CN107058492A - 一种鉴定裸鼹鼠线粒体细胞色素b基因的限制性片段多态性的方法及试剂盒 - Google Patents

一种鉴定裸鼹鼠线粒体细胞色素b基因的限制性片段多态性的方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种鉴定裸鼹鼠线粒体细胞色素b基因的限制性片段多态性的方法及试剂盒。本发明首次建立裸鼹鼠的线粒体细胞色素b基因DNA序列的限制性片段多态性，作为裸鼹鼠特定的DNA指纹，可用于裸鼹鼠的物种鉴定。

Description

一种鉴定裸鼹鼠线粒体细胞色素b基因的限制性片段多态性 的方法及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术检测领域，具体涉及裸鼹鼠的物种鉴定方法，特别是一种鉴定裸鼹鼠线粒体细胞色素b基因DNA序列限制性片段多态性的方法。
背景技术
裸鼹鼠属于啮齿目，滨鼠科，裸鼹鼠属，裸鼹鼠种，原产于非洲东部，营蜜蜂式的真社会性生活。此外，裸鼹鼠具有诸多特殊特性，包括对某些疼痛刺激耐受、抗肿瘤能力强、寿命为普通啮齿类的7倍、耐低氧以及骨骼维稳能力强等特殊优势，因此，作为一种新型实验动物，近年来裸鼹鼠得到国际上的广泛重视。目前已有很多实验室针对裸鼹鼠的抗肿瘤、长寿、耐低氧等特性进行分子生物学水平的研究，而裸鼹鼠的细胞及组织是研究的重要实验材料。各个实验室可能进行裸鼹鼠与其他物种的类比研究，在实验过程中有可能由于疏忽或者储存时间过长将不同物种的细胞或组织混淆，导致大批样本的浪费，因此，使用本发明的方法对组织或细胞进行鉴定，可避免不必要的损失。
动物线粒体DNA(mtDNA)具有分子量小、结构简单、易于提取、基因排列紧凑、无内含子、母系遗传等特点，是研究动物起源进化及遗传分析的有力工具。其中，线粒体蛋白质编码基因中的细胞色素b基因在分子系统解析中用得最多。目前，对于人类、猴、犬、猪、小鼠、大鼠等物种的线粒体色素b基因的限制性片段多态性都已明确，但作为一种新型实验动物裸鼹鼠的线粒体色素b基因的限制性片段多态性还未见报道。该多态性相当于相应物种的指纹，具有物种特异性。
因此，研究新型实验动物裸鼹鼠的线粒体色素b基因的限制性片段多态性具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于服现有技术的不足，提供了一种鉴定裸鼹鼠线粒体细胞色素b基因的限制性片段多态性的方法。本发明研究了裸鼹鼠的线粒体细胞色素b基因DNA序列的限制性片段多态性，建立了裸鼹鼠的物种鉴定方法。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：
本发明的一种鉴定裸鼹鼠线粒体细胞色素b基因的限制性片段多态性的方法，包括：
(a)提取基因组DNA；
(b)扩增线粒体色素b基因：以步骤(a)提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获取扩增产物；
扩增线粒体细胞色素b基因的引物序列如下：，
正向引物MtDNA-F：CCATCCAACATCTCCGCATGATGAAA，如SEQ ID NO:1所示；
反向引物MtDNA-R：CCCCTCAGAATGATATTTGGCCTCA，如SEQ ID NO:2所示；
(c)使用6种限制性内切酶对步骤(b)中获取的扩增产物进行酶切，获取相应的酶切产物；其中，所述6种限制性内切酶为AluⅠ、HinfⅠ、HaeⅢ、TaqⅠ、RsaⅠ以及MboⅠ，酶切时间和温度见表1.
(d)将酶切产物采用3％的琼脂糖凝胶进行电泳，若线粒体细胞色素b基因DNA序列的多态性片段大小bp如下所示，即鉴定该物种为裸鼹鼠；
AluⅠ：358
HinfⅠ：311、47
HaeⅢ：225、111、22
TaqⅠ：228、130
RsaⅠ：238、88、32
MboⅠ：213、114、31。
进一步的，所述步骤b中的PCR扩增，条件如下：PCR试剂盒为2×Pfu PCRMasterMix，反应体系为30μl，各组分的终浓度为：0.05U Pfu Taq Polymerase/μl，250μMdNTP，50mM KCl，1.5mM MgCl2，特异性引物0.2μM，0.5μl DNA模板；PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。
进一步的，所述步骤(c)中6种限制性内切酶的酶切时间和温度分别为：AluⅠ：1h，37℃；HinfⅠ：1h，37℃；HaeⅢ：1h，37℃；TaqⅠ：1h，65℃；RsaⅠ：1h，37℃；MboⅠ：1h，37℃。本发明的第二目的在于提供一种用于鉴定裸鼹鼠线粒体细胞色素b基因的试剂盒，包括：
(a)扩增线粒体色素b基因的引物，序列如下：
