CN103911452B - 中国人群耳聋基因筛查试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种中国人群耳聋基因筛查试剂盒及其应用。该试剂盒包括：以GJB2基因35位点、109位点、176-199位点、235位点、299-300位点，SLC26A4基因1174位点、1226位点、1229位点、1975位点、2027位点、2162位点、2168位点和IVS7-2位点，线粒体DNA基因1494位点、1555位点、3243位点和7444位点的突变为检测对象而设计的PCR扩增引物和延伸引物，其序列分别如SEQ ID No.1～SEQ ID No.33所示；以及，PCR反应试剂，包括聚合酶及缓冲溶液。利用本发明的试剂盒，通过简单操作，一次可获得多达17个位点的基因型，其成本低廉，且检测通量和检测结果的准确性等较之现有技术均有大幅提升，具有非常好的临床及规模化应用价值。
Description
技术领域
本发明特别涉及一种耳聋基因筛查试剂盒及其应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
耳聋是导致交流障碍最常见的疾病。估计全世界约有7亿人口听力损失至少达55dB，其中，学语前聋是常见的发病形式，也是社会影响较重的一类，发病率为1/1000，约半数是遗传因素所致，此人群已超过2700万，其中40％以上是NSHI（nonsyndromic hearing loss，非综合征性听力损害）。尽管遗传性耳聋早在十六世纪就已经被发现，但由于研究手段的限制，人们对其病理方面的研究进展缓慢。
近10多年来，随着现代科学技术的发展及分子生物学、遗传学的飞速发展，人们对遗传性聋的认识不断加深，并取得了显著进步，并探知了多种导致NSHI的基因缺陷。考虑到耳聋的早期确诊对保证语言、智商的康复治疗意义重大，例如，对于线粒体位点突变的个体，指导用药可以完全避免耳聋的发生。因此，通过早期筛查耳聋基因，对于提前预知和早期干预治疗从而预防耳聋的发生具有极其重要的临床应用价值。
传统的耳聋基因筛选方法主要有单链构象多态性分析、PCR-限制性片段长度多态性、变性高效液相色谱、直接测序、基因芯片等，但这些方法均或多或少存在一些不足之处，特别是，其中一个普遍的缺陷是无法进行高通量检测，效率低，成本高，难以实现临床快速检测或规模化人群筛查。
有鉴于此，本案发明人曾于公告号为CN102618624B的发明专利中提出了一种针对中国人群耳聋基因常见突变位点的一次性定性筛查试剂盒，其以GJB2基因35位点delG、109位点G→A突变、176-191位点缺失16个碱基、235位点delC和299-300位点delAT，SLC26A4基因1174位点的A→T突变、1229位点的A→G突变、2027位点的T→A突变、2168位点的A→G突变和IVS7-2位点的A→G突变，线粒体DNA1494位点的C→T突变、1555位点的A→G突变、3243位点的A→G突变和7445位点A→G突变共14个位点为检测对象，针对各个目的位点同时进行多重PCR扩增和标记延伸，通过毛细管电泳分析，一次获得14个位点的基因型。但是，经过大样本临床验证，上述试剂盒的个别位点扩增时，出现假阴性结果（1/5800），而且未涵盖诸如SLC26A4基因1226、1975、2162和线粒体DNA基因7444等位点，这些位点在耳聋患者遗传病因中也占有较高的比例，如何开发出具有更高检测效率，更高准确性，更大检测通量的耳聋基因筛选技术，仍是业界需要解决的重要技术问题之一。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的主要目的在于提供一种适用于中国人群的耳聋基因突变筛查试剂盒，其包括：
以GJB2基因35位点G→T突变、109位点G→A突变、176-199位点del16突变、235位点的delC、299-300位点delAT，SLC26A4基因1174位点A→T突变、1226位点G→A突变、1229位点C→T突变、1975位点G→C突变、2027位点、2162位点、2168位点的A→G突变和IVS7-2位点的A→G突变，线粒体DNA基因1494位点C→T突变、1555位点的A→G突变、3243位点的A→G突变和7444位点G→A突变为检测对象而设计的PCR扩增引物和延伸引物，其中，
