CN117535392B - 一种用于鉴定天鹅性别的rpa引物、试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于鉴定天鹅性别的RPA引物、试剂盒及应用，涉及生物技术领域。该RPA引物包括SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8所示序列。采用该引物能够凭借少量羽毛就快速、准确、无创地鉴定天鹅性别，且全程不依赖昂贵的精密仪器，耗时短、鉴定结果准确实用。

Description

一种用于鉴定天鹅性别的RPA引物、试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于鉴定天鹅性别的RPA引物、试剂盒及应用。

背景技术

天鹅别称鸿鹄，是雁形目鸭科天鹅属的一种大型水禽，雌雄体态及羽毛色泽基本一致，外观区别不十分明显，单凭肉眼观察比较难以分辨雌雄，其中，黑天鹅(学名：Cygnusatratus)属于雁形目天鹅科，原产于澳大利亚塔斯马尼亚州和新西兰，属于单态性鸟类，在外观和和其他行为特点也都难以区分雌雄。

传统性别鉴定的方法是通过观察黑天鹅的泄殖腔形态差异进行鉴定，而此种判断方法对黑天鹅的应激较大，主观性强，还具有侵入性和危害性，严重还会导致不育或死亡。随着分子技术的发展，PCR等分子鉴定技术已为黑天鹅性别鉴定提供了工具，但是常规的PCR方法设备要求较高，耗时长，对操作人员专业素质要求高，该方法也难以普及于一般动物园或饲养场。然而在动物园的饲养、管理工作中，需要能快速准确无创对黑天鹅进行性别鉴定，才能更有利于饲养管理、繁殖与育种、遗传疾病的防治、种群结构和种群遗传分析，更有利于加强饲养管理同时降低饲养成本，提高经济效益。因此，亟需一种快速鉴别黑天鹅性别且伤害性较小的方法。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种用于天鹅性别鉴定的引物，采用该引物能够凭借少量羽毛就快速、准确、无创地鉴定天鹅性别，且全程不依赖昂贵的精密仪器，耗时短、鉴定结果准确实用。

为了达到上述目的，本发明提供了一种用于鉴定天鹅性别的RPA引物，包括：

上游引物：5’-AGAGGAGGAAAGACAAAAAGAACTTGAAGA-3’(SEQ ID NO：7)；

下游引物：5’-AAACCATCCAACACAGAAGTACAAGCCAAA-3’(SEQ ID NO：8)。

重组酶聚合酶恒温扩增技术(Recombinase polymerase amplification；RPA)是一种由重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶参与的恒温扩增技术，在37℃-42℃下进行20-30分钟即可完成扩增，具有特异性强、与PCR灵敏度一致、操作简便、对仪器设备要求低等优点。目前，RPA检测技术已经广泛应用在临床中快速检测病毒、细菌和寄生虫等，然而将RPA技术应用于鉴别天鹅性别时，并非任意功能性基因片段就能实现较好的扩增、鉴定效果。本发明人选择黑天鹅基因组中雌雄存在差异的Z与W染色体螺旋蛋白基因(Chromo-helicase-DNAbinding gene，CHD)序列作为目的扩增片段，然而在进一步研究过程中，本发明人发现并非任意以CHD为目的扩增片段的引物序列均能实现较好的性别鉴定，本发明人经过实验后，提出上述RPA引物，采用该引物能够凭借少量羽毛就快速、准确、无创地鉴定天鹅性别，且全程不依赖昂贵的精密仪器，耗时短、鉴定结果准确实用。

本发明还提供了所述的RPA引物在制备用于鉴定天鹅性别的试剂和/或试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种用于鉴定天鹅性别的试剂盒，包括所述RPA引物。

在其中一个实施例中，所述试剂盒包括RPA反应体系，所述RPA反应体系包括重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶和所述RPA引物。

在其中一个实施例中，所述RPA引物的工作浓度为0.15-0.25μM。

所述工作浓度为上述RPA引物在使用时能够达到预期效果的浓度，可以理解的，本领域技术人员在配制含有上述RPA引物的产品时，可以配制浓度更高的母液或者储备液，待使用时再稀释，所述母液或者储备液及其浓度均在本发明的保护范围之内。在其中一个实施例中，所述RPA反应体系还包括：反应缓冲液、醋酸镁溶液、雌性阳性模板、雄性阳性模板。

