CN109045288A - FGFR1-MIP3α/Fc融合蛋白在制备靶向抗乳腺癌药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了FGFR1‑MIP3α/Fc融合蛋白在制备靶向抗乳腺癌药物中的用途。本发明发现FGFR1‑MIP3a Fc融合蛋白疫苗能明显抑制4T1小鼠乳腺癌的生长，肿瘤体积明显减小，小鼠体重和肿瘤重量明显减轻；单独FGFR1‑Fc、MIP3α‑Fc免疫治疗组具有一定程度的抗肿瘤作用但效果不如FGFR1‑MIP3α组；同时实验过程中未发现明显毒副作用。

Description

FGFR1-MIP3α/Fc融合蛋白在制备靶向抗乳腺癌药物中的用途

技术领域

本发明涉及FGFR1-MIP3α/Fc融合蛋白在制备靶向抗乳腺癌药物中的用途，属于生物医药技术领域。

背景技术

树突状细胞(DC)疫苗是当前肿瘤免疫研究的热点^[1-3]。DC的功能主要是在感知外周危险信号之后通过淋巴管运输抗原迁移到淋巴结，在其中分泌启动免疫反应的细胞因子并将幼稚T细胞活化成细胞毒性T淋巴细胞和T辅助细胞，从而形成适应性免疫应答的主要介质，此外它们还可以减少免疫阻遏物例如CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞(Treg)的数量，是目前所知的抗原提呈功能最强的免疫细胞^[4-6]。关于DC疫苗的抗肿瘤治疗效果已有大量的研究报道，L等人将肾癌细胞裂解物在体外与DC共孵育之后所得的DC疫苗再接种回患者的临床试验中显示出DC疫苗的治疗潜力^[7]。近期有一项为期两年的II期临床研究中，24名初次诊断为胶质母细胞瘤(GBM)的患者接受了采用替莫唑胺(TMZ)标准放化疗和融合佐剂TMZ的DC疫苗联合治疗，研究结果显示有37.5％的患者在DC疫苗接种后出现NK细胞的显著持续活化，并增强了患者体内的免疫应答反应，且发现患者的生存期与DC疫苗的存在显著相关^[8]。虽然这样的DC疫苗的试验是有前景的，但是由于体内外周血的有核细胞中树突状细胞占有的比例极少，在肿瘤发生时，若单靠自身体内自然生成的树突状细胞来发挥免疫应答反应，其效果是远远不够的。为了解决这个问题，目前运用得最多的是在将体外扩增好的树突状细胞与病人的肿瘤细胞或人工制备的抗原共同进行体外培养，让这些树突状细胞在体外对抗原进行适当处理后再输回患者体内，但是这种方式制备DC疫苗的方法存在操作复杂、成本高、规范难等不足^[9-11]。为了克服这个问题，我们将寻找一种既能诱导体内树突状细胞大量增殖又能发挥其抗肿瘤免疫功效的DC疫苗，使DC疫苗治疗肿瘤变得更加简单有效。

巨噬细胞炎性蛋白3α(Macrophage inflammatoryprotein3 alpha，MIP-3α)也称为趋化因子配体20(CCL20)，是DC最重要的特异性趋化因子，它通过吸引表达CCR6的未成熟DC趋化于病原感染组织，使DC能够接触处理和递呈抗原^[11-15]。可见，如果设法让肿瘤组织中的MIP3α水平增加，就能够促使DC向肿瘤组织趋化，进而提高DC递呈肿瘤抗原的能力，这样就可以制备出一种具有体内特性的DC疫苗，既可以达到体外DC疫苗的效果，又可以省去复杂的体外操作且降低治疗成本，其潜在的临床应用前景可观。本课题组前期已自主研发的专利《MIP3α-Fc融合蛋白及其用途》，发现该融合蛋白具有树突状细胞趋化募集的作用，并具有长效血浆半衰期，在体内外均体现出良好的生物活性和稳定性。