所述GJB2基因35位点、109位点、176位点、235位点、299位点的扩增引物序列均如SEQ ID No.1与SEQ ID No.2所示，
所述SLC26A4基因1174位点、1226位点、1229位点的扩增引物序列均如SEQ ID No.3与SEQ ID No.4所示，
所述SLC26A4基因1975位点、2027位点的扩增引物序列均如SEQ ID No.5与SEQ ID No.6所示
所述SLC26A4基因2162位点、2168位点的扩增引物序列均如SEQ ID No.7与SEQ ID No.8所示，
所述SLC26A4基因IVS7-2位点的扩增引物序列如SEQ ID No.9与SEQ IDNo.10所示，
所述线粒体DNA基因1494位点、1555位点的扩增引物序列均如SEQ IDNo.11与SEQ ID No.12所示，
所述线粒体DNA基因3243位点和7444位点的扩增引物序列分别如SEQ IDNo.13与SEQ ID No.14以及SEQ ID No.15与SEQ ID No.16所示；
以及，PCR反应试剂，包括聚合酶及缓冲溶液。
其中，所述PCR反应试剂可包括dNTP、PCR缓冲液、Mg2+离子与FastTaq酶等，亦还可包括用以纯化的SAP酶、阳性对照标本、阴性对照标本等。
进一步的，针对GJB2基因35、109、176、235、299位点，SLC26A4基因1174、1226、1229、1975、2027、2162、2168和IVS7-2位点，线粒体DNA基因1494、1555、3243、7444位点而设计的延伸引物的序列分别如SEQ ID No.17～SEQ ID No.33所示。
本发明的另一目的在于提供前述任一项中国人群耳聋基因筛查试剂盒在耳聋基因突变筛查中的应用。
本发明的又一目的在于提供一种耳聋基因突变筛查方法，其包括：
（1）提供前述任一项所述的中国人群耳聋基因筛查试剂盒，
（2）以所述扩增引物对耳聋基因进行多重PCR扩增，并对扩增产物进行纯化；
（3）以所述延伸引物针对步骤（2）所获纯化产物进行延伸标记反应和二次纯化；
（4）对步骤（3）所获二次纯化产物进行毛细管电泳，并对毛细管电泳结果进行数据采集和分析，获得筛查结果。
在本发明中，本案发明人经大量研究和实践，对中国人群耳聋基因的突变位点进行了筛选和组合，并构建了本发明的试剂盒，利用该试剂盒，可针对多达17个特异性耳聋基因突变位点同时进行多重PCR扩增和标记延伸，继而再通过简单的毛细管电泳分析等，一次获得多达17个位点的基因型，其操作简便，成本低，且检测通量和检测结果的准确性等较之CN102618624B所提供的试剂盒均有大幅提升，并优化了部分PCR引物和延伸引物，增加了准确性，降低了假阴性率，例如，摒弃了1个不常见位点，新增4个位点，修订了已有的4个延伸引物，检测通量从14个位点提高到17个位点，检测结果的准确度可达到近100%，具有较高的规模化临床应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一典型实施方案中利用该中国人群耳聋基因筛查试剂盒进行基因筛查的工艺流程图；
图2是本发明一典型实施方案中SNaPshot基因分型毛细管电泳峰图，其中A所示为正常对照样本SNaPshot基因分型毛细管电泳峰图，B-I所示的依次为GJB2基因235delC突变、SLC26A4基因1174位点A→T突变、GJB2基因35位点G→T突变、SLC26A4基因IVS7-2位点的A→G突变，线粒体DNA3243位点的A→G突变，线粒体DNA1555位点的A→G突变、GJB2基因299-300位点delAT、GJB2基因109位点G→A突变的毛细管电泳峰图。
具体实施方式
本发明的一个方面提供了一种中国人群耳聋基因筛查试剂盒，其包括：
以GJB2基因35位点G→T突变、109位点G→A突变、176-199位点del16突变、235位点的delC、299-300位点delAT，SLC26A4基因1174位点A→T突变、1226位点G→A突变、1229位点C→T突变、1975位点G→C突变、2027位点、2162位点、2168位点的A→G突变和IVS7-2位点的A→G突变，线粒体DNA基因1494位点C→T突变、1555位点的A→G突变、3243位点的A→G突变和7444位点G→A突变为检测对象而设计的PCR扩增引物和延伸引物，其中，
