CN116219042A - 一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测方法 - Google Patents

一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116219042A
CN116219042A CN202310018439.6A CN202310018439A CN116219042A CN 116219042 A CN116219042 A CN 116219042A CN 202310018439 A CN202310018439 A CN 202310018439A CN 116219042 A CN116219042 A CN 116219042A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rickettsia
rpa
primer
bemisia tabaci
ric
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310018439.6A
Other languages
English (en)
Inventor
李玉婷
李兴烨
栾军波
郑康吾
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenyang Agricultural University
Original Assignee
Shenyang Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenyang Agricultural University filed Critical Shenyang Agricultural University
Priority to CN202310018439.6A priority Critical patent/CN116219042A/zh
Publication of CN116219042A publication Critical patent/CN116219042A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于农业生物技术领域，本发明提供了一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测方法。本发明技术方案利用RPA技术，以携带Rickettsia的烟粉虱为材料，提取基因组DNA，并以此为模板，通过反应条件优化、特异性及灵敏度检测等试验，建立一种高效、便捷、省时、特异性好、灵敏度较高的检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的方法，为田间快速检测提供了技术支持，并为烟粉虱与Rickettsia的互作机制研究奠定了基础。

Description

一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测方法
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，尤其涉及一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测方法。
背景技术
烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)是重要的世界性农业害虫之一，被冠以“超级害虫”的称谓，被列为最危险的100种入侵物种。烟粉虱不仅通过直接刺吸汁液为害寄主植物，而且分泌蜜露导致霉污病滋生而影响植物的光合作用和呼吸作用，更重要是烟粉虱作为病毒的超级载体，能够传播极具破坏性的植物病毒病，每年造成数十亿美元的经济损失。烟粉虱是一个物种复合体，至少包含36个隐种，其中MEAM1隐种(B型)和MED(Q型)是两种入侵性烟粉虱，成为田间为害的优势种。
Rickettsia属于变形菌纲Proteobacteria的α亚群立克次体科Rickettsiaceae革兰氏阴性菌。Rickettsia于1909年在研究洛基山斑疹热时首次发现，通常将Rickettsia分为感染脊椎动物的致病菌和感染节肢动物的共生菌。Rickettsia作为烟粉虱体内重要的次生共生菌，可通过垂直和水平的方式在烟粉虱种群传播。研究表明，Rickettsia对烟粉虱的生殖、发育、抗药性等都有重要影响，且在不同种群和隐种间的感染率不同。
