CN111979333B - 一种绵羊多胎主效基因FecB快速可视化检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种绵羊多胎主效基因FecB快速可视化检测方法，该检测方法的步骤为：(1)采集绵羊个体肌肉组织样本并提取其基因组DNA；(2)从GeneBank数据库查找FecB基因的DNA序列，针对FecB的SNP位点设计ARMS特异性引物，即下游引物的3’端的最后一个碱基与SNP位点互补，引物长度应为20bp左右；(3)采用上述引物，反应后将核酸染料SYBR GreenⅠ加入PCR反应体系，通过直接观察反应体系颜色的变化判断该绵羊是否携带有多胎主效基因FecB，即携带有FecB的样本呈亮绿色，反之则为橙黄色。本发明检测方法灵敏度、准确性高，可快速、可视化、低成本的检测绵羊的多胎主效基因。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种绵羊多胎主效基因FecB的快速可视化检测技术。
背景技术
绵羊在农业生产和人们生活中都占有重要地位，是非常重要的家畜动物。生育率和生殖效率是影响养羊业经济的关键因素(Wang W,La Y,Zhou X,et al.The geneticpolymorphisms of TGFβsuperfamily genes are associated with litter size in aChinese indigenous sheep breed(Hu sheep)[J].Animal reproduction science,2018,189:19-29.)，因此绵羊的多胎性是绵羊养殖业最为看重的经济性状。有关研究表明，多胎性能主效基因的作用能够显著增加羊肉产量。然而，由于绝大多数绵羊品种产单羔，少数双羔，这极大地影响了母羊胎产羔数这一绵羊生产最重要的繁殖指标(Goyal S,Aggarwal J,Dubey P K,et al.Expression analysis of genes associated with prolificacy inFecB carrier and noncarrier Indian sheep[J].Animal biotechnology,2017,28(3):220-227.)。FecB(fecundity booroola，FecB)是1980年在布鲁拉美利奴(BooroolaMerino)绵羊中发现的能增加排卵数和产羔数的一个突变基因，是在绵羊中识别出的第一个高繁殖力主效基因(Piper L R,Bindon B M.The Booroola Merino and theperformance of medium non-Peppin crosses at Armidale[J].Wool Technology andSheep Breeding,1983,31(1).)。FecB突变位点位于编码区第746位发生A→G的改变，引起第249位氨基酸由谷氨酰胺变为精氨酸(Q249R)(Abudayyeh O O,Gootenberg J S,Konermann S,et al.C2c2is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector[J].Science,2016,353(6299):aaf5573.)。由于目前没有进行定向选育，带有多胎性能主效基因的个体数量较少，大多数还分散在群体之中。因此，如果我们有目的地按照多胎绵羊的选育措施，加强该品种的选育，建立核心群，就可以提高多胎性能基因型频率，使多胎性能主效基因固定下来。因此快速、准确的现场可视化检测绵羊多胎主效基因FecB是非常有效的分离多胎绵羊群体的技术。
目前存在检测FecB基因的方法有很多，比如PCR-RFLP方法被广泛用于分析FecB基因的突变(Georgescu S E,Hrinca G,Rebedea M,et al.Investigation of FecBMutation in Four Romanian Sheep Breeds[J].Scientific Papers Animal Scienceand Biotechnologies,2011,44(1):219-222.)，但是该方法的引物中需有酶切位点，且需使用昂贵的限制酶，该方法操作繁琐且检测成本高。其他方法如DNA测序或PCR-SSCP，这些方法在准确性、成本、分辨率、劳动力和时间消耗方面存在缺点，随着样本量的增加，这些缺点变得难以接受。前者作为金标准，不仅需要精密的温控循环系统，而且当样品数量大时成本很高，不适用与现场检测；至于PCR-SSCP，该方法操作繁琐，在劳动力和时间方面存在不足。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性、重复性好，灵敏度、准确率高，可在现场快速可视化地检测绵羊多胎主效基因FecB的方法。