所述GJB2基因35位点、109位点、176位点、235位点、299位点的扩增引物序列均如SEQ ID No.1与SEQ ID No.2所示，
所述SLC26A4基因1174位点、1226位点、1229位点的扩增引物序列均如SEQ ID No.3与SEQ ID No.4所示，
所述SLC26A4基因1975位点、2027位点的扩增引物序列均如SEQ ID No.5与SEQ ID No.6所示
所述SLC26A4基因2162位点、2168位点的扩增引物序列均如SEQ ID No.7与SEQ ID No.8所示，
所述SLC26A4基因IVS7-2位点的扩增引物序列如SEQ ID No.9与SEQ IDNo.10所示，
所述线粒体DNA基因1494位点、1555位点的扩增引物序列均如SEQ IDNo.11与SEQ ID No.12所示，
所述线粒体DNA基因3243位点和7444位点的扩增引物序列分别如SEQ IDNo.13与SEQ ID No.14以及SEQ ID No.15与SEQ ID No.16所示；
以及，PCR反应试剂，包括聚合酶及缓冲溶液。
进一步的，所述PCR反应试剂包括dNTP、PCR缓冲液、Mg2+离子与FastTaq酶，其中PCR缓冲液可以是5×和10×PCR缓冲液。
进一步的，所述试剂盒还包括主要由SAP酶、Exon I酶与配套缓冲液组成的纯化试剂。
进一步的，所述试剂盒还可包括SNaPshot Multiplex混合液。
进一步的，所述试剂盒还可包括单个位点纯合、杂合突变的阳性对照标本和/或阴性对照标本。
进一步的，针对GJB2基因35、109、176、235、299位点，SLC26A4基因1174、1226、1229、1975、2027、2162、2168和IVS7-2位点，线粒体DNA基因1494、1555、3243、7444位点而设计的延伸引物的序列分别如SEQ ID No.17～SEQ ID No.33所示。
本发明的另一个方面提供了前述中国人群耳聋基因筛查试剂盒在耳聋基因突变筛查中的应用。
本发明的又一个方面提供了一种耳聋基因突变筛查的实验方法，其包括：
（1）提供前述的中国人群耳聋基因筛查试剂盒，
（2）以所述扩增引物对耳聋基因进行多重PCR扩增，并对扩增产物进行纯化；
（3）以所述延伸引物针对步骤（2）所获纯化产物进行延伸标记反应和二次纯化；
（4）对步骤（3）所获二次纯化产物进行毛细管电泳，并对毛细管电泳结果进行数据采集和分析，获得筛查结果。
藉由本发明的试剂盒及方法，可针对多达17个的耳聋基因突变位点同时进行多重PCR扩增和标记延伸，继而在通过简单的毛细管电泳分析等，一次获得多达17个位点的基因型。
在本发明中，对于该试剂盒中的PCR延伸引物的浓度，可以根据实际应用的需要而优化配置，使其能够在扩增时兼顾各个位点的PCR产量，有利于后续检测中各个位点突变情况的判断识别。
例如，在一较为优选的典型实施方案中，针对前述17个耳聋基因位点的PCR延伸引物的终浓度可如表5所示。
又及，在本发明的一个实施方案之中，可以使用Primer Premier5引物设计程序（加拿大PREMIER生物软件公司）和Gene Runner V3.05软件（Hasting软件公司）协助设计引物，通过多重PCR扩增，使被检测样本的各个目的位点得到扩增富集。PCR扩增引物设计时选择目的区域上下游100-400bp的距离引物设计的起始部位，引物与序列匹配的特异性要好，引物间的退火温度要尽量一致，且保持在55℃左右。使在一个多重PCR反应中的各个扩增引物的扩增效率相当。
其中，对于各突变位点的扩增片段长度，可以参考表4。而在扩增结束后可采用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行扩增片段检测，并发现了相应的扩增条带。
在获得扩增产物后，进行酶反应纯化，以去除多余的引物及dNTP等杂质。而后再对富集的片段进行寡核苷酸引物的微测序，针对经过扩增的17个突变位点进行延伸引物设计，引物设计的指导思想是：仅在突变点的上下游设计正反向的延伸引物，引物设计长度较扩增片段长度少1个碱基，延伸的单个碱基为带有相应颜色荧光标记的双脱氧核苷酸ddNTP。
优选的，各个引物延伸片段长度应该有一定的差异，均匀分布在18-58bp之间，以便于毛细管电泳能检测。