成纤维细胞生长因子受体1(Fibroblast growth factor receptor 1，FGFR1)是肿瘤血管生成最重要的靶标分子之一，已证实通过与高亲和力配体bFGF的结合而发挥其生物学活性，促进肿瘤新生血管生成^[16]。研究表明，bFGF/FGFR1信号通路在肿瘤发生发展关系中扮演重要角色，尤其是bFGF和FGFR1过量表达的自分泌信号环路是肿瘤恶性进展的重要条件^[16-18]。本研究中选择FGFR1作为抗肿瘤血管生成靶标具有以下优点:(1)重要性：FGFR1靶分子在恶性肿瘤的生长、侵袭以及转移等恶性表型中起到关键作用；(2)遗传稳定性：血管内皮细胞遗传稳定，突变率低，故针对肿瘤血管内皮细胞的治疗策略不会或只会引起微乎其微的抗药性；(3)天然靶向特异性：FGFR1靶分子在肿瘤细胞和或肿瘤新生血管的内皮细胞高表达，而在正常的细胞及血管内皮细胞表面表达极低，具有良好肿瘤组织特异性和血管靶向性；(4)易检测性：肿瘤组织生物标本获取和检测便捷。我们团队前期开展了靶向FGFR1抗肿瘤血管生成研究并取得阶段性成果^[19-24]。

Fc融合蛋白(亦称为抗体融合蛋白)是通过基因工程技术把具有活性功能的蛋白分子与抗体的Fc段融合后形成的新功能蛋白分子，不仅能够保留原功能蛋白的全部生物学活性和体内长效半衰期，而且还可以完全取代抗体功能且免疫原性极低，是理想的信号通路阻断剂，展示了良好的临床应用价值^[25,26]。研究表明，使用Fc融合蛋白作为肿瘤治疗性抗体除了在动物体内半衰期长外，来源于小鼠的Fc还可以增强抗原提呈细胞对靶抗原的提呈能力，这均大大增强其抗肿瘤免疫效果^[25-29]。因此，本项目拟将通过基因工程的方法构建FGFR1-MIP3α/Fc融合蛋白，将极有可能大大增强其肿瘤组织靶向性，极大地提高其抗肿瘤免疫活性。

综上所述，将FGFR1-MIP3α/Fc融合蛋白作为疫苗进行体内动物实验，则有可能让肿瘤部位靶向获得高浓度MIP3α，充分发挥体内MIP3α趋化募集DC作用，并巧妙借助FGFR1的天然靶向特性使整个FGFR1-MIP3α/Fc融合蛋白更精确地靶向肿瘤细胞和/或肿瘤新生血管进而诱导更强力更持久的特异性免疫反应，同时来源于小鼠的FGFR1-Fc可以增强抗原提呈细胞对靶抗原FGFR1的提呈能力进而增强抗肿瘤免疫效应，加上FGFR1-Fc(本身具有抗体的全部功能而免疫原性极低且具有体内长效半衰期)靶向抗肿瘤血管生成协同/叠加作用，这必将极大增强它们对肿瘤细胞和/或肿瘤新生血管特异性靶向杀伤作用。据此，本研究利用课题组前期基因工程技术制备的FGFR1-MIP3α/Fc融合蛋白作为疫苗初步研究其抗肿瘤作用机制，为肿瘤生物治疗新策略提供科学实验依据。

靶向和抗血管免疫治疗是肿瘤治疗研究的两大热点。肿瘤靶向治疗是借助某些媒介，将具有治疗作用的物质尽可能地作用于特定肿瘤靶细胞而不损伤正常组织细胞，因此靶点的选择至关重要。但由于一般传统的肿瘤靶向治疗都针对肿瘤细胞，而许多肿瘤细胞并没有表达特异的细胞抗原，有些肿瘤细胞尽管表达一定程度的特异抗原，但这些抗原在肿瘤细胞在生长过程中不断突变，在不同时期表现出的抗原也各不相同^[30,31]。因此，针对肿瘤血管生成的靶向治疗能够选择性地破坏或阻塞肿瘤新生血管，具有较好的应用前景。

FGFR1是肿瘤血管生成的重要靶标，已经证实通过与其高亲和力配体bFGF结合而发挥生物学活性^[16-18]。研究表明，以过量表达bFGF和/或FGFR1为特征的自分泌信号通路在肿瘤细胞恶性增生中扮演极其重要作用^[16-20]。我们课题组前期研究成果也证实了靶向FGFR1免疫治疗具有显著抗肿瘤血管生成效果^[21-24]。因此，本研究设计由FGFR1与MIP3a、鼠源抗体Fc段共同组成FGFR1-MIP3a Fc融合蛋白，由于其含有FGFR1能够提供精准的靶向作用，使得抗肿瘤活性成分富集在肿瘤细胞和或肿瘤新生血管以充分发挥抗肿瘤功效。同时，该融合蛋白进入体内后能够特异性地与肿瘤细胞中高表达的bFGF结合，干扰bFGF/FGFR1信号通路进而抑制肿瘤新生血管生成，达到抑制肿瘤生长作用。

