CN112725490B - 一种尖鳞伞的特异性基因及其应用 - Google Patents

一种尖鳞伞的特异性基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及一种尖鳞伞的特异性基因及其应用，其中，所述特异性基因短序列SEQ ID NO.1:ATTGAATTACCTATCCAAGGTGACTTGGGGA，应用上述的特异性基因进行尖鳞伞分子鉴定的方法，包括如下步骤：(1)从待测样品组织中提取基因组DNA；(2)以步骤(1)所提取的基因组DNA为模板，用尖鳞伞特异性引物进行聚合酶链式反应，获得扩增DNA产物；(3)对步骤(2)扩增得到的DNA产物进行测序；(4)将测序结果拼接校对后获得扩增片段，检测所述扩增片段中是否存在所述特异性基因短序列SEQ ID NO.1，若存在这一片段，即可将该样品鉴定为尖鳞伞。本申请所提供的特异性短序列和方法可以快速准确的将毒蘑菇尖鳞伞从易混淆的可食蘑菇中准确鉴定出来，且这种特异性短序列易扩增，操作简便，适用性广。

Description

一种尖鳞伞的特异性基因及其应用
技术领域
本申请属于毒蘑菇鉴定技术领域，尤其涉及一种尖鳞伞的特异性基因及其应用。
背景技术
野生食用菌味道鲜美、营养丰富并具有一定的保健价值，因此深受人们的喜爱。但市场销售的野生食用菌中常常混有有毒蘑菇，主要是由于可食蘑菇和一些有毒蘑菇形态特征非常相近，尤其是烘干处理后，混到一起，很难辨别。比如市场中被销售的名为“刺蘑儿”的蘑菇实际上包括多种呈黄色、菌盖表面带鳞片的蘑菇，如黄伞Pholiota adiposa、柠檬鳞伞Pholiota limonella、金毛鳞伞Pholiota aurivella等，但在其中常常混有颜色、菌盖鳞片等特征非常相近的毒蘑菇尖鳞伞Pholiota squarrosoides，若非专业的形态学鉴定专家很难将其区分开来，很容易因误食而中毒，其中毒主要症状为恶心、呕吐、腹绞痛、腹泻，可能伴有焦虑、发汗、畏寒和心跳加速等症状，严重情况下出现肌肉痉挛、循环障碍或电解质流失。此外，由于基层医疗单位缺少专业的形态学鉴定专家，而且中毒事件发生后常常毒蘑菇样品不完整，需要从剩余物、煮熟的蘑菇或呕吐物中提取样本进行鉴定，这些都不利于对毒蘑菇物种的鉴定的准确性，阻碍了对中毒患者及时的有针对性的治疗。因此，对该毒蘑菇物种进行快速和准确鉴定的研究，可有助于解决毒源鉴定困难的问题，为食品安全提供有效保障。
发明内容
为克服形态学鉴定有毒蘑菇尖鳞伞存在的缺陷，本申请提供了一种尖鳞伞的特异性基因及用其进行尖鳞伞分子鉴定的方法，可以快速准确地将该毒蘑菇从黄伞、金毛鳞伞、柠檬鳞伞等易混淆的可食用蘑菇中鉴定出来，从而保证人们食用野生菌的安全性和疑似该毒菌中毒事件的快速和有效的毒源鉴定。
为实现上述目的，本申请的具体技术方案如下：
本申请第一方面提供一种尖鳞伞的特异性基因，所述特异性基因短序列SEQ IDNO.1:ATTGAATTACCTATCCAAGGTGACTTGGGGA。
本申请第二方面提供一种应用上述的特异性基因进行尖鳞伞分子鉴定的方法，包括如下步骤：
(1)从待测样品组织中提取基因组DNA；
(2)以步骤(1)所提取的基因组DNA为模板，用尖鳞伞特异性引物进行聚合酶链式反应，获得扩增DNA产物；
(3)对步骤(2)扩增得到的DNA产物进行测序；
(4)将测序结果拼接校对后获得扩增片段，检测所述扩增片段中是否存在所述特异性基因短序列SEQ ID NO.1，若存在这一片段，即可将该样品鉴定为尖鳞伞。
作为本申请的进一步说明，所述尖鳞伞特异性引物为：
正向引物PhsITS1-1F:5′-GGATTGCTGTGTAGAAATACTTGGC-3′；
反向引物PhsITS1-1R:5′-TACAAAACGTGCACAGGTGGAA-3′。
作为本申请的进一步说明，所述聚合酶链式反应中的反应体系为25μl；其中ddH2O17.25μl、10XloadingBuffer 2.5μl、dNTPs 2μl，TaqDNA聚合酶0.25μl、DNA模板1μl，正向引物PhsITS1-1F 1μl，反向引物PhsITS1-1R 1μl。
作为本申请的进一步说明，所述待测样品包括尖鳞伞以及与尖鳞伞形态相似且烘干处理后不易区分的可食用蘑菇，如黄伞、金毛鳞伞、柠檬鳞伞以及其他相近种如翘鳞伞等，且待测样品形式可为新鲜子实体、烘干处理后的子实体及蘑菇的剩余物、煮熟的蘑菇或呕吐物等。
作为本申请的进一步说明，所述聚合酶链式反应中，扩增条件为95℃预变性3min，接下来95℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min，一共进行34个循环，最后72℃延伸10min。
作为本申请的进一步说明，所述测序的引物为PhsITS1-1F和PhsITS1-1R。