本发明针对背景技术中提到的问题，采用的技术方案为：
①、DNA模板制备：获取待检测绵羊的肌肉组织并提取DNA；
②、ARMS特异性引物设计与合成：引物序列为：
正向引物F：5’-AACTTGTCTCACCAGT CTCCT-3’
反向引物R：5’-GCCTCATCAACACCGTCC-3’；
③、PCR反应体系建立：将步骤①得到的的DNA和步骤②所设计的引物进行PCR扩增；
④、核酸染料SYBR GreenⅠ染色：向步骤③的反应体系中加入核酸染料SYBR GreenⅠ染色，对PCR产物进行染色；
⑤、结果判断：通过裸眼直接观察PCR管中的颜色变化来判断样品中是否含有FecB基因，即显示亮绿色表示样品为多胎样品，显示橙黄色则表示样品不是多胎样品。
一种绵羊多胎主效基因FecB的快速可视化检测方法，包括绵羊样本的采集、DNA模板制备、ARMS特异性引物的设计与合成、PCR反应体系的建立、核酸染料SYBR GreenⅠ染色、结果判断，其具体步骤如下：
①、绵羊样本的采集：在新疆石河子某屠宰场随机采集绵羊个体，分别剪取不同个体3g肌肉组织样本，将其分别置于冻存管内并贴标签后放在-80℃的环境中保存。所述绵羊可以为新疆哈萨克羊；
②、DNA模板制备：取上述采集的各个样本，使用基因组DNA提取试剂盒(天根)提取所述样本的DNA，提取步骤按照说明书进行。提取的DNA经琼脂糖凝胶电泳和微量核酸蛋白检测仪(ND2000)检测以确定其纯度，将其置于-20℃的环境中保存；
③、ARMS特异性引物的设计与合成：基于GeneBank公布的绵羊多胎主效基因FecB(NC_040257.1)基因序列，使用引物设计软件Primer 5.0对ARMS PCR引物进行设计，特异性扩增具有SNP位点的FecB基因序列，由于FecB基因在其突变位点为A→G的突变。换言之，针对FecB基因的SNP位点，其下游引物的3’端的最后一个碱基为C，对于携带有FecB基因的绵羊个体就会正常扩增；反之，特异性引物与野生型的绵羊个体的基因存在一个错配，由于缺乏Taq DNA聚合酶的3'至5'核酸外切酶校正活性，引物3'末端的错配可以显着降低退火并因此降低扩增。因此，针对突变型的SNP设计的ARMS特异性引物只扩增突变型片段，不扩增野生型片段，引物序列为，
正向引物F：5’-AACTTGTCTCACCAGT CTCCT-3’，
反向引物R：5’-GCCTCATCAACACCGTCC-3’，
上述引物长度适当，引物与引物之间难以形成二聚体和发夹结构，其自身不存在互补序列，自身难以形成发夹结构，并且在错配位点的引发效率极低，与模板的序列能够紧密互补，扩增效率高、灵敏度高；
④、PCR反应体系的建立：将制备的DNA模板进行PCR扩增，PCR反应总体积为20μL，内含TaKaRa Ex Taq(5U/μl)0.1μL、10×PCR Buffer(Mg 2+free)2μL、MgCl 2(25mM)1.2μL、dNTP Mixture(各2.5mM)1.6μL、0.1nM引物各0.5μL、ddH2O 13.1μL、DNA模板1μL，PCR反应参数：95℃预变性5min，95℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸5min；
⑤、核酸染料SYBR GreenⅠ染色：所述PCR反应结束后，向反应体系中加入终浓度为10×的SYBR GreenⅠ核酸染料，对PCR产物进行染色，混匀后即刻观察PCR管中的颜色变化；
⑥、结果判断：通过裸眼直接观察PCR管中的颜色变化来判断样品中是否含有FecB基因，即PCR管显示亮绿色表示样品为多胎样品，若PCR管显示橙黄色则表示样品不是多胎样品。
与现有技术相比，本方法特异性、重复性好，灵敏度、准确度高，检测结果符合检测FecB基因的金标准——测序，但本方法成本低廉，简单快速，具有较高的应用价值和推广前景。
作为优选，扩增阻滞突变系统(ARMS)可以在3个小时内得出结果，所以与其它分子生物学基因诊断方法相比，具有准确、特异、简便、快速的特点。ARMS首先利用扩增阻滞突变原理，在目的片段的突变位点处设计ARMS特异性引物，该引物的3’末端碱基必须与突变目的片段相匹配。其原理是：扩增阻滞突变系统(ARMS)是PCR的应用，其中DNA通过等位基因特异性引物扩增。在PCR中，引物3'末端的错配可以显着降低退火并因此降低扩增，这是由于缺乏Taq聚合酶的3'至5'核酸外切酶校正活性。