MIP3α(巨噬细胞炎性蛋白3α)是一种分子量只有9kDa的CC型小分子细胞趋化因子，是目前发现DC最重要的特异性趋化因子。CC趋化因子受体6(CCR6)是MIP3α的唯一受体^[11-15]。研究表明，MIP3α可以通过吸引表达CCR6的未成熟DC募集病原感染组织或肿瘤区域，使募集来的DC活化发挥抗原递呈作用^[11-15]。可见，如果设法让肿瘤组织中的MIP3α水平增加，就能够在肿瘤局部组织募集到大量DC，进而大大增强这些DC处理递呈抗原的能力。因此，为了使体内MIP3α趋化募集而来的DC能够更有效地靶向肿瘤细胞并提高其在肿瘤局部杀伤肿瘤细胞的生物活性必须寻找新的有效策略。

如何有效提高肿瘤抗原的免疫原性和免疫效果是肿瘤免疫亟待探索的问题，需要另辟蹊径。最近有关Fc融合蛋白在肿瘤中应用研究可能为我们解决靶向募集DC不足以及抑瘤活性欠佳的瓶颈问题带来新的希望。Fc融合蛋白又称抗体融合蛋白，是利用基因工程技术将具有活性功能的蛋白分子与抗体的Fc段融合所产生的新型功能蛋白。这类融合蛋白不仅保留原功能蛋白的全部生物学活性和长效体内半衰期，而且可以完全取代抗体功能而无免疫原性，是理想的信号通路阻断剂^[25,26]。研究表明，使用Fc融合蛋白作为肿瘤治疗性抗体除了在动物体内半衰期长外，来源于小鼠的Fc还可以增强抗原提呈细胞对靶抗原的提呈能力，这均大大增强其抗肿瘤免疫效果^[25-29]。本课题组前期已自主成功研制了人和小鼠MIP3αFc融合蛋白，发现该融合蛋白具有树突状细胞趋化募集的作用，并具有长效血浆半衰期，在体内外均体现出良好的生物活性和稳定性。因此，本项目我们拟将通过基因工程的方法构建FGFR1-MIP3α/Fc融合蛋白，将极有可能大大增强其肿瘤组织靶向性，极大地提高其抗肿瘤免疫活性，展示了良好的临床应用价值。

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发明内容

本发明的目的是提供FGFR1-MIP3α/Fc融合蛋白在制备靶向抗乳腺癌药物中的用途。

本研究首先将前期成功制备FGFR1-MIP3α/Fc融合蛋白进行抗肿瘤作用观察。结果发现FGFR1-MIP3a Fc融合蛋白疫苗能明显抑制4T1小鼠乳腺癌的生长，肿瘤体积明显减小，小鼠体重和肿瘤重量明显减轻；单独FGFR1-Fc、MIP3α-Fc免疫治疗组具有一定程度的抗肿瘤作用但效果不如FGFR1-MIP3α组；同时实验过程中未发现明显毒副作用。

接着，对FGFR1-MIP3α/Fc融合蛋白抗肿瘤作用机制进行初步探讨。我们首先利用FGFR1抗体免疫荧光染色进行肿瘤组织特异性和血管靶向性观察，发现FGFR1-MIP3α/Fc和FGFR1-Fc两个治疗组均可以特异性识别肿瘤组织中的微血管，其它组织成份没有明显荧光信号；对照抗体则没将肿瘤微血管染色，说明我们制备的疫苗具有较高的肿瘤组织特异性和血管靶向性。同时，利用抗CD31免疫组化染色直接观察肿瘤组织微血管密度，结果显示FGFR1-MIP3α/Fc组微血管密度明显少于其他对照组。这些结果均说明重组FGFR1-MIP3α/Fc融合蛋白具有良好的肿瘤组织和新生血管靶向特异性，通过抑制肿瘤血管生成就可以达到治疗肿瘤目的。

本研究还发现，FGFR1-Fc和MIP3α-Fc单独治疗都表现一定程度的促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞增殖的作用，但是FGFR1-MIP3α/Fc融合蛋白组效果更佳，这些结果提示FGFR1-MIP3α/Fc融合蛋白抗肿瘤作用可能是通过抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡作用来实现。

