CN112430651A - 一种ffpe样本完整性的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及一种人类基因组DNA完整性的检测方法。该检测方法包括：提取样本的基因组DNA；扩增基因组DNA的保守区域；扩增产物条带数量和/或浓度的检测；对扩增产物评分，评估样本基因组DNA的完整性。本发明还包括相应的检测试剂盒和应用。本发明的检测方法操作简便、能够快速、高效、准确的评估样本中人类基因组DNA的完整性和质量，对后续的建库测序有指导性作用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种FFPE样本核酸完整性的检测方法，检测试剂盒及其应用。
背景技术
FFPE样本是福尔马林固定、石蜡包埋的样本，FFPE样本测序流程主要是核酸提取、文库构建、上机测序及数据分析、解读四个部分，提取的核酸质量对建库的成功与否乃至下机数据的可靠性都起着至关重要的作用。因为福尔马林的固定容易使组织中的核酸发生不同程度的降解和分子间的交联，石蜡的高温渗入过程又进一步加速了核酸的降解，保存的时间及环境对样本中的核酸也有巨大影响。另外DNA和DNA之间，DNA和蛋白之间存在交联后续的NGS检测PCR扩增。所以了解FFPE样本DNA的完整性和交联程度对测序过程至关重要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是评估FFPE样本DNA的完整性。
本发明提供了一种人类基因组DNA完整性的检测方法，包括如下步骤：
提取样本的基因组DNA；
扩增基因组DNA的保守区域；
扩增产物条带数量和/或浓度的检测；
和/或
对扩增产物评分，评估样本基因组DNA的完整性。
所述的扩增使用序列如SEQ ID NO 1所示的上游引物和序列如SEQ ID NO 2-4中任意一条所示的下游引物。
所述的评分是指对比样本与阳性参照的扩增产物的条带大小和亮度，获取样本DNA的完整性的分值，判断样本的DNA的完整性；分值越大，DNA的完整度越高。
所述的评分规则为:
扩增产物中分子量最大的条带如果和阳参亮度一样或比阳参还亮，评分为3分；
如果该条带但没有阳参亮但有明显轮廓，评分为2分；
如果该条带比阳参亮度弱且无明显轮廓、呈弥散状态，评为1分；
如果无该条带，则评分为0分。
扩增产物的评分越高，样本DNA的完整度越高。
在本发明的一个优选实施例中，所称的分子量最大的条带大小为300bp，是指MarkL100 300bp指示带对应的产物条带。
优选的，结合条带扫描装置和比对软件进行评分。
优选的，所述的检测方法还包括构建基于基因组DNA的基因文库；
和/或通过测序方法确定基因组DNA的步骤。
本发明中，所述的样本是经过冰冻、保鲜保存的人类组织或者体液样本，包括血液、唾液、体液、肌肉、脂肪、血管、骨骼、指甲、牙齿等等的样本。
通常，所述的样本是取自人体但是已经离体，例如取自活检或者生化检测的样本，也可以取自尸体的样本。
在本发明的一个优选实施例中，所述的样本是福尔马林固定、石蜡包埋的FFPE样本。
本发明中，所述的扩增基因组DNA的保守区域，包括使用上游引物和下游引物进行PCR的步骤。例如，所述的上游引物序列如SEQ ID NO 1所示；所述的下游引物序列选自SEQID NO 2-4中任意一项或者几项。
本发明所述的扩增可以采用本领域常规技术方法。PCR通常由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。
2、模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。
3、引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。
优选的，所述的扩增条件是：
变性温度为94-95℃；延伸温度为66-75℃。
较好的，退火温度为48-57℃，例如49-55℃；在本发明的优选实施例中使用的退火温度包括49℃、51℃、53℃、55℃、57℃等。
在本发明的一个优选实施例中，采用的实验条件如下：
取4ng的gDNA作为PCR起始模板即可(样本浓度>＝2ng/μl的，稀释到2ng/μl后取2μl；样本浓度<2ng/μl，直接使用3μl)，阳参、阴参及待测样本起始量均为4ng，Forward&Reverse primer(10uM)各2ul，Premix Taq12.5ul，UPDW8.5ul，反应程序为：
所用的引物包括上游的一条管家引物(Forward 1：5’CTATCCCTGTACGCCTCTGG 3’，SEQ ID NO 1)和下游不同位置的三条引物(Reverse 1：5’CCAGGTCCAGACGCAGGA 3’,SEQ IDNO 2；Reverse 2：5’CACGCACGATTTCCCGCT3’,SEQ ID NO 3；Reverse 3：5’CCGTCAGGCAGCTCGTAG 3’,SEQ ID NO 4)，Reverse 1扩增出来的目标片段为124bp，Reverse2扩增出来的目标片段为214bp，Reverse 3扩增出来的目标片段为317bp。
