CN112126691A - 利用猪2号染色体基因多态性位点辅助检测猪背膘厚性状的方法、引物、试剂盒及应用 - Google Patents
利用猪2号染色体基因多态性位点辅助检测猪背膘厚性状的方法、引物、试剂盒及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种利用猪2号染色体基因多态性位点辅助检测猪背膘厚性状的方法、引物、试剂盒及应用。该方法为：检测待测猪的猪2号染色体自5′末端起第71588075位脱氧核糖核苷酸是G还是A，确定待测猪的基因型是GG还是AA，GG基因型猪背膘厚高于AA基因型猪；使用所述引物对所述试剂盒按所述方法检测待测猪的猪2号染色体自5′末端起第71588075位脱氧核糖核苷酸是G还是A，确定待测猪的基因型是GG还是AA；选择AA基因型的猪进行育种，可获得更薄背膘厚性状的猪。用该方法选择猪的性状，可使猪背膘厚变薄约0.83cm，从而获得生产性能更高的猪。用该方法对猪育种，可缩短选取优良种猪时间，降低育种花费。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种利用猪2号染色体(v11.1)自5′末端起第71588075位G>A多态性位点辅助检测猪达100kg体重背膘厚性状的方法、引物、专用试剂盒及应用，即一种利用猪2号染色体基因多态性位点辅助检测猪背膘厚性状的方法、引物、试剂盒及应用。
背景技术
猪的达100kg体重背膘厚不仅与瘦肉率有关，与生长速度也存在强相关，因此，其在育种上的价值很高，一直是猪育种目标的重要组成部分。但是，达100kg体重背膘厚的测定时段为猪只体重在85-110kg范围，只能在猪长成之后才能测定。对其成年后测定一方面会加大育种成本，另一方面会拉长世代间隔，减缓遗传进展速度，对其进行早期选择优势明显。分子生物技术、芯片技术、测序技术的飞速发展为猪达100kg体重背膘厚等数量性状开展育种更早、更准确、进展更快速的分子育种提供了研究基础。而且，由于猪的器官大小和人比较相似，是人类研究的一种重要的模式动物，因此，找到猪对达成年体重背膘有影响的基因有可能对人类的肥胖的研究提供一定的借鉴意义。
发明内容
本发明的目的是：克服现有技术的不足，提供一种利用国际猪基因组11.1版本(v11.1)参考序列中的猪2号染色体自5′末端起第71588075位G>A多态性位点辅助检测猪达100kg体重背膘厚性状的方法、引物、专用试剂盒及应用，即一种利用猪2号染色体基因多态性位点辅助检测猪背膘厚性状的方法、引物、试剂盒及应用。
本发明的技术方案如下：
本发明提供一种利用猪2号染色体基因多态性位点辅助检测猪背膘厚性状的方法，即一种利用国际猪基因组11.1版本参考序列中的猪2号染色体g.71588075G>A多态性位点辅助检测猪达100kg体重背膘厚性状的方法，该方法为：检测待测猪的猪2号染色体(v11.1)自5′末端起第71588075位脱氧核糖核苷酸是G还是A，亦即检测待测猪的国际猪基因组11.1版本参考序列中的猪2号染色体自5′末端起第71588075位脱氧核糖核苷酸是G还是A，确定待测猪的基因型是GG还是AA，GG基因型的猪的背膘厚高于AA基因型的猪的背膘厚；所述GG基因型为国际猪基因组11.1版本参考序列中的猪2号染色体(v11.1)自5′末端起第71588075位脱氧核糖核苷酸为G的纯合体；所述AA基因型为国际猪基因组11.1版本参考序列中的猪2号染色体(v11.1)自5′末端起第71588075位脱氧核糖核苷酸为A的纯合体。
进一步地，所述检测待测猪的猪2号染色体(v11.1)自5′末端起第71588075位脱氧核糖核苷酸是G还是A的方法具体为测序分析。
进一步地，所述测序分析包括PCR扩增和对PCR扩增产物进行测序的步骤；所述PCR扩增所用的引物对满足如下条件:以待测猪的基因组DNA为模板使用该引物对进行PCR扩增得到的扩增产物，含有猪2号染色体(v11.1)自5′末端起第71588075位脱氧核糖核苷酸。