目前对Rickettsia的检测主要依赖于16S或23SrRNA的PCR扩增和测序，但受引物和灵敏度限制而易出现假阴性，且测序验证较耗时。实时荧光定量PCR被广泛用于Rickettsia滴度的检测，虽然其灵敏度更高，但是操作步骤繁琐且耗时耗力。此外，对Rickettsia的检测方法还包括荧光原位杂交(FISH)、16SrDNA扩增子测序等，然而FISH设备昂贵，操作困难，而16SrDNA扩增子测序侧重于微生物群落多样性研究。综上所述，目前对烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测存在假阴性、操作繁琐、设备昂贵、耗时耗力等不足，因此急需一种快速高效检测烟粉虱体内Rickettsia的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测方法，利用RPA技术，以携带Rickettsia的烟粉虱的基因组DNA为模板，通过反应条件优化、特异性及灵敏度检测等试验建立的检测方法，从而实现快速、准确地检测烟粉虱体内Rickettsia的目的，同时缩减了鉴定时间，节约了生化试剂，降低了成本，为烟粉虱体内共生菌Rickettsia的快速、高效检测提供技术保障。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测引物组，所述引物组包括引物Ric-RPAF和引物Ric-RPAR，所述引物Ric-RPAF的序列如SEQ ID NO.2所示，所述引物Ric-RPAR的序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测试剂盒，包括上述的检测引物组。
本发明还提供了一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测方法，包括如下步骤：
(1)提取所述烟粉虱基因组DNA；
(2)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，采用上面所述的引物组进行RPA扩增，得到RPA扩增产物；
(3)检测步骤(2)得到的RPA扩增产物中是否存在如SEQ ID No.3所述的序列，若存在，表明被测样品被共生菌Rickettsia感染；若不存在，表明被检测样品为未被共生菌Rickettsia感染。
作为优选，步骤(2)所述RPA扩增的扩增体系以50μl计，包括以下组分：Rehydration Buffer 29.5μl，去离子水13.0μl，引物Ric-RPAF、引物Ric-RPAR各2μl，模板DNA 1μl，醋酸镁溶液2.5μl。
作为优选，所述引物Ric-RPAF、引物Ric-RPAR的浓度为0.1-0.6μmol/L，所述模板DNA的浓度为120-180ng/μl。
作为优选，步骤(2)所述RPA扩增的温度为35-42℃，所述RPA扩增的时间为10-40min。
作为优选，采用1-2％琼脂糖凝胶电泳的方法检测步骤(2)得到的RPA扩增产物。
通过采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：
本发明根据共生菌Rickettsia的基因组中具有物种特异性的Pgt基因片段设计RPA引物，获得Rickettsia-RPA检测体系，该检测体系特异性强，除粉虱体内的Rickettsia以外的共生菌均不能扩增出条带；灵敏度较高，RPA的检测限度为150×10-3ng/μl，比普通PCR灵敏10倍；还可以实现快速、准确地检测烟粉虱体内Rickettsia的目的，同时缩减了鉴定时间，节约了生化试剂，降低了成本，大大提高了Rickettsia在烟粉虱体内的检测效率，也为烟粉虱体内共生菌Rickettsia的快速、高效检测提供技术保障。
附图说明
图1为Rickettsia-RPA不同反应时间的检测结果(M：2000bp DNA Marker；泳道1-5分别为10-50min反应时间)；
图2为RPA反应特异性检测结果(M：2000bp DNA Marker；1：携带Portiera、Hamiltonella和Rickettsia的MEAM1；2：抗生素去除共生菌的MEAM1；3：携带Portiera、Hamiltonella和Rickettsia的MED；4：携带Portiera、Hamiltonella和Cardinium的MED；5：携带Portiera和Arsenophonus的温室白粉虱；6：ddH2O；A：分别以Portiera、Hamiltonella、Rickettsia、Cardinium和Arsenophonus相应的引物组通过PCR技术检测；B：Rickettsia的RPA技术检测)；
图3为RPA灵敏度检测结果(M：2000bp DNAMarker；1-5：模板分别为100、10-1、10-2、10-3、10-4倍的烟粉虱基因组DNA；A：普通PCR；B：RPA)；
图4为RPA田间样品检测结果(M：2000bp DNAMarker；1-5：田间样本；6：ddH2O；A表示PCR检测，B表示RPA检测)。
具体实施方式