本发明还提供了一种天鹅性别鉴定的方法，包括以下步骤：提取待测样本的DNA，进行PCR扩增反应，采用所述试剂盒进行RPA反应。

将利用上述引物的试剂盒与RPA扩增法结合，借助雌性黑天鹅W染色体和雄性黑天鹅Z染色体的序列差异得到的天鹅性别鉴定方法，简单快速、准确无创，结果判定的电泳条带清晰明亮，且比常规PCR耗时短。

在其中一个实施例中，所述天鹅性别鉴定的方法还包括采用所述试剂盒进行RPA反应得到RPA反应产物后，对RPA反应产物进行电泳分析。

在其中一个实施例中，所述电泳分析包括以下步骤：将所述RPA反应产物进行纯化，进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据检测结果判断天鹅性别。

在其中一个实施例中，所述判断天鹅性别的方法包括：所述检测结果为在149bp处出现电泳条带，所述待测样本来源于雌性天鹅；所述检测结果为在240bp处出现电泳条带，所述待测样本来源于雄性天鹅。

在其中一个实施例中，所述RPA反应的条件为：将所述RPA反应体系混合后，在37-42℃下反应3-7min，混匀，离心，在37-42℃下反应20-30min，置于冰上终止反应。

在其中一个实施例中，所述PCR扩增反应的扩增引物包括第一引物组和/或第二引物组；

所述第一引物组包括：CHD-W-F：AGAGGAGGAAAGACAAAAAG(SEQ ID NO：9)，CHD-W-R：TTTCCATTAAAGCTAATCTG(SEQ ID NO：10)；

所述第二引物组包括：CHD-Z-F：AGAGGAGGAAAGACAAAAAG(SEQ ID NO：11)，CHD-Z-R：CTTCCATTGGAGCTGATC(SEQ ID NO：12)。

在其中一个实施例中，所述PCR扩增反应的条件为：92-96℃预变性2.5-3.5min；92-96℃变性28-32s，53-57℃退火28-32s，70-75℃延伸28-32s，共35个循环；70-75℃再延伸4.5-5.5min。

在其中一个实施例中，所述天鹅包括黑天鹅，所述待测样本包括羽毛。

在其中一个实施例中，所述待测样本包括羽毛根部。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的一种用于天鹅性别鉴定的引物、试剂盒及应用，采用该引物能够凭借少量羽毛就快速、准确、无创地鉴定天鹅性别，且全程不依赖昂贵的精密仪器，耗时短、鉴定结果准确实用。

附图说明

图1为实施例1中各组RPA引物的性别鉴定结果电泳图；其中，M：DL2000 DNAMarker；1、3、5、7为使用雄性黑天鹅DNA模板；2、4、6、8为使用雌性黑天鹅DNA模板；且1、2为SEQ ID NO：1/SEQ ID NO：2引物组扩增；3、4为SEQ ID NO：3/SEQ ID NO：4引物组扩增；5、6为SEQ ID NO：5/SEQ ID NO：6引物组扩增；7、8为SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：8引物组扩增；

图2为实施例2特异性扩增检测实验中，利用RPA鉴定方法得到的电泳图；其中，M：DL2000 DNAMarker；1：RPA试剂盒自带雌性阳性对照；2-5：雌性黑天鹅；6：RPA试剂盒自带雄性阳性对照；7-10：雄性黑天鹅；

图3为实施例2特异性扩增检测实验中，利用常规PCR鉴定方法得到的电泳图；其中，M：DL2000 DNA Marker；1：RPA试剂盒自带雌性阳性对照；2-5：雌性黑天鹅；6：RPA试剂盒自带雄性阳性对照；7-10：雄性黑天鹅；

图4为实施例2灵敏度扩增检测实验中，利用RPA鉴定方法得到的电泳图；其中，M：DL2000 DNA Marker；1：60ng/μL；2：12ng/μL；3：2.4ng/μL；4：0.48ng/μL；5：96pg/μL；6：60ng/μL；7：12ng/μL；8：2.4ng/μL；9：0.48ng/μL；10：96pg/μL；