作为本申请的进一步说明，所述测序时进行正反向测序或重复测序。
与现有技术相比，本申请具有以下有益的技术效果：
本申请所提供的特异性短序列和方法可以快速准确的将毒蘑菇尖鳞伞从易混淆的可食蘑菇中鉴定出来，在GenBank中尖鳞伞的ITS正确序列只有11条，且均含有这个31bp的特异性短序列，因此利用该特异短序列鉴定尖鳞伞准确性高。此外，这种特异性短序列易扩增，操作简便，适用性广。
附图说明
图1为毒蘑菇尖鳞伞Pholiota squarrosoides特异性短序列BLAST比对结果图；
图2为毒蘑菇尖鳞伞Pholiota squarrosoides特异性短序列与易混淆可食蘑菇序列的比对图，其中方框中为比对后的31bp的尖鳞伞特异性短序列。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本申请实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
下面将结合具体实施例对本申请的技术方案加以解释。
实施例1：尖鳞伞特异性短序列的确定
在对大量的鳞伞属及其相关类群内物种进行数据分析的基础上，筛选出了一个31bp的毒蘑菇尖鳞伞Pholiota squarrosoides的特异性短序列SEQ ID NO.1:ATTGAATTACCTATCCAAGGTGACTTGGGGA。以此31bp序列进行BLAST比对，得到序列覆盖度及相似度为100％的结果有且仅有尖鳞伞(如图1所示)，表明该短序列为尖鳞伞所特有。若待测样品ITS1序列中存在这一段31bp的短序列，即可判断该物种为尖鳞伞。因此利用该短序列可快速准确鉴定毒蘑菇尖鳞伞。
实施例2：将尖鳞伞从易混淆的可食蘑菇中鉴定出来的方法
(1)待测样品：(见表1)采集于湖南省、吉林省和黑龙江省的尖鳞伞共3份，其他样品为采自于吉林省的金毛鳞伞2份、采自于吉林省和黑龙江省的柠檬鳞伞2份，采自于吉林省的多脂鳞伞(黄伞)1份以及采自吉林省的翘鳞伞2份。
(2)取样品组织(带一部分菌褶)15-20mg，研磨后用康为世纪公司生产的康为植物全基因组DNA提取试剂盒提取DNA。
(3)PCR扩增：扩增DNA片段，进行聚合酶链式(PCR)反应，用特异的引物进行扩增；
引物对序列为正向引物PhsITS1-1F:5′-GGATTGCTGTGTAGAAATACTTGGC-3′和反向引物PhsITS1-1R:5′-TACAAAACGTGCACAGGTGGAA-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；
PCR反应体系为25μl：ddH2O 17.25μl、10XloadingBuffer 2.5μl、dNTPs 2μl，TaqDNA聚合酶0.25μl、DNA模板1μl，正向引物PhsITS1-1F 1μl，反向引物PhsITS1-1R 1μl；
扩增程序：95℃预变性3min，接下来95℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min，一共进行34个循环，最后72℃延伸10min。
(4)测序：将PCR扩增获得的PCR产物送至测序公司测序。测序引物为PhsITS1-1F和PhsITS1-1R。为确保DNA条形码序列的可靠性，进行了正反向测序或重复测序，然后将序列进行拼接获得DNA序列。
(5)序列处理：用Sequencher 5.0.1检测序列峰图质量，确定峰图质量达到数据分析的要求之后，在Sequencher 5.0.1中剪切、拼接、对照色谱图手工校对碱基，获得目的基因片段。
(6)序列比对：用AliView软件对测序拼接后的待测样品序列进行比对：
如图2所示，所有尖鳞伞样品均含有特异性短序列SEQ ID No.:ATTGAATTACCTATCCAAGGTGACTTGGGGA，而其他样品均不包含这一短序列。由此可见，该短序列在尖鳞伞中特异性强，可以实现对尖鳞伞的快速准确鉴定。
表1尖鳞伞和易混淆可食蘑菇及相关物种的样品信息表
Figure BDA0002821206590000041
Figure BDA0002821206590000051
以上给出的实施例是实现本申请较优的例子，本申请不限于上述实施例。本领域的技术人员根据本申请技术方案的技术特征所做出的任何非本质的添加、替换，均属于本申请的保护范围。
序列表
<110> 吉林农业大学
<120> 一种尖鳞伞的特异性基因及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 尖鳞伞(Pholiota aurivella)
<400> 1
attgaattac ctatccaagg tgacttgggg a 31