前述GJB2基因35、109、176、235、299位点，SLC26A4基因1174、1226、1229、1975、2027、2162、2168和IVS7-2位点，线粒体DNA基因1494、1555、3243、7444位点的延伸引物片段在经过毛细管电泳后的理论长度可如表1所示。在实际电泳过程存在位置飘移现象，尤其是对于发生了突变的位点而言，其峰漂移更多，即与毛细管电泳分子量marker-LIZ所测片段大小有差距，但不会影响整体结果判读。
表1耳聋基因17个位点延伸片段理论长度
经过对突变位点的单个碱基进行荧光标记PCR延伸扩增后，再进行一次扩增产物的酶反应纯化，带有不同荧光的不同长度的片段经遗传分析仪毛细管电泳后就能够分析出相应片段所携带的碱基类型，延伸位点碱基的类型决定电泳峰的颜色，延伸引物的片段长度决定峰的位置，延伸引物的浓度影响电泳检测的峰高。更为具体的，若峰的颜色为绿色，则代表A碱基，蓝色为G碱基，红色为T碱基，黑色为C碱基，具体请参阅表2。根据峰的颜色可以清楚方便的判断为野生型（正常）还是突变型，如表3所示。
表2荧光标记颜色
| ddNTP | 标记物 | 标记色 |
| A | dR6G | 绿 |
| C | dTAMRATM | 黑 |
| G | dR110 | 蓝 |
| T(U) | dROXTM | 红 |
表3突变热点野生型与突变型颜色标记
*所示设计为反向测序反应，因此在毛细管电泳结果中野生型与突变型均要按反向测序去判断。GJB2基因的109位点，正向测序突变类型为G→A，反向测序即为C→T；mtDNA1555位点正向测序突变类型为A→G，反向测序即为T→C；SLC26A4基因的2168位点，正向测序突变类型为G→A，反向测序即为C→T。
电泳顺序由左向右依次为：176-191、1226、2162、1229、2168、7444、1174、35、IVS7-2、2027、235、3243、1555、1975、1494、299-300及109位点，如图2所示。
表4耳聋基因17个突变热点PCR扩增引物
表5耳聋基因17个突变热点PCR延伸引物
为了使检测准确可靠、简单易行，还可将PCR反应所需试剂、纯化试剂、阴性和阳对照样本集成在本发明的试剂盒内，从而使核酸片段扩增、纯化可以在试剂盒提供试剂的基础上顺序而简便地完成。另外，还可在本发明的试剂盒内集成说明书等。
藉由本发明的试剂盒，可一次检测多达17个特异性基因突变位点，且可在继续保持操作简便，成本低等优点的基础上，使检测通量从14个位点提高到17个位点，检测结果的准确度可达到近100%，具有较高的规模化临床应用价值。
以下结合附图和若干实施例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
在本实施例中，提供了一种适用于新生儿足跟血片的一型试剂盒（96人份），其可在体外完成新生儿耳聋基因突变热点筛查。
该试剂盒包含以下组分：
（1）PCR反应试剂组I，包括2mM的dNTP150μl、10×PCR缓冲液100μl、25mM MgCl2溶液100μl、去离子水200μl、引物混合物I400μl（其中包含的扩增引物序列请参阅表4）、5U/μl的FastTaq酶15μl；
（2）纯化试剂组，包括1U/μl SAP酶300μl，5U/μl的Exon I酶40μl，去离子水260μl；
（3）PCR反应试剂组II，5×seq Buffer120μl、引物混合物II（其中包含的延伸引物序列请参阅表5）100μl、SNaPShot Mix100μl、去离子水180μl；
（4）GJB2基因235delC纯合、杂合突变阳性对照DNA样本各10μl、阴性对照标本10μl；
（5）使用说明书。
样本选择：样本来源于苏州市立医院生殖与遗传中心常规新生儿遗传代谢性疾病筛查后剩余的干血片标本1823份，所有患者样本收集前均签署了知情同意书。
利用本实施例试剂盒对前述样本进行检测的过程如下：
（1）多重PCR扩增反应。
PCR反应体系10μl，用自前述样本中提取的基因组DNA10ng作为模板，加入2mM的dNTP1.50μl、10×PCR缓冲液1.00μl、25mM MgCl2溶液1.00μl、去离子水1.55μl、引物混合物I4.00μl、5U/μl的FastTaq酶0.15μl。PCR采用touch-down程序：95℃预变性4min；94℃变性30s，66℃退火50s，每循环降0.5℃，72℃延伸50s,11个循环；94℃变性30s，61℃退火50s，72℃延伸50s，24个循环；72℃再延伸10min。按照同样的PCR反应条件，用试剂盒提供的GJB2基因235delC纯合、杂合突变阳性和阴性DNA样本PCR反应，并设立无模板PCR空白对照管。