本发明提供了一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测引物组，所述引物组优选的基于Rickettsia基因组(CP016305.1)中磷酸甘油转移酶(Pgt)基因片段序列设计得到的，该Pgt基因片段大小为154bp，该Pgt基因序列SEQ ID NO.1为TAAAAACGGTCCATATGAGATTTTCTCGGCTTATCTTAATAACAGTCTAA ATTATAATAGTTTCTATCCCACTATAGATAGTAAGCAGGCTTTAAGCATAGTACGTGATAGCTTACAAAATAATAGTGACAAGTTCGTGGGTGGTGACTCTATC。
在本发明中，所述引物组优选的包括引物Ric-RPAF和引物Ric-RPAR，所述引物Ric-RPAF的序列(5’-3’)如SEQ ID NO.2所示，为GATAGAGTCACCACCCACGAACTTGTCACT；所述引物Ric-RPAR的序列(5’-3’)如SEQ ID NO.3所示，为TAAAAACGGTCCATATGAGATTTTCTCGGC。
本发明还提供了一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测试剂盒，优选的包括上述所述的检测引物组。
本发明还提供了一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测方法，包括如下步骤：
(1)提取所述烟粉虱基因组DNA；
(2)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，采用上述所述的引物对进行RPA扩增，得到RPA扩增产物；
(3)检测步骤(2)得到的RPA扩增产物中是否存在如SEQ ID No.3所述的序列，若存在，表明被测样品被共生菌Rickettsia感染；若不存在，表明被检测样品为未被共生菌Rickettsia感染。
在本发明中，提取所述烟粉虱的基因组DNA，先将裂解液加到PCR管内，所述裂解液优选的包括5-12mmol/L Tris-HCl(pH＝8.4)、0.3-0.6％Nonidet P-40、40-60mmol/L KCl、0.1-0.3％gelatin、0.3-0.6％Tween 20、40-70μg/mL proteinase K，进一步优选的包括8-11mmol/L Tris-HCl、0.35-0.5％Nonidet P-40、45-55mmol/L KCl、0.15-0.25％gelatin、0.35-0.5％Tween 20、45-65μg/mL proteinase K，更进一步优选的包括10mmol/LTris-HCl、0.45％Nonidet P-40、50mmol/L KCl、0.2％gelatin、0.45％Tween 20、60μg/mLproteinase K；所述裂解液的添加量优选为40-60μL，进一步的优选为45-55μL，更进一步的优选为50μL。然后，将实验室饲养的携带Rickettsia的单头烟粉虱放入PCR管内，可优选的采用解剖针进行，之后加入研磨珠进行研磨，所述研磨珠的添加量优选为1-4个，进一步的优选为2-3个；所述研磨珠的直径优选为0.5-2mm，进一步的优选为0.8-1.5mm，更进一步的优选为1mm。本发明所述研磨优选的在组织研磨仪中进行，所述研磨的频率优选为50-80Hz，进一步的优选为60-85Hz，更进一步的优选为70Hz；所述的时间优选为250-400s，进一步的优选为280-350s，更进一步的优选为300s。本发明研磨完成后将PCR管优选的进行离心处理，所述离心的转速优选为5000-7000rpm，进一步的优选为5500-6500rpm，更进一步的优选为6000rpm；所述离心的时间优选为20-50s，进一步的优选为25-40s，更进一步的优选为30s。本发明所述PCR管离心处理后优选的放入水浴中，所述水浴的温度优选为60-70℃，进一步的优选为63-68℃，更进一步的优选为65℃；所述水浴的时间优选为1-2.5h，进一步的优选为1.5-2.3h，更进一步的优选为2h。本发明所述PCR管水浴后放入100℃沸水中5-15min，进一步的优选为8-12min，更进一步的优选为10min。本发明所述沸水操作可使proteinase K失活；提取得到的烟粉虱基因组DNA经离心后即可用于后续实验，或暂时保存在-20℃冰箱内。
在本发明中，以获得的烟粉虱基因组DNA为模板，采用所述引物组进行RPA扩增得到RPA扩增产物。本发明所述RPA扩增优选的在含有冻干酶粉的0.2ml TwistAmp反应管(TwistAmp Basic kits，Twist)中进行，所述RPA扩增的扩增体系以50μl计，优选的包括以下组分：Rehydration Buffer 29.5μl，去离子水13.0μl，引物Ric-RPAF、引物Ric-RPAR各2μl，模板DNA 1μl，醋酸镁溶液2.5μl。本发明中所述引物Ric-RPAF和引物Ric-RPAR的浓度均优选为0.1-0.6μmol/L，进一步的优选为0.3-0.5μmol/L，更进一步的优选为0.4μmol/L；所述模板DNA的浓度优选为120-180ng/μl，进一步的优选为130-160ng/μl，更进一步的优选为150ng/μl；所述醋酸镁溶液的浓度优选为250-300mmol/L，进一步的优选为270-290mmol/L，更进一步的优选为280mmol/L。