为了进一步观察FGFR1-MIP3α/Fc融合蛋白是否具有DC趋化作用，我们通过流式细胞检测观察，结果发现FGFR1-MIP3α/Fc治疗组的CD11c和CD86双标阳性树突状细胞数量较对照组明显增多，说明所制备的疫苗具有一定程度的DC细胞趋化募集作用。此外，由于CD11c和CD86双标阳性是成熟DC细胞的表面分子标志物，因此这些成熟的DC细胞拥有更强的肿瘤抗原递呈能力，理应在提高抗肿瘤免疫活性方面发挥重要作用，具体机制尚待探讨。

综上所述，本研究利用基因工程技术将具有肿瘤靶向(FGFR1)、抗肿瘤血管生成(FGFR1)、促进免疫效应(MIP3a)以及增强抗原提呈作用(鼠源抗体Fc段)综合在一起构建核苷酸序列，从而编码得到一种具有特异性抗肿瘤作用的Fc融合蛋白FGFR1-MIP3α/Fc，制备出一种具有体内DC特性的疫苗。该Fc融合蛋白中各部分相互促进，从而协同发挥抗肿瘤作用，达到抑制肿瘤生长的效果；其抗肿瘤作用可能是通过抑制肿瘤血管生成和肿瘤细胞增殖，促进免疫效应和肿瘤细胞凋亡协同作用来实现的，具体作用机制尚待进一步深入探究。上述阶段性研究结果将为深入探讨靶向FGFR1的肿瘤生物治疗策略奠定基础。

说明书附图

图1为融合蛋白药物对小鼠乳腺癌细胞4T1肿瘤体积的影响；

图2为融合蛋白药物对小鼠乳腺癌细胞4T1动物体重的影响；

图3为FGFR1-MIP3α Fc融合蛋白对4T1小鼠肿瘤重量的影响；与NS对照组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；

图4为FGFR1-MIP3α/Fc融合蛋白肿瘤血管靶向性观察；其中A为FGFR1-MIP3α/Fc融合蛋白治疗组；B为FGFR1/Fc融合蛋白治疗组；C为MIP3α/Fc融合蛋白治疗组；D为生理盐水对照组；

图5为肿瘤组织微血管密度免疫组化观察；其中A为FGFR1-MIP3α/Fc融合蛋白治疗组；B为FGFR1/Fc融合蛋白治疗组；C为MIP3α/Fc融合蛋白治疗组；D为生理盐水对照组；E为各组肿瘤微血管密度统计分析图；

图6为肿瘤细胞凋亡指数检测统计分析图；

图7为肿瘤细胞增殖指数检测；其中A为FGFR1-MIP3α/Fc融合蛋白治疗组；B为FGFR1/Fc融合蛋白治疗组；C为MIP3α/Fc融合蛋白治疗组；D为生理盐水对照组；E为各组肿瘤微血管密度统计分析图；

图8为FGFR1-MIP3α/Fc融合蛋白体内DC趋化作用观察。

具体实施方式

下列实施例中所涉及的肿瘤细胞均为小鼠乳腺癌4T1细胞，所述的肿瘤组织均来自于小鼠4T1乳腺癌模型。

FGFR1/MIP3α-Fc、FGFR1-Fc、MIP3α-Fc重组融合蛋白的制备方法，参照如下论文：黄用豪，和永壮，张晓钿，方丹丹，陈艳，刘思汝，许仙花，郑少江，小鼠FGFR1/MIP3α-Fc融合基因真核表达载体的构建及表达[J]，中国热带医学,2017.4.18,(04)：340～343。

实施例1

一、材料方法与实验结果

1.1材料和方法

1.1.1材料

课题组前期制备的小鼠FGFR1/MIP3α-Fc、FGFR1-Fc、MIP3α-Fc重组融合蛋白4℃保存备用；弗氏完全佐剂(F5881)、弗氏不完全佐剂(F5506)均购自SIGMA公司；18-22g雄性BALB/c小鼠由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供(实验动物生产许可证：SCXK(湘)2016-0002)；小鼠乳腺癌4T1细胞实验室保种。