作为优选，选择SYBR GreenⅠ为核酸染料。SYBR GreenⅠ法检测ARMS扩增，利用的是SYBR GreenⅠ能嵌入双链DNA(Double strand DNA,dsDNA)双螺旋小沟区域的特性。SYBRGreenⅠ在游离状态下发出很弱的荧光，然而当SYBR GreenⅠ与双链DNA结合后，荧光强度大大增强，因此可以利用SYBR GreenⅠ的荧光强度变化来检测核酸扩增。除此之外，当SYBRGreenⅠ浓度较高时，自然光条件下呈现橙黄色，当其与dsDNA结合后则会显现为黄绿色，可通过裸眼观察核酸扩增结果。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)本发明检测方法特异性好、重复性好，灵敏度高、准确度高，可快速可视化地检测绵羊多胎主效基因FecB，检测成本低，具有较高的应用价值和推广前景；
2)本发明检测方法用ARMS方法设计引物，特异性扩增绵羊多胎主效基因FecB，下游引物的3’端与SNP位点互补，提高了扩增的特异性；
3)本发明检测方法用核酸染料SYBR GreenⅠ对ARMS扩增产物进行染色，加入染料后可立刻通过观察PCR管的颜色变化来判断其是否有扩增产物，进而判断样本是否为含有FecB基因的多胞样本。
附图说明
图1为利用本发明方法检测哈萨克绵羊单胎及多胎样本所获得的测试图片，即本发明方法准确度的检测，SYBR GreenⅠ染色结果与电泳验证结果一致。
图2为利用本发明方法检测梯度稀释后的哈萨克绵羊多胎样本所获得的测试图片，即本发明方法灵敏度的检测，SYBR GreenⅠ染色结果与电泳验证结果一致，本发明方法的灵敏度为0.5ng/μL。
注：图1中使用SYBR GreenⅠ染色ARMS扩增产物结果图，其中2，4，5号样本为多胎样本。
注：图2中使用SYBR GreenⅠ染色ARMS扩增产物的灵敏度检测结果图，其中1，2，3，4，5分别为5ng/μL，0.5ng/μL，0.05ng/μL，0.005ng/μL，0.0005ng/μL。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细叙述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
本发明人依据FecB基因序列，针对该基因设计ARMS特异性引物，并且将该PCR方法与SYBR GreenⅠ核酸染料进行结合，以快速、准确、可视化地检测绵羊FecB基因，在此基础上完成了发明。
一种绵羊多胎主效基因FecB的快速检测方法，包括以下步骤：
1、绵羊样本的采集及DNA模板制备
于新疆石河子某屠宰场采集哈萨克绵羊个体的肌肉组织样本，分别剪取不同绵羊个体3g肌肉组织样本，将其分别置于冻存管内并贴标签后放在-80℃的环境中保存；使用基因组DNA提取试剂盒(天根)提取所述样本的DNA，提取步骤按照说明书进行。提取的DNA经琼脂糖凝胶电泳和微量核酸蛋白检测仪(ND2000，基因有限公司)检测以确定其纯度，将其置于-20℃的环境中保存。
2、ARMS特异性引物的设计与合成
基于GeneBank公布的绵羊多胎主效基因FecB(NC_040257.1)基因序列，使用引物设计软件Primer 5.0对ARMS PCR引物进行设计，特异性扩增具有SNP位点的FecB基因序列。由于FecB基因在其突变位点为A→G的突变，所以针对FecB基因的SNP位点，其下游引物的3’端的最后一个碱基为C，对于携带有FecB基因的绵羊个体就会正常扩增；反之，特异性引物与野生型的绵羊个体的基因存在一个错配，由于缺乏Taq DNA聚合酶的3'至5'核酸外切酶校正活性，引物3'末端的错配可以显着降低退火并因此降低扩增。因此，针对突变型的SNP设计的ARMS特异性引物只扩增突变型片段，不扩增野生型片段，引物序列为，正向引物F：5’-AACTTGTCTCACCAGTCTCCT-3’，反向引物R：5’-GCCTCATCAACACCGTCC-3’，上述引物长度适当，引物与引物之间难以形成二聚体和发夹结构，其自身不存在互补序列，自身难以形成发夹结构，并且在错配位点的引发效率极低，与模板的序列能够紧密互补，扩增效率高、灵敏度高。
3、ARMS PCR反应体系的建立