在本发明中，所述RPA扩增的温度优选为35-42℃，进一步的优选为36-40℃，更进一步的优选为37℃；所述RPA扩增的时间优选为10-40min，进一步的优选为20-35min，更进一步的优选为30min。
在本发明中，所述RPA反应结束后，使用DNA纯化试剂盒(Wizard PCR Preps kit，Promega)对产物进行纯化。
在本发明中，检测纯化后的RPA扩增产物中是否存在如SEQ ID No.1所述的序列，优选的采用1-2％琼脂糖凝胶电泳的方法，所述琼脂糖凝胶的浓度可进一步的优选为1.3-1.8％，更进一步的优选为1.5％。
在本发明中，若存在如SEQ ID No.1所述的序列，表明被测样品被共生菌Rickettsia感染；若不存在如SEQ ID No.1所述的序列，表明被检测样品为未被共生菌Rickettsia感染。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测方法，具体包括如下步骤：
(1)将50μl由10mmol/L Tris-HCl(pH＝8.4)、0.45％Nonidet P-40、50mmol/LKC1、0.2％gelatin、0.45％Tween 20、60μg/mLproteinase K组成的裂解液加到PCR管内，然后用解剖针将携带Rickettsia的烟粉虱挑入PCR管内，加入2个直径1mm的研磨珠，然后放到组织研磨仪中，70Hz下研磨300s，再将PCR管以6000rpm离心30s后放入65℃水浴2h，再置入100℃沸水中10min，获得烟粉虱基因组DNA；
(2)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，采用引物Ric-RPAF和引物Ric-RPAR进行RPA扩增，RPA扩增体系为50μl，具体体系如下：向含有冻干酶粉的0.2ml TwistAmp反应管中加入Rehydration Buffer 29.5μl，去离子水13.0μl，终浓度均为0.4μmol/L的引物Ric-RPAF、引物Ric-RPAR各2μl，150ng/μl的模板DNA 1μl，280mmol/L的醋酸镁溶液2.5μl。将RPA扩增体系充分混匀，置于37℃的水浴锅中反应30min，即得到RPA扩增产物；
(3)使用DNA纯化试剂盒对步骤(2)得到的RPA扩增产物进行纯化；
(4)用1.5％琼脂糖凝胶对纯化后的RPA扩增产物进行电泳检测。
实施例2
一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测方法，具体包括如下步骤：
(1)将50μl由11mmol/L Tris-HCl(pH＝8.4)、0.3％Nonidet P-40、50mmol/L KC1、0.2％gelatin、0.45％Tween 20、60μg/mLproteinase K组成的裂解液加到PCR管内，然后用解剖针将携带Rickettsia的烟粉虱挑入PCR管内，加入2个直径1mm的研磨珠，然后放到组织研磨仪中，50Hz下研磨250s，再将PCR管以5000rpm离心30s后放入60℃水浴2h，再置入100℃沸水中10min，获得烟粉虱基因组DNA；
(2)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，采用引物Ric-RPAF和引物Ric-RPAR进行RPA扩增，RPA扩增体系为50μl，具体体系如下：向含有冻干酶粉的0.2ml TwistAmp反应管中加入Rehydration Buffer 29.5μl，去离子水13.0μl，终浓度均为0.1μmol/L的引物Ric-RPAF、引物Ric-RPAR各2μl，120ng/μl的模板DNA 1μl，250mmol/L的醋酸镁溶液2.5μl。将RPA扩增体系充分混匀，置于37℃的水浴锅中反应10min，即得到RPA扩增产物；
(3)使用DNA纯化试剂盒对步骤(2)得到的RPA扩增产物进行纯化；
(4)用1.3％琼脂糖凝胶对纯化后的RPA扩增产物进行电泳检测。
实施例3
一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测方法，具体包括如下步骤：
(1)将50μl由10mmol/LTris-HCl(pH＝8.4)、0.6％Nonidet P-40、50mmol/L KC1、0.2％gelatin、0.45％Tween 20、40μg/mLproteinase K组成的裂解液加到PCR管内，然后用解剖针将携带Rickettsia的烟粉虱挑入PCR管内，加入2个直径1mm的研磨珠，然后放到组织研磨仪中，70Hz下研磨250s，再将PCR管以5000rpm离心50s后放入65℃水浴2.5h，再置入100℃沸水中5min，获得烟粉虱基因组DNA；
(2)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，采用引物Ric-RPAF和引物Ric-RPAR进行RPA扩增，RPA扩增体系为50μl，具体体系如下：向含有冻干酶粉的0.2ml TwistAmp反应管中加入Rehydration Buffer 29.5μl，去离子水13.0μl，终浓度均为0.6μmol/L的引物Ric-RPAF、引物Ric-RPAR各2μl，150ng/μl的模板DNA 1μl，280mmol/L的醋酸镁溶液2.5μl。将RPA扩增体系充分混匀，置于35℃的水浴锅中反应30min，即得到RPA扩增产物；
(3)使用DNA纯化试剂盒对步骤(2)得到的RPA扩增产物进行纯化；
(4)用1.8％琼脂糖凝胶对纯化后的RPA扩增产物进行电泳检测。
试验例1反应时间
基于实施例1，将RPA扩增体系混匀后，置于37℃的水浴锅中分别反应10min、20min、30min、40min、50min，得到的RPA扩增产物使用DNA纯化试剂盒纯化后进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，结果如图1。可以看出：在10min的反应后，出现了一个清晰的预期大小的条带(154bp)；DNA条带的密度分析表明，20min反应后的DNA产率是10min反应的2倍，而30min和40min的产物之间没有显著差异。因此，将30min作为最佳RPA检测的反应时间。
试验例2特异性检测
基于实施例1，为验证Rickettsia-RPA反应体系的特异性，分别以携带Portiera、Hamiltonella、Rickettsia、Cardinium的烟粉虱(MEAM1或MED)和携带Portiera和Arsenophonus的温室白粉虱为材料，分别利用Portiera、Hamiltonella、Cardinium和Arsenophonus相应的引物组(如表1)进行PCR扩增，利用Rickettsia相应的引物组进行PCR和RPA扩增。其中，PCR扩增体系为20μl，具体体系如下：向PCR管中加入2×Taq Master Mix(全式金)10μl，去离子水6.4μl，上、下游引物各0.8μl(终浓度为10mmol/L)，模板DNA 2.0μl(～300ng)。PCR反应条件：94℃预变性3分钟，接着进行如下30个循环：94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒；循环结束后，然后在72℃延伸10分钟。
然后，扩增后的产物采用1.5％的琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳，利用凝胶成像系统观察电泳结果，对Rickettsia-RPA反应体系的特异性进行验证，结果如图2。结果表明，粉虱体内的Rickettsia以外的共生菌均不能扩增出条带，即本发明检测体系特异性强；同时还可以看出，Rickettsia-PCR检测出的条带在1000bp左右，而Rickettsia-RPA检测出的条带在154bp。
表1烟粉虱共生菌PCR检测引物序列
Figure BDA0004041528470000081
Figure BDA0004041528470000091
试验例3灵敏度检测
基于实施例1和试验例1，将提取的烟粉虱基因组DNA进行10倍连续稀释，依次为100、10-1、10-2、10-3、10-4，以最佳反应条件进行RPA检测，以确定最低检出限度，结果如图3。结果显示，RPA的检测限度为10-3，比普通PCR灵敏10倍。
试验例4田间样品检测
从辽宁省沈阳市、大连市、锦州市、葫芦岛市和铁岭市5地采集蔬菜上的烟粉虱，按照实施例1和试验例1所述方法、最优参数随机对部分样品进行RPA检测；同时，以普通PCR法对同一批样品进行平行检测，并对结果进行观察比对分析并记录。结果表明，5份样品中，1份检测为携带Rickettsia样品，检测结果与PCR结果一致，但可以看出，本发明RPA检测结果条带出现在154bp，而普通PCR法检测结果条带出现在1000bp左右。
由以上实施例和试验例可知，本发明利用RPA技术，以携带Rickettsia的烟粉虱的基因组DNA为模板，通过反应条件优化、特异性及灵敏度检测等试验建立的检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测方法，该检测体系特异性强，除粉虱体内的Rickettsia以外的共生菌均不能扩增出条带；灵敏度较高，RPA的检测限度为10-3，比普通PCR灵敏10倍；还可以实现快速、准确地检测烟粉虱体内Rickettsia的目的，同时缩减了鉴定时间，节约了生化试剂，降低了成本，大大提高了Rickettsia在烟粉虱体内的检测效率，也为烟粉虱体内共生菌Rickettsia的快速、高效检测提供技术保障。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测引物组，其特征在于，所述引物组包括引物Ric-RPAF和引物Ric-RPAR，所述引物Ric-RPAF的序列如SEQ ID NO.2所示，所述引物Ric-RPAR的序列如SEQ IDNO.3所示。