图5为实施例2灵敏度扩增检测实验中，利用常规PCR鉴定方法得到的电泳图；其中，M：DL2000 DNA Marker；1：60ng/μL；2：12ng/μL；3：2.4ng/μL；4：0.48ng/μL；5：96pg/μL；6：60ng/μL；7：12ng/μL；8：2.4ng/μL；9：0.48ng/μL；10：96pg/μL。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

来源：

RPA反应管、反应缓冲液购自英国TwistDX公司，商品编Basic kit；其中，RPA冻干酶粉(包含重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶)存在于RPA反应管中，使用时，用反应缓冲液溶解，整个RPA扩增反应在RPA反应管中进行。

采用纯化试剂盒对产物进行纯化，购自上海碧云天生物技术有限公司。

ddH₂O购自美国赛默飞世尔公司。

本实施例所用试剂、材料、设备如无特殊说明，均为市售来源；试验方法如无特殊说明，均为本领域的常规试验方法。

实施例1

雌雄黑天鹅性别鉴定RPA引物的设计筛选和性别鉴定方法的建立。

一、雌雄黑天鹅性别鉴定RPA引物的设计和筛选。

利用黑天鹅Z和W染色体螺旋蛋白基因(Chromo-helicase-DNA binding gene，CHD)上的基因组序列差异，根据RPA引物设计原则与比对分析，设计出多对适用于RPA反应的引物组，下表展示其中4对引物组。

表1用于黑天鹅性别鉴定的RPA引物组筛选的引物

二、雌雄黑天鹅阳性DNA模板的制备。

各挑取一只已知性别的雌性黑天鹅与雄性黑天鹅，从背部或尾部取5根羽毛，低温保存下带回实验室，剪下羽毛根部，按照DNA提取试剂盒提取羽毛DNA。

根据雌雄黑天鹅染色体CHD基因设计两对PCR引物，分别是：

CHD-W-F：AGAGGAGGAAAGACAAAAAG(SEQ ID NO：9)，

CHD-W-R：TTTCCATTAAAGCTAATCTG(SEQ ID NO：10)；

CHD-Z-F：AGAGGAGGAAAGACAAAAAG(SEQ ID NO：11)，

CHD-Z-R：CTTCCATTGGAGCTGATC(SEQ ID NO：12)。

利用CHD-W-F/R和CHD-Z-F/R引物组及PCR技术分别对雌雄黑天鹅DNA进行PCR扩增。

扩增体系为Taq酶25μL，上游引物(10mM)1μL，下游引物(10mM)1μL，DNA模板2μL，ddH₂O加至50μL。

PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30Sec，55℃退火30Sec，72℃延伸30Sec，共35个循环；72℃再延伸5min，程序结束后保存于-20℃作为雌雄黑天鹅阳性DNA模板。

三、RPA反应体系及反应条件。

RPA反应体系：RPA反应使用Basic kit，RPA冻干酶粉5mg，反应缓冲液29.5μL，10μM的上游引物和下游引物(具体为上表中的4组RPA引物)各1μL，待检DNA模板5μL，ddH₂O 11μL，用移液器吸打混匀后，最后加入280mM的MgAc溶液2.5μL；即在RPA反应体系中，上游引物、下游引物的工作浓度为0.2μM。

反应条件：以上组分充分混匀后在39℃下反应5min，取出进行多次颠倒充分混匀离心，再于39℃下反应25min，随后在冰上结束反应，获得RPA反应产物。

四、RPA反应产物纯化及分析。

纯化：将上述RPA反应产物进行纯化，用3％琼脂糖凝胶电泳分析检测并分析结果。

分析结果：如图1所示，SEQ ID NO：7/SEQ ID NO：8引物组在149bp处出现特异性电泳条带，鉴定为雌性黑天鹅；在240bp出现特异性电泳条带，鉴定为雄性黑天鹅。其余引物组因未能扩增出特异性差、灵敏度低和稳定性差等原因被舍弃。

实施例2

对实施例1的性别鉴定方法进行检测。

一、特异性扩增检测。

1、RPA鉴定。

(1)方法：收集4只雌性黑天鹅羽毛和4只雄性黑天鹅羽毛共8个样本，对其提取DNA作为待测样本，以雌雄黑天鹅阳性DNA模板作为阳性对照，基于实施例1建立的性别鉴定方法进行RPA反应并检测。

