KR102512271B1 - 초위성체 마커를 이용한 경주마의 개체식별 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 초위성체 마커를 이용한 경주마의 개체식별 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 초위성체 마커를 이용한 경주마의 개체식별 방법은 AHT4, AHT5, ASB2, HMS3, HMS6, HMS7, HTG4, HTG10, VHL20, ASB17, ASB23, HMS1, LEX3, CA425, HMS2, HTG6, HTG7, LEX033, AMEL, HMS18, LEX27, SRY 및 LEX020으로 이루어진 제1세트, 또는, HTG21, COR089, TKY279, TKY287, TKY294, TKY297, TKY301, TKY312, TKY321, TKY325, TKY333, TKY337, TKY341, TKY343, TKY344, TKY374 및 TKY394로 이루어진 제2세트 중에서 한 세트 이상을 조합한 초위성체 마커를 이용하여 다중 PCR 증폭하는 단계; 상기 다중 PCR 증폭하는 단계에서 증폭된 산물을 전기영동장치를 통해 대립유전자를 검출하고 크기를 분석하여 유전자형을 결정하는 단계; 및 상기 전기영동장치를 통해 분석된 대립유전자의 크기를 개체별 및 품종별로 정리하여 이를 기초로 한 대립유전자의 수 및 빈도 분포를 작성하는 단계를 포함한다.
상기한 구성에 의해 본 발명에 따른 초위성체 마커를 이용한 경주마의 개체식별 방법은 초위성체 마커(Microsatellite Marker)를 이용한 다중 중합연쇄반응(Multiplex PCR)을 통하여 기존의 기술보다 보다 신속하고 정확하며 경제적으로 경주마의 개체를 식별하거나 친자감정 등을 안정적으로 수행할 수 있다.
본 발명에 따른 초위성체 마커를 이용한 경주마의 개체식별 방법은 AHT4, AHT5, ASB2, HMS3, HMS6, HMS7, HTG4, HTG10, VHL20, ASB17, ASB23, HMS1, LEX3, CA425, HMS2, HTG6, HTG7, LEX033, AMEL, HMS18, LEX27, SRY 및 LEX020으로 이루어진 제1세트, 또는, HTG21, COR089, TKY279, TKY287, TKY294, TKY297, TKY301, TKY312, TKY321, TKY325, TKY333, TKY337, TKY341, TKY343, TKY344, TKY374 및 TKY394로 이루어진 제2세트 중에서 한 세트 이상을 조합한 초위성체 마커를 이용하여 다중 PCR 증폭하는 단계; 상기 다중 PCR 증폭하는 단계에서 증폭된 산물을 전기영동장치를 통해 대립유전자를 검출하고 크기를 분석하여 유전자형을 결정하는 단계; 및 상기 전기영동장치를 통해 분석된 대립유전자의 크기를 개체별 및 품종별로 정리하여 이를 기초로 한 대립유전자의 수 및 빈도 분포를 작성하는 단계를 포함한다.
상기한 구성에 의해 본 발명에 따른 초위성체 마커를 이용한 경주마의 개체식별 방법은 초위성체 마커(Microsatellite Marker)를 이용한 다중 중합연쇄반응(Multiplex PCR)을 통하여 기존의 기술보다 보다 신속하고 정확하며 경제적으로 경주마의 개체를 식별하거나 친자감정 등을 안정적으로 수행할 수 있다.
Description
본 발명은 초위성체 마커를 이용한 경주마의 개체식별 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 초위성체 마커(Microsatellite Marker)를 이용한 다중 중합연쇄반응(Multiplex PCR)을 통하여 기존의 기술보다 보다 신속하고 정확하며 경제적으로 경주마의 개체를 식별하거나 친자감정 등을 안정적으로 수행할 수 있는 초위성체 마커를 이용한 경주마의 개체식별 방법에 관한 것이다.
최근 들어 유전자원에 대한 미래 활용가치의 중요성이 인식되면서 자원의 확보, 보존, 관리와 더불어 특성평가 및 활용 등에 많은 관심과 노력을 기울이고 있다. 특히 DNA 다형에 기초한 여러 유전적 마커를 활용하여 기원, 품종 형성, 유전적 다양성, 타 품종들과의 유연관계 등 보유자원의 유전적 특성 파악을 위한 분자생물학적 특성평가가 활발히 진행되고 있다(Groeneveld et al, (2010) Anim Genet. 41:6-31).
초위성체(Microsatellite, MS)는 2 내지 6개의 염기서열이 반복되는 구조를 나타내며, 진핵생물 DNA 상의 비암호화(non-coding) 영역에 넓게 펴져 존재한다(Tautz와 Renz, (1984) Nucleic Acids Res. 12:4127-4138).