2.一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的检测引物组。
3.一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取所述烟粉虱基因组DNA；
(2)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的引物组进行RPA扩增，得到RPA扩增产物；
(3)检测步骤(2)得到的RPA扩增产物中是否存在如SEQ ID No.1所述的序列，若存在，表明被测样品被共生菌Rickettsia感染；若不存在，表明被检测样品为未被共生菌Rickettsia感染。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述RPA扩增的扩增体系以50μl计，包括以下组分：RehydrationBuffer29.5μl，去离子水13.0μl，引物Ric-RPAF、引物Ric-RPAR各2μl，模板DNA1μl，醋酸镁溶液2.5μl。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述引物Ric-RPAF、引物Ric-RPAR的浓度为0.1-0.6μmol/L，所述模板DNA的浓度为120-180ng/μl。
6.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述RPA扩增的温度为35-42℃，所述RPA扩增的时间为10-40min。
7.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，采用1-2％琼脂糖凝胶电泳的方法检测步骤(2)得到的RPA扩增产物。
CN202310018439.6A 2023-01-06 2023-01-06 一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测方法 Pending CN116219042A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310018439.6A CN116219042A (zh) 2023-01-06 2023-01-06 一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310018439.6A CN116219042A (zh) 2023-01-06 2023-01-06 一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116219042A true CN116219042A (zh) 2023-06-06

Family

ID=86586550

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310018439.6A Pending CN116219042A (zh) 2023-01-06 2023-01-06 一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116219042A (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103088147A (zh) * 2013-02-07 2013-05-08 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 同时鉴别q型和b型烟粉虱的特异性pcr方法及试剂盒
CN103898225A (zh) * 2014-04-11 2014-07-02 山东省农业科学院生物技术研究中心 一种鉴别烟粉虱隐种和白粉虱的引物及鉴别方法
KR20150050062A (ko) * 2013-10-31 2015-05-08 경북대학교 산학협력단 온실가루이 진단을 위한 특이 프라이머 및 이의 용도
CN104975083A (zh) * 2015-06-09 2015-10-14 福建省农业科学院植物保护研究所 一种快速鉴定烟粉虱meam1、med两隐种的引物及其鉴定方法
CN107254536A (zh) * 2017-07-10 2017-10-17 青岛农业大学 一种快速检测Q烟粉虱体内共生菌Cardinium的引物及方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103088147A (zh) * 2013-02-07 2013-05-08 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 同时鉴别q型和b型烟粉虱的特异性pcr方法及试剂盒
