CN116855633A - 一种同时检测疣状毛癣菌、犬小孢子茵和须毛癣菌的多重pcr检测方法与试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于疫病检测领域，具体涉及一种同时检测疣状毛癣菌、犬小孢子茵和须毛癣菌的多重PCR检测方法与试剂盒。本发明的设计三对特异性引物，通过优化多重PCR反应条件，建立了一种可同时快速检测这3种真菌的多重PCR，具有检测时间短，成本低，检测结果特异性高，结果易判读，实用性强，可同时对牛源浅表真菌病原作出快速诊断与鉴别。
Description
技术领域
本发明属于疫病检测领域，具体涉及一种同时检测疣状毛癣菌、犬小孢子茵和须毛癣菌的多重PCR检测方法与试剂盒。
背景技术
牛皮肤癣菌病(Dermatophytosis)(亦称铜钱癣、脱毛癣或秃毛癣病)是由皮肤癣菌(Dermatophytes)引起的牛浅在性皮肤真菌病，属于临床常发疾病，主要表现为局部的皮肤炎症和病变，对生长发育和育肥增重效果影响较大。引起牛皮肤癣菌病的病原有疣状毛癣菌(Trichophyton verrucosum)、须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)、犬小孢子菌(Microsporum canis)、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、石膏样小孢子菌(Microsporum gypseum)等。同时，疣状毛癣菌、犬小孢子菌和须毛癣菌属于重要的人兽共患病原菌，可引起人感染皮肤癣菌病，对公共卫生安全造成了较大威胁。
目前，真菌分型鉴定通常采用分离培养及菌落表型特征分析，但是分离培养时间周期长，人为误差大，对于混合真菌样品难以区分，很难对疑似菌进行准确鉴别。近年来，分子生物学检测技术发展迅速，在一定程度上为真菌种属鉴别以及基因分型提供了有力支撑，包括线粒体DNA限制性片段长度多态性分析、随机扩增多态性分析以及基于PCR的限制性片段长度多态性分析和随机引物法等，但这些方法存在培养物纯度难以达到要求，操作步骤繁琐等缺点。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种识别疣状毛癣菌的特异性引物对，所述的特异性引物对具体为：正向引物如SEQ NO.1所示，逆向引物如SEQ NO.2所示。
本发明还提供了一种识别犬小孢子茵的特异性引物对，所述的特异性引物对具体为：正向引物如SEQ NO.3所示，逆向引物如SEQ NO.4所示。
本发明还提供了一种识别须毛癣菌感的特异性引物对，所述的特异性引物对具体为：正向引物如SEQ NO.5所示，逆向引物如SEQ NO.6所示。
本发明还提供了一种同时检测疣状毛癣菌、犬小孢子茵和须毛癣菌的试剂盒，包括上述引物对中的至少一种。
本发明还提供了一种同时检测疣状毛癣菌、犬小孢子茵和须毛癣菌的多重PCR检测方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样品基因组DNA；
(2)使用SEQ NO.1-SEQ NO.6引物对进行扩增；
(3)凝胶电泳检测，于凝胶成像系统下拍照检测，分别存在581bp、1513bp、371bp的DNA特异性条带，则确定样品中含有疣状毛癣菌、犬小孢子茵、须毛癣菌。
进一步的，步骤(2)中所述的PCR扩增反应程序为：94℃预变性10min；进入循环，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min10s，30个循环；72℃延伸5min，降温4℃，结束。
本发明还提供了一种同时检测疣状毛癣菌、犬小孢子茵和须毛癣菌的多重PCR检测方法，其特征在于，使用上述试剂盒进行检测。
本发明具有以下有益效果：
本发明的设计了三对特异性引物，通过优化多重PCR反应条件，建立了一种可同时快速检测这3种真菌的多重PCR，具有检测时间短，成本低，检测结果特异性高，结果易判读，实用性强，可同时对牛源浅表真菌病原作出快速诊断与鉴别。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1：泳道1-8分别为疣状毛癣菌、须毛癣菌、犬小孢子菌、阿萨西毛孢子菌、Trichosporon loubieri、石膏样小孢子菌、红色毛癣菌和dd水；泳道9-16分别为须毛癣菌、疣状毛癣菌、犬小孢子菌、阿萨西毛孢子菌、Trichosporon loubieri、石膏样小孢子菌、红色毛癣菌和dd水；泳道17-24分别为犬小孢子菌、疣状毛癣菌、须毛癣菌、阿萨西毛孢子菌、Trichosporon loubieri、石膏样小孢子菌、红色毛癣菌和dd水；泳道1-8、泳道9-16和泳道17-24中每种病原菌DNA模板中分别加入引物TAFP-1/TAFP-4、QM-1/QM-4和XM-1/XM-4；
图2：多重PCR特异性验证；
图3：多重PCR引物浓度的优化；
图4：多重PCR退火温度优化；
图5：A—C：单重PCR中对引物TAFP-1/TAFP-4、QC6-1/QC6-4和XM-1/XM-1进行单独的灵敏度测定；A-C：泳道1—6：基因组浓度分别为10ng/L、1ng/L、500pg/L、100pg/L、10pg/L、1pg/L。
图6：多重PCR的灵敏度测定；泳道1—6：基因组浓度分别为10ng/L、1ng/L、500pg/L、100pg/L、10pg/L、1pg/L；
图7：发病样品的多重PCR检测结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，实施例中方法如无特殊说明均采用常规方法，使用试剂如无特殊说明，均为常规市售试剂或采用常规方法配置的试剂。该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例：
1)单重PCR特异性检测及结果
以3种目标病原菌基因组DNA为模板，分别以从病牛皮屑中分离的石膏样毛癣菌、红色毛癣菌、阿萨西毛孢子菌、Trichosporon loubieri等非目标病菌基因组DNA及ddH20为阴性对照，检测设计的3对引物的特异性。
如图1所示，以3种病原菌的DNA作为模板，用相应的引物经PCR扩增分别得到581bp、1513bp、371bp的特异性条带，与预期片段一致，而在阿萨西毛孢子菌、Trichosporonloubieri、石膏样小孢子菌、红色毛癣菌和阴性对照中均未能扩增出条带。说明引物特异性高，可用于多重PCR检测。
2)多重PCR特异性检测及结果
采用设计的3对引物优化的PCR体系，分别加入一种及多种目标病原菌DNA组合验证多重PCR特异性。
如图2所示，多重PCR反应随机扩增疣状毛癣菌、须毛癣菌以及犬小孢子菌这三种病原菌，均能扩增得到与目标片段大小一致的条带，说明这3对引物之间不会互相产生影响，检测特异性强。
3)多重PCR反应体系的建立及条件优化
在常规PCR反应的基础上，同时加入3种目标病原菌的基因组DNA和特异性引物，对影响多重PCR扩增的重要因素进行优化。引物用量设置如表1，不同反应体系中分别加入相应体积的每条引物。退火温度分别设置为50℃、52℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、62℃。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶成像仪进行拍照，筛选出最佳PCR体系。
表1引物用量设置
引物用量会影响多重PCR的扩增效率，如图3的1泳道所示，当引物浓度一样，犬小孢子菌目标条带较暗，通过逐步降低须毛癣菌和犬小孢子菌的引物用量，犬小孢子菌目标条带逐渐清晰，结果如图3的7泳道所示，当TAFP-1/TAFP-4、QC6-1/QC6-4、XM-1/XM-1分别加0.4L、1L和0.4L时，能获得3条清晰的条带，应为最佳引物浓度。此外，如图4所示，退火温度从50℃到57℃均可扩增出3条条带，55℃时条带清晰；当退火温度≥58℃时，多重PCR己不能扩增出须毛癣菌的目的条带。综合引物特异性和条带清晰度，本研究设定55℃为最佳退火温度。
4)多重PCR灵敏度检测及结果
牛源疣状毛癣菌、犬小孢子菌与须毛癣菌的基因组DNA提取物的浓度分别为62.2ng/L、66.4ng/L、51.1ng/L。使用DeNOVIX仪器将其浓度调至50ng/L，然后进行2～10倍梯度稀释，共6个梯度(10ng、1ng、500pg、100pg、10pg、1pg)，以3种病原菌10ng～1pg范围内的基因组DNA作为模板，分别加入3种病原菌及其引物进行单重PCR扩增。PCR反应体系(25L)：Premix Taq(Ex TaqVersion 2.0plus dye)12L，DNA模板1L，引物各0.4L、1L、0.4L，ddH20 6.4L。再以3种病原菌10ng～1pg范围内的基因组DNA为模板，每个反应中加入3种病原菌的基因组DNA和3对引物，多重PCR反应体系(25L)：2×PCR Mix 12L，3种DNA模板各1L，引物各0.4L、1L、和0.4L，加ddH20补足25L。按照优化的PCR程序进行扩增。
单重PCR灵敏度检测结果如图5A—C所示，疣状毛癣菌的检测极限是1pg/L，须毛癣菌的检测极限是1pg/L，犬小孢子菌的检测极限是1pg/L，三种菌在1pg/L时的检测结果都不明显。多重PCR灵敏度检测结果如图6所示，与单重PCR相比，疣状毛癣菌、须毛癣菌、犬小孢子菌的检测极限与单重PCR的结果一致，能够同时检测到5种病原菌的灵敏度为1pg/L。
5)发病样品的多重PCR检测及结果
采到1-10号样品，采集病变边缘处的皮屑。采用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取样品DNA，并采用本研究建立的多重PCR体系，对带菌样品进行三重PCR检测。
如图7所示，在病牛牛场采集到的10份发病样品中，10份发病样品中检测出疣状毛癣菌，其中有2份发病样品的检测结果不明显，7份发病样品中检测出须毛癣菌，其中有2份发病样品的检测结果不明显。10份发病样品中，所有样品都可见疣状毛癣菌，3份样品未见须毛癣菌，所有样品均未见犬小孢子菌。通过检测发现，病牛存在2种病原菌复合感染现象，还未发现三种病原菌复合感染现象。因此本研究建立的多重PCR体系可用于牛场病牛“铜钱癣”中疣状毛癣菌、须毛癣菌和犬小孢子菌的快速检测。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (7)
1.一种识别疣状毛癣菌的特异性引物对，其特征在于，所述的特异性引物对具体为：正向引物如SEQ NO.1所示，逆向引物如SEQ NO.2所示。
2.一种识别犬小孢子茵的特异性引物对，其特征在于，所述的特异性引物对具体为：正向引物如SEQ NO.3所示，逆向引物如SEQ NO.4所示。
3.一种识别须毛癣菌感的特异性引物对，其特征在于，所述的特异性引物对具体为：正向引物如SEQ NO.5所示，逆向引物如SEQ NO.6所示。
4.一种同时检测疣状毛癣菌、犬小孢子茵和须毛癣菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3所述的引物对中的至少一种。
5.一种同时检测疣状毛癣菌、犬小孢子茵和须毛癣菌的多重PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测样品基因组DNA；
(2)使用权利要求1-3所述的引物对进行扩增；
(3)凝胶电泳检测，于凝胶成像系统下拍照检测，分别存在581bp、1513bp、371bp的DNA特异性条带，则确定样品中含有疣状毛癣菌、犬小孢子茵、须毛癣菌。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述的PCR扩增反应程序为：94℃预变性10min；进入循环，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min10 s，30个循环；72℃延伸5min，降温4℃，结束。
7.一种同时检测疣状毛癣菌、犬小孢子茵和须毛癣菌的多重PCR检测方法，其特征在于，使用如权利要求4所述的试剂盒进行检测。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN202311066938.9A CN116855633B (zh) | 2023-08-23 | 一种同时检测疣状毛癣菌、犬小孢子菌和须毛癣菌的多重pcr检测方法与试剂盒 |
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN1696311A (zh) * | 2005-04-22 | 2005-11-16 | 中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所 | 检测致病真菌生物芯片 |
| CN111206114A (zh) * | 2020-03-03 | 2020-05-29 | 杭州缔蓝生物技术有限公司 | 九种皮肤癣菌的荧光pcr检测用引物及试剂盒 |
Patent Citations (2)
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| AR SALEHINODEH ET AL.: "In vitro effect of antigenic extract of Trichophyton verrucosum on fibroblast proliferation and matrix metalloproteinase-2 activities", 《IRAN J PUBLIC HEALTH》, vol. 41, no. 6, 30 June 2012 (2012-06-30), pages 93 - 96 * |
| 秦曼等: "四川家兔源万博节皮菌的分离鉴定及其致病性研究", 《中国兽医科学》, vol. 46, no. 9, 30 September 2016 (2016-09-30), pages 1079 - 1086 * |
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