또한, 초위성체 하나의 좌위 당 약 10개 정도의 대립유전자를 나타내기 때문에 다형정보가 풍부하며, 크기가 작기 때문에 혈액, 모근, 피부 등 다양한 시료로부터 추출된 DNA를 이용하여 쉽게 증폭할 수 있다. 특히, 2개 이상의 초위성체 특이 프라이머를 한 번에 반응 및 증폭시킬 수 있는 멀티플렉스(multiplex) PCR 기법을 적용할 수 있기 때문에 저비용으로 손쉽게 대립유전자형을 분석할 수 있는 장점이 있다(Butler, (2007) Biotechniques 43:Sii-Sv).
초위성체의 이러한 장점을 활용하여 1990년대부터 사람, 가축을 포함한 동물의 유전특성 및 유연관계 분석, 연관지도 작성 등에 있어 가장 효율적인 유전적 마커로서 활용되고 있다(Naidoo와 Chetty, (1998) Pathol Oncol Res. 4:310-315).
또한, 현재까지도 품종 혹은 집단의 유전적 다양성, 양적유전자좌위 동정, 개체식별 및 친자감별 등에 이용되고 있다(Gutierrez-Gil et al, (2010) Meat Sci. 85:721-729; Costa et al, (2012) BMC Res Notes. 5:479). 아울러, 국내에서도 초위성체 분석을 통해 여러 학술적·산업적 성과가 도출되고 있으며, 이와 함께 한우·수입육 판별법 개발, 쇠고기 이력 관리제 등이 추진되고 있다.
한편, 국내에서 경주마 유전자의 보존 측면과 품종 간 유전적 다양성 연구와 친자 확인용으로 개발된 유전자 표지(초위성체 마커: Microsatellite Marker)를 활용한 유전자 감식 기법이 사용되고 있긴 하지만, 아직 그 유용성 및 정확도가 떨어질 뿐만 아니라 상대적으로 검사 비용이 비싸고 분석 시간이 오래 걸리는 단점이 있다.
본 발명은 초위성체 마커(Microsatellite Marker)를 이용한 다중 중합연쇄반응(Multiplex PCR)을 통하여 기존의 기술보다 보다 신속하고 정확하며 경제적으로 경주마의 개체를 식별하거나 친자감정 등을 안정적으로 수행할 수 있는 초위성체 마커를 이용한 경주마의 개체식별 방법을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명은 종래 마커보다 저렴한 비용으로 더욱 정확한 결과를 도출함으로써 재검률을 감소시키고 검사시간 및 검사인력을 최소화하며 일반마 및 당나귀 등의 개체식별 및 친자감정에도 확대 수행되어 호환성이 증대될 수 있는 초위성체 마커를 이용한 경주마의 개체식별 방법을 제공하는데 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 다양한 과제들은 이상에서 언급한 과제들에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명에 따른 초위성체 마커를 이용한 경주마의 개체식별 방법은 AHT4, AHT5, ASB2, HMS3, HMS6, HMS7, HTG4, HTG10, VHL20, ASB17, ASB23, HMS1, LEX3, CA425, HMS2, HTG6, HTG7, LEX033, AMEL, HMS18, LEX27, SRY 및 LEX020으로 이루어진 제1세트, 또는, HTG21, COR089, TKY279, TKY287, TKY294, TKY297, TKY301, TKY312, TKY321, TKY325, TKY333, TKY337, TKY341, TKY343, TKY344, TKY374 및 TKY394로 이루어진 제2세트 중에서 한 세트 이상을 조합한 초위성체 마커를 이용하여 다중 PCR 증폭하는 단계; 상기 다중 PCR 증폭하는 단계에서 증폭된 산물을 전기영동장치를 통해 대립유전자를 검출하고 크기를 분석하여 유전자형을 결정하는 단계; 및 상기 전기영동장치를 통해 분석된 대립유전자의 크기를 개체별 및 품종별로 정리하여 이를 기초로 한 대립유전자의 수 및 빈도 분포를 작성하는 단계를 포함한다.
상기 다중 PCR 증폭하는 단계에서 상기 초위성체 마커는 제1세트 및 제2세트로 이루어질 수 있다.
상기 제1세트는 AHT4(서열목록 1 및 2), AHT5(서열목록 3 및 4), ASB2(서열목록 5 및 6), HMS3(서열목록 7 및 8), HMS6(서열목록 9 및 10), HMS7(서열목록 11 및 12), HTG4(서열목록 13 및 14), HTG10(서열목록 15 및 16), VHL20(서열목록 17 및 18), ASB17(서열목록 19 및 20), ASB23(서열목록 21 및 22), HMS1(서열목록 23 및 24), LEX3(서열목록 25 및 26), CA425(서열목록 27 및 28), HMS2(서열목록 29 및 30), HTG6(서열목록 31 및 32), HTG7(서열목록 33 및 34), LEX033(서열목록 35 및 36), AMEL(서열목록 37 및 38), HMS18(서열목록 39 및 40), LEX27(서열목록 41 및 42), SRY(서열목록 43 및 44) 및 LEX020(서열목록 45 및 46)으로 이루어진 정방향 및 역방향 프라이머를 포함할 수 있다.
상기 제2세트는 HTG21(서열목록 47 및 48), COR089(서열목록 49 및 50), TKY279(서열목록 51 및 52), TKY287(서열목록 53 및 54), TKY294(서열목록 55 및 56), TKY297(서열목록 57 및 58), TKY301(서열목록 59 및 60), TKY312(서열목록 61 및 62), TKY321(서열목록 63 및 64), TKY325(서열목록 65 및 66), TKY333(서열목록 67 및 68), TKY337(서열목록 69 및 70), TKY341(서열목록 71 및 72), TKY343(서열목록 73 및 74), TKY344(서열목록 75 및 76), TKY374(서열목록 77 및 78) 및 TKY394(서열목록 79 및 80)로 이루어진 정방향 및 역방향 프라이머를 포함할 수 있다.
상기 다중 PCR 증폭하는 단계에서 상기 다중 PCR 증폭 조건은 95℃에서 2분간 유지하고, 95℃에서 30초 동안 denaturation, 56.5℃에서 90초 동안 annealing, 72℃에서 60초 동안 extension을 33회 반복한 후, 72℃에서 30분 동안 final-extension을 수행하며, 4℃에서 유지함으로써 이루어질 수 있다.
기타 실시 예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명에 포함되어 있다.
본 발명에 따른 초위성체 마커를 이용한 경주마의 개체식별 방법은 초위성체 마커(Microsatellite Marker)를 이용한 다중 중합연쇄반응(Multiplex PCR)을 통하여 기존의 기술보다 보다 신속하고 정확하며 경제적으로 경주마의 개체를 식별하거나 친자감정 등을 안정적으로 수행할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 초위성체 마커를 이용한 경주마의 개체식별 방법은 종래 마커보다 저렴한 비용으로 더욱 정확한 결과를 도출함으로써 재검률을 감소시키고 검사시간 및 검사인력을 최소화하며 일반마 및 당나귀 등의 개체식별 및 친자감정에도 확대 수행되어 호환성이 증대될 수 있다.
본 발명의 기술적 사상의 실시예는, 구체적으로 언급되지 않은 다양한 효과를 제공할 수 있다는 것이 충분히 이해될 수 있을 것이다.
도 1 내지 도 9는 본 발명에 따른 초위성체 마커를 이용한 경주마의 개체식별 방법에 따라 수행된 경주마 유전자(DNA) 판독 결과를 보여주는 그래프이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예를 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미가 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미가 있는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
이하, 본 발명에 따른 초위성체 마커를 이용한 경주마의 개체식별 방법에 대하여 바람직한 실시예를 들어 상세하게 설명한다.
한편, 본 발명에 따른 초위성체 마커를 이용한 경주마의 개체식별 방법은 초위성체 마커(Microsatellite Marker)를 이용한 다중 중합연쇄반응(Multiplex PCR)을 통하여 경주마(racehorse)의 개체식별이나 친자감정에 이용될 수 있는 것을 일 예로 들어 설명하나, 본 발명의 기술적 사상은 상기한 경주마에만 한정되는 것은 아니고, 상기 경주마 이외에도 일반마, 당나귀를 포함한 이종 동물에도 확대 적용가능함을 밝힌다.
본 발명에서 용어, "초위성체(microsatellite)"는 2 내지 6개의 염기서열이 반복되는 구조를 가지는 STR(short tandem repeat)을 의미한다. 이러한 초위성체는 대부분의 진핵생물 게놈에 골고루 분포되어 있는 것으로 알려져 있으며, 특히 non-coding DNA에 주로 존재한다.
본 발명에서 용어, "초위성체 마커"는 상기 초위성체 반복 단위의 반복수에 변이가 존재하여 발생하는 다형성을 의미한다.
이와 같은 초위성체 마커는, 개체 또는 종에 따라 초위성체 반복 단위의 반복수가 다양할 수 있으므로, 초위성체가 반복되는 부분의 양쪽 염기쌍 중에 유전자상에서 독특한 서열을 프라이머 서열로 디자인하고 PCR 증폭을 수행한 다음, 수득하는 산물의 크기를 비교하여 개체 또는 종을 식별할 수 있다.
본 발명에서 용어, "프라이머(primer)"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.
본 발명에서 용어, "PCR(polymerase chain reaction)"은 DNA의 원하는 부분을 복제 및 증폭시키는 분자생물학적 기술이다. 구체적으로, PCR은 일련의 세 개의 단계를 포함한다. PCR의 첫 번째 단계는 DNA를 변성(Denaturation)시키는 것으로, 두 가닥의 DNA를 가열함으로써 분리시킬 수 있다. 분리된 각각의 DNA는 주형(Template)으로서 역할을 하게 된다.
PCR의 두 번째 단계는 결합(Annealing)으로, 이 단계에서 초위성체 마커에 대한 프라이머들이 주형 DNA에 결합을 하게 된다. 결합(Annealing) 온도는 반응의 정확성을 결정하는 중요한 요소인데 만약 온도를 너무 높게 하면 프라이머가 주형 DNA에 너무 약하게 결합되어서 증폭된 DNA의 산물이 매우 적어진다. 그리고 만약 온도를 너무 낮게 하면 프라이머가 비특이적으로 결합하기 때문에 원하지 않는 DNA가 증폭될 수 있어, 사용하는 프라이머들의 종류 등에 따라 온도는 적절히 조절되어야 한다.
PCR의 세 번째 단계는 신장(Extension) 단계이다. 이 단계에서 주형에 프라이머가 결합한 경우에는 열에 강한 DNA 중합효소가 주형 DNA에서 새로운 DNA를 만들게 된다.
본 발명과 같이 수개의 초위성체 마커에 대하여 분석을 수행하는 경우에는 멀티플렉스 PCR을 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어, "다중 PCR(multiplex PCR)"은, 하나의 주형 DNA에 대한 한 개의 유전자를 증폭하는 단일 PCR과 달리 여러 개의 유전자를 동시에 증폭하는 PCR 기법을 의미한다. 다중 PCR에서는 단일 PCR 혼합물에 여러 프라이머쌍이 포함시키는데, 이때 서로 다른 DNA 서열에 대해서는 각각에 특이적인 증폭 산물의 크기 범위를 나타내어 크기가 서로 중첩되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
다중 PCR 기법에서는 여러 종류의 다른 프라이머 쌍을 한 튜브에 넣고 반응시키기 때문에, 프라이머 간에 억제(inhibition)가 발생할 수 있으므로, 다중 PCR에 적용할 때에는 증폭하고자 하는 유전자들에 대한 프라이머들의 선정이 중요하다.
또한, 포함되는 여러 프라이머마다 적합한 결합 온도가 다를 수 있으므로, 다중 PCR 적용시에는 단일 PCR 반응에서 포함되는 PCR 프라이머 쌍 모두가 효과적으로 결합할 수 있도록 다중 PCR에 적합한 결합 온도의 최적화가 요구된다.
이와 같은 PCR 수행 후에는, PCR 증폭 산물은 SDS-PAGE나 모세관 전기영동(capillary electrophoresis)과 같은, PCR 증폭 산물의 크기에 따른 분류가 가능한 기법으로 개체 식별을 할 수 있다.
구체적으로, 전기영동법 등으로 PCR 증폭 산물을 크기별로 분류하여 이의 크기 결정을 통하여 각 대립유전자에 얼마나 많은 반복단위가 포함되어 있는지 알 수 있다. 따라서, 상기와 같은 유전자형 데이터와 검증한 경주마의 데이터를 기록하는 데이터 베이스를 별도로 구축하거나 규명된 정보를 이용하여, 이러한 정보와 실험을 통해 확인된 자료를 서로 비교하여 개체를 식별할 수 있다.
본 발명은 경주마의 유전자 개체식별을 위한 다중 중합연쇄반응(Multiplex PCR) 방법을 통한 유전자 감식방법으로서 선정된 초위성체 마커(Microsatellite Marker)들은 국제동물유전학회(ISAG : International Society for Animal Genetics)의 데이터베이스에 보고된 경주마의 초위성체 마커들을 기초로 하여 선정하였고, 세부적인 선발 조건인 대립유전형의 출현 빈도(Allele Frequency), 프라이머의 어닐링 온도(Annealing Temp), 증폭산물의 크기(Product Size), 형광물질(Dye) 등을 고려하여 최종적으로 총 40개, 2세트로 나누어 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR)이 가능하도록 조합되었다.
본 발명에서 상기 초위성체 마커는 제1세트 및 제2세트와 같이 2개의 세트로 나눌 수 있는데, 상기 제1세트는 AHT4(서열목록 1 및 2), AHT5(서열목록 3 및 4), ASB2(서열목록 5 및 6), HMS3(서열목록 7 및 8), HMS6(서열목록 9 및 10), HMS7(서열목록 11 및 12), HTG4(서열목록 13 및 14), HTG10(서열목록 15 및 16), VHL20(서열목록 17 및 18), ASB17(서열목록 19 및 20), ASB23(서열목록 21 및 22), HMS1(서열목록 23 및 24), LEX3(서열목록 25 및 26), CA425(서열목록 27 및 28), HMS2(서열목록 29 및 30), HTG6(서열목록 31 및 32), HTG7(서열목록 33 및 34), LEX033(서열목록 35 및 36), AMEL(서열목록 37 및 38), HMS18(서열목록 39 및 40), LEX27(서열목록 41 및 42), SRY(서열목록 43 및 44) 및 LEX020(서열목록 45 및 46)으로 이루어진 정방향 및 역방향 프라이머로 증폭될 수 있다.
또한, 상기 제2세트는 HTG21(서열목록 47 및 48), COR089(서열목록 49 및 50), TKY279(서열목록 51 및 52), TKY287(서열목록 53 및 54), TKY294(서열목록 55 및 56), TKY297(서열목록 57 및 58), TKY301(서열목록 59 및 60), TKY312(서열목록 61 및 62), TKY321(서열목록 63 및 64), TKY325(서열목록 65 및 66), TKY333(서열목록 67 및 68), TKY337(서열목록 69 및 70), TKY341(서열목록 71 및 72), TKY343(서열목록 73 및 74), TKY344(서열목록 75 및 76), TKY374(서열목록 77 및 78) 및 TKY394(서열목록 79 및 80)로 이루어진 정방향 및 역방향 프라이머로 증폭될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 초위성체 마커를 이용한 경주마의 개체식별 방법은, 초위성체 마커인, AHT4, AHT5, ASB2, HMS3, HMS6, HMS7, HTG4, HTG10, VHL20, ASB17, ASB23, HMS1, LEX3, CA425, HMS2, HTG6, HTG7, LEX033, AMEL, HMS18, LEX27, SRY 및 LEX020으로 이루어진 제1세트, 또는, HTG21, COR089, TKY279, TKY287, TKY294, TKY297, TKY301, TKY312, TKY321, TKY325, TKY333, TKY337, TKY341, TKY343, TKY344, TKY374 및 TKY394로 이루어진 제2세트 중에서 한 세트 이상을 조합한 초위성체 마커를 이용하여 다중 PCR 증폭하는 단계; 상기 다중 PCR 증폭하는 단계에서 증폭된 산물을 전기영동장치를 통해 대립유전자를 검출하고 크기를 분석하여 유전자형을 결정하는 단계; 및 상기 전기영동장치를 통해 분석된 대립유전자의 크기를 개체별 및 품종별로 정리하여 이를 기초로 한 대립유전자의 수 및 빈도 분포를 작성하는 단계를 포함한다.
상기 다중 PCR 증폭하는 단계에서 상기 초위성체 마커용 시약은 Platinum Multiplex PCR Master Mix 25㎕, GC Enhancer 5㎕, Primer Mix 10㎕, Genomic DNA 4㎕ 및 Deionized Water 6㎕로 이루어질 수 있다.
또는, 상기 다중 PCR 증폭하는 단계에서 상기 초위성체 마커용 시약은 Platinum Multiplex PCR Master Mix 12.5㎕, GC Enhancer 2.5㎕, Primer Mix 5㎕, Genomic DNA 2㎕ 및 Deionized Water 3㎕로 이루어질 수도 있다.
또한, 상기 다중 PCR 증폭하는 단계에서 상기 다중 PCR 증폭 조건은 95℃에서 2분간 유지하고, 95℃에서 30초 동안 denaturation, 56.5℃에서 90초 동안 annealing, 72℃에서 60초 동안 extension을 33회 반복한 후, 72℃에서 30분 동안 final-extension을 수행하며, 4℃에서 최종적으로 유지함으로써 이루어질 수 있다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 초위성체 마커를 이용한 경주마의 개체식별 방법에 대한 실시예를 들어 더욱 구체적으로 설명하기로 한다.
< 실시예 >
1. 경주마의 개체식별을 위한 초위성체 마커 선발
경주마의 개체식별에 효과적으로 사용될 수 있는 초위성체 마커를 선발하기 위해, 데이터베이스에 보고된 경주마의 초위성체 마커들을 기초로 하여 세부적인 선발 조건인 대립유전형의 출현 빈도(Allele Frequency), 프라이머의 어닐링 온도(Annealing Temp), 증폭산물의 크기(Product Size), 형광물질(Dye) 등을 고려하여 최종적으로 총 40개, 2세트로 초위성체 마커를 선발하였다.
상기 최위성체 마커는 하기와 같다.
즉, 상기 초위성체 마커는 제1세트 및 제2세트와 같이 2개의 세트로 선발하였는데, 상기 제1세트는 AHT4(서열목록 1 및 2), AHT5(서열목록 3 및 4), ASB2(서열목록 5 및 6), HMS3(서열목록 7 및 8), HMS6(서열목록 9 및 10), HMS7(서열목록 11 및 12), HTG4(서열목록 13 및 14), HTG10(서열목록 15 및 16), VHL20(서열목록 17 및 18), ASB17(서열목록 19 및 20), ASB23(서열목록 21 및 22), HMS1(서열목록 23 및 24), LEX3(서열목록 25 및 26), CA425(서열목록 27 및 28), HMS2(서열목록 29 및 30), HTG6(서열목록 31 및 32), HTG7(서열목록 33 및 34), LEX033(서열목록 35 및 36), AMEL(서열목록 37 및 38), HMS18(서열목록 39 및 40), LEX27(서열목록 41 및 42), SRY(서열목록 43 및 44) 및 LEX020(서열목록 45 및 46)으로 이루어진 정방향 및 역방향 프라이머로 증폭될 수 있다.
또한, 상기 제2세트는 HTG21(서열목록 47 및 48), COR089(서열목록 49 및 50), TKY279(서열목록 51 및 52), TKY287(서열목록 53 및 54), TKY294(서열목록 55 및 56), TKY297(서열목록 57 및 58), TKY301(서열목록 59 및 60), TKY312(서열목록 61 및 62), TKY321(서열목록 63 및 64), TKY325(서열목록 65 및 66), TKY333(서열목록 67 및 68), TKY337(서열목록 69 및 70), TKY341(서열목록 71 및 72), TKY343(서열목록 73 및 74), TKY344(서열목록 75 및 76), TKY374(서열목록 77 및 78) 및 TKY394(서열목록 79 및 80)로 이루어진 정방향 및 역방향 프라이머로 증폭될 수 있다.
2. 분석기기
분석기기로 하기의 [표 1]에 나타낸 바와 같은 분석 장비 및 보조 장비를 이용하였다.
3. 분석기기 조건
하기의 [표 2]에 나타낸 바와 같은 분석기기 조건으로 수행하였다.
4. 분석 소프트웨어
·3130 Data collection version 3.0 : 3130xL 기기점검 및 Running
·3500 Data collection version 3.0 : 3500xL 기기점검 및 Running
·GeneMapper version 4.0) : 3130xL 결과분석
·GeneMapper version 5.0 : 3500xL 결과분석
5. 분석 시약 및 조성
상기 제1세트는 하기의 [표 3]에 나타낸 바와 같은 분석 시약 및 조성을 사용하였다.
한편, 상기 제2세트는 DNA 추출 및 DNA 증폭에 대하여는 상기의 [표 3]에 나타낸 바와 같은 분석 시약 및 조성을 사용하였으나, DNA 분석에 대하여는 GeneScan 500LIZ Size standard가 아닌 GeneScan 400HD ROX Size standard를 사용하여 분석하였다.
즉, Filter Set : D, Dye Primer Matrix standard set : DS-30이고, 시약 사용량은 동일하였다.
(1) Platinum Multiplex PCR MasterMix 유전자검사 KIT
상기 [표 3]에서 Platinum Multiplex PCR MasterMix 유전자검사 KIT로 하기의 [표 4]에 나타낸 바와 같은 공지의 제품을 사용하였다.
(2) 초위성체 마커용 시약 세부 조성
상기 [표 3]에서 DNA 증폭을 위한 시약의 조성물로 하기 [표 5]와 같이 배합된 초위성체 마커용 시약을 사용하였다.
6. PCR 조건
하기의 [표 6]에 나타낸 바와 같은 PCR 조건으로 실험을 수행하였다.
7. PCR 전처리 조건
하기의 [표 7]에 나타낸 바와 같은 PCR 전처리 조건으로 실험을 수행하였다.
8. 희석 조건
PCR Products : D.W를 1 : 20의 중량 비율로 희석하여 실험을 수행하였다.
9. 결과
도 1 내지 도 9와 같은 경주마 유전자(DNA) 판독 결과를 얻었다.
도 1 내지 도 9는 본 발명에 따른 초위성체 마커를 이용한 경주마의 개체식별 방법에 따라 수행된 경주마 유전자(DNA) 판독 결과를 보여주는 그래프이다.
도 1 내지 도 9를 참조하면, 본 발명에 따른 초위성체 마커를 이용한 경주마의 개체식별 방법은 경주마의 개체를 용이하고 정확하게 식별할 수 있음을 확인할 수 있다.
이상, 본 발명의 바람직한 일 실시예를 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 일 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
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MICROSATELLITE DNA
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aaccgcctga gcaaggaagt 20
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gctcccagag agtttaccct 20
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acggacacat ccctgcctgc 20
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gcaggctaag ggggctcagc 20
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ccactaagtg tcgtttcaga agg 23
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cacaactgag ttctctgata gg 22
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ccatcctcac tttttcactt tgtt 24
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ccaactcttt gtcacataac aaga 24
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gaagctgcca gtattcaacc attg 24
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ctccatcttg tgaagtgtaa ctca 24
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caggaaactc atgttgatac catc 24
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tgttgttgaa acataccttg actgt 25
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ctatctcagt cttgattgca ggac 24
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ctccctccct ccctctgttc tc 22
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tttttattct gatctgtcac attt 24
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caattcccgc cccacccccg gca 23
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caagtcctct tacttgaaga ctag 24
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aactcaggga gaatcttcct cag 23
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gagggcggta cctttgtacc 20
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accattcagg atctccaccg 20
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gagggcagca ggttgggaag g 21
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acatcctggt caaatcacag tcc 23
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catcactctt catgtctgct tgg 23
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ttgacataaa tgcttatcct atggc 25
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acatctaacc agtgctgaga ct 22
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gaaggaaaaa aaaggaggaa gac 23
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agctgcctcg ttaattca 18
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ctcatgtccg cttgtctc 18
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cttgcagtcg aatgtgtatt aaatg 25
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acggtggcaa ctgccaagga ag 22
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cctgcttgga ggctgtgata agat 24
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gttcactgaa tgtcaaattc tgct 24
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cctgaagcag aacatccctc cttg 24
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ataaagtgtc tgggcagagc tgct 24
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tttaatcaaa ggattcagtt g 21
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gggacacttt ctttactttc 20
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cacttcctgg ccaacactcc atggtt 26
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gccaagcttc cagaggcagg tcagga 26
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caacaatgaa aatttgtcct gtgc 24
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gtaaatgagt agacaatcat gagg 24
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accactggga aactgtgtaa 20
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gcccagaatc cgaacc 16
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cttaagcttc tgctatgtcc agagtatcc 29
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gcggtttgtc acttttctgt ggcatctt 28
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ggaataggtg ggggtctgtt 20
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agggtactag ccaagtgact gc 22
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attacttcct ccaggtatct cag 23
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aggcagggct gggagacgt 19
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cctgccataa atttgtttcc 20
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tccctacctc atctccacac 20
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aatgaatgag acttgaacc 19
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tctgctgttt taggctcgg 19
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atcagagaac accaagaagg 20
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tctctgctat aggtaaggtc 20
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gatctatgtg ctagcaaaca c 21
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ctagtgtttc agatagcctc 20
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gtctttttgt gcctctggtg 20
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tcaggggaca gtggcagcag 20
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aatggtggct aatcaatggg 20
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gtgtatgatg ccctcatctc 20
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aacctgggtt tctgttgttg 20
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gatccttctt tttatggctg 20
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ttgttgggtt taggtatgaa gg 22
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gtgtcaatgt gacttcaaga ac 22
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tggatgaacc atgaatagtg 20
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ccttcactag ccttcaaatg 20
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ttgtgtttag acagtgctgc 20
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tatccagtca cccattttac 20
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ttgtgtcagt acactctatg 20
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gtgtccatca atggatgaag 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> Equus caballus
<400> 76
cttaaggcta aataatatcc c 21
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> Equus caballus
<400> 77
ctggtccctc tggatggaag 20
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> Equus caballus
<400> 78
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<212> DNA
<213> Equus caballus
<400> 79
gcatcatcgc cttgaagttg 20
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<212> DNA
<213> Equus caballus
<400> 80
cctttctggt tggtatcctg 20
Claims (3)
- AHT4에 대한 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머 쌍, AHT5에 대한 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머 쌍, ASB2에 대한 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머 쌍, HMS3에 대한 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머 쌍, HMS6에 대한 서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머 쌍, HMS7에 대한 서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머 쌍, HTG4에 대한 서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머 쌍, HTG10에 대한 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머 쌍, VHL20에 대한 서열번호 17의 정방향 프라이머 및 서열번호 18의 역방향 프라이머 쌍, ASB17에 대한 서열번호 19의 정방향 프라이머 및 서열번호 20의 역방향 프라이머 쌍, ASB23에 대한 서열번호 21의 정방향 프라이머 및 서열번호 22의 역방향 프라이머 쌍, HMS1에 대한 서열번호 23의 정방향 프라이머 및 서열번호 24의 역방향 프라이머 쌍, LEX3에 대한 서열번호 25의 정방향 프라이머 및 서열번호 26의 역방향 프라이머 쌍, CA425에 대한 서열번호 27의 정방향 프라이머 및 서열번호 28의 역방향 프라이머 쌍, HMS2에 대한 서열번호 29의 정방향 프라이머 및 서열번호 30의 역방향 프라이머 쌍, HTG6에 대한 서열번호 31의 정방향 프라이머 및 서열번호 32의 역방향 프라이머 쌍, HTG7에 대한 서열번호 33의 정방향 프라이머 및 서열번호 34의 역방향 프라이머 쌍, LEX033에 대한 서열번호 35의 정방향 프라이머 및 서열번호 36의 역방향 프라이머 쌍, AMEL에 대한 서열번호 37의 정방향 프라이머 및 서열번호 38의 역방향 프라이머 쌍, HMS18에 대한 서열번호 39의 정방향 프라이머 및 서열번호 40의 역방향 프라이머 쌍, LEX27에 대한 서열번호 41의 정방향 프라이머 및 서열번호 42의 역방향 프라이머 쌍, SRY에 대한 서열번호 43의 정방향 프라이머 및 서열번호 44의 역방향 프라이머 쌍 및 LEX020에 대한 서열번호 45의 정방향 프라이머 및 서열번호 46의 역방향 프라이머 쌍으로 이루어진 제1 프라이머 세트; 및 HTG21에 대한 서열번호 47의 정방향 프라이머 및 서열번호 48의 역방향 프라이머 쌍, COR089에 대한 서열번호 49의 정방향 프라이머 및 서열번호 50의 역방향 프라이머 쌍, TKY279에 대한 서열번호 51의 정방향 프라이머 및 서열번호 52의 역방향 프라이머 쌍, TKY287에 대한 서열번호 53의 정방향 프라이머 및 서열번호 54의 역방향 프라이머 쌍, TKY294에 대한 서열번호 55의 정방향 프라이머 및 서열번호 56의 역방향 프라이머 쌍, TKY297에 대한 서열번호 57의 정방향 프라이머 및 서열번호 58의 역방향 프라이머 쌍, TKY301에 대한 서열번호 59의 정방향 프라이머 및 서열번호 60의 역방향 프라이머 쌍, TKY312에 대한 서열번호 61의 정방향 프라이머 및 서열번호 62의 역방향 프라이머 쌍, TKY321에 대한 서열번호 63의 정방향 프라이머 및 서열번호 64의 역방향 프라이머 쌍, TKY325에 대한 서열번호 65의 정방향 프라이머 및 서열번호 66의 역방향 프라이머 쌍, TKY333에 대한 서열번호 67의 정방향 프라이머 및 서열번호 68의 역방향 프라이머 쌍, TKY337에 대한 서열번호 69의 정방향 프라이머 및 서열번호 70의 역방향 프라이머 쌍, TKY341에 대한 서열번호 71의 정방향 프라이머 및 서열번호 72의 역방향 프라이머 쌍, TKY343에 대한 서열번호 73의 정방향 프라이머 및 서열번호 74의 역방향 프라이머 쌍, TKY344에 대한 서열번호 75의 정방향 프라이머 및 서열번호 76의 역방향 프라이머 쌍, TKY374에 대한 서열번호 77의 정방향 프라이머 및 서열번호 78의 역방향 프라이머 쌍 및 TKY394에 대한 서열번호 79의 정방향 프라이머 및 서열번호 80의 역방향 프라이머 쌍으로 이루어진 제2 프라이머 세트를 이용하여 다중 PCR 증폭하는 단계;
상기 다중 PCR 증폭하는 단계에서 증폭된 산물을 전기영동장치를 통해 대립유전자를 검출하고 크기를 분석하여 유전자형을 결정하는 단계; 및
상기 전기영동장치를 통해 분석된 대립유전자의 크기를 개체별 및 품종별로 정리하여 이를 기초로 한 대립유전자의 수 및 빈도 분포를 작성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 초위성체 마커를 이용한 경주마의 개체식별 방법. - 삭제
- 제 1항에 있어서,
상기 다중 PCR 증폭하는 단계에서 상기 다중 PCR 증폭 조건은 95℃에서 2분간 유지하고, 95℃에서 30초 동안 denaturation, 56.5℃에서 90초 동안 annealing, 72℃에서 60초 동안 extension을 33회 반복한 후, 72℃에서 30분 동안 final-extension을 수행하며, 4℃에서 유지함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 초위성체 마커를 이용한 경주마의 개체식별 방법.
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| KR1020210002808A KR102512271B1 (ko) | 2021-01-08 | 2021-01-08 | 초위성체 마커를 이용한 경주마의 개체식별 방법 |
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