CN106701916A - 棉花体细胞染色体Oligo‑FISH方法 - Google Patents

棉花体细胞染色体Oligo‑FISH方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种棉花体细胞染色体Oligo‑FISH方法，与现有技术相比，本发明根据公布的棉花基因组序列信息，设计单染色体的寡核苷酸混合池，寡核苷酸混合池经过乳化PCR扩增、体外转录、反转录，获得荧光标记的ssDNA混合池，即目标染色体的寡核苷酸混合探针。以此探针对棉花体细胞中期染色体进行荧光原位杂交(FISH)，建立棉花寡核苷酸FISH方法(Oligo‑FISH)，为棉花染色体DNA重排、染色体配对、亲缘关系分析、异源染色质鉴定等提供技术支持。

Description

棉花体细胞染色体Oligo-FISH方法
技术领域
本发明属于生物信息学及分子细胞遗传学领域，尤其涉及一种棉花体细胞染色体Oligo-FISH方法。
背景技术
染色体涂染技术是细胞遗传学研究领域的关键技术之一，是准确识别和区分染色体及其区段的重要手段。探针的选择是染色体涂染技术应用的关键环节。典型的涂染探针多来自于克隆的基因组片段或流式分拣的染色体，经过缺刻平移或者PCR扩增直接或间接荧光标记。标记后的探针长度多在150～250bp，这样在杂交过程中易于渗透到固定的细胞。由于许多基因组克隆和流式分拣的染色体富含基因组重复序列，杂交过程通常需要使用未标记的基因组重复序列(Cot1DNA)进行封阻。染色体上顺序排列的克隆混合成的探针也可以用来涂染较大的染色体区域，但这种方法通常都具有挑战性，因为杂交之前每个克隆需要分别进行DNA提取与标记，这些探针的效率由于随机标记和片段化的原因稳定性难以保障，在复杂植物基因组中的应用更表现了很大局限性，因此多在基因组相对较小、复杂度低的植物物种中应用。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种棉花体细胞染色体Oligo-FISH方法。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
本发明设计oligos的基因组是二倍体D基因组野生种雷蒙德氏棉G.raimondii(D5)基因组(Paterson et al.2012)；原位杂交所用棉花材料为二倍体D基因组雷蒙德氏棉G.raimondii(D5)，种植于海南三亚中国农业科学院棉花研究所海南野生棉花种植园，并且在河南安阳中国农业科学院棉花研究所温室有备份；具体方法包括雷蒙德氏棉第1号染色体的寡核苷酸混合池设计和寡核酸探针的标记；
所述雷蒙德氏棉第1号染色体的寡核苷酸混合池设计包括以下步骤：
(1)用RepeatMasker系统去除雷蒙德氏棉基因组第1号染色体序列中所有重复序列；
(2)去重复的染色体序列分成含有48个碱基的寡核苷酸片段(每个片段间步移5个碱基)；
(3)获得的寡核苷酸片段通过BLAT系统与D5参考基因组进行匹配；
(4)利用Primer3(Untergasser et al.2012)来计算Tm值和发卡Tm值，留下dTm(dTm＝Tm–发卡Tm)值大于10℃的寡核苷酸序列；
(5)利用Python和R系统识别并排除非单一序列，获得染色体特异、基因组中唯一的序列组成该染色体寡核苷酸混合池；
所述寡核酸探针的标记包括以下步骤：
1)乳化PCR，以合成的寡核苷酸序列为模板进行乳化PCR扩增，扩增程序：98℃2min；接着30个循环的98℃15s，56℃30s，72℃30s；最后延伸72℃5s；
2)体外转录，扩增产物作为模版进行体外(T7)转录；
3)反转录，体外转录获得的RNA用新的5’端带有生物素或地高辛标记的R引物进行反转录；
4)酶解去除RNA；获得带标记的单链ssDNA分子，即标记好的寡核苷酸探针；1.2.3Oligo-FISH
5)取材及预处理：取种子在温水中浸泡过夜，种植于灭菌潮湿的沙土中，然后在光照培养箱里28～30℃培养，待根长至1～2cm时，截取根尖用25ppm放线菌酮25℃下处理2h，然后用蒸馏水冲洗，用卡诺固定液固定24h以上，备用；
6)酶解：取出固定好的根尖，用蒸馏水冲洗数次，混合酶液(2％纤维素酶+1％果胶酶)处理，37℃，45min；
7)制片：用60％乙酸进行压片，保留下好的制片在-80℃冷冻4h以上；-80℃取出，迅速揭掉盖片，80℃烤干，4℃保存备用；
8)荧光原位杂交流程，参照王春英等(2001)介绍的方法；地高辛标记的探针在荧光显微镜下观察显示红色；生物素标记在荧光显微镜下观察显示为绿色；染色体用DAPI衬染在荧光显微镜下观察显示蓝色；
9)荧光显微镜观察：用Zeiss荧光显微镜观察荧光信号，用Zeiss-Isis成像系统软件进行荧光原位杂交图像的获取、采集、加工。
具体的，所述步骤1)中每个寡核苷酸合成的oligo含有48个基因组序列碱基，5’F引物，包括T7RNA多聚酶启动子序列和3’R引物；通过乳化PCR的方法进行扩增。
本发明的有益效果在于：
本发明是一种棉花体细胞染色体Oligo-FISH方法，与现有技术相比，本发明根据公布的棉花基因组序列信息，设计单染色体的寡核苷酸混合池，寡核苷酸混合池经过乳化PCR扩增、体外转录、反转录，获得荧光标记的ssDNA混合池，即目标染色体的寡核苷酸混合探针。以此探针对棉花体细胞中期染色体进行荧光原位杂交(FISH)，建立棉花寡核苷酸FISH方法(Oligo-FISH)，为棉花染色体DNA重排、染色体配对、亲缘关系分析、异源染色质鉴定等提供技术支持。
附图说明
图1乳化PCR产物和标记探针的电泳检测。a-1，对照1(空白)；a-2，对照2(非乳化PCR产物)；a-3，乳化PCR产物；b-1，标记的探针。
图2雷蒙德氏棉有丝分裂中期染色体Oligo-FISH。a，DAPI衬染；b，生物素标记的45S rDNA信号；c，地高辛标记的oligos探针信号；d，整合图片；a和d中白色箭头指示的为D501染色体。Bar＝5μm。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步说明：
如图1所示：本发明设计oligos的基因组是二倍体D基因组野生种雷蒙德氏棉G.raimondii(D5)基因组(Paterson et al.2012)；原位杂交所用棉花材料为二倍体D基因组雷蒙德氏棉G.raimondii(D5)，种植于海南三亚中国农业科学院棉花研究所海南野生棉花种植园，并且在河南安阳中国农业科学院棉花研究所温室有备份；具体方法包括雷蒙德氏棉第1号染色体的寡核苷酸混合池设计和寡核酸探针的标记；
所述雷蒙德氏棉第1号染色体的寡核苷酸混合池设计包括以下步骤：
(1)用RepeatMasker系统去除雷蒙德氏棉基因组第1号染色体序列中所有重复序列；
(2)去重复的染色体序列分成含有48个碱基的寡核苷酸片段(每个片段间步移5个碱基)；
(3)获得的寡核苷酸片段通过BLAT系统与D5参考基因组进行匹配；
(4)利用Primer3(Untergasser et al.2012)来计算Tm值和发卡Tm值，留下dTm(dTm＝Tm–发卡Tm)值大于10℃的寡核苷酸序列；
(5)利用Python和R系统识别并排除非单一序列，获得染色体特异、基因组中唯一的序列组成该染色体寡核苷酸混合池；
所述寡核酸探针的标记包括以下步骤：
1)乳化PCR，以合成的寡核苷酸序列为模板进行乳化PCR扩增，扩增程序：98℃2min；接着30个循环的98℃15s，56℃30s，72℃30s；最后延伸72℃5s；
2)体外转录，扩增产物作为模版进行体外(T7)转录；
3)反转录，体外转录获得的RNA用新的5’端带有生物素或地高辛标记的R引物进行反转录；
4)酶解去除RNA；获得带标记的单链ssDNA分子，即标记好的寡核苷酸探针；1.2.3Oligo-FISH
5)取材及预处理：取种子在温水中浸泡过夜，种植于灭菌潮湿的沙土中，然后在光照培养箱里28～30℃培养，待根长至1～2cm时，截取根尖用25ppm放线菌酮25℃下处理2h，然后用蒸馏水冲洗，用卡诺固定液固定24h以上，备用；
6)酶解：取出固定好的根尖，用蒸馏水冲洗数次，混合酶液(2％纤维素酶+1％果胶酶)处理，37℃，45min；
7)制片：用60％乙酸进行压片，保留下好的制片在-80℃冷冻4h以上；-80℃取出，迅速揭掉盖片，80℃烤干，4℃保存备用；
8)荧光原位杂交流程，参照王春英等(2001)介绍的方法；地高辛标记的探针在荧光显微镜下观察显示红色；生物素标记在荧光显微镜下观察显示为绿色；染色体用DAPI衬染在荧光显微镜下观察显示蓝色；
9)荧光显微镜观察：用Zeiss荧光显微镜观察荧光信号，用Zeiss-Isis成像系统软件进行荧光原位杂交图像的获取、采集、加工。
具体的，所述步骤1)中每个寡核苷酸合成的oligo含有48个基因组序列碱基，5’F引物，包括T7RNA多聚酶启动子序列和3’R引物；通过乳化PCR的方法进行扩增。