正向引物MtDNA-F：CCATCCAACATCTCCGCATGATGAAA；
反向引物MtDNA-R：CCCCTCAGAATGATATTTGGCCTCA；
(b)识别线粒体细胞色素b基因多态性位点的6种限制性内切酶：AluⅠ、HinfⅠ、HaeⅢ、TaqⅠ、RsaⅠ以及MboⅠ；其中，裸鼹鼠的线粒体细胞色素b基因DNA序列的多态性片段大小bp如下所示：
AluⅠ：358
HinfⅠ：311、47
HaeⅢ：225、111、22
TaqⅠ：228、130
RsaⅠ：238、88、32
MboⅠ：213、114、31。
本发明首次建立裸鼹鼠的线粒体细胞色素b基因DNA序列的限制性片段多态性，作为裸鼹鼠特定的DNA指纹，可用于裸鼹鼠的物种鉴定。
附图说明
图1为实施例1的4种物种线粒体细胞色素b DNA的PCR-RLFP(聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析)琼脂糖电泳结果；其中，a为人源293T细胞，b为昆明小鼠皮肤成纤维细胞，c为裸鼹鼠皮肤成纤维细胞，d为SD(Sprague Dawley)大鼠皮肤成纤维细胞。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例 线粒体细胞色素b基因的限制性片段多态性鉴定裸鼹鼠物种的方法人、裸鼹鼠、大鼠、小鼠线粒体细胞色素b DNA的PCR-RLFP
分别提取人源293T细胞、昆明小鼠皮肤成纤维细胞、裸鼹鼠皮肤成纤维细胞、SD(Sprague Dawley)大鼠皮肤成纤维细胞基因组DNA，以基因组DNA为模板，线粒体色素b基因引物(正向引物MtDNA-F,反向引物MtDNA-R)为4个物种的统一引物，使用高保真扩增酶分别进行PCR。接着分别使用限制性内切酶：AluⅠ、HinfⅠ、HaeⅢ、TaqⅠ、RsaⅠ、MboⅠ(6种限制性内切酶购自大连宝生物TAKARA公司)酶切4种物种的PCR产物，将产物进行琼脂糖电泳。得到不同物种线粒体色素b基因的限制性片段多态性。
检测步骤：
1)提取基因组DNA：
分别将人源293T细胞、昆明小鼠皮肤成纤维细胞、裸鼹鼠皮肤成纤维细胞、SD(Sprague Dawley)大鼠皮肤成纤维细胞使用基因组提取试剂盒(QIA GEN，America)提取基因组DNA，并检测基因组DNA的质量及浓度。
2)线粒体色素b基因的扩增：
以步骤1)中4种物种的基因组DNA为模板，使用线粒体色素b基因引物(正向引物MtDNA-F：CCATCCAACATCTCCGCATGATGAAA，反向引物MtDNA-R：CCCCTCAGAATGATATTTGGCCTCA)进行PCR扩增，PCR试剂盒为2×Pfu PCR MasterMix(TIANGEN,天根生化)，反应体系为30μl，各组分的终浓度为：0.05U Pfu Taq Polymerase/μl，250μM dNTP，50mM KCl，1.5mM MgCl2，特异性引物(R链，F链)0.2μM，0.5μl DNA模板(30～60ng)。PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。
3)PCR产物的纯化测序和酶切：
将步骤2)中的PCR产物送生工生物技术公司双向测序，并分别将4种PCR产物根据不同内切酶的酶切最佳温度和时间(如表1所示)，使用6种限制性内切酶(AluⅠ、HinfⅠ、HaeⅢ、TaqⅠ、RsaⅠ、MboⅠ)进行酶切。
表1 6种限制性内切酶的酶切最佳温度和时间
4)琼脂糖电泳
分别将不同酶切的产物进行琼脂糖电泳(3％的琼脂糖，跑胶30min)，检测酶切结果。
5)SECentral软件验证酶切结果
将测序结果的序列使用SECentral软件，验证6种限制性内切酶的酶切结果。结果显示酶切片段的琼脂糖电泳结果与SECentral软件的验证结果一致。
通过实施例1中人类、小鼠、大鼠、裸鼹鼠4种物种的酶切产物的琼脂糖跑胶结果，确定了裸鼹鼠细胞线粒体色素b基因限制性片段多态性的指纹，为裸鼹鼠物种的鉴定提供有力的工具。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军第二军医大学
<120> 一种鉴定裸鼹鼠线粒体细胞色素b基因的限制性片段多态性的方法及试剂盒
<130> 说明书、权利要求书
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccatccaaca tctccgcatg atgaaa 26
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cccctcagaa tgatatttgg cctca 25

Claims (4)

1.一种鉴定裸鼹鼠线粒体细胞色素b基因的限制性片段多态性的方法，包括：
(a)提取基因组DNA；
(b)扩增线粒体色素b基因：以步骤(a)提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获取扩增产物；
扩增线粒体细胞色素b基因的引物序列如下：，
正向引物MtDNA-F：CCATCCAACATCTCCGCATGATGAAA；
反向引物MtDNA-R：CCCCTCAGAATGATATTTGGCCTCA；
(c)使用6种限制性内切酶对步骤(b)中获取的扩增产物进行酶切，获取相应的酶切产物；其中，所述6种限制性内切酶为Alu Ⅰ、Hinf Ⅰ、HaeⅢ、Taq Ⅰ、Rsa Ⅰ以及Mbo Ⅰ；
(d)将酶切产物采用3％的琼脂糖凝胶进行电泳，若线粒体细胞色素b基因DNA序列的多态性片段大小bp如下所示，即鉴定该物种为裸鼹鼠；
Alu Ⅰ：358
Hinf Ⅰ：311、47
HaeⅢ：225、111、22
Taq Ⅰ：228、130
Rsa Ⅰ：238、88、32
Mbo Ⅰ：213、114、31。
2.根据权利要求1所述的一种鉴定裸鼹鼠线粒体细胞色素b基因的限制性片段多态性的方法，其特征在于：所述步骤b中的PCR扩增，条件如下：PCR试剂盒为2×Pfu PCRMasterMix，反应体系为30μl，各组分的终浓度为：0.05U Pfu Taq Polymerase/μl，250μMdNTP，50mM KCl，1.5mM MgCl2，特异性引物0.2μM，0.5μl DNA模板；PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。
3.根据权利要求1所述的一种鉴定裸鼹鼠线粒体细胞色素b基因的限制性片段多态性的方法，其特征在于：所述步骤(c)中6种限制性内切酶的酶切时间和温度分别为：Alu Ⅰ：1h，37℃；Hinf Ⅰ：1h，37℃；HaeⅢ：1h，37℃；Taq Ⅰ：1h，65℃；Rsa Ⅰ：1h，37℃；Mbo Ⅰ：1h，37℃。
4.一种用于鉴定裸鼹鼠线粒体细胞色素b基因的试剂盒，包括：
(a)扩增线粒体色素b基因的引物，序列如下：
正向引物MtDNA-F：CCATCCAACATCTCCGCATGATGAAA；
反向引物MtDNA-R：CCCCTCAGAATGATATTTGGCCTCA；
(b)识别线粒体细胞色素b基因多态性位点的6种限制性内切酶：Alu Ⅰ、Hinf Ⅰ、HaeⅢ、Taq Ⅰ、Rsa Ⅰ以及Mbo Ⅰ；其中，裸鼹鼠的线粒体细胞色素b基因DNA序列的多态性片段大小bp如下所示：
Alu Ⅰ：358
Hinf Ⅰ：311、47
HaeⅢ：225、111、22
Taq Ⅰ：228、130
Rsa Ⅰ：238、88、32
Mbo Ⅰ：213、114、31。
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