KR20150050062A (ko) * 2013-10-31 2015-05-08 경북대학교 산학협력단 온실가루이 진단을 위한 특이 프라이머 및 이의 용도
CN103898225A (zh) * 2014-04-11 2014-07-02 山东省农业科学院生物技术研究中心 一种鉴别烟粉虱隐种和白粉虱的引物及鉴别方法
CN104975083A (zh) * 2015-06-09 2015-10-14 福建省农业科学院植物保护研究所 一种快速鉴定烟粉虱meam1、med两隐种的引物及其鉴定方法
CN107254536A (zh) * 2017-07-10 2017-10-17 青岛农业大学 一种快速检测Q烟粉虱体内共生菌Cardinium的引物及方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YUAN LIU: "A single-pair method to screen Rickettsia-infected and uninfected whitefly Bemisia tabaci populations", 《JOURNAL OF MICROBIOLOGICAL METHODS》, vol. 168, pages 1 - 22 *
师沛琼等: "烟粉虱内共生菌Rickettsia在植物体内的形态及动态变化", 《应用昆虫学报》, vol. 58, no. 3, pages 704 - 713 *
彭华康等: "RPA技术及其在食品检测中的应用", 《分子植物育种》, vol. 16, no. 7, pages 2244 - 2248 *
王紫淇;刘媛;师沛琼;安璇;邱宝利;: "内共生菌Rickettsia对烟粉虱生物学特性的影响", 应用昆虫学报, no. 04, pages 166 - 173 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108220474A (zh) 一种禾谷镰刀菌的lamp检测引物及其应用
CN114075607B (zh) 一种基于sherlock检测单增李斯特菌的现场可视化试剂盒及应用
WO2019075868A1 (zh) 一种检测布鲁菌感染的方法及其应用
CN115029459A (zh) 一种基于CRISPR-Cas12a可视化检测多杀性巴氏杆菌的试剂盒及应用
CN113151522A (zh) 基于lfd-rpa技术的水稻细菌性条斑病菌检测试剂盒及其引物探针组合物与应用
CN114196766B (zh) 用于特异鉴定水稻白叶枯菌Xoo的分子标记、引物对、试剂盒和方法
CN107974515B (zh) 一种罗非鱼罗湖病毒的恒温快速检测试剂盒
US20200299788A1 (en) Methods and compositions for identifying and quantifying microbial dna
CN116219042A (zh) 一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测方法
CN116377118A (zh) 一种用于茄科三种病原菌多重pcr检测方法和应用
CN109371110B (zh) 一种杨树细菌性溃疡病菌的lamp检测试剂盒
CN115873979A (zh) 一种用于检测耳念珠菌的恒温核酸扩增raa引物探针组合及其应用
CN114277166B (zh) 一种瓜类细菌性果斑病菌的rpa检测引物、探针及检测方法
CN115960902A (zh) 基于CRISPR-Cas系统的用于检测多种支原体的引物、crRNA及其应用
CN112048573B (zh) 用于检测棉花曲叶病毒的rpa引物、试剂盒及其检测方法与应用
CN114032336A (zh) 一种检测黄瓜花叶病毒的方法及其试剂盒
CN114574628A (zh) 一种检测试剂盒及其应用
CN112831578B (zh) 用于检测肺炎支原体的引物组、试剂盒及方法
CN114807416A (zh) 热带念珠菌的rpa-lfs检测引物探针组合及其应用
CN116855633B (zh) 一种同时检测疣状毛癣菌、犬小孢子菌和须毛癣菌的多重pcr检测方法与试剂盒
CN117551799B (zh) 用于鰤鱼诺卡氏菌菌株分型的引物组合、多重pcr鉴定方法及应用
CN114574611B (zh) 一种牛无绿藻pcr引物及其应用
CN116855633A (zh) 一种同时检测疣状毛癣菌、犬小孢子茵和须毛癣菌的多重pcr检测方法与试剂盒
CN114150077B (zh) 用于鉴定水稻黄单胞菌的分子标记、引物组合物、试剂盒和方法
KR101166786B1 (ko) 벼흰잎마름병원균의 ｋ3 또는 ｋ5 레이스의 판별용 유전자 마커 및 이를 이용한 판별 방법

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination