CN114561477B - 牛str复合扩增检测试剂盒、引物组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了牛STR复合扩增检测试剂盒、引物组合物及其应用。具体地公开了同时扩增牛14个STR位点的引物组合物，所述14个STR位点分别为TGLA227、BM2113、ETH10、SPS115、ILSTS006、TGLA126、TGLA122、INRA023、BM1818、ETH225、BM1824、CSRM60、HAUT27和CSSM66，所述引物组合物由核苷酸序列分别如SEQ ID No.1‑28所示的引物组成。本发明用于牛个体识别与亲权鉴定的引物组合物、试剂盒及检测方法灵敏度高、稳定性好，可实现样本直接扩增，使用方法简单，符合牛DNA相关案件检验及DNA数据库建设要求。

Description

牛STR复合扩增检测试剂盒、引物组合物及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及法庭科学DNA检验技术领域，具体涉及牛STR复 合扩增检测试剂盒、引物组合物及其应用。
背景技术
俗称的“牛”是偶蹄目、牛科、牛亚科下的一族动物，共有5属，包括非洲水牛 和美洲野牛、黄牛、水牛和牦牛。其中黄牛是中国固有的普通牛种，其在中国的饲养 头数在大家畜中或牛类中均居首位，饲养地区几乎遍布全国，在农区主要作役用，半 农半牧区役乳兼用，牧区则乳肉兼用，是一种对我国农牧民非常重要的家畜。
短串联重复(Short tandem repeats，STR)，又称微卫星DNA(MicrosatelliteDNA) 或简单重复序列(Simple repeat sequence，SRS或SSR)，是广泛存在于原核生物和真核生物基因组中的核苷酸重复序列。有丝分裂过程中DNA链之间的错配引起的复制 滑动被认为是导致STR产生的较为常见原因，并且依据不同复制单元大小的不同以及 不同物种之间，复制滑动发生的概率也不相同。STR是以核心序列(core repeat units) 首尾相连多次重复形成。每个STR的核心序列结构相同，长度为2-6bp，但其重复单 位数目和重复区域的长度不同，因此STR在不同人群之间的分布具有差异性，构成了 STR遗传多态性。不同个体之间在一个同源STR位点的重复次数也不同，因而同指纹 识别一样，STR位点分析也可对个体进行身份识别。通过识别个体基因组在特定位点的特定序列重复，即可创建其基因档案。基于此，STR分析法已经成为一种重要的鉴 定分析方法，应用于法医学、亲子鉴定及细胞鉴定等领域。
目前，进行牛个体识别和亲缘关系鉴定主流采用的商品化试剂盒是美国ABI公司的StockMarks牛基因分型试剂盒，该试剂盒是采用国际动物遗传学会(ISAG)推荐的 微卫星标记进行牛亲缘关系鉴定和基因分型的，包括以下11个位点：TGLA227、BM2113、 TGLA53、ETH10、SPS115、TGLA126、TGLA122、INRA023、ETH3、ETH225、BM1824，采用四色荧光标记。此外，还有美国ThermoFisher公司的Bovine Genotypes Panel 3.1 Kit，可实现单管18个STR位点的复合扩增，其中包括国际动物遗传学会(ISAG)推 荐的12个位点：TGLA227、BM2113、TGLA53、ETH10、SPS115、TGLA126、TGLA122、INRA023、 ETH3、ETH225、BM1824、BM1818，以及联合国粮农组织(FAO)推荐的6个位点:SPS113、 RM067、CSRM60、MGTG4B、CSSM66、ILSTS006，采用五色荧光标记。该产品价格昂贵， 且技术垄断，此外还存在位点少、检测速度慢、无法实现直接扩增、识别率低等一系列问题。
针对上述现状，迫切需要开展用于牛个体识别和亲权鉴定的检验试剂研究开发工作，即在对现有牛STR技术进行深入研究的基础上，针国内分布较为广泛的黄牛进行DNA检验试剂的研究和开发。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何准确、方便地解决牛个体识别的问题，和/或，牛亲缘关系鉴定的问题。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术 人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于扩增牛14个STR位点的引物组合物，所述引物组合物由扩增如下14个STR位点的引物对组成：TGLA227、BM2113、ETH10、 SPS115、ILSTS006、TGLA126、TGLA122、INRA023、BM1818、ETH225、BM1824、CSRM60、 HAUT27和CSSM66，其中：
扩增TGLA227的引物对分别是核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA和核苷酸序列是SEQ ID No.2的DNA；
扩增BM2113的引物对分别是核苷酸序列是SEQ ID No.3的DNA和核苷酸序列是SEQID No.4的DNA；
扩增ETH10的引物对分别是核苷酸序列是SEQ ID No.5的DNA和核苷酸序列是SEQID No.6的DNA；
扩增SPS115的引物对分别是核苷酸序列是SEQ ID No.7的DNA和核苷酸序列是SEQID No.8的DNA；
扩增ILSTS006的引物对分别是核苷酸序列是SEQ ID No.9的DNA和核苷酸序列是SEQ ID No.10的DNA；
扩增TGLA126的引物对分别是核苷酸序列是SEQ ID No.11的DNA和核苷酸序列是SEQ ID No.12的DNA；
扩增TGLA122的引物对分别是核苷酸序列是SEQ ID No.13的DNA和核苷酸序列是SEQ ID No.14的DNA；
扩增INRA023的引物对分别是核苷酸序列是SEQ ID No.15的DNA和核苷酸序列是SEQ ID No.16的DNA；