进一步地，所述PCR扩增所用的引物对，是根据国际猪基因组11.1版本参考序列中的猪2号染色体(v11.1)g.71588075G>A上下游序列信息，设计并合成的一对引物，具体如下：
U(上游引物)：5’-GAGATGGCTTCACTGAGG-3’(序列表中的序列1)；
D(下游引物)：5’-ATCAACAAGGCTGAGGAC-3’(序列表中的序列2)。
即：所述PCR扩增所用的引物对，是由序列表中的序列1所示的核苷酸和序列表中的序列2所示的核苷酸组成的引物对。
进一步地，采用所述引物对，以待测猪的基因组DNA为模板，进行PCR扩增；根据待测猪的基因组DNA的不同，得到的扩增产物的DNA片段为序列表中的序列3所示的核苷酸序列或序列表中的序列4所示的核苷酸序列。
进一步地，所述的待测猪，具体可为大白猪。可选用大白猪的血液、体液或其它组织的细胞作为生物样本，取大白猪的细胞核的2号染色体上的基因组DNA作为模板，使用上游引物U和下游引物D进行PCR扩增。
本发明还提供一种上述检测方法中所用到的用于扩增含有g.71588075G>A多态性位点的DNA片段的引物对；所述引物对，是根据国际猪基因组11.1版本参考序列中的猪2号染色体g.71588075G>A上下游序列信息，设计并合成的一对引物，具体为：
上游引物U：5’-GAGATGGCTTCACTGAGG-3’，即序列表中的序列1所示的核苷酸；
下游引物D：5’-ATCAACAAGGCTGAGGAC-3’，即序列表中的序列2所示的核苷酸；
亦即：所述引物对，是由序列表中的序列1所示的核苷酸和序列表中的序列2所示的核苷酸组成的引物对。
本发明还提供一种上述检测方法中使用的，利用猪2号染色体g.71588075G>A多态性位点辅助检测猪达100kg体重背膘厚性状的试剂盒，它包括由序列表中的序列1所示的核苷酸和序列表中的序列2所示的核苷酸组成的引物对。
进一步地，所述试剂盒，用于以大白猪的基因组DNA为模板，使用引物对即上游引物U和下游引物D进行PCR扩增；
PCR扩增反应体系为：基因组DNA200ng，10×PCR扩增缓冲液5μl，dNTPs 10mM，上游引物、下游引物各50ng，Taq DNA聚合酶0.75U，Mg2+2.5mmol/L，用ddH2O补充反应体系至50μl；
其中，所述的上游引物、下游引物为：
上游引物U：5’-GAGATGGCTTCACTGAGG-3’，即序列表中的序列1所示的核苷酸；
下游引物D：5’-ATCAACAAGGCTGAGGAC-3’，即序列表中的序列2所示的核苷酸；
所述的基因组DNA，是选用大白猪的血液、体液或其它组织的细胞作为生物样本，取大白猪的细胞核的2号染色体上的基因组DNA获得的。
本发明还提供一种上述检测方法中所用到的用于扩增含有g.71588075G>A多态性位点的DNA片段的引物对，即一种由序列表中的序列1所示的核苷酸和序列表中的序列2所示的核苷酸组成的引物对，在制备辅助检测猪达100kg体重背膘厚性状的试剂盒中的应用。
本发明还提供以上所述的检测方法、所述的引物对、所述的试剂盒，在猪的育种中的应用。以上所述的检测方法、所述的引物对、所述的试剂盒，均可用于培育具有更薄背膘厚性状的猪，从而应用于猪的育种中。
培育具有更薄背膘厚性状的猪的方法包括：使用所述的引物对和所述的试剂盒，按所述的方法，检测待测猪的猪2号染色体自5′末端起第71588075位脱氧核糖核苷酸是G还是A，确定待测猪的基因型是GG还是AA；选择AA基因型的猪进行育种，可获得更薄背膘厚性状的猪。
猪2号染色体(v11.1)自5′末端起第71588075位脱氧核糖核苷酸存在一个脱氧核糖核苷酸的差异(G/A)，该单核苷酸多态被命名为g.71588075G>A。AA纯合基因型群体背膘厚比GG纯合基因型群体背膘厚薄约0.83cm，所以，该位点可作为猪达100kg体重背膘厚性状的分子育种标记。即：国际猪基因组11.1版本参考序列中的猪2号染色体g.71588075G>A多态性位点，可作为猪达100kg体重背膘厚性状的分子育种标记。
