CN104593508A - 黄瓜6号染色体探针的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了黄瓜6号染色体探针制备的方法和应用。它是基于黄瓜基因组序列，通过RepeatMasker软件和黄瓜基因组数据库BLAST分析选取不含重复序列的DNA序列，利用Primer Premier 5.0软件进行引物设计。通过PCR扩增获得覆盖单染色体的PCR产物，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳纯化，利用核酸浓度测量仪测定浓度后，将每对引物等量的产物进行混池，并用缺刻平移法标记探针，并利用荧光原位杂交技术杂交到染色体制片上，完成单染色体探针的制备和检测应用。通过应用此方法，可以快速获得黄瓜单染色体或者任何染色体区段的探针，可对单染色体或任何染色体的形态结构进行精确的分析研究。

Description

黄瓜6号染色体探针的制备方法及应用

一、技术领域

本发明公开了利用黄瓜基因组序列制备6号染色体探针的方法，有利于促进黄瓜单染色体探针在研究中的应用，属于植物生物技术领域。

二、技术背景

黄瓜(Cucumis sativus L.，2n＝2x＝14)是世界上最重要的蔬菜作物之一。黄瓜染色体数目少，仅为14条，使得其成为近年来分子细胞遗传学研究的模式物种之一。同时，2009年中国和美国的研究机构完成了对黄瓜基因组的测序，测序结果显示黄瓜的基因组相对较小，约为370Mb，并且测序结果已经经过不断地修正完善，目前的测序数据已相当准确，可以直接参考利用。

细胞遗传相关的研究需要对染色体进行分析，得特定染色体的探针可为染色体的结构分析、染色体异常的诊断、染色体重排、染色体比较分析等各个相关研究提供有力的手段，染色体探针目前已在染色体方面的研究得到广泛利用。因此，成功制备个体染色体的探针能够有效地推动细胞遗传相关的研究进程。

迄今，有关单染色体探针的制备方法主要为染色体显微分离技术，这种方法主要是根据染色体的形态差异通过机械方法进行个体染色体或染色体臂的分离，获得的个体染色体或染色体臂再通过随机扩增的方法获得足够量的DNA，这些特定染色体的DNA集合作为染色体的探针进一步用于相关研究。在人类和动物中，基于染色体显微分离方法的制备的探针已经在染色体相关研究中广泛应用^[1]。

然而，基于染色体显微分离制备探针的方法在植物中较难开展，其主要原因是植物染色体上分散着大量的重复序列，任何一条这种方法分离到的染色体探针在进行原位杂交分析时均会在所有染色体上产生大量的背景杂信号，从而无法对该特定染色体进行有效的研究与分析。在植物中，基于大片段插入DNA克隆[例如细菌人工染色体(BAC)或酵母人工染色体(YAC)]的染色体探针代替使用显微分离的染色体探针已得到开发利用。覆盖整条染色体或染色体区段的BAC克隆集合已经利用在茄属的染色体进化研究上^[2]。然而，利用这种方法制备单染色体探针首先需要利用连续分布的分子标记筛选获得连续排列的BAC克隆，同时需要利用荧光原位杂交(Fluorescence in situ Hybridization，FISH)技术筛选出不含重复序列的连续的BAC克隆。由于BAC克隆通常含有50kb-100kb或更大的基因组插入，在植物中筛选获得不含有重复序列的BAC克隆是一项费时、繁琐的工作。此外，BAC克隆的繁殖培养、质粒DNA的制备也需要大量的人力和时间，因此在植物中很难得到广泛的应用推广^[3]。最近在哺乳动物和果蝇细胞染色体研究中使用复杂的核苷酸文库进行特异性区域探针的制备，然而它们在高等植物中的应用还有待验证^[3，4]。

目前，黄瓜的基因组序列已经比较完善，本发明提出利用黄瓜基因组序列进行单染色体探针的制备和应用。根据黄瓜的基因组序列，每隔约100kb选取一段序列，通过RepeatMasker软件和黄瓜基因组数据库BLAST分析，筛选出不含重复序列的DNA序列，进行引物设计，通过PCR扩增与切胶回收，最终对覆盖单条染色体的PCR产物进行混池，并用相应的荧光素标记后进行荧光原位杂交，制备出单条染色体探针并用于细胞学分析。这种技术方法避免了利用显微分离法获得单染色体探针时重复序列的干扰、和利用BAC文库制备单染色体探针的繁杂性，仅利用简便的PCR方法快速获得覆盖整条染色体的探针，可有效地用于黄瓜染色体的结构分析，染色体的进化等相关研究。该方法也可用于任何已经有基因组序列物种的单染色体或染色体区段的探针制备，有利于加速高等植物细胞遗传学研究的进展。