扩增BM1818的引物对分别是核苷酸序列是SEQ ID No.17的DNA和核苷酸序列是SEQ ID No.18的DNA；
扩增ETH225的引物对分别是核苷酸序列是SEQ ID No.19的DNA和核苷酸序列是SEQ ID No.20的DNA；
扩增BM1824的引物对分别是核苷酸序列是SEQ ID No.21的DNA和核苷酸序列是SEQ ID No.22的DNA；
扩增CSRM60的引物对分别是核苷酸序列是SEQ ID No.23的DNA和核苷酸序列是SEQ ID No.24的DNA；
扩增HAUT27的引物对分别是核苷酸序列是SEQ ID No.25的DNA和核苷酸序列是SEQ ID No.26的DNA；
扩增CSSM66的引物对分别是核苷酸序列是SEQ ID No.27的DNA和核苷酸序列是SEQ ID No.28的DNA。
进一步地，SEQ ID No.1-SEQ ID No.28所示的引物是根据STR位点两侧的保守序列 设计的引物，分别为：
扩增TGLA227的上游引物D18S1-F，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
扩增TGLA227的下游引物D18S1-R，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
扩增BM2113的上游引物D2S26-F，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
扩增BM2113的下游引物D2S26-R，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
扩增ETH10的上游引物D5S3-F，其核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
扩增ETH10的下游引物D5S3-R，其核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
扩增SPS115的上游引物D15-F，其核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；
扩增SPS115的下游引物D15-R，其核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
扩增ILSTS006的上游引物D7S8-F，其核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；
扩增ILSTS006的下游引物D7S8-R，其核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；
扩增TGLA126的上游引物D20S1-F，其核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；
扩增TGLA126的下游引物D20S1-R，其核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；
扩增TGLA122的上游引物D21S6-F，其核苷酸序列如SEQ ID No.13所示；
扩增TGLA122的下游引物D21S6-R，其核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；
扩增INRA023的上游引物D3S10-F，其核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；
扩增INRA023的下游引物D3S10-R，其核苷酸序列如SEQ ID No.16所示；
扩增BM1818的上游引物D23S21-F，其核苷酸序列如SEQ ID No.17所示；
扩增BM1818的下游引物D23S21-R，其核苷酸序列如SEQ ID No.18所示；
扩增ETH225的上游引物D9S2-F，其核苷酸序列如SEQ ID No.19所示；
扩增ETH225的下游引物D9S2-R，其核苷酸序列如SEQ ID No.20所示；
扩增BM1824的上游引物D1S34-F，其核苷酸序列如SEQ ID No.21所示；
扩增BM1824的下游引物D1S34-R，其核苷酸序列如SEQ ID No.22所示；
扩增CSRM60的上游引物D10S5-F，其核苷酸序列如SEQ ID No.23所示；
扩增CSRM60的下游引物D10S5-R，其核苷酸序列如SEQ ID No.24所示；
扩增HAUT27的上游引物D26S21-F，其核苷酸序列如SEQ ID No.25所示；
扩增HAUT27的下游引物D26S21-R，其核苷酸序列如SEQ ID No.26所示；
扩增CSSM66的上游引物D14S31-F，其核苷酸序列如SEQ ID No.27所示；
扩增CSSM66的下游引物D14S31-R，其核苷酸序列如SEQ ID No.28所示。
进一步地，所述引物组合物按照STR位点可分为四组，所述引物组合物由第一组STR位点的扩增引物、第二组STR位点的扩增引物、第三组STR位点的扩增引物和第 四组STR位点的扩增引物组成，
第一组STR位点的组成如下：TGLA227、BM2113、ETH10、SPS115和ILSTS006； 第二组STR位点的组成如下：TGLA126、TGLA122、INRA023和BM1818；
第三组STR位点的组成如下：ETH225和BM1824；
第四组STR位点的组成如下：CSRM60、HAUT27和CSSM66；
所述第一组STR位点的扩增引物、第二组STR位点的扩增引物、第三组STR位点 的扩增引物和第四组STR位点的扩增引物采用的荧光染料标记物彼此不同。
上述引物组合物中，所述第一组STR位点的扩增引物采用的荧光染料标记物可为6-FAM；所述第二组STR位点的扩增引物采用的荧光染料标记物可为HEX；所述第三组 STR位点的扩增引物采用的荧光染料标记物可为TAMRA；所述第四组STR位点的扩增引 物采用的荧光染料标记物可为ROX。