相应的，本发明提供了一种检测DNA完整性的试剂盒，所述的试剂盒含有扩增保守区域的上游引物和下游引物。
较好的，所述的上游引物序列如SEQ ID NO 1所示；所述的下游引物序列如SEQ IDNO 2-4中任意一项所示。
优选的，所述的试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、基因组DNA、dNTP、聚合酶、说明书中的一种或者几种。
本发明的检测方法可以用于检测人类gDNA的质量。
在本发明的一个优选实施例中，所述的检测方法用于评估样本中国人类FFPE样本基因组DNA的完整性。
本发明提供了一种检测人类gDNA完整性的方法，包括检测实验、测序实验、生物分子学的实验分析等。通过四条引物对获取的样本，例如FFPE的DNA进行PCR扩增反应，扩增结果对比阳参，从而判断FFPE DNA的完整性。根据gDNA的一段保守区域设计四条引物，其中上游引物为一段管家基因，极为保守稳定，结合三条不同区域的下游引物根据目的片段能扩增出不同大小的PCR产物，通过扩增出来的目的条带来判断FFPE样本DNA的完整性。本发明的检测方法操作简便、能够快速、高效、准确的评估样本中人类基因组DNA的完整性和质量，对后续的建库测序有指导性作用。
本方法与目前市售同类检测试剂盒相比优势在于：
1.不需要昂贵的精密仪器和系统，通常qPCR检测DNA完整性的方法均需要昂贵的qPCR仪和对应的qPCR系统。普通的PCR仪即可完成扩增，对仪器的精密度没有太高要求。
2.不需要专门的试剂盒，通常市场上试剂盒容易被各种因素比如货期等条件制约，本方法仅需要进行普通的引物合成和taq酶以及样本即可完成。
3.不需要进行专门标准品对比和定曲线，本方法仅需要一个阳性参照即可，且阳性参照来源容易获得。
4.本方法对环境要求不是特别严格，qPCR因为灵敏度太高，为避免假阳性，对环境洁净度和人员操作细节要求较高。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明的检测方法的流程示意图。
图2是样本的琼脂糖凝胶电泳结果。
图3是使用本发明方法和市售方法处理4组不同质量的FFPE样本的结果比较图。
图4是在不同的退火温度下3对引物都能扩增目的条带片段。
图5是实施例1-2对应的检测流程简图。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
实施例1
使用质量好的血液抽提所得的DNA作为阳参，Nuclease-Free Water作为阴参，使用这四条引物对从FFPE样本获取的DNA进行PCR扩增反应，对反应后的PCR产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，观察其扩增后的片段大小分布，参照阳参的扩增条带来判断所获取的DNA的完整性。
四条引物，包括上游的一条管家引物(Forward 1：5’CTATCCCTGTACGCCTCTGG 3’)和下游不同位置的三条引物(Reverse 1：5’CCAGGTCCAGACGCAGGA 3’Reverse 2：5’CACGCACGATTTCCCGCT3’Reverse 3：5’CCGTCAGGCAGCTCGTAG 3’)，Reverse 1扩增出来的目标片段为124bp，Reverse 2扩增出来的目标片段为214bp，Reverse 3扩增出来的目标片段为317bp。
取4ng的gDNA作为PCR起始模板即可(样本浓度>＝2ng/μl的，稀释到2ng/μl后取2μl；样本浓度<2ng/μl，直接使用3μl)，阳参、阴参及待测样本起始量均为4ng，Forward&Reverse primer(10uM)各2ul，Premix Taq12.5ul，UPDW8.5ul，反应程序为：
取反应后的PCR产物，进行琼脂糖凝胶电泳检测并拍照分析电泳条带，对不同FFPE样本DNA进行评分分类，评分示例如图2所示。对照阳参，观察300bp处的条带，如果FFPE样本的DNA有300bp处的条带且和阳参亮度一样或比阳参还亮，评为3分；如果FFPE样本的DNA有300bp处的条带但没有阳参亮，比阳参亮度弱但300bp处的条带有明显轮廓评为2分；如果FFPE样本的DNA有300bp处的条带但比阳参亮度弱且300bp处的条带无明显轮廓，呈弥散状态评为1分；如果FFPE样本的DNA无300bp处的条带则评为0分。此处的300bp是指评判MarkL100 300bp指示带对应的产物条带亮度。
本实施例检测流程简图如图5所示。
实施例2
如下选取5组不同质量的FFPE样本提取的DNA分别使用本方法和
DNA QCAssay Calibration Kit,7500进行DNA完整性对比试验；
结果如下：
如图3所示，使用
DNA QC Assay Calibration Kit qPCR方法得出结果数值越接近1，DNA完整性越高，本方法使用PCR评分方式也同样精确显示出DNA的完整性，其结果与市售产品一致。
