的组合物，其包含:
(a)一定量的有效地降低CD46的细胞表面水平的试剂，所述试剂包含权利要求1－5中任一项所述的多种多肽，其中所述多肽包含经修饰的腺病毒纤维钮结构域，其中所述经修饰的腺病毒纤维钮结构域能够形成与从多个由SEQ ID NO:3组成的多肽形成的同源三聚体相比较而言对于CD46结合的亲和力增强的同源三聚体；和
(b)药学上可接受的载体。
13.一种试剂盒，其包含:
(a)权利要求1－5中任一项的多肽；和
(b)结合哺乳动物细胞表面上的抗原并且诱导细胞溶解的抗体或其片段。
CN201080022959.5A 2009-03-31 2010-03-31 用于调节靶细胞上补体调节蛋白的活性的组合物和方法 Active CN102448982B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16543409P 2009-03-31 2009-03-31
US61/165,434 2009-03-31
US25545009P 2009-10-27 2009-10-27
US61/255,450 2009-10-27
PCT/US2010/029471 WO2010120541A2 (en) 2009-03-31 2010-03-31 Compositions and methods for modulating the activity of complement regulatory proteins on target cells

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102448982A CN102448982A (zh) 2012-05-09
CN102448982B true CN102448982B (zh) 2018-04-20

Family

ID=42826361

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201080022959.5A Active CN102448982B (zh) 2009-03-31 2010-03-31 用于调节靶细胞上补体调节蛋白的活性的组合物和方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US8753639B2 (zh)
EP (1) EP2414385B1 (zh)
CN (1) CN102448982B (zh)
ES (1) ES2543166T3 (zh)
WO (1) WO2010120541A2 (zh)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1998804B1 (en) * 2006-03-27 2014-04-16 Crucell Holland B.V. Compositions comprising a recombinant adenovirus and an adjuvant
WO2012031273A2 (en) 2010-09-03 2012-03-08 Stem Centrx, Inc. Novel modulators and methods of use
WO2014194213A1 (en) * 2013-05-30 2014-12-04 University Of Iowa Research Foundation Specific complement proteins and efficacy of antibody therapy
US20170037431A1 (en) * 2014-05-01 2017-02-09 University Of Washington In vivo Gene Engineering with Adenoviral Vectors
EP3234598B1 (en) 2014-12-18 2019-11-06 F.Hoffmann-La Roche Ag Assay and method for determining cdc eliciting antibodies
GB201608197D0 (en) * 2016-05-10 2016-06-22 Ducentis Biotherapeutics Ltd Novel proteins
JP2019525138A (ja) * 2016-06-16 2019-09-05 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｃｄｃを誘発する抗体を決定するためのアッセイ法および方法
WO2018232195A1 (en) * 2017-06-14 2018-12-20 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods targeting complement component 3 for inhibiting tumor growth
BR112021026832A2 (pt) 2019-07-02 2022-05-10 Hutchinson Fred Cancer Res Vetores ad35 recombinantes e aprimoramentos da terapia gênica relacionada
CN117805382B (zh) * 2024-02-28 2024-05-03 军科正源（北京）药物研究有限责任公司 检测抗利妥昔单抗中和抗体的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006026331A3 (en) * 2004-08-25 2006-08-17 Cell Genesys Inc Fiber-modified adenoviral vectors for enhanced transduction of tumor cells
CN101068933A (zh) * 2004-08-25 2007-11-07 细胞基因系统有限公司 用于肿瘤细胞增强转导的纤维修饰的腺病毒载体

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5211657A (en) 1988-11-07 1993-05-18 The United States Government As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Laminin a chain deduced amino acid sequence, expression vectors and active synthetic peptides
US5549910A (en) 1989-03-31 1996-08-27 The Regents Of The University Of California Preparation of liposome and lipid complex compositions
US5270163A (en) 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
JP3218637B2 (ja) 1990-07-26 2001-10-15 大正製薬株式会社 安定なリポソーム水懸濁液
JP2958076B2 (ja) 1990-08-27 1999-10-06 株式会社ビタミン研究所 遺伝子導入用多重膜リポソーム及び遺伝子捕捉多重膜リポソーム製剤並びにその製法
US5741516A (en) 1994-06-20 1998-04-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5795587A (en) 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US5738868A (en) 1995-07-18 1998-04-14 Lipogenics Ltd. Liposome compositions and kits therefor
US6258782B1 (en) * 1998-05-20 2001-07-10 Trimeris, Inc. Hybrid polypeptides with enhanced pharmacokinetic properties
SG98393A1 (en) 2000-05-19 2003-09-19 Inst Materials Research & Eng Injectable drug delivery systems with cyclodextrin-polymer based hydrogels
US7390795B2 (en) 2000-12-18 2008-06-24 Pentraxin Therapeutics Limited Treatment and prevention of tissue damage
EP1516055A4 (en) * 2002-01-24 2007-08-08 Scripps Research Inst FIBER OPERATING MODIFICATIONS FOR EFFICIENT TARGETS
CA2490007C (en) 2002-07-19 2011-05-24 Omeros Corporation Biodegradable triblock copolymers, synthesis methods therefor, and hydrogels and biomaterials made there from
EP1931803A2 (en) 2005-09-15 2008-06-18 Duke University Focused libraries, functional profiling, laser selex and deselex

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006026331A3 (en) * 2004-08-25 2006-08-17 Cell Genesys Inc Fiber-modified adenoviral vectors for enhanced transduction of tumor cells
CN101068933A (zh) * 2004-08-25 2007-11-07 细胞基因系统有限公司 用于肿瘤细胞增强转导的纤维修饰的腺病毒载体

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Expression and Regulation by Interferon-gamma of the Membrane-bound Complement Regulators CD46 (MCP),CD55 (DAF) and CD59 in Gastrointestinal Tumours;C.A. Schmitt, et al;《European Journal of Cancer》;19991231;117-124 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20100255011A1 (en) 2010-10-07
WO2010120541A3 (en) 2011-05-26
US8753639B2 (en) 2014-06-17
ES2543166T3 (es) 2015-08-17
WO2010120541A2 (en) 2010-10-21
EP2414385A4 (en) 2012-11-28
EP2414385A2 (en) 2012-02-08
CN102448982A (zh) 2012-05-09
EP2414385B1 (en) 2015-04-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102448982B (zh) 用于调节靶细胞上补体调节蛋白的活性的组合物和方法
JP6917952B2 (ja) 癌の診断および治療のためのｖｉｓｔａ調節剤
JP6560682B2 (ja) 小細胞肺癌に対する標的療法
US10703817B2 (en) System for delivery into XCR1 positive cell and uses thereof
CN107614519A (zh) 抗体/t细胞受体嵌合构建体及其用途
CN107922473A (zh) 用于修饰的t细胞的条件活性嵌合抗原受体
US20180147257A1 (en) Btn3a ectodomain proteins and methods of use
CN110248669A (zh) 工程化天然杀伤细胞及其用途
CN106573981A (zh) 利用抗cd40抗体的组合疗法
CN107683289A (zh) IL13RAα2结合剂和其在癌症治疗中的用途
TW201920265A (zh) 結合人類cd137之促效劑抗體及其用途
BR112020026386A2 (pt) Composições e métodos para modulação de fenótipos inflamatórios com monócitos e macrófagos e usos de imunoterapia dos mesmos
US20070275049A1 (en) Anti-tumor molecular vacine and method of making thereof
WO2014031174A1 (en) Antibodies and vaccines for use in treating ror1 cancers and inhibiting metastasis
JP7328983B2 (ja) 抗ｉｌ－２７抗体及びその使用
CN105749276A (zh) Cd37抗体在cll血液样品中的优良效力
CN112543773A (zh) SIRPα-4-1BBL变体融合蛋白及其使用方法
CN1309663A (zh) 抗血管生成蛋白及其应用
CN109415706A (zh) 假型化的溶瘤弹状病毒及其在组合治疗中的应用
JP2021536256A (ja) 修飾ｔ細胞に対する条件的活性型キメラ抗原受容体
Yamada-Hunter et al. Engineered CD47 protects T cells for enhanced antitumour immunity
CN109045288A (zh) FGFR1-MIP3α/Fc融合蛋白在制备靶向抗乳腺癌药物中的用途
CA2529058A1 (en) Increased t-cell tumor infiltration by mutant light
CN107683142A (zh) 基于多孔硅微粒的癌症疫苗和增强抗肿瘤免疫性的方法
JP2021511837A (ja) Ｉｃａｍ−１マーカーおよびその応用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant