CN109136384A - 同时分析牛基因组dna16个基因座的荧光检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可以同时分析16个牛基因座的荧光标记复合扩增检测试剂盒，其特征在于：包含16个基因座TGLA227、BM2113、TGLA53、ETH10、SPS115、TGLA126、TGLA122、INRA023、CSSM66、ETH3、ETH225、BM1824、BM1818、BAmel、G18833和BM720，分为4组，共涉及5种颜色的荧光标记。本发明的荧光标记复合扩增检测试剂盒提供用于复合扩增16个基因座的寡核苷酸引物混合物；系统中包括的用于鉴别DNA样本性别的基因座是BAmel基因座。该系统的检测结果表明其多态性高、平衡性好、灵敏度高、特异性强、分型结果准确、种属特异性强，完全能够满足牛类个体识别、亲权鉴定以及DNA数据库建设的需要。

Description

同时分析牛基因组DNA16个基因座的荧光检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种荧光标记复合扩增检测试剂盒，具体涉及一种通过复合扩增同时分析牛基因组DNA 15个STR基因座和DAmel基因座的五色荧光标记复合扩增检测试剂盒。
背景技术
短串联重复序列(简称STR)也称微卫星DNA，是一类广泛存在于原核及真核生物基因组中的核苷酸重复序列。其一般由2-6个核苷酸为重复单元组成的几十至一百多个的核苷酸重复序列，不同数目的核心序列呈串联重复排列，而长度呈现多态性。根据两端保守性序列，设计引物，进行PCR，然后通过聚丙烯酰胺、琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳等检测STR遗传标记的多态性。
STR基因座具有片段小易扩增，各基因座的扩增条件相似能够构建检测试剂盒的特点，因而具有灵敏度高、准确性强、检测快速、信息量大等优点，尤其是在建立DNA数据库方面，STR复合扩增技术具有极大的优越性。长期的DNA检测实践表明，STR基因座的遗传多样性在品种间存在一定的差异，各个基因座间差别也很大。现在市场上，在牛类的个体识别、亲权鉴定和遗传育种等方面多采用美国ABI公司推荐的StockMarks AnimalGenotyping System的11个牛基因座。
在实现发明的过程中，发明人发现现有的技术至少存在以下问题：美国ABI公司推荐的StockMarks Animal Genotyping System中仅有11个牛基因座，而且部分基因座的遗传多态性不高，或是不同牛群间差异较大，由此给DNA检测技术的应用及其效率带来一定的影响，不能满足使用的要求。
发明内容
发明目的
本发明的目的在于提供一种牛16个基因座的荧光标记复合扩增检测试剂盒，提高了系统的累计个体识别力和累积非父排除率，满足牛的个体识别、亲权鉴定和遗传育种等方面应用的需要。
为实现上述目的，采用如下技术方案实现：
一种同时分析牛基因组DNA 16个基因座的荧光标记检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有的引物混合物如下：
上述16个基因座对应的引物对中至少有一条引物的5′端进行荧光染料标记。
作为一种优化方式所述的16个基因座对应的引物分为四组并分别用四种不同的荧光染料进行标记；其中TGLA227、BM2113、TGLA53、ETH10和SPS115为一组，TGLA126、TGLA122、INRA023和CSSM66为一组，ETH3、ETH225、BM1824和BM1818为一组，BAmel、G18833和BM720为一组；
其中所述的四种荧光染料为FAM、HEX、TANRA和ROX。
作为进一步优化方式：TGLA227、BM2113、TGLA53、ETH10和SPS115为一组，其对应的引物采用FAM标记；TGLA126、TGLA122、INRA023和CSSM66为一组，其对应的引物采用HEX标记；ETH3、ETH225、BM1824和BM1818为一组，其对应的引物采用TAMRA标记；BAmel、G18833和BM720为一组，其对应的引物采用ROX标记；
所述试剂盒具体为
一种同时分析牛基因组DNA 16个基因座的荧光标记检测试剂盒的检测方法，其特征在于按如下步骤实现：
A、牛基因组DNA提取；
B、按照权利要求1所述的16个基因座的分组并对相应的引物进行荧光标记；
C、PCR扩增体系：
D、扩增热循环：
其扩增程序及参数为：
E、扩增产物在遗传分析仪上进行荧光检测；
F、分型分型。
其中步骤A中的牛基因组DNA样本来源包括血液、血痕、组织、精斑、口腔拭子或毛发等。
一种同时分析牛基因组DNA 16个基因座的荧光标记检测试剂盒的应用，其特征在于该试剂盒用于鉴别牛DNA样本性别。
具体说明：
本发明的荧光标记检测试剂盒涉及在一个复合扩增体系中同时扩增16个基因座的技术，该荧光标记检测试剂盒中的16个基因座可分为四组并分别用四种不同的荧光染料对上述基因座对应的引物进行标记；优选分组方式为5、4、4、3的组合方式，即将16个基因座按每组5个、4个、4个和3个的方式进行分组，使用FAM、HEX、TAMRA和ROX分组标记，分子量内标用第五色荧光染料ATTO 633标记；其中一种优选组合和标记方式为：TGLA227、BM2113、TGLA53、ETH10和SPS115为一组，用FAM标记；TGLA126、TGLA122、INRA023和CSSM66为一组，用HEX标记；ETH3、ETH225、BM1824和BM1818为一组，用TAMRA标记；BAmel、G18833和BM720为一组，用ROX标记，分子量内标用Orange 500，以ATTO 633标记。
本发明所采用的16个基因座分别采用基因座核心重复区两侧的一对引物扩增，其中每对引物中至少有一条引物的5′端进行荧光染料标记；本发明的试剂盒中包含的用于鉴别牛DNA样本性别的基因座是BAmel基因座。
本发明的系统中扩增多个基因座采用聚合酶链式反应进行，检测方法采用单道或多道毛细管电游。
本发明还涉及一种采用该荧光标记复合扩增检测试剂盒对待测的DNA样本进行分析的方法；其中，本发明适用的DNA样本来源于血液、血痕、组织、精斑、口腔拭子或毛发等。
本发明原理介绍
一、基因座的确定
通过对TGLA227、BM2113、TGLA53、ETH10、SPS115、TGLA126、TGLA122、INRA023、CSSM66、ETH3、ETH225、BM1824、BM1818、BM1862、BMc701、G18833、BM720、INRA063、HEL9和INRA037这20个STR基因座在7个品种232头牛的遗传多态性调查，并对现有商品化试剂盒(如美国ABI公司)进行深入分析，最终确定TGLA227、BM2113、TGLA53、ETH10、SPS115、TGLA126、TGLA122、INRA023、CSSM66、ETH3、ETH225、BM1824、BM1818、G18833和BM720这15个STR基因座。此基因座构成既兼容了现有商品化试剂盒中的牛SYR基因座，保证已有DNA数据的共享和交流，又能够提高DNA检测试剂盒的累计个体识别能力和累积非父排除率，更加符合DNA检验的技术要求。
本发明在国内首次使用了鉴定牛性别的BAmel基因座，只需检测BAmel基因座就能够精准鉴定牛性别，不需要如现有技术那样同时检测位于Y染色体上的SRY和位于X染色体上的CHR.X这两个基因座，使牛不同个体的性别鉴定更加精准和有效。
二、荧光标记复合扩增体系的基因座组合方案设计
本发明对荧光染料进行了鉴别、遴选，选用了蓝、绿、黄、红和橙五种荧光标记物，构建了5色荧光组合方案。
在确定5色荧光组合方案的基础上，通过大量反复实验，设计出基因座组合方式以及荧光标记类型。从生产成本及各基因座引物扩增效率等方面考虑，选择了5、4、4、3标记组合方式，即将16个基因座按每组5个、4个、4个和3个的方式进行分组，使用FAM、HEX、TAMRA和ROX分组标记，分子量内标用第五色荧光染料ATTO 633标记。以下举例说明其中一种优选组合和标记方式：TGLA227、BM2113、TGLA53、ETH10和SPS115为一组，采用FAM标记；TGLA126、TGLA122、INRA023和CSSM66为一组，采用HEX标记；ETH3、ETH225、BM1824和BM1818为一组，采用TAMRA标记；BAmel、G18833和BM720为一组，采用ROX标记；内标选用橙色荧光标记，荧光标记物为ATTO 633。这种基因座组合方式使得仅需标记五种荧光就可以实现这16个基因座的同时检测分析。
在组合方案的基础上，根据16个基因座核心重复单元的侧翼序列进行引物设计，通过实验摸索和优化，所得结果中没有发现非特异峰，各基因座峰值均衡，实现了16个基因座在同一反应中的复合扩增，同时将全部基因座扩增产物控制在300bp以内，从而使本发明的复合扩增检测试剂盒具有较高的灵敏度，引物序列及浓度见下表，按表中浓度配成5×的引物混合物。
三、荧光标记STR复合扩增体系的优化及建立
先对16个基因座的单一扩增条件进行优化，在成功地建立了单个基因座扩增条件的基础上，研究16个基因座复合扩增反应条件，通过大量的反复实验确定了复合扩增中的各个参数，如循环数、退火温度、缓冲液离子强度、酶量、复合扩增反应体积的变化以及模板中DNA量等，使扩增产物达到平衡、特异的要求，最终建立起16个基因座的复合扩增体系。
有益效果
本发明的荧光标记复合扩增检测试剂盒良好的应用效果主要表现在下述几个方面：
1、系统的灵敏度高、特异性强
本发明中16个基因座的荧光标记复合扩增检测试剂盒在DNA模版1.0ng的条件下，可检出全部16个基因座，各基因座峰值均衡，却无非特异性峰产生。
2、本系统适用于不同来源的检材
本发明中16个基因座的荧光标记复合扩增检测试剂盒对同一个体的血痕、口腔拭子、毛发及组织的DNA样本进行复合扩增和荧光检测，结果一致，表明该系统适用于不同来源的检测。
3、种属特异性强
本发明中16个基因座的荧光标记复合扩增检测试剂盒检验人、猪、马、狗、猫、鸡、鸭、鱼和大肠杆菌等，没有出现特异性扩增峰，表明该系统具有种属特异性。
4、实际应用的效果
本发明中16个基因座的荧光标记复合扩增检测试剂盒已在国内多个畜牧园区测试与试用，结果表明该系统多态性高、平衡性好、灵敏度高、完全能够满足牛类个体识别、亲权鉴定以及DNA数据库建立的需要。该16个基因座的非父排除率(PE)为0.996016，个体识别力(DP)为0.99999993，优于现有技术的非父排除率(0.971013)和个体识别力(0.9999999)。
附图说明
图1：牛基因组DNA 16个基因座荧光标记复合扩增检测试剂盒的各基因座排布图；
图2-3：实施实例1的结果，其中图2和图3分别为对2个无关个体牛A和B的DNA样本的STR分型结果；
图4-6：实施实例2的结果，其中图4-6分别为母牛、父牛和仔牛的相应检测结果。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步对本发明进行说明。实施例仅仅是为了说明的目的，而并非限制本发明的范围。
实施例1牛基因组DNA 16个基因座荧光标记复合扩增试剂的制备
1、复合扩增系统位点的排布
本发明的牛基因组DNA 16个基因座荧光标记复合扩增检测试剂盒包括TGLA227、BM2113、TGLA53、ETH10、SPS115、TGLA126、TGLA122、INRA023、CSSM66、ETH3、ETH225、BM1824、BM1818、BAmel、G18833和BM720。
上述STR位点的排布方式如附图1所示。
2、复合扩增体系专用引物
根据上述位点设计复合扩增引物、引物序列、引物浓度及荧光素标记方式如下表所示。
3、荧光复合扩增验证系统的制备
用于大规模样本排查的DNA验证试剂即为PCR扩增体系，具体如下，下面的终浓度为在扩增体系中的终浓度：
5×Primers为上表所示的31条引物按照上表所示的浓度进行混匀。
每25.0μL的PCR扩增体系如下：
PCR扩增体系即为用于牛基因组DNA 16个基因座荧光标记复合扩增检验试剂。
因此，DNA检测试剂由具有表中所示终浓度的引物、终浓度为5.0mM的MgCl2、终浓度为125mM的Tris-HCl、终浓度为125mM的KCl、终浓度为0.5mM的dNTPs、终浓度为1.5mg/mL的BSA、终浓度为1U/μL的DNA聚合酶和去离子超纯水组成。
实例2复合扩增检测试剂盒的复合扩增以及荧光检测
1、样本DNA提取
样本为2个无关个体的牛肌肉组织样本，采用Chelex-100法分别提取2个牛肌肉组织样本的基因组DNA。
取小米粒大小的肌肉组织，放入0.5ml离心管中，加入1mL sdH2O于管中，振荡，13,000rpm离心3分钟，弃上清液，保留足够上清液盖没沉淀，勿搅起沉淀；加入200μL的Chelex-100和5μL 5mg/mL的PK酶，放入56℃保温3小时以上。取出振荡，100℃保温8分钟，振荡，13,000rpm离心3分钟，上清为提取得到的基因组DNA。
2、样本扩增
将24μL由实例1制备的DNA检验试剂加入1μL的0.4-1.0ng/μL上述DNA提取样本，进行PCR扩增。
PCR扩增程序为：98℃1min；98℃20s、60℃75s、72℃30s，30个循环；72℃终延伸5min；4-16℃保持。
3、PCR产物的检测
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标(南京沿溯生物技术有限公司的Orange-500ATTO 633标记)组成上样混合物[(0.5μL分子量内标+10μL去离子甲酰胺)×(样品数)]。将9μL上样混合物与1μL扩增产物混合，简短离心将液体收集到离心管管子底部。样品95℃变性3分钟，然后置于冰上冷却3分钟，使DNA完全变性，将样品放入基因分析仪的样品托盘中，用ABI3100遗传分析仪进行电泳和检测。
4、分型分析
用片段分析软件GeneMapper分析遗传分析仪检测收集的数据，得到实际样本各个基因座的分子量大小，结果见附图2-3。
结果和讨论：两样本有12个STR基因座分型不一致，做出无关认定。
实施例3应用16个基因座的荧光标记复合扩增检测试剂盒进行牛的亲子鉴定
样品为有亲缘关系的父本、母本和子本，按照实施例2进行DNA的提取、PCR扩增、遗传分析仪检测并最终获得分型结果。
结果和讨论：亲子鉴定的基本原理为：根据孟德尔遗传定律，亲代基因型决定子代基因型。在没有基因突变、分型差错的前提下：1)孩子的一对等位基因必定是来自父亲，一个来自母亲；2)孩子不可能带有双亲均没有的等位基因。
本实施例的结果见附图4-6及表1，在附图4-6依次为父牛、母牛和仔牛的相应检测结果。
表1：
CPI＝22188403.8 RCP＝99.999995﹪
PI为父权指数，又称亲子关系指数，是指假设父牛提供生父牛基因的可能性(X)与随机父牛提供生父牛基因的可能性(Y)的比值，表示假设父牛为仔牛生父牛比随机生父牛为仔牛生父的可能性大多少倍，即PI＝X/Y。
PI＝X/Y＝∑f×c/∑f×p
其中，f表示生母牛给仔牛必需等位基因的机会；
c表示被控父牛给仔牛必需等位基因的机会；
p表示随机父牛给仔牛必需等位基因的机会，等于必需等位基因的频率；
联合父权指数CPI，为各个不连锁基因座PI的乘积；
相对亲权概率(RCP)＝(CPI/(CPI+1))×100﹪
根据上述计算，本实验中父牛—仔牛—母牛三联体亲子鉴定RCP值为99.999995﹪，认定为亲子关系。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种同时分析牛基因组DNA 16个基因座的荧光标记检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有的引物混合物如下：
2.权利要求1所述的引物，特征在于16对引物，分成四组。TGLA227、BM2113、TGLA53、ETH10和SPS115为一组，其对应的引物采用FAM标记；TGLA126、TGLA122、INRA023和CSSM66为一组，其对应的引物采用HEX标记；ETH3、ETH225、BM1824和BM1818为一组，其对应的引物采用TAMRA标记；BAmel、G18833和BM720为一组，其对应的引物采用ROX标记；
所述试剂盒为
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