CN103898225B - 一种鉴别烟粉虱隐种和白粉虱的引物及鉴别方法 - Google Patents

一种鉴别烟粉虱隐种和白粉虱的引物及鉴别方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种鉴别烟粉虱隐种和白粉虱的引物及鉴别方法。一种鉴别烟粉虱MEAM1隐种、烟粉虱MED隐种和白粉虱的引物，所述引物为一对，分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。本发明还涉及利用上述引物鉴别烟粉虱隐种和白粉虱的方法。本发明所述鉴别烟粉虱MEAM1隐种、烟粉虱MED隐种和白粉虱的引物能够扩增烟粉虱MEAM1隐种和烟粉虱MED隐种基因组DNA中的BtabCSP2基因，而对白粉虱基因组DNA没有扩增作用，为鉴定烟粉虱MEAM1隐种、烟粉虱MED隐种和白粉虱提供了简便稳定的分子标记，解决了现有烟粉虱MEAM1隐种、烟粉虱MED隐种和白粉虱鉴定较繁琐的问题。

Description

一种鉴别烟粉虱隐种和白粉虱的引物及鉴别方法
技术领域
本发明涉及一种鉴别烟粉虱隐种和白粉虱的引物及鉴别方法，特别涉及一种鉴别烟粉虱MEAM1隐种、烟粉虱MED隐种和白粉虱的引物及鉴别方法，属于生物技术领域。
背景技术
烟粉虱（Bemisa tabaci）和白粉虱（Trialeurodes vaporariorum）是两种世界性的杂食性害虫。白粉虱一直是我国北方重要的农业害虫。自20世纪90年代末期以来，烟粉虱在我国广大地区突然大面积暴发成灾。两种粉虱除直接危害农作物外，还传播多种重要的植物病毒病。在我国北方地区，它们寄主重叠、危害习性相同、生活史也十分相近，且体型微小、外形相似，经常同域发生，仅靠外部形态很难区分。
烟粉虱是一种包含30多个隐种的物种复合体。在世界范围内分布并造成严重危害的是烟粉虱MEAM1隐种和MED隐种，从2000年前后传入我国并迅速扩散，到2009年在我国除重庆、西藏和辽宁之外所有省市均发现MEAM1隐种和MED隐种烟粉虱，在南方及东南沿海地区以MEAM1隐种烟粉虱为主，在长江流域和东部沿海地区以MED隐种为主。
由于长期使用农药，MEAM1隐种和MED隐种烟粉虱对常见农药都产生了抗药性，包括有机磷类、拟除虫菊酯类、生长调节剂类及新烟碱类。MED隐种烟粉虱对吡虫啉、噻虫嗪等新烟碱类杀虫剂抗性较高，而MEAM1隐种烟粉虱较为敏感，针对不同烟粉虱隐种应该制定相应的防治策略。因此开发MEAM1隐种和MED隐种烟粉虱快速准确的鉴定方法对于有效防控烟粉虱具有重要意义。
MEAM1隐种和MED隐种烟粉虱在寄主范围、传毒能力及抗药性方面存在差异，但在外形上难以区分，目前主要依靠分子生物学方法鉴定，包括mtCOI测序、RAPD、AFLP、SSR和SCAR，其中最常用的是mtCOI测序法。mtCOI方法需要进行测序，费用较高，而且时间长。
限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)技术，又称为酶切位点多态性序列（CSPS）技术，是利用已知DNA序列设计特异性引物来扩增一段DNA片段，再利用限制性内切酶对PCR产物进行消化，经琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，进行RFLP分析。该技术是以已知DNA序列上酶切位点的分布为基础，能揭示单个碱基的差异，因此非常适合鉴别MEAM1隐种和MED隐种烟粉虱这种DNA差异较小的物种。Khansdan等（2005）曾利用mtCOI和核钠离子通道基因为基础开发了鉴别MEAM1隐种和MED隐种烟粉虱的方法，由于所扩DNA片段均大于800bp，所以扩增成功的难度较大。
因此需要开发一种易于扩增的PCR-RFLP方法来鉴别MEAM1隐种和MED隐种烟粉虱以及经常混合发生且较难区分的白粉虱。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种鉴别烟粉虱MEAM1隐种、烟粉虱MED隐种和白粉虱的引物及鉴别方法。
一种鉴别烟粉虱MEAM1隐种、烟粉虱MED隐种和白粉虱的引物，所述引物为一对，分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
正义引物Bc2-F：5’-CAAATCAGTTTAGTGGAGGC-3’；SEQ ID NO.1
反义引物Bc2-R：5’-TAAGCAATCCGAACTTGACTA-3’；SEQ ID NO.2