本发明使用基因测序方法检测g.71588075G>A，只需进行PAR反应，测序即可判别个体的基因型，基因型判型非常准确，检测费用不高，具有很高的育种实践应用价值。用本发明的方法对猪和性状进行选择，可使猪平均背膘厚变薄约0.83cm，从而获得生产性能更高的猪。
本发明的有益效果：
应用本发明提供的方法对猪进行育种，可对待选猪进行早期筛选，有效地缓解实际生产中的选优良种猪时间长的问题，降低育种花费，有效降低或提高实际生产中的猪的背膘性状育种进展。本发明的检测方法操作简单、费用不高、准确度高，并可实现自动化的直接检测。本发明能在猪的育种工作中发挥巨大作用。
附图说明
图1为序列M1(GG纯合体基因型)和序列M2(AA纯合体基因型)的测序结果图(猪2号染色体(v11.1)g.71588075G>A)。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下实施例中的引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。
以下实施例中的大白猪：该猪来自上海新农科技股份有限公司猪场。
实施例1、多态性位点的确定，及多态性位点与猪背膘厚性状的相关性分析一、猪2号染色体(v11.1)g.71588075G>A多态性位点的确定
1、PCR扩增
根据国际猪基因组11.1版本参考序列中的猪2号染色体(v11.1)g.71588075G>A上下游序列信息，设计并合成一对引物如下：
U(上游引物)：5’-GAGATGGCTTCACTGAGG-3’(序列表中的序列1)；
D(下游引物)：5’-ATCAACAAGGCTGAGGAC-3’(序列表中的序列2)。
选择大白猪(2头)为实验材料。以大白猪的基因组DNA为模板，使用上游引物U和下游引物D进行PCR扩增。(选用大白猪的耳部组织的细胞作为生物样本，取大白猪的细胞核的2号染色体上的基因组DNA作为模板，使用上游引物U和下游引物D进行PCR扩增)
PCR扩增体系为：基因组DNA 200ng，10×PCR扩增缓冲液5μl，dNTPs 10mM，上、下游引物各50ng，Taq DNA聚合酶0.75U，Mg2+2.5mmol/L，用ddH2O(双蒸水)补充反应体系至50μl。
PCR扩增程序(PCR反应条件)为：95℃变性5min；然后95℃变性20s，59℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸10min。
PCR扩增产物经琼脂糖凝胶检测后于-20℃保存。
按上述方法，以2头不同的大白猪的不同的基因组DNA为模板，使用上述上游引物U和下游引物D，进行上述PCR扩增的扩增产物分别命名为产物1、产物2。
2、克隆测序及序列分析
分别对上述2种PCR扩增产物(即产物1、产物2)进行核苷酸序列测定(由英潍捷基(上海)贸易有限公司测定)。
测序结果表明：产物1的核苷酸序列为序列M1，产物2的核苷酸序列为序列M2。序列M1和序列M2的长度均为236bp，只存在一个脱氧核糖核苷酸的差异(G/A)(见图1)，此脱氧核糖核苷酸为猪2号染色体(v11.1)自5′末端起第71588075位脱氧核糖核苷酸，将该单核苷酸多态命名为g.71588075G>A。
产物1即序列M1的核苷酸序列，见序列表中的序列3。产物2即序列M2的核苷酸序列，见序列表中的序列4。序列3所示的核苷酸序列与序列4所示的核苷酸序列只存在一个碱基的差异。即：序列3中自5′末端起第71588075位脱氧核糖核苷酸的碱基为G。序列4中自5′末端起第71588075位脱氧核糖核苷酸的碱基为A。
亦即，对上述以大白猪的基因组DNA为模板使用上游引物U和下游引物D进行PCR扩增得到的PCR扩增产物进行测序；测得PCR扩增产物的DNA片段为序列表中的序列3所示的核苷酸序列或序列表中的序列4所示的核苷酸序列。
将猪2号染色体(v11.1)自5′末端起第71588075位脱氧核糖核苷酸的碱基为A的纯合体基因型命名为AA；将猪2号染色体(v11.1)自5′末端起第71588075位脱氧核糖核苷酸的碱基为G的纯合体基因型命名为GG；将猪2号染色体(v11.1)自5′末端起第71588075位脱氧核糖核苷酸的碱基为A和G的杂合体基因型命名为AG。
即：序列M1为GG纯合体基因型，带这种基因的个体(猪)为GG基因型个体(GG基因型的猪)；序列M2为AA纯合体基因型，带这种基因的个体为AA基因型个体(AA基因型的猪)。
图1中，上部为序列M1(GG纯合体基因型)的测序结果图，下部为序列M2(AA纯合体基因型)的测序结果图。
二、猪2号染色体(v11.1)g.71588075G>A多态性位点与猪达100kg体重背膘厚性状的相关性分析
为确定g.71588075G>A多态性位点与猪达100kg体重背膘厚性状是否相关，以2520头大白猪为实验材料，进行如下试验：提取基因组进行测序分析，方法同步骤一；同时测定并记录猪达100kg体重背膘厚性状；对g.71588075G>A多态性位点与猪达100kg体重背膘厚性状以最小二乘法开展关联分析。所用模型如下：
Y＝S+P+G+e
其中：Y为猪背膘厚(猪达100kg体重背膘厚)性状测定值，S为性别效应，P为品系效应，G为基因型效应，e为残差效应。
结果见表1。
表1猪2号染色体(v11.1)突变位点g.71588075G>A基因型与猪背膘厚相关性状的关联
注：同列上标不同字母表示差异显著(P<0.05)
结果表明：在猪背膘厚性状中，GG基因型个体分别比AA基因型个体在猪背膘厚性状方面高约0.83cm(P<0.05)。
所以，在实际的猪育种中，为获得更薄背膘厚性状的猪，最好选择AA基因型的猪进行育种。
实施例2、检测方法的建立(提供引物对、试剂盒)
(一)建立一种利用猪2号染色体基因多态性位点辅助检测猪背膘厚性状的检测方法，即一种利用国际猪基因组11.1版本参考序列中的猪2号染色体g.71588075G>A多态性位点辅助检测猪达100kg体重背膘厚性状的检测方法，该检测方法为：检测待测猪的猪2号染色体(v11.1)自5′末端起第71588075位脱氧核糖核苷酸是G还是A，亦即检测待测猪的国际猪基因组11.1版本参考序列中的猪2号染色体自5′末端起第71588075位脱氧核糖核苷酸是G还是A，确定待测猪的基因型是GG还是AA，GG基因型的猪的背膘厚高于AA基因型的猪的背膘厚；所述GG基因型为国际猪基因组11.1版本参考序列中的猪2号染色体(v11.1)自5′末端起第71588075位脱氧核糖核苷酸为G的纯合体；所述AA基因型为国际猪基因组11.1版本参考序列中的猪2号染色体(v11.1)自5′末端起第71588075位脱氧核糖核苷酸为A的纯合体。
所述检测待测猪的猪2号染色体(v11.1)自5′末端起第71588075位脱氧核糖核苷酸是G还是A的方法具体为测序分析。所述测序分析包括PCR扩增和对PCR扩增产物进行测序的步骤(具体方法步骤同上述实施例1中的步骤一)。
(二)提供一种上述检测方法中所用到的用于扩增含有g.71588075G>A多态性位点的DNA片段的引物对；所述引物对，是根据国际猪基因组11.1版本参考序列中的猪2号染色体g.71588075G>A上下游序列信息，设计并合成的一对引物，具体为：
上游引物U：5’-GAGATGGCTTCACTGAGG-3’，即序列表中的序列1所示的核苷酸；
下游引物D：5’-ATCAACAAGGCTGAGGAC-3’，即序列表中的序列2所示的核苷酸；
亦即：所述引物对，是由序列表中的序列1所示的核苷酸和序列表中的序列2所示的核苷酸组成的引物对。
(三)提供一种上述检测方法中使用的，利用猪2号染色体g.71588075G>A多态性位点辅助检测猪达100kg体重背膘厚性状的试剂盒，它包括由序列表中的序列1所示的核苷酸和序列表中的序列2所示的核苷酸组成的引物对。
所述试剂盒，用于以大白猪的基因组DNA为模板，使用引物对即上游引物U和下游引物D进行PCR扩增；
PCR扩增反应体系为：基因组DNA 200ng，10×PCR扩增缓冲液5μl，dNTPs 10mM，上游引物、下游引物各50ng，Taq DNA聚合酶0.75U，Mg2+2.5mmol/L，用ddH2O补充反应体系至50μl；
其中，所述的上游引物、下游引物为：
上游引物U：5’-GAGATGGCTTCACTGAGG-3’，即序列表中的序列1所示的核苷酸；
下游引物D：5’-ATCAACAAGGCTGAGGAC-3’，即序列表中的序列2所示的核苷酸；
所述的基因组DNA：是选用大白猪的耳部组织的细胞作为生物样本，取大白猪的细胞核的2号染色体上的基因组DNA获得的。
实施例3、育种方法的建立(检测方法、引物对、试剂盒的应用)
将上述实施例2中所述的检测方法、所述的引物对、所述的试剂盒，应用于猪的育种中，用于培育具有更薄背膘厚性状的猪。
培育具有更薄背膘厚性状的猪的方法：检测待测猪的猪2号染色体(v11.1)自5′末端起第71588075位脱氧核糖核苷酸是G还是A，确定待测猪的基因型是GG还是AA；选择AA基因型的猪进行育种，可获得更薄背膘厚性状的猪。
所述检测待测猪的猪2号染色体(v11.1)自5′末端起第71588075位脱氧核糖核苷酸是G还是A的方法具体为测序分析；所述测序分析包括PCR扩增和对PCR扩增产物进行测序的步骤(具体方法步骤同上述实施例1中的步骤一)。亦即，采用实施例2的(一)中所述的检测方法进行检测。
上述检测方法中用到实施例2的(二)中所述的引物对，以及实施例2的(三)中所述的试剂盒。
Claims (10)
1.一种利用猪2号染色体基因多态性位点辅助检测猪背膘厚性状的方法，即一种利用国际猪基因组11.1版本参考序列中的猪2号染色体g.71588075G>A多态性位点辅助检测猪达100kg体重背膘厚性状的方法，其特征在于，该方法是：检测待测猪的国际猪基因组11.1版本参考序列中的猪2号染色体自5′末端起第71588075位脱氧核糖核苷酸是G还是A，确定待测猪的基因型是GG还是AA，GG基因型的猪的背膘厚高于AA基因型的猪的背膘厚；所述GG基因型为国际猪基因组11.1版本参考序列中的猪2号染色体自5′末端起第71588075位脱氧核糖核苷酸为G的纯合体；所述AA基因型为国际猪基因组11.1版本参考序列中的猪2号染色体自5′末端起第71588075位脱氧核糖核苷酸为A的纯合体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述检测待测猪的国际猪基因组11.1版本参考序列中的猪2号染色体自5′末端起第71588075位脱氧核糖核苷酸是G还是A的方法为测序分析；所述测序分析包括PCR扩增和对PCR扩增产物进行测序两个步骤；所述PCR扩增所用的引物对满足如下条件:以待测猪的基因组DNA为模板使用该引物对进行PCR扩增的产物，含有国际猪基因组11.1版本参考序列中的猪2号染色体自5′末端起第71588075位脱氧核糖核苷酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
所述PCR扩增所用的引物对，是根据国际猪基因组11.1版本参考序列中的猪2号染色体g.71588075G>A上下游序列信息，设计并合成的一对引物，具体如下：
上游引物U：5’-GAGATGGCTTCACTGAGG-3’，即序列表中的序列1所示的核苷酸；
下游引物D：5’-ATCAACAAGGCTGAGGAC-3’，即序列表中的序列2所示的核苷酸；
亦即：所述PCR扩增所用的引物对，是由序列表中的序列1所示的核苷酸和序列表中的序列2所示的核苷酸组成的引物对。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：以待测猪的基因组DNA为模板，采用所述引物对，进行PCR扩增，得到的扩增产物的DNA片段为序列表中的序列3所示的核苷酸序列或序列表中的序列4所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述待测猪为大白猪；所述的测序分析方法包括：以大白猪的基因组DNA为模板，使用上游引物U和下游引物D进行PCR扩增；