细胞培养瓶、冻存管、吸管、离心管、枪头、冻存盒、细胞培养板等耗材均购自Corning公司；DMEM培养基、胎牛血清(FCS)购自美国Gibico BRL公司；免抗小鼠PCNA抗体购自Santa Cruz公司。FGFR1单克隆抗体(大鼠抗小鼠)购自Santa Cruz公司；CD31抗体购自Abcam公司；PCNA抗体购自凯基生物公司；CD11c-PE、CD86-PE购自eBioscience公司；抗CD4、CD8和NK单克隆抗体(大鼠IgG)均购自美国ATCC。辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠、羊抗兔抗体购自Vector Laboratories公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG购自北京中山生物技术有限公司。生物素化山羊抗兔IgG、生物素化山羊抗大鼠IgG购自VectorLaboratories公司；DAB显色试剂盒购自Vector Laboratories公司；细胞凋亡测定试剂盒(In Situ Cell Death Detection Kit)购自Roche公司。羊抗兔和马抗鼠FITC抗体Ig G购自Sigma Chemical公司。

1.1.2方法

(1)细胞培养

①细胞复苏培养

取出在液氮保种的细胞迅速放入37℃的水浴锅中复温融化，在超净台中将冻存液转移置无菌15ml离心管，并加入3ml含有10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的DMEM轻柔吹洗数次，500rpm，5min离心后去上清，加入2ml培养基重悬，再转移置6孔板中，于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

②细胞传代培养

贴壁生长细胞传代：显微镜下观察细胞长满约90％后，弃除旧培养基，用PBS清洗2次，加入0.25％的胰酶，显微镜下观察细胞收缩变圆后，加入完全培养基终止消化，并轻柔吹打至细胞充分分散脱落，收集液体于无菌15ml离心管，800rpm，5min离心后弃上清，用完全培养基重悬细胞沉淀，吹打均匀后分皿培养。

(2)实验动物模型建立、疫苗的免疫方法

①构建小鼠乳腺癌肿瘤模型

收集培养好的小鼠4T1乳腺癌细胞液，将细胞液浓度调整为1×10⁷/ml，以每只0.1ml接种于小鼠右侧腋窝皮下。

②重组Fc融合蛋白配制

将适量抗原(重组Fc融合蛋白)直接与等体积溶剂乳化，乳化过程用注射器推住法。用两个注射器分别取抗原和弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂然后中间用橡皮管连好(首次免疫用弗氏完全佐剂，后面的免疫均用弗氏不完全佐剂)，确定注射器连接密闭后反复推送两端注射器，反复此操作30min，配置到所需浓度即可。

③分组与给药

待肿瘤长至100mm³时将32只动物随机分组，按照组别与给药方案将动物随机分组：FGFR1/MIP3α-Fc、FGFR1-Fc、MIP3α-Fc和生理盐水对照组，每组8只，瘤内注射，给药剂量(500ug/kg，100ul/20g)，三天一次，持续给药40天；使用游标卡尺测量瘤径的方法，动态观察动物给药过程和给药后的变化(活动，外观，精神，肿瘤增长，死亡等情况)，各实验组在给药前以及给药后均做血液检测，即首次给药前(第0周)和首次给药后的第2、4、6周均经小鼠尾静脉采集血液，在4℃环境静置2-4h后5000rpm，5min，收集上层血清，保存于-20℃以备用。在连续给药40天后，随即处死小鼠，手术剥取瘤块称重，并固定于10％福尔马林备用。

④融合蛋白与佐剂配制方法

本次实验中药物给药剂量为500ug/kg，融合蛋白浓度即为0.1mg/ml，给药体积为100ul/20g小鼠体重。配制时先用生理盐水稀释蛋白到0.2mg/ml的浓度，按与佐剂体积比例1:1来研磨，所得浓度为0.1mg/ml，按照100ul/20g瘤内注射。生理盐水佐剂组用1:1的生理盐水和佐剂研磨乳化，按照100ul/20g瘤内注射。

⑤肿瘤体积计算

将肿瘤细胞接种于皮下一周后，给药前每天用游标卡尺测量肿瘤的长和宽，按照公式：肿瘤体积(mm³)＝0.52×长×宽²计算，在肿瘤增长至100mm³后给药并每3天用游标卡尺测量肿瘤的长与宽。