Claims (9)

1. 一种尖鳞伞的特异性基因，其特征在于，所述特异性基因短序列SEQ ID NO.1:ATTGAATTACCTATCCAAGGTGACTTGGGGA。
2.一种应用权利要求1所述的特异性基因进行尖鳞伞分子鉴定的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)从待测样品组织中提取基因组DNA；
(2)以步骤(1)所提取的基因组DNA为模板，用尖鳞伞特异性引物进行聚合酶链式反应，获得扩增DNA产物；
(3)对步骤(2)扩增得到的DNA产物进行测序；
(4)将测序结果拼接校对后获得扩增片段，检测所述扩增片段中是否存在所述特异性基因短序列SEQ ID NO.1，若存在这一片段，即可将该样品鉴定为尖鳞伞。
3.根据权利要求2所述的尖鳞伞分子鉴定的方法，其特征在于，所述尖鳞伞特异性引物为：
正向引物PhsITS1-1F: 5′- GGATTGCTGTGTAGAAATACTTGGC -3′；
反向引物 PhsITS1-1R: 5′- TACAAAACGTGCACAGGTGGAA -3′。
4.根据权利要求3所述的尖鳞伞分子鉴定的方法，其特征在于，所述聚合酶链式反应中的反应体系为25μl；其中ddH2O 17.25μl、10XloadingBuffer 2.5μl、dNTPs 2μl，TaqDNA聚合酶0.25μl、DNA模板1μl，正向引物PhsITS1-1F 1 μl，反向引物 PhsITS1-1R 1 μl。
5.根据权利要求2所述的尖鳞伞分子鉴定的方法，其特征在于，所述待测样品包括尖鳞伞以及与尖鳞伞形态相似且烘干处理后不易区分的可食用蘑菇。
6.根据权利要求5所述的尖鳞伞分子鉴定的方法，其特征在于，所述可食用蘑菇包括黄伞、金毛鳞伞、柠檬鳞伞及翘鳞伞。
7.根据权利要求2所述的尖鳞伞分子鉴定的方法，其特征在于，所述聚合酶链式反应中，扩增条件为95℃预变性3min，接下来95℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min，一共进行34个循环，最后72℃延伸10min。
8.根据权利要求3所述的尖鳞伞分子鉴定的方法，其特征在于，所述测序的引物为PhsITS1-1F和PhsITS1-1R。
9.根据权利要求2所述的尖鳞伞分子鉴定的方法，其特征在于，所述测序时进行正反向测序或重复测序。
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