三、发明内容

(一)技术问题

本发明针对以往利用显微分离单染色体或基于BAC文库制备单染色体探针方法的繁琐和不足，发明了一种通过基因组特定序列制备黄瓜单染色体探针的方法，为染色体探针制备提供了新的方法，加快了染色体探针的发展及应用。

(二)技术方案

本发明提供的利用黄瓜基因组序列制备单染色体探针的方法的特征在于：通过黄瓜不含重复序列的DNA测序序列，经过快速的PCR扩增，获得覆盖单染色体的PCR产物，即可制备有效可用的探针。

上述利用黄瓜基因组序列制备染色体探针，通过以下方法获得：

(1)从黄瓜基因组数据库(http：//www.icugi.org)获取黄瓜全基因组序列，中间隔～100kb选取一段序列，通过RepeatMasker软件和BLAST分析进行重复序列比对，筛选出不含重复序列的序列。

(2)将得到的序列用Primer Premier 5.0软件进行引物设计，设定所有的引物符合退火温度在55-65℃，GC含量在40-60％，扩增产物在2500bp-4000bp，所有引物的扩增可以利用同一个PCR反应程序进行，保证了操作的简便性。

(3)将设计获得的引物进行PCR扩增，然后将产物用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测并利用试剂盒进行回收。将回收得到的产物利用核酸浓度测量仪测出浓度。

(4)按比例将每对引物的产物进行混池，然后采用缺刻平移法标探针，具体根据探针标记试剂盒说明，用Digoxigenin-11-dUTP(购自Roche公司)将混池产物标上探针，备用。

(5)探针的利用是基于荧光原位杂交在黄瓜的粗线期染色体上进行。摘取黄瓜幼小的雄花花蕾，在E∶G(3∶1)固定液中保存。在体视显微镜下解剖出处于粗线期的花药并利用纤维素酶和果胶酶进行酶解。利用荧光原位杂交技术将标记好的探针杂交到染色体上。经过37℃过夜杂交后进行洗片，在荧光显微镜下观察探针的杂交结果。

(三)有益效果

本发明与现有技术相比，具有如下优点和积极效果：

(1)本发明直接利用基因组任何序列进行分析，快速获得不含重复序列的区段，避免了利用显微分离技术和BAC克隆技术制备染色体探针的繁琐性以及重复序列的干扰。

(2)本发明在设计引物时通过退火温度和GC含量的设定，使所有的引物可以在同一个PCR反应程序下进行，可保证快速获得覆盖单染色体或任何区段的探针。

(3)本发明将所有的PCR产物混合形成一个混池，进行FISH探针的标记，对于任何一条染色体或染色体区段，直接进行一次标记即可，而BAC克隆制备单染色体需要对单个BAC克隆进行荧光原位杂交筛选可用的克隆。因此本发明基于基因组序列进行PCR制备探针的方法体现了经济、简便、高效的特点。

四、附图说明

图1：引物PCR扩增检测结果。图2：黄瓜中期染色体探针混池的FISH结果。图3：黄瓜粗线期染色体80000bp-150000bp约7Mb的探针混池的FISH结果。

五、具体实施方式

(1)从黄瓜基因组序列中隔～100kb挑选部分序列，使用RepeatMasker软件筛选(http：//www.repeatmasker.org)和BLAST分析进行重复序列比对，筛选出不含重复序列的序列。

(2)利用Primer Premier 5.0软件进行引物设计，引物长度设置为～20bp，Tm值设置为55-65℃，GC比例设置为40-60％，PCR产物长度设置为2500-4000bp。选取Rating值在75以上且不含发卡结构、二聚体结构、错配及二聚体结构交叉的引物进行重复序列比对和BLAST分析，筛选出不含重复序列的理想可用引物。

(3)以黄瓜基因组DNA为模板，按照PCR体系进行扩增。PCR反应体系：

5×buffer：4ul

dNTP：1.6ul

DNA：1.2ul

Prime Star：0.6ul

dd water：12ul

Sense Primer：0.4ul

Anti-sense Primer：0.4ul

PCR程序如下：98℃变性10秒；60℃复性15秒；68℃延伸4分钟；循环数为40，循环结束后68℃延伸10分钟，使产物延伸完整；最后4℃保存。

反应所用的酶为Prime Star GXL高保真长片段PCR用DNA聚合酶(购自Takara公司)。然后将PCR反应产物全部加到0.8％的琼脂糖凝胶中电泳检测并切取不同引物的目标片段。根据试剂盒的要求进行回收，切胶产物用核酸浓度测定仪进行浓度测定，得到不同引物产物的浓度。

(4)根据测定浓度按比例将切胶产物进行混池。然后采用缺刻平移法标探针，具体根据探针标记试剂盒说明，用Digoxigenin-11-dUTP(购自Roche公司)将混池产物标上探针，备用。

(5)在黄瓜植株上取大小适当的花药，放入体积比为3∶1的E∶G(乙醇∶冰醋酸)固定液中至少24h。利用4％纤维素酶和2％果胶酶于37℃酶解花药，将酶解好的花药固定于体积比为3∶1的M∶G(甲醇∶冰醋酸)固定液中备用。选取酶解好的花药于10ul60％的醋酸溶液中，取适量涂于载玻片上，用吸耳球吹干水分。

(6)制备杂交混合液(含有标记好的探针、50％去离子甲酰胺，2×SSC，10％硫酸葡聚糖)，体系为20ul。将探针杂交混合液于90℃变性6min，冰浴10min；载玻片于80℃的70％去离子甲酰胺中变性1min30s，以70％、90％、100％系列冰乙醇脱水各5min，晾干，将变性的探针杂交液滴于变性后的玻片上，封片，置杂交盒37℃杂交过夜。

(7)将杂交后的片子放入2×SSC溶液中浸泡至封片脱落，放入2×SSC中，摇床震荡洗涤10min，转入42℃的2×SSC中洗涤15min，再放入2×SSC中洗涤10min，1×TNT洗涤10min，取出后直接滴加罗丹明偶联的抗地高辛抗体(购自Roche公司)，于37℃温育40min，使信号放大。

(8)信号的检测：在室温风干的制片上加入含有抗荧光淬灭剂的DAPI，盖玻片封片后，染色体制片在避光的条件下，用Olympus BX60荧光显微镜观察杂交信号。

参考文献：

[1]Chuanliang Deng，LIli Bai，Shulan Fu，et al.，Microdissection and Chromosome Painting of theAlien Chromosome in an Addition Line of Wheat-Thinopyrum intermedium[J].PLOSONE，2013，DOI：10.1371/joumal.pone.0072564.

[2]Dora Szinay，Erik Wijnker，Ronald van den Berg，et al.，Chromosome evolution in Solanumtraced by cross-species BAC-FISH[J].New Phytologist(2012)195：688-698.

[3]Lou QF，Zhang YX，He YH，et al.，Single copy gene-based chromosome painting in cucumberand its application for chromosome rearrangement analysis in Cucumis[J].The Plant Journal，2014.DOI：10.1111/tpj.12453.

[4]Shelagh Boyle，Matthew J.Rodesch，Heather A.Halvensleben，et al.，Fluorescence in situhybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated bymassively parallel synthesis[J].Chromosome Res(2011)19：901-909.

Claims (3)

1.黄瓜6号染色体探针的制备方法及应用，其特征在于：

利用黄瓜基因组数据，经分析去除重复序列后获得平均分布于染色体上的特定DNA序列，通过PCR扩增快速获得覆盖单染色体的DNA产物，进行探针制备，并用于染色体的荧光原位杂交分析。

2.根据权利要求1所述的利用黄瓜基因组数据进行染色体探针制备，是通过以下方法获得的：

(1)从黄瓜基因组序列中每隔约100kb选取一段序列，进行重复序列及染色体比对，筛选出不含重复序列的DNA区段，将得到的序列用Primer Premier 5.0软件进行引物设计。

(2)将设计获得的引物进行PCR扩增，然后将产物用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测并利用试剂盒进行回收。将回收得到的产物利用核酸浓度测量仪测出浓度。

(3)按比例将每对引物的产物进行混池，然后采用缺刻平移法标记荧光探针，利用荧光原位杂交技术检测探针的效果。

3.根据权利要求1和2所述的利用黄瓜基因组序列获得的染色体探针，可清晰地检测黄瓜染色体制片中任何单染色体或染色体区段的形态和结构特征，没有其它背景的干扰。