(2)结果：如图2所示，在149bp处出现特异电泳条带鉴定为雌性黑天鹅，在240bp出现特异电泳条带鉴定为雄性黑天鹅。

2、PCR鉴定。

(1)方法：PCR引物组，具体如下所示：

F：5’-GTTTTGGCTTGTACTTCTGTGTTG-3’(SEQ ID NO：13)；

R：5’-GCTCCTACTGCGTCTCCCTTCA-3’(SEQ ID NO：14)。

利用上述PCR引物组和PCR技术对本实施例的8份样品进行PCR扩增。

PCR体系为：Taq酶10μL，上游引物(10mM)1μL，上游引物(10mM)1μL，DNA模板2μL，ddH₂O加至20μL。PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性40Sec，55℃退火40Sec，72℃延伸40Sec，共35个循环；72℃再延伸5min，12℃保存。

反应结束后取10μL PCR产物在3％琼脂糖凝胶电泳下检测后利用凝胶成像系统分析。

(2)结果：如图3所示在125bp处出现电泳条带鉴定为雌性黑天鹅，在290bp出现电泳条带鉴定为雄性黑天鹅。

特异性扩增检测结果分析：结合图2、图3显示的结果，实施例1的RPA鉴定方法与常规的PCR鉴定方法，两者验证结果一致，均能分别出雌雄黑天鹅。

二、灵敏度扩增检测。

1、检测方法：采用实施例1中制备得到的雌雄黑天鹅阳性DNA模板，通过Nanodrop2000测定其基因组DNA浓度，采用ddH₂O将其稀释成60ng/μL、12ng/μL、2.4ng/μL、0.48ng/μL、96pg/μL。

(1)RPA检测：分别以这5种不同浓度的雌雄黑天鹅阳性DNA模板，按照实施例1中的RPA鉴定方法进行RPA反应并检测。结果如图4所示，RPA引物组的最低检测值为0.48ng/μL。

(2)PCR检测：以上述梯度稀释的DNA模板，按照实施例2中的PCR鉴定方法进行PCR反应并检测。结果如图5所示，PCR引物组最低检测值为0.48ng/μL。

2、结果：图4与图5结果显示，实施例1的RPA鉴定方法与普通PCR方法的灵敏度相当，为0.48ng/μL。可见，利用本发明的提供的RPA引物、试剂盒和鉴定方法可以操作简便、耗时短、对黑天鹅无伤害、鉴定准确，且不需要依赖昂贵的精密仪器设备和专业技术背景，便于基层人员使用，具有广阔的应用前景。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种用于鉴定天鹅性别的RPA引物组，其特征在于，包括：

上游引物：5’-AGAGGAGGAAAGACAAAAAGAACTTGAAGA-3’(SEQ ID NO：7)；

下游引物：5’-AAACCATCCAACACAGAAGTACAAGCCAAA-3’(SEQ ID NO：8)。

2.权利要求1所述的RPA引物组在制备用于鉴定天鹅性别的试剂和/或试剂盒中的应用。

3.一种用于鉴定天鹅性别的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的RPA引物组。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括RPA反应体系，所述RPA反应体系包括重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶和权利要求1所述的RPA引物组。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述RPA引物组的工作浓度为0.15-0.25μM。

6.一种天鹅性别鉴定的方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待测样本的DNA，进行PCR扩增反应，采用权利要求3-5中任一项所述的试剂盒进行RPA反应。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述RPA反应的条件为：将所述RPA反应体系混合后，在37-42℃下反应3-7min，混匀，离心，在37-42℃下反应20-30min，置于冰上终止反应。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的扩增引物包括第一引物组和/或第二引物组；

所述第一引物组包括：CHD-W-F：AGAGGAGGAAAGACAAAAAG(SEQ ID NO：9)，CHD-W-R：TTTCCATTAAAGCTAATCTG(SEQ ID NO：10)；

所述第二引物组包括：CHD-Z-F：AGAGGAGGAAAGACAAAAAG(SEQ ID NO：11)，CHD-Z-R：CTTCCATTGGAGCTGATC(SEQ ID NO：12)。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的条件为：92-96℃预变性2.5-3.5min；92-96℃变性28-32s，53-57℃退火28-32s，70-75℃延伸28-32s，共35个循环；70-75℃再延伸4.5-5.5min。

10.根据权利要求6-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述天鹅包括黑天鹅，所述待测样本包括羽毛。