以制备的DNA作为模板模板进行PCR扩增，各PCR反应总体积为20μL，内含TaKaRaEx Taq(5U/μl)0.1μL、10×PCR Buffer(Mg2+free)2μL、MgCl2(25mM)1.2μL、dNTP Mixture(各2.5mM)1.6μL、0.1nM引物各0.5μL、ddH2O 13.1μL、DNA模板1μL，PCR反应参数：95℃预变性5min，95℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸5min；
4、核酸染料SYBR GreenⅠ染色及结果判断
①、核酸染料SYBR GreenⅠ染色
向反应产物中加入终浓度为10×的SYBR GreenⅠ核酸染料，对PCR产物进行染色，混匀后观察PCR管中的颜色变化；
②、结果判断
通过裸眼直接观察PCR管中的颜色变化来判断样品中是否含有FecB基因，即PCR管显示亮绿色表示样品为多胎样品，若PCR管显示橙黄色则表示样品不是多胎样品。记录裸眼观察的结果并用智能手机拍照。本方法特异性、重复性好，灵敏度、准确度高，本方法成本低廉，简单快速，具有较高的应用价值和推广前景；
本发明方法准确度及灵敏度的检测
①、本发明方法准确度的检测
将上述样本送北京睿博生物公司测序以验证裸眼判断的结果，结果显示裸眼判断结果、电泳验证以及测序验证结果完全一致，本检测方法的准确率为100％。
②、本发明方法灵敏度的检测
选取实施例4中测序验证的多胞样本的DNA，采用ARMS引物扩增梯度稀释后DNA模板，检测本方法的灵敏度，结果显示本方法可以检测到浓度为0.5ng/μL。
上述ARMS特异性引物的设计与合成步骤中扩增阻滞突变系统(ARMS)可以在3个小时内得出结果，所以与其它分子生物学基因诊断方法相比，具有简便、快速、准确、特异的特点。ARMS首先利用扩增阻滞突变原理，在目的片段的突变位点处设计ARMS特异性引物，该引物的3’末端碱基必须与突变目的片段相匹配。其原理是：扩增阻滞突变系统(ARMS)是PCR的应用，其中DNA通过等位基因特异性引物扩增。在PCR中，引物3'末端的错配可以显着降低退火并因此降低扩增，这是由于缺乏Taq聚合酶的3'至5'核酸外切酶校正活性。
上述PCR产物染色步骤中选择SYBR GreenⅠ为核酸染料，SYBR GreenⅠ法检测ARMS扩增，利用的是SYBR GreenⅠ能嵌入双链DNA(Double strand DNA,dsDNA)双螺旋小沟区域的特性。SYBR GreenⅠ在游离状态下发出很弱的荧光，然而当SYBR GreenⅠ与双链DNA结合后，荧光强度大大增强，因此可以利用SYBR GreenⅠ的荧光强度变化来检测核酸扩增。除此之外，当SYBR GreenⅠ浓度较高时，自然光条件下呈现橙黄色，当其与dsDNA结合后则会显现为黄绿色，可通过裸眼观察核酸扩增结果。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种绵羊多胎主效基因FecB快速可视化检测方法，其特征在于：包含以下步骤：
①、DNA模板制备：获取待检测绵羊的肌肉组织并提取DNA；
②、ARMS特异性引物设计与合成：引物序列为：
正向引物F：5’-AACTTGTCTCACCAGT CTCCT-3’
反向引物R：5’-GCCTCATCAACACCGTCC-3’；
③、PCR反应体系建立：将步骤①得到的DNA和步骤②所设计的引物进行PCR扩增；
将制备的DNA模板进行PCR扩增，PCR反应总体积为20μL，内含TaKaRa Ex Taq(5U/μl)0.1μL、10×PCR Buffer(Mg2+free)2μL、MgCl2(25mM)1.2μL、dNTP Mixture(各2.5mM)1.6μL、0.1nM引物各0.5μL、ddH2O 13.1μL、DNA模板1μL，PCR反应参数：95℃预变性5min，95℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸5min；
④、核酸染料SYBR Green Ⅰ染色：向步骤③的反应体系中加入核酸染料SYBR Green Ⅰ染色，对PCR产物进行染色；向反应体系中加入终浓度为10×的SYBR Green Ⅰ核酸染料。
2.根据权利要求1所述的一种绵羊多胎主效基因FecB快速可视化检测方法，其特征在于：剪取肌肉组织样本，将取样样本置于冻存管内并贴标签后放在-80℃的环境中保存，使用基因组DNA提取试剂盒提取所取样本的DNA，提取的DNA经琼脂糖凝胶电泳和微量核酸蛋白检测仪检测以确定其纯度，将其置于-20℃的环境中保存。
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