(3)流式细胞术

①取新鲜肿瘤组织放于含少量PBS培养皿中，用剪刀将组织剪成匀浆状；

②加入10mlPBS，用吸管吸取组织匀浆，以300目尼龙网过滤到试管内；

③1000rpm离心5min，再用PBS洗3次，每次以800rpm、5min去除细胞碎片；

④70％冰乙醇固定细胞4℃过夜；

⑤1000rmp,3min离心去除上清后加CD86、CD11c一抗工作液室温孵育2h；

⑥1000rmp,3min离心去除上清；

⑦PBS洗3次，每次1000rmp，3min离心去除上清；

⑧避光条件下加入荧光二抗，室温孵育30min；

⑨1000rmp,3min离心去除上清；

⑩PBS洗3次，每次1000rmp，3min离心去除上清；

11最后一次清洗后加入200ulPBS重悬细胞，上流式细胞仪检测。

(4)免疫荧光

①取各组新鲜肿瘤组织做的冰冻切片用4％多聚甲醛固定30min后PBS清洗3次，每次2min；

②滴加5％BSA，室温封闭60min；

③弃去封闭液，滴加按抗体说明书稀释好的一抗(FGFR1)，放置湿盒内，4℃环境孵育过夜；

④PBS洗3次，每次5min；

⑤室温避光条件下，将带有荧光素染料偶联的二抗(红光)按说明书稀释成工作液后孵育样本1h，PBS洗3次，每次5min。

(5)免疫组化染色

肿瘤微血管密度(抗CD31)和增殖指数(抗PCNA)免疫组化检测参考我们前期经验【Zheng SP，etal.Eur J Cancer,2007,43(14):2134-2139】，取各组新鲜肿瘤组织做冰冻切片。具体方法按试剂盒操作说明进行如下：

①用4％多聚甲醛固定组织切片30min后PBS洗3次，每次5min；

②0.3％H₂O₂室温侵泡10min后PBS洗3次，每次5min；

③滴加PBS稀释好的山羊血清室温封闭1h；

④弃去封闭液，滴加一抗工作液，放置湿盒内，37℃温箱孵育2h后PBS洗3次，每次5min；

⑤滴加生物素标记的二抗工作液，放置湿盒内，37℃孵育30min后PBS洗3次，每次5min；

⑥滴加新鲜配制的DAB工作液，显微镜下监测染色程度；

⑦染色结束后，流水充分冲洗；

⑧苏木素复染5sec后迅速放入自来水充分冲洗，脱水、透明、封片。

(6)细胞凋亡检测

TUNEL检测采用Roche公司的In Situ Cell Death Detection Kit(AP)检测，基本步骤按试剂盒说明进行：

①将石蜡切片置于60℃孵箱中加温1小时后用二甲苯脱蜡2次，每次15min；然后依次用100％、100％、95％、80％、70％酒精各浸泡2min；蒸馏水洗涤2次，每次5min；室温干燥15min。

②PBS清洗切片5min，用滤纸吸干切片多余液体，滴加蛋白酶K溶液(10μg/ml)，37℃温箱内消化水解60min后PBS清洗3次，每次5min。

③滴加2％H₂O₂室温反应5min，PBS洗2次，每次5min。

④用滤纸小心吸去切片上组织周围多余液体，迅速在切片上滴加2滴TUNEL缓冲液，室温5min。

⑤弃去TUNEL缓冲液，迅速在切片上滴加50μl TUNEL反应混合液，置湿盒内于37℃孵育60min后PBS洗3次，每次5min。

⑥荧光显微镜下观察结果，激发光波长450～500nm，检测光波长515～565nm。

⑦用滤纸吸去切片周围液体，滴加50μl Converter-AP，置湿盒内于37℃孵育30min。

⑧PBS清洗切片3次，每次5min，用滤纸吸去切片周围液体，滴加50～100μl底物缓冲液(Fast Red，购自Sigma)，避光条件下室温孵育15min，之后PBS洗切片3次，每次5min。

⑨苏木素复染2min后迅速流水充分冲洗，二甲苯透明，中性树胶封片。

⑩光镜下观察并记录实验结果。对照设置：1、阳性对照：在滴加TUNEL反应混合液之前，加入DNaseI室温孵育10min以诱导DNA链断裂。2、阴性对照：滴加无末端转移酶的标记溶液替代TUNEL反应混合液。其余实验条件、染色方法和过程均与实验组相同。

(7)统计处理

实验结果均值用X±SD表示，计量资料采用Student’s T检验，小鼠生存率比较采用Long rank test分析；应用SPSS 17.0对结果进行统计分析。