一种鉴别烟粉虱MEAM1隐种、烟粉虱MED隐种和白粉虱的方法，步骤如下：
（1）提取待鉴别样品的基因组DNA，得基因组DNA溶液；
所述待鉴别样品为烟粉虱MEAM1隐种、烟粉虱MED隐种或白粉虱；
（2）以步骤（1）提取的基因组DNA为模板，利用上述鉴别烟粉虱MEAM1隐种、烟粉虱MED隐种和白粉虱的引物进行PCR扩增，制得的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，当电泳结果中显示有一条463bp的条带时，待鉴别样品为烟粉虱；当电泳结果中没有条带时，则待鉴别样品为白粉虱；
（3）用限制性内切酶Sac II酶切步骤（2）制得的长度为463bp的PCR扩增产物，制得酶切产物；
（4）对步骤（3）制得的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当电泳结果中显示有一条463bp的条带时，则该待鉴别样品为烟粉虱MEAM1隐种；当电泳结果中显示有一条235bp的条带时，则该待鉴别样品为烟粉虱MED隐种。
所述步骤（2）中PCR扩增的扩增体系为：
基因组DNA溶液2.5μl，20μM引物0.5μl，5U/μl Taq酶0.25μl，10×Taq Buffer（缓冲液）2.5μl，10mM dNTP0.5μl，ddH2O补至25μl；
优选的，所述步骤（2）中PCR扩增的扩增条件如下：
94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行35个循环；72℃延伸7分钟。
所述步骤（3）中限制内切酶Sac II酶切反应条件如下：37℃酶切2小时。
上述步骤（1）中提取待鉴别样品的基因组DNA、步骤（2）和步骤（4）中琼脂糖凝胶电泳分析均按本领域常规技术操作。上述实验步骤如无特别说明均可参见《分子克隆实验指南》第三版（北京：科学出版社，2002）。
有益效果
1、本发明所述鉴别烟粉虱MEAM1隐种、烟粉虱MED隐种和白粉虱的引物能够扩增烟粉虱MEAM1隐种和烟粉虱MED隐种基因组DNA中的BtabCSP2基因，而对白粉虱基因组DNA没有扩增作用，为鉴定烟粉虱MEAM1隐种、烟粉虱MED隐种和白粉虱提供了简便稳定的分子标记，解决了现有烟粉虱MEAM1隐种、烟粉虱MED隐种和白粉虱鉴定较繁琐的问题；
2、本发明所述的限制性内切酶为常用的限制性内切酶，为筛选烟粉虱MEAM1隐种和烟粉虱MED隐种提供了简便稳定的酶切标记；
3、本发明从分子水平探索了烟粉虱MEAM1隐种和烟粉虱MED隐种BtabCSP2基因序列差异，探索建立了MEAM1隐种和MED隐种烟粉虱的鉴别技术，为今后烟粉虱MEAM1隐种和烟粉虱MED隐种的种群动态鉴定、生物学以及综合防治奠定了基础。
附图说明
图1是实施例2中PCR产物经Sac II酶切后的琼脂糖凝胶电泳图；
其中：MEAM1：烟粉虱MEAM1隐种，MED：烟粉虱MED隐种，M：DL2000DNAMarker。
图2是实施例3中利用引物Bc2-F和Bc2-R PCR扩增田间粉虱样品的琼脂糖凝胶电泳图；
其中：1-5为潍坊蜀葵的粉虱样品，6-10为潍坊向日葵的粉虱样品。11-15为德州棉花的粉虱样品，16-20为德州茄子的粉虱样品，21-25为青岛辣椒的粉虱样品，26-30为济南甘蓝的粉虱样品；
图3是实施例3中利用内切酶Sac II酶切PCR产物后的琼脂糖凝胶电泳图。
其中：1-5为潍坊蜀葵的粉虱样品，6-10为潍坊向日葵的粉虱样品。11-15为德州棉花的粉虱样品，16-20为德州茄子的粉虱样品，21-25为青岛辣椒的粉虱样品，26-30为济南甘蓝的粉虱样品。
具体实施方式
下面结合实施例及说明书附图对本发明的内容做进一步的说明，但本发明所保护范围不限于此。
实施例1、实施例2中所述烟粉虱MEAM1隐种和烟粉虱MED隐种为本实验室饲养种群；
实施例3中所述烟粉虱和白粉虱于2013年采集于山东省各地（表1）。
表1
实施例所述Sac II内切酶购自Fermentas公司，Tris-HCl、乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸钠均购自上海生物工程公司，其它试剂均为普通市售产品。
实施例1
（1）烟粉虱MEAM1隐种和烟粉虱MED隐种基因组DNA的提取