在本发明的一个实施方案中，所述第一组STR位点(TGLA227、BM2113、ETH10、SPS115、ILSTS006)为蓝色组，荧光染料标记物为6-FAM；所述第二组STR位点(TGLA126、TGLA122、INRA023、BM1818)为绿色组，荧光染料标记物为HEX；所述第三组STR位 点(ETH225、BM1824)为黄色组，荧光染料标记物为TAMRA；所述第四组STR位点(CSRM60、HAUT27、CSSM66)为红色组，荧光染料标记物为ROX；内标NH500为橙色组，荧光染 料标记物为NH650。
本发明荧光STR复合扩增检测STR位点排布图如图1所示。
本发明还提供了用于扩增牛14个STR位点的试剂，所述试剂包括本文中任一所 述的引物组合物。
进一步地，所述试剂可为溶液，所述试剂中，
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物的浓度为0.125μM；
SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示引物的浓度为0.25μM；
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示引物的浓度为0.5μM；
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示引物的浓度为0.25μM；
SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示引物的浓度为0.5μM；
SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示引物的浓度为0.25μM；
SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示引物的浓度为0.25μM；
SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示引物的浓度为0.5μM；
SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示引物的浓度为0.25μM；
SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示引物的浓度为0.25μM；
SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22所示引物的浓度为0.25μM；
SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示引物的浓度为0.25μM；
SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26所示引物的浓度为0.25μM；
SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28所示引物的浓度为0.25μM。
本发明还提供了一种用于牛个体识别和/或亲权鉴定的荧光STR复合扩增检测试剂盒，所述试剂盒包含本文中任一所述的引物组合物，或包含所述试剂。所述试剂可 为五色荧光STR复合扩增体系。
进一步地，所述试剂盒还包括PCR扩增所需要的Taq DNA聚合酶、dNTP、PCR缓 冲液、Mg2+中的一种或多种。
所述试剂盒的各种试剂组分可以存在于分开的容器中，或者可以全部或部分预组合成试剂混合物。
所述试剂盒可单管同时扩增14个牛的STR位点，主要包括TGLA227、BM2113、ETH10、SPS115、ILSTS006、TGLA126、TGLA122、INRA023、BM1818、ETH225、BM1824、 CSRM60、HAUT27和CSSM66；所述STR位点排布如图1所示。
在本发明的一个实施方案中，所述试剂盒包含如表1中所示的复合扩增体系。
表1 荧光STR复合扩增检测试剂盒复合扩增体系
在本发明的一个实施方案中，所述复合扩增体系为10μl，由2μL 5×PCR缓冲 液、5μL 2×牛荧光STR复合扩增引物组合物、1μL提取DNA和2μL ddH2O组成。
其中5×PCR缓冲液具体可为：50mM Tris-HCl Ph8.3；7.5mM MgCl2；1mM dNTP；0.5％ TritonX-100；25％甘油；
2×牛荧光STR复合扩增引物组合物的溶质为表3中的14条5’标记荧光引物与 14条非荧光标记引物，引物浓度和加入量如表1所示，溶剂为10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA。
本发明还提供了一种扩增牛14个STR位点的方法，所述方法包括如下步骤：
A1)提取待测样本DNA；
A2)以所述DNA为模板，利用所述引物组合物或所述试剂进行PCR扩增，得到扩 增产物；
A3)采用毛细管电泳进行检测。
上述方法中，所述PCR扩增中采用的PCR反应温度程序可为：95℃11分钟；94℃ 30秒，59℃2分钟，72℃45秒，27-29个循环；60℃30分钟；4℃保存。
上述方法中，所述待测样本可为牛组织或血液。
本发明还提供了一种扩增牛14个STR位点的复合扩增方法(直接扩增检测的方法)，所述方法包括如下步骤：
(1)将待测样本直接加入本发明所述复合扩增体系中进行PCR扩增，得到扩增 产物；
(2)采用毛细管电泳进行检测。
上述方法中，所述待测样本可为牛血卡类样本。
本发明还提供了本文任一所述的引物组合物，和/或，所述试剂，和/或，所述试 剂盒，和/或，所述扩增牛14个STR位点的方法在下述任一项中的应用：
B1)牛个体识别或制备牛个体识别的产品；
B2)牛亲缘关系鉴定或制备牛亲缘关系鉴定的产品；
B3)牛群体遗传学分析或制备牛群体遗传学分析的产品；
B4)牛DNA相关案件检验或制备牛DNA相关案件检验的产品；
B5)牛DNA数据库建设或制备牛DNA数据库建设的产品。