实验结果
通过RepeatMaster软件先去除该染色体上的重复序列，然后根据oligo的长度、序列相似性、Tm值等的选择，去除不符合要求的序列，保留染色体特异、序列唯一的该染色体oligos。我们得到的D501染色体oligos有19,786个，根据基因组数据，该染色体长度62,769,430bp，因此可以计算在染色体的密度是每kb有0.315个oligos。
通过乳化PCR方法扩增所设计的oligos，使之大量扩增(图1a-3)，对照1(空白)没有扩增出条带(图1a-1)，对照2(非乳化PCR)扩增出非乳化PCR产物(图1a-2)。反转录引物带有生物素或地高辛标记，所以去除RNA后的单链DNA可以作为探针，片段大小在68bp左右(图1b-1)，直接作为探针进行FISH研究。
以雷蒙德氏棉体细胞有丝分裂中期染色体为靶DNA，生物素标记的45S rDNA和地高辛标记的雷蒙德氏棉D501染色体oligos为探针，进行了双色荧光原位杂交。所设计和标记的探针在雷蒙德氏棉有丝分裂中期染色体上产生1对特异的弥散信号，实现D501染色体的准确识别(图2)。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (2)

1.一种棉花体细胞染色体Oligo-FISH方法，其特征在于：设计oligos的基因组是二倍体D基因组野生种雷蒙德氏棉G.raimondii(D5)基因组(Paterson et al.2012)；原位杂交所用棉花材料为二倍体D基因组雷蒙德氏棉G.raimondii(D5)，种植于海南三亚中国农业科学院棉花研究所海南野生棉花种植园，并且在河南安阳中国农业科学院棉花研究所温室有备份；具体方法包括雷蒙德氏棉第1号染色体的寡核苷酸混合池设计和寡核酸探针的标记；
所述雷蒙德氏棉第1号染色体的寡核苷酸混合池设计包括以下步骤：
(1)用RepeatMasker系统去除雷蒙德氏棉基因组第1号染色体序列中所有重复序列；
(2)去重复的染色体序列分成含有48个碱基的寡核苷酸片段(每个片段间步移5个碱基)；
(3)获得的寡核苷酸片段通过BLAT系统与D5参考基因组进行匹配；
(4)利用Primer3(Untergasser et al.2012)来计算Tm值和发卡Tm值，留下dTm(dTm＝Tm–发卡Tm)值大于10℃的寡核苷酸序列；
(5)利用Python和R系统识别并排除非单一序列，获得染色体特异、基因组中唯一的序列组成该染色体寡核苷酸混合池；
所述寡核酸探针的标记包括以下步骤：
1)乳化PCR，以合成的寡核苷酸序列为模板进行乳化PCR扩增，扩增程序：98℃2min；接着30个循环的98℃15s，56℃30s，72℃30s；最后延伸72℃5s；
2)体外转录，扩增产物作为模版进行体外(T7)转录；
3)反转录，体外转录获得的RNA用新的5’端带有生物素或地高辛标记的R引物进行反转录；
4)酶解去除RNA；获得带标记的单链ssDNA分子，即标记好的寡核苷酸探针；1.2.3Oligo-FISH
5)取材及预处理：取种子在温水中浸泡过夜，种植于灭菌潮湿的沙土中，然后在光照培养箱里28～30℃培养，待根长至1～2cm时，截取根尖用25ppm放线菌酮25℃下处理2h，然后用蒸馏水冲洗，用卡诺固定液固定24h以上，备用；
6)酶解：取出固定好的根尖，用蒸馏水冲洗数次，混合酶液(2％纤维素酶+1％果胶酶)处理，37℃，45min；
7)制片：用60％乙酸进行压片，保留下好的制片在-80℃冷冻4h以上；-80℃取出，迅速揭掉盖片，80℃烤干，4℃保存备用；
8)荧光原位杂交流程，参照王春英等(2001)介绍的方法；地高辛标记的探针在荧光显微镜下观察显示红色；生物素标记在荧光显微镜下观察显示为绿色；染色体用DAPI衬染在荧光显微镜下观察显示蓝色；
9)荧光显微镜观察：用Zeiss荧光显微镜观察荧光信号，用Zeiss-Isis成像系统软件进行荧光原位杂交图像的获取、采集、加工。
2.根据权利要求1所述的棉花体细胞染色体Oligo-FISH方法，其特征在于：所述步骤1)中每个寡核苷酸合成的oligo含有48个基因组序列碱基，5’F引物，包括T7RNA多聚酶启动子序列和3’R引物；通过乳化PCR的方法进行扩增。
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