将单头烟粉虱分别置于含60μl碱裂解液的0.2ml的离心管中，碱裂解液为：50mmol·L- 1Tris-HCl(pH8.0)、20mmol·L-1NaCl、1mmol·L-1EDTA（乙二胺四乙酸）、1%SDS（十二烷基硫酸钠），用封口枪头充分研磨匀浆后，置于水浴锅65℃水浴15min，然后在95℃水浴10min后，制得烟粉虱MEAM1隐种和烟粉虱MED隐种基因组DNA溶液。
（2）烟粉虱MEAM1隐种和烟粉虱MED隐种BtabCSP2基因的PCR扩增
分别以MEAM1隐种和MED隐种烟粉虱基因组DNA溶液为模板进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；
PCR扩增体系为：
MEAM1隐种和MED隐种烟粉虱基因组DNA溶液：3μl；20μM引物：0.5μl；5U/μl Taq酶：0.5μl；10×Taq Buffer：5μl；10mM dNTP：1μl；ddH2O补至50μl；
引物序列如下：
正义引物Bc2-F：5’-CAAATCAGTTTAGTGGAGGC-3’；SEQ ID NO.1
反义引物Bc2-R：5’-TAAGCAATCCGAACTTGACTA-3’；SEQ ID NO.2
PCR扩增条件如下：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行35个循环；72℃延伸7分钟。
（3）用2wt%琼脂糖凝胶电泳对步骤（2）制得的PCR扩增产物进行检测，均检测出一长度在463bp左右条带（如图1所示），对该条带进行双向测序，MEAM1隐种烟粉虱得到的条带序列如SEQ ID NO.3所示，MED隐种烟粉虱得到的条带序列如SEQ ID NO.4所示。
（4）通过对限制性内切酶酶切位点进行分析发现，在片段235bp处烟粉虱MEAM1隐种和烟粉虱MED隐种有碱基差异，且烟粉虱MED隐种得到的条带在该处可被限制性内切酶SacII酶切（酶切位点CCGCGG）。
实施例2
一种鉴别烟粉虱MEAM1隐种和烟粉虱MED隐种的方法，步骤如下：
（1）将实验室饲养的烟粉虱MEAM1隐种和烟粉虱MED隐种个体作为鉴别样品分别置于含60μl碱裂解液的0.2ml的离心管中，碱裂解液为：50mmol·L-1Tris-HCl(pH8.0)、20mmol·L- 1NaCl、1mmol·L-1EDTA、1%SDS，用封口枪头充分研磨匀浆后，置于水浴锅65℃水浴15min，然后在95℃水浴10min后，得基因组DNA溶液；
（2）以步骤（1）制得的基因组DNA为模板，对基因组DNA中的线粒体COI基因进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；
PCR扩增体系为：
基因组DNA溶液2.5μl，20μM引物0.5μl，5U/μlTaq酶0.25μl，10×Taq Buffer2.5μl，10mM dNTP0.5μl，ddH2O补至25μl；
引物序列如下：
正义引物Bc2-F：5’-CAAATCAGTTTAGTGGAGGC-3’；SEQ ID NO.1
反义引物Bc2-R：5’-TAAGCAATCCGAACTTGACTA-3’；SEQ ID NO.2
PCR扩增条件如下：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行35个循环；72℃延伸7分钟。
（3）用限制性内切酶Sac II酶切步骤（2）制得的PCR扩增产物，得酶切产物；
酶切体系如下：10×缓冲液2μl；PCR扩增产物5μl；Sac II内切酶0.5μl；灭菌双蒸水至15μl。
反应条件如下：37℃水浴2小时。
（4）用2wt%的琼脂糖凝胶电泳分离步骤（3）制得的酶切产物，EB染色后在紫外凝胶成像仪上成像，观察其多态性。结果显示，成像胶片上在463bp有条带时，则该鉴别样品为烟粉虱MEAM1隐种；当PCR产物电泳图谱显示被测样品在235bp有条带时，则该鉴别样品为烟粉虱MED隐种，结果如图1所示。
本检测方法的结果与mtCOI方法进行检测的结果一致。
实施例3
一种鉴别烟粉虱MEAM1隐种、烟粉虱MED隐种和白粉虱的方法，步骤如下：
（1）将田间采集的待鉴别样品分别置于含60μl碱裂解液的0.2ml的离心管中，碱裂解液为：50mmol·L-1Tris-HCl(pH8.0)、20mmol·L-1NaCl、1mmol·L-1EDTA、1%SDS，用封口枪头充分研磨匀浆后，置于水浴锅65℃水浴15min，然后在95℃水浴10min后，得基因组DNA溶液；
（2）以步骤（1）制得的基因组DNA为模板，对基因组DNA中的线粒体COI基因进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；