PCR扩增反应体系为：基因组DNA 200ng，10×PCR扩增缓冲液5μl，dNTPs 10mM，上游引物、下游引物各50ng，Taq DNA聚合酶0.75U，Mg2+2.5mmol/L，用ddH2O补充反应体系至50μl；
上游引物U：5’-GAGATGGCTTCACTGAGG-3’，即序列表中的序列1所示的核苷酸；
下游引物D：5’-ATCAACAAGGCTGAGGAC-3’，即序列表中的序列2所示的核苷酸；
PCR扩增程序为：95℃变性5min；然后95℃变性20s，59℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸10min；
PCR扩增产物经琼脂糖凝胶检测后于-20℃保存；
对上述PCR扩增得到的PCR扩增产物进行测序；测得PCR扩增产物的DNA片段为序列表中的序列3所示的核苷酸序列或序列表中的序列4所示的核苷酸序列。
6.一种如权利要求1至5中任一所述的方法中所用到的用于扩增含有g.71588075G>A多态性位点的DNA片段的引物对，其特征在于，所述引物对，是根据国际猪基因组11.1版本参考序列中的猪2号染色体g.71588075G>A上下游序列信息，设计并合成的一对引物，具体为：
上游引物U：5’-GAGATGGCTTCACTGAGG-3’，即序列表中的序列1所示的核苷酸；
下游引物D：5’-ATCAACAAGGCTGAGGAC-3’，即序列表中的序列2所示的核苷酸；
亦即：所述引物对，是由序列表中的序列1所示的核苷酸和序列表中的序列2所示的核苷酸组成的引物对。
7.一种如权利要求1至5中任一所述的方法中使用的，利用猪2号染色体g.71588075G>A多态性位点辅助检测猪达100kg体重背膘厚性状的试剂盒，其特征在于：它包括由序列表中的序列1所示的核苷酸和序列表中的序列2所示的核苷酸组成的引物对。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒，用于以大白猪的基因组DNA为模板，使用引物对即上游引物U和下游引物D进行PCR扩增；
PCR扩增反应体系为：基因组DNA200ng，10×PCR扩增缓冲液5μl，dNTPs 10mM，上游引物、下游引物各50ng，Taq DNA聚合酶0.75U，Mg2+2.5mmol/L，用ddH2O补充反应体系至50μl；
其中，所述的上游引物、下游引物为：
上游引物U：5’-GAGATGGCTTCACTGAGG-3’，即序列表中的序列1所示的核苷酸；
下游引物D：5’-ATCAACAAGGCTGAGGAC-3’，即序列表中的序列2所示的核苷酸；
所述的基因组DNA：是选用大白猪的血液、体液或组织的细胞作为生物样本，取大白猪的细胞核的2号染色体上的基因组DNA获得的。
9.一种如权利要求1至5中任一所述的方法中所用到的用于扩增含有g.71588075G>A多态性位点的DNA片段的引物对，即一种由猪的基因组DNA序列表中的序列1所示的核苷酸和序列表中的序列2所示的核苷酸组成的引物对，在制备辅助检测猪达100kg体重背膘厚性状的试剂盒中的应用。
10.权利要求1至5中任一所述的方法，或权利要求6所述的引物对，或权利要求7至8中任一所述的试剂盒，在猪的育种中的应用，用于培育具有更薄背膘厚性状的猪；培育具有更薄背膘厚性状的猪的方法包括：使用所述的引物对和所述的试剂盒，按所述的方法，检测待测猪的猪2号染色体自5′末端起第71588075位脱氧核糖核苷酸是G还是A，确定待测猪的基因型是GG还是AA；选择AA基因型的猪进行育种，可获得更薄背膘厚性状的猪。
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