进一步而言，选取上述4组不同质量的FFPE样本提取的DNA分别使用本方法和
DNA QC Assay Calibrat ion Kit方法相比，优势在于：
一、不需要昂贵的精密仪器和系统，通常qPCR检测DNA完整性的方法均需要昂贵的qPCR仪和对应的qPCR系统。普通的PCR仪即可完成扩增，对仪器的精密度没有太高要求；
二、不需要专门的试剂盒，通常市场上试剂盒容易被各种因素比如货期等条件制约，本方法仅需要进行普通的引物合成和taq酶以及样本即可完成；
三、不需要进行专门标准品对比和定曲线，本方法仅需要一个阳性参照即可，且阳性参照来源容易获得；
四、本方法对环境要求不是特别严格，qPCR因为灵敏度太高，为避免假阳性，对环境洁净度和人员操作细节要求较高。
实施例3-6
实施例3-6的检测方法中，仅表中列出条件与实施例1不同，其余与实施例1相同。
| 退火温度 | 延长温度 | |
| 实施例3 | 49 | 72 |
| 实施例4 | 51 | 72 |
| 实施例5 | 53 | 72 |
| 实施例6 | 55 | 72 |
结果显示，实施例3-6的实验条件均能够成功扩增目标条带。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本申请公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 至本医疗科技（上海）有限公司
<120> 一种FFPE样本完整性的检测方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<400> 4
ccgtcaggca gctcgtag 18
Claims (10)
1.一种人类基因组DNA完整性的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括：
提取样本的基因组DNA；
扩增基因组DNA的保守区域；
扩增产物条带数量和/或浓度的检测；
和/或
对扩增产物评分，评估样本基因组DNA的完整性；
所述的扩增使用序列如SEQ ID NO 1所示的上游引物和序列如SEQ ID NO 2-4中任意一条所示的下游引物。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的评分是指对比样本与阳性参照的扩增产物的条带大小和亮度，获取样本DNA的完整性的分值，判断样本的DNA的完整性；分值越大，DNA的完整度越高。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，扩增产物中分子量最大的条带，如果和阳性参照亮度一样或比阳性参照还亮，评分为3分；
如果该条带但没有阳参亮但有明显轮廓，评分为2分；
如果该条带比阳参亮度弱且无明显轮廓、呈弥散状态，评为1分；
如果无该条带，则评分为0分。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的检测方法还包括构建基于基因组DNA的基因文库；
和/或
通过测序方法确定基因组DNA的步骤。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的样本是经过冰冻、保鲜保存的人类组织或者体液样本。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述的扩增的退火温度的范围为49-57℃。
7.一种检测DNA完整性的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有扩增保守区域的上游引物和下游引物；
所述的上游引物序列如SEQ ID NO 1所示；
所述的下游引物序列如SEQ ID NO 2-4中任意一项所示。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、dNTP、聚合酶说明书中的一种或者几种。
9.权利要求1-6任意一项所述的检测方法的应用，其特征在于，所述的检测方法用于检测人类gDNA的质量。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的检测方法用于评估FFPE样本的完整性。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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-
2020
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| CN117247999B (zh) * | 2023-11-17 | 2024-02-23 | 迈杰转化医学研究(苏州)有限公司 | 一种核酸完整性质量评估方法及其应用 |
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