PCR扩增体系为：
基因组DNA溶液2.5μl，20μM引物0.5μl，5U/μlTaq酶0.25μl，10×Taq Buffer2.5μl，10mM dNTP0.5μl，ddH2O补至25μl；
引物序列如下：
正义引物Bc2-F：5’-CAAATCAGTTTAGTGGAGGC-3’；SEQ ID NO.1
反义引物Bc2-R：5’-TAAGCAATCCGAACTTGACTA-3’；SEQ ID NO.2
PCR扩增条件如下：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行35个循环；72℃延伸7分钟。
用2wt%的琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，EB染色后在紫外凝胶成像仪上成像，结果显示无带时，则检测样本为白粉虱，若显示一条463bp的条带，则检测样品为烟粉虱。结果如图2所示，除第7-8孔外，其余样品均在463bp扩增出一条带，因此判定7-8孔的潍坊向日葵的2个粉虱样品为白粉虱，其余为烟粉虱。
（3）用限制性内切酶Sac II酶切步骤（2）制得的PCR扩增产物，得酶切产物；
酶切体系如下：10×缓冲液2μl；PCR扩增产物5μl；Sac II内切酶0.5μl；灭菌双蒸水至15μl。
反应条件如下：37℃水浴2小时。
（4）用2wt%的琼脂糖凝胶电泳分离步骤（3）制得的酶切产物，EB染色后在紫外凝胶成像仪上成像，观察其多态性。结果显示，成像胶片上在463bp有条带时，则该待鉴别样品为烟粉虱MEAM1隐种；当PCR产物电泳图谱显示在235bp有条带时，则该待鉴别样品为烟粉虱MED隐种。结果如图3所示，除第28-29孔显示一条463bp条带外，其余样品均显示一条235bp条带，因此判定28-29孔对应的济南甘蓝的粉虱样品为MEAM1隐种烟粉虱，其余均为MED隐种烟粉虱。与mtCOI鉴定结果一致。
本检测方法的结果与mtCOI方法进行检测的结果一致。

Claims (5)

1.一种鉴别烟粉虱MEAM1隐种、烟粉虱MED隐种和白粉虱的引物，所述引物为一对，分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
2.一种鉴别烟粉虱MEAM1隐种、烟粉虱MED隐种和白粉虱的方法，其特征在于，步骤如下：
（1）提取待鉴别样品的基因组DNA，得基因组DNA溶液；
所述待鉴别样品为烟粉虱MEAM1隐种、烟粉虱MED隐种或白粉虱；
（2）以步骤（1）提取的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的鉴别烟粉虱MEAM1隐种、烟粉虱MED隐种和白粉虱的引物进行PCR扩增，制得的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，当电泳结果中显示有一条463bp的条带时，待鉴别样品为烟粉虱；当电泳结果中没有条带时，则待鉴别样品为白粉虱；
（3）用限制性内切酶Sac II酶切步骤（2）制得的长度为463bp的PCR扩增产物，制得酶切产物；
（4）对步骤（3）制得的酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，当电泳结果中显示有一条463bp的条带时，则该待鉴别样品为烟粉虱MEAM1隐种；当电泳结果中显示有一条235bp的条带时，则该待鉴别样品为烟粉虱MED隐种。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中PCR扩增的扩增体系为：
基因组DNA溶液2.5μl，20μM引物0.5μl，5U/μl Taq酶0.25μl，10×Taq缓冲液2.5μl，10mM dNTP0.5μl，ddH2O补至25μl。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中PCR扩增的扩增条件如下：
94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸30秒，进行35个循环；72℃延伸7分钟。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中限制内切酶Sac II酶切反应条件如下：37℃酶切2小时。
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