进一步地，所述牛可为非洲水牛、美洲野牛、黄牛、水牛和/或牦牛。
进一步地，所述牛可为黄牛。
本发明提供一种用于牛个体识别与亲权鉴定(又称亲缘关系鉴定)的荧光STR复合扩增检测试剂盒，可单管同时扩增包括14个STR位点，包括BM1818、BM1824、BM2113、CSRM60、CSSM66、ETH10、ETH225、HAUT27、ILSTS006、INRA023、SPS115、TGLA122、 TGLA126、TGLA227，采用成熟的五色荧光标记技术，灵敏度高、稳定性好，可实现样本直接扩增，使用方法简单，易于掌握，完全符合涉及到牛DNA相关案件检验要求及 牛DNA数据库建设要求。
附图说明
图1为荧光STR复合扩增检测STR位点排布图。
图2为实施例4中常规样本DNA检测的结果图。
图3为实施例4中血卡类样本直接扩增检测的结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域 普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文 献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等， 如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、牛荧光STR复合扩增检测试剂盒STR位点的筛选及引物的设计
本实施例提供一种牛荧光STR复合扩增检测试剂盒，其中包含五色荧光复合扩 增引物体系，通过对16个牛STR位点核心重复序列两端保守区序列组成特点的研究及优化筛选，最终选定14个牛STR基因座(STR位点)作为靶位点进行引物设计。 各STR基因座(STR位点)相应信息如表2所示：
表2 牛STR位点信息
位点名称 重复序列特点 重复序列
BM1818 simple (TG)n
BM1824 simple (GT)n
BM2113 simple (CA)n
CSRM60 simple (AC)n
CSSM66 simple (AC)n
ETH3 compound (GT)nAC(GT)6
ETH10 simple (AC)n
ETH225 compound (TG)4CG(TG)(CA)n
HAUT27 simple (AC)n
ILSTS006 simple (GT)n
INRA023 simple (AC)n
SPS115 compound (CA)nTA(CA)6
TGLA53 compound (TG)6CG(TG)4(TA)n
TGLA122 compound (AC)n(AT)n
TGLA126 simple (TG)n
TGLA227 simple (TG)n
最终选定的14个牛STR位点为：TGLA227、BM2113、ETH10、SPS115、ILSTS006、TGLA126、TGLA122、INRA023、BM1818、ETH225、BM1824、CSRM60、HAUT27和CSSM66。
根据STR位点两侧的保守序列设计引物如下：
扩增TGLA227的上游引物D18S1-F，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
扩增TGLA227的下游引物D18S1-R，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
扩增BM2113的上游引物D2S26-F，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
扩增BM2113的下游引物D2S26-R，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
扩增ETH10的上游引物D5S3-F，其核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
扩增ETH10的下游引物D5S3-R，其核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
扩增SPS115的上游引物D15-F，其核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；
扩增SPS115的下游引物D15-R，其核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
扩增ILSTS006的上游引物D7S8-F，其核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；
扩增ILSTS006的下游引物D7S8-R，其核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；
扩增TGLA126的上游引物D20S1-F，其核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；
扩增TGLA126的下游引物D20S1-R，其核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；
扩增TGLA122的上游引物D21S6-F，其核苷酸序列如SEQ ID No.13所示；
扩增TGLA122的下游引物D21S6-R，其核苷酸序列如SEQ ID No.14所示；
扩增INRA023的上游引物D3S10-F，其核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；
扩增INRA023的下游引物D3S10-R，其核苷酸序列如SEQ ID No.16所示；
扩增BM1818的上游引物D23S21-F，其核苷酸序列如SEQ ID No.17所示；
扩增BM1818的下游引物D23S21-R，其核苷酸序列如SEQ ID No.18所示；
扩增ETH225的上游引物D9S2-F，其核苷酸序列如SEQ ID No.19所示；
扩增ETH225的下游引物D9S2-R，其核苷酸序列如SEQ ID No.20所示；
扩增BM1824的上游引物D1S34-F，其核苷酸序列如SEQ ID No.21所示；
扩增BM1824的下游引物D1S34-R，其核苷酸序列如SEQ ID No.22所示；
扩增CSRM60的上游引物D10S5-F，其核苷酸序列如SEQ ID No.23所示；
扩增CSRM60的下游引物D10S5-R，其核苷酸序列如SEQ ID No.24所示；
扩增HAUT27的上游引物D26S21-F，其核苷酸序列如SEQ ID No.25所示；
扩增HAUT27的下游引物D26S21-R，其核苷酸序列如SEQ ID No.26所示；
扩增CSSM66的上游引物D14S31-F，其核苷酸序列如SEQ ID No.27所示；
扩增CSSM66的下游引物D14S31-R，其核苷酸序列如SEQ ID No.28所示。
实施例2、复合扩增体系引物浓度优化
荧光STR复合扩增引物体系的优化与建立是牛荧光复合扩增试剂盒研发的核心内容。在完成单引物筛选及设计工作后，需要将各单引物进行混合并进行复合扩增 调试，同单位点扩增一样，需要排除产生非特异及扩增效率低下的引物；最后，在 初步确定了各基因座复合扩增引物后，进行引物浓度调配，在初次复合扩增时应以等摩尔数引物加入反应体系，然后根据反应结果调整各对引物浓度比例；最终通过 大量实验确定引物序列及浓度如表3所示。
表3 复合扩增体系引物终浓度
实施例3、牛STR复合扩增缓冲试剂体系构建
复合扩增试剂体系决定着体系的灵敏度、稳定性、扩增能力、扩增效率等诸多 试剂关键性能参数。首先，基于实施例2配制的引物体系，开展PCR缓冲液优化与研究，经过大量PCR组分和浓度的优化实验，摸索出不同成分对体系扩增性能的影 响，建立系统的优化及评价方法，在确定各分组分的基础上，需要进行各成分的联 合应用测试，优化出配套的循环参数，最终建立复合扩增缓冲试剂体系，最终反应 体系如表4所示，PCR循环参数如表5所示：
表4 复合扩增缓冲试剂体系
表5 PCR循环参数
实施例4、牛荧光STR复合扩增试剂盒的应用
一、常规样本DNA检测
待测样本为实际案件样本黄牛血液样本。
1、提取待测样本DNA
采用Magattract M48试剂盒按照操作说明书进行DNA提取。
2、以所述DNA为模板，利用本发明的复合扩增体系进行PCR扩增，得到扩增产 物
(1)制备复合扩增体系。复合扩增体系为10μl，由2μL 5×PCR缓冲液、5μL 2×牛荧光STR复合扩增引物组合物、1μL提取DNA和2μL ddH2O组成。
其中5×PCR缓冲液具体为：
50mM Tris-HCl Ph8.3；7.5mM MgCl2；1mM dNTP；0.5％TritonX-100；25％甘油
2×牛荧光STR复合扩增引物组合物的溶质为表3中的14条5’标记荧光引物与 14条非荧光标记引物，引物浓度和加入量如表1所示，溶剂为10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA。
(2)按照实施例3中表5所示的循环参数进行扩增，得到扩增产物。
3、采用毛细管电泳进行检测
取1μl PCR产物加入到10μl的上样缓冲液(含去离子甲酰胺9.7μl，ROX-500 内标0.3μl)中，扩增产物经3130xl型遗传分析仪进行毛细管电泳检测，经 GeneMapper IDX 1.4软件分析后获得检测图谱。检测结果如图2所示。
检测结果表明，对于常规DNA类型样本来说，采用本发明复合扩增试剂检测获 得了完整的STR分型结果，且峰型尖锐、无位点丢失现象出现，完全满足个体识别 和鉴定的需要。
二、直接扩增检测
待测样本为实际案件样本黄牛血卡类样本，取孔径为1.2mm血卡直接加入复 合扩增体系中。
PCR体系参照实施例3，进行STR复合扩增，得到扩增产物。
按照实施例3中表5所示的循环参数进行扩增，得到扩增产物。
取上述扩增产物1μL，与甲酰胺内标混合物混合，95℃变性3分钟后冰浴， 采用3130xl型遗传分析仪进行毛细管电泳检测，经GeneMapper IDX 1.4软件分析获得检测图谱。结果如图3所示。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨 和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较 宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发 明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的 改变。
SEQUENCE LISTING
<110> 公安部物证鉴定中心
<120> 牛STR复合扩增检测试剂盒、引物组合物及其应用
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
acagaaactc aatgaaagca ggaa 24
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
cccaggaatt ccaaatctgt taatt 25
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
tgcatggtgc tgccttctac c 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
gagaagcaac acctgtcact tt 22
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
ttctctgtgt cgtcagagct cca 23
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 6
tgtagctctg tccagcgggt tc 22
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 7
ttcaccagag catctccaat atctc 25
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 8
ttaaatggtt tcagggaacc gagt 24
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 9
ctgtatttct gctgtggaaa g 21
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 10
gttacacgga agcgatctaa ac 22
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 11
ctctgaatat tccccaccac acc 23
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 12
ccactactct ctgctaattt agaatgag 28
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 13
atgccctcct ccaggtaaat ca 22
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 14
cacatggcaa ataagtacat acctatg 27
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 15
gctacaagat aaacttccag aaag 24
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 16
atttaactac agggtgttag atgaac 26
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 17
actgtgtgat ccagctggga atat 24
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 18
gtccatgcat gttatcacaa atgg 24
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 19
tttctgatca ccttgccact atttc 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 20
gccagctgct actagagaag ttgac 25
<210> 21
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 21
ataaactaaa agatagtaga gcaaggtg 28
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 22
ttgaaatggt gcgtgaaagg ta 22
<210> 23
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 23
gatccaagag agaggcagag ag 22
<210> 24
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 24
ggttttcagg accagatcgt ga 22
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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tttgactgga ttgtttgctt gttg 24
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 26
atctttactc tgataactgc tgaaatctc 29
<210> 27
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 27
gagcttgggc tgcagtctac ag 22
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 28
tcactgcaga gaaccaacac aaat 24

Claims (9)

1.用于扩增牛14个STR位点的引物组合物在牛个体识别或牛亲缘关系鉴定中的应用，所述引物组合物由扩增如下14个STR位点的引物对组成：TGLA227、BM2113、ETH10、SPS115、ILSTS006、TGLA126、TGLA122、INRA023、BM1818、ETH225、BM1824、CSRM60、HAUT27和CSSM66，其中：
扩增TGLA227的引物对分别是核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA和核苷酸序列是SEQ IDNo.2的DNA；
扩增BM2113的引物对分别是核苷酸序列是SEQ ID No.3的DNA和核苷酸序列是SEQ IDNo.4的DNA；
扩增ETH10的引物对分别是核苷酸序列是SEQ ID No.5的DNA和核苷酸序列是SEQ IDNo.6的DNA；
扩增SPS115的引物对分别是核苷酸序列是SEQ ID No.7的DNA和核苷酸序列是SEQ IDNo.8的DNA；
扩增ILSTS006的引物对分别是核苷酸序列是SEQ ID No.9的DNA和核苷酸序列是SEQID No.10的DNA；
扩增TGLA126的引物对分别是核苷酸序列是SEQ ID No.11的DNA和核苷酸序列是SEQID No.12的DNA；
扩增TGLA122的引物对分别是核苷酸序列是SEQ ID No.13的DNA和核苷酸序列是SEQID No.14的DNA；
扩增INRA023的引物对分别是核苷酸序列是SEQ ID No.15的DNA和核苷酸序列是SEQID No.16的DNA；
扩增BM1818的引物对分别是核苷酸序列是SEQ ID No.17的DNA和核苷酸序列是SEQ IDNo.18的DNA；
扩增ETH225的引物对分别是核苷酸序列是SEQ ID No.19的DNA和核苷酸序列是SEQ IDNo.20的DNA；
扩增BM1824的引物对分别是核苷酸序列是SEQ ID No.21的DNA和核苷酸序列是SEQ IDNo.22的DNA；
扩增CSRM60的引物对分别是核苷酸序列是SEQ ID No.23的DNA和核苷酸序列是SEQ IDNo.24的DNA；
扩增HAUT27的引物对分别是核苷酸序列是SEQ ID No.25的DNA和核苷酸序列是SEQ IDNo.26的DNA；
扩增CSSM66的引物对分别是核苷酸序列是SEQ ID No.27的DNA和核苷酸序列是SEQ IDNo.28的DNA。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述引物组合物按照STR位点分为四组，所述引物组合物由第一组STR位点的扩增引物、第二组STR位点的扩增引物、第三组STR位点的扩增引物和第四组STR位点的扩增引物组成，
第一组STR位点的组成如下：TGLA227、BM2113、ETH10、SPS115和ILSTS006；第二组STR位点的组成如下：TGLA126、TGLA122、INRA023和BM1818；
第三组STR位点的组成如下：ETH225和BM1824；
第四组STR位点的组成如下：CSRM60、HAUT27和CSSM66；
所述第一组STR位点的扩增引物、第二组STR位点的扩增引物、第三组STR位点的扩增引物和第四组STR位点的扩增引物采用的荧光染料标记物彼此不同。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述第一组STR位点的扩增引物采用的荧光染料标记物为6-FAM；所述第二组STR位点的扩增引物采用的荧光染料标记物为HEX；所述第三组STR位点的扩增引物采用的荧光染料标记物为TAMRA；所述第四组STR位点的扩增引物采用的荧光染料标记物为ROX。
4.用于扩增牛14个STR位点的试剂在牛个体识别或牛亲缘关系鉴定中的应用，所述试剂包括权利要求1-3中任一所述的引物组合物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂为溶液，所述试剂中，
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物的浓度为0.125μM；
SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示引物的浓度为0.25μM；
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示引物的浓度为0.5μM；
SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示引物的浓度为0.25μM；
SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示引物的浓度为0.5μM；
SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示引物的浓度为0.25μM；
SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示引物的浓度为0.25μM；
SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示引物的浓度为0.5μM；
SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示引物的浓度为0.25μM；
SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示引物的浓度为0.25μM；
SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22所示引物的浓度为0.25μM；
SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示引物的浓度为0.25μM；
SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26所示引物的浓度为0.25μM；
SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28所示引物的浓度为0.25μM。
6.一种试剂盒在牛个体识别或牛亲缘关系鉴定中的应用，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1-3中任一所述的引物组合物，或包含权利要求4或5所述的试剂。
7.一种扩增牛14个STR位点的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
A1)提取待测样本DNA；
A2)以所述DNA为模板，利用权利要求1-3中任一所述的引物组合物，或权利要求4或5所述的试剂进行PCR扩增，得到扩增产物；
A3)采用毛细管电泳进行检测。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增中采用的PCR反应温度程序为：95℃11分钟；94℃30秒，59℃2分钟，72℃45秒，27-29个循环；60℃30分钟；4℃保存。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述待测样本为牛组织或血液。
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