1.2结果

1.2.1 FGFR1-MIP3α/Fc融合蛋白抗肿瘤作用观察

我们建立4T1乳腺癌模型，通过生长曲线、肿瘤体积、瘤重等指标进行抗肿瘤作用观察。结果发现FGFR1-MIP3α融合蛋白作为疫苗(单独FGFR1-Fc、MIP3α-Fc和生理盐水NS作为对照)可以有效治疗肿瘤，明显抑制肿瘤生长，肿瘤体积明显减小(图1)，小鼠体重(图2)和肿瘤重量(图3)明显减轻；单独FGFR1-Fc、MIP3α-Fc免疫治疗组具有一定的抗肿瘤作用但效果不如FGFR1-MIP3α组。

1.2.2 FGFR1-MIP3α/Fc融合蛋白抗肿瘤作用机制研究

(1)FGFR1-MIP3α/Fc作为疫苗具有肿瘤组织特异性和血管靶向性

免疫荧光染色(FGFR1抗体)发现，FGFR1-MIP3α/Fc(图4-A)和FGFR1-Fc(图4-B)两个治疗组均可以特异性识别肿瘤组织中的微血管(肿瘤微血管表面见红色荧光信号沉积)，其它组织成份没有明显荧光信号；对照抗体则没将肿瘤微血管染色(图4-C和D)，说明我们制备的疫苗具有较高的肿瘤组织特异性和血管靶向性。

(2)FGFR1-MIP3α-Fc作为疫苗具有抑制肿瘤血管生成作用

肿瘤组织冰冻切片微血管密度检测(免疫组化CD31)，结果显示各组微血管密度分别为FGFR1-MIP3α/Fc组11.5±1.51(图5-A)、FGFR1-Fc组17.2±1.03(图5-B)、MIP3a-Fc组29.5±2.46(图6-C)、NS组43.6±2.29(图5-D)，FGFR1-MIP3α/Fc组微血管密度明显少于其他对照组(图5-E)。

(3)FGFR1-MIP3α/Fc治疗促进肿瘤细胞凋亡

TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡情况。结果发现各组凋亡指数为26.5±2.84(FGFR1-MIP3α/Fc)、17.3±1.25(FGFR1-Fc)、13.9±2.02(MIP3a-Fc)、8.1±0.94(NS)，FGFR1-MIP3α/Fc组凋亡指数明显高于其他对照组(P＜0.05)。FGFR1-Fc和MIP3α-Fc单独治疗都表现一定程度促进肿瘤细胞凋亡作用(图6)。

(4)FGFR1-MIP3α/Fc治疗抑制肿瘤细胞增殖

抗PCNA抗体免疫组化方法检测肿瘤细胞增殖情况。结果发现，FGFR1-MIP3α/Fc组的增殖指数(图7A-D)明显低于其他对照组(P＜0.05)，各组的增殖指数分别为11.6±1.26(FGFR1-MIP3α/Fc)、16.5±1.43(FGFR1-Fc)、21.7±1.49(MIP3a-Fc)、30.8±3.52(NS)。FGFR1-Fc和MIP3α-Fc单独治疗均显示出一定程度的抑制肿瘤细胞增殖的作用(图7E)。

(5)FGFR1-MIP3α/Fc作为疫苗具有一定的DC趋化募集作用

流式细胞检测显示，FGFR1-MIP3α/Fc治疗组的树突状细胞(CD11c和CD86双标)数量较对照组明显增多；各组树突状细胞数量分别为FGFR1-MIP3α/Fc(91.27％)、FGFR1-Fc(33.75％)、MIP3α-Fc(71.35％)和生理盐水对照组(23.13％)(图8)。

二、结论

1.FGFR1-MIP3a Fc融合蛋白疫苗能明显抑制小鼠肿瘤生长的作用；

2.FGFR1-MIP3a Fc融合蛋白具有抑制肿瘤血管生成作用；

3.FGFR1-MIP3a Fc融合蛋白具有一定程度的DC趋化募集作用；

4.FGFR1-MIP3a Fc融合蛋白抗肿瘤作用可能是通过抑制肿瘤血管生成和肿瘤细胞增殖、促进免疫效应和肿瘤细胞凋亡协同作用来实现的。

Claims (1)

1.FGFR1-MIP3α/Fc融合蛋白在制备靶向抗乳腺癌药物中的用途。