（2）扩增产物的纯化
取步骤1所获扩增产物1.0μl，加入2.0μl SAP酶，0.4μlExon I酶，去离子水2.6μl，反应总体系为6μl，混匀后37℃反应80min，80℃终止反应15min，4℃保存。
（3）延伸标记、纯化
对步骤（2）所获纯化产物进行延伸标记，PCR反应体系为6.0μl，含纯化产物1μl，5×Seq Buffer1.2μl，SNaPshot Mix1.0μl，去离子水1.8μl，7个位点的引物混合物II1.0μl。PCR反应条件为：96℃预变性1min；96℃变性10s，52℃退火5s，60℃延伸30s，28个循环。反应结束后进行第二次纯化，每反应产管中加入1U SAP酶，37℃反应60min，75℃灭活反应15min，4℃保存。
（4）毛细管电泳
每个反应体系中加入Hi-Di甲酰胺（ABI公司，Cat.4311320）9μl，内标GS120LIZsize standard（ABI公司，Cat.4324287）0.22μl，步骤（3）所获第二次纯化产物1μl，混匀离心后，95℃变性5min，立即置冰上5min，于ABI3130遗传分析仪进行毛细管电泳，电泳结果用GeneMapper系列软件进行数据的采集和分析。
（5）测序法验证其可靠性的检测
通过突变检测金标准“Sanger测序”的方法对各突变热点进行测序验证，证实应用此试剂盒检测的特异性和敏感性均达到了100%。
（6）检测结果
根据野生型电泳峰型颜色和突变峰型颜色不同进行判断，检测1823例样本中共发现236例阳性样本（见表6），其中，GJB2基因35位点杂合突变1例（0.05‰），GJB2基因109位点杂合突变159例（8.72‰），GJB2基因109位点纯合突变3例（0.16‰），235位点杂合突变34例（1.87‰），235位点纯合突变3例（0.16‰），299-300位点杂合突变2例（0.11‰），SLC26A4基因1226位点杂合突变2例（0.11‰），SLC26A4基因2027位点杂合突变1例（0.05‰），SLC26A4基因2027位点纯合突变1例（0.05‰），SLC26A4基因2162位点杂合突变1例（0.05‰），SLC26A4基因2168位点杂合突变3例（0.16‰），线粒体DNA1555位点同质突变1例（0.05‰），线粒体DNA3243位点异质性突变4例（0.22‰），线粒体DNA7444位点同质突变2例（0.11‰）。
表6本实施例的阳性样本分类
应当理解，在本说明书中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。又及，对于本领域的普通技术人员来说，可以根据本发明技术方案和技术构思做出其它各种相应的改变和变形，而这些改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。
<110> 陈瑛
<120> 中国人群耳聋基因筛查试剂盒及其应用
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<400> 6
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AGTGTAAGTTGGGTGCTTTGTGTT
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ATCTAACTTTCTTCCCACAACACTT
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TTTTTTTTTTTTTTTTTCTGCAGACGATCCTGGGGG
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<213> 人工序列
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TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCACACCTCCTTTGCAGCCACAA
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<211> 18
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gcaacaccctgcagccag
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<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
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TTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATCTCCCACATCCGGCTATGGGCC
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<211> 56
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TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCACGTGGCCTACCGGAGAC
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<212> DNA
<213> 人工序列
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TTTTTTTTTTGAATTCATTGCCTTTGGGATCAGC
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<211> 21
<212> DNA
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TGGCCACCACTGCTCTTTCC[C/T]
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<400> 33
TTTTTTTTTTGAACCCGTATACATAAAATCTA
Claims (7)
1.一种中国人群耳聋基因筛查试剂盒，其特征在于包括：
以GJB2基因35位点G→T突变、109位点G→A突变、176-199位点del16突变、235位点的delC、299-300位点delAT，SLC26A4基因1174位点A→T突变、1226位点G→A突变、1229位点C→T突变、1975位点G→C突变、2027位点、2162位点、2168位点的A→G突变和IVS7-2位点的A→G突变，线粒体DNA基因1494位点C→T突变、1555位点的A→G突变、3243位点的A→G突变和7444位点G→A突变为检测对象而设计的PCR扩增引物和延伸引物，其中，
所述GJB2基因35位点、109位点、176位点、235位点、299位点的扩增引物序列均如SEQ ID No.1与SEQ ID No.2所示，
所述SLC26A4基因1174位点、1226位点、1229位点的扩增引物序列均如SEQ ID No.3与SEQ ID No.4所示，
所述SLC26A4基因1975位点、2027位点的扩增引物序列均如SEQ ID No.5与SEQ ID No.6所示
所述SLC26A4基因2162位点、2168位点的扩增引物序列均如SEQ ID No.7与SEQ ID No.8所示，
所述SLC26A4基因IVS7-2位点的扩增引物序列如SEQ ID No.9与SEQ IDNo.10所示，
所述线粒体DNA基因1494位点、1555位点的扩增引物序列均如SEQ IDNo.11与SEQ ID No.12所示，
所述线粒体DNA基因3243位点和7444位点的扩增引物序列分别如SEQ IDNo.13与SEQ ID No.14以及SEQ ID No.15与SEQ ID No.16所示；
以及，PCR反应试剂，包括聚合酶及缓冲溶液。
2.根据权利要求1所述的中国人群耳聋基因筛查试剂盒，其特征在于所述PCR反应试剂包括dNTP、PCR缓冲液、Mg2+离子与FastTaq酶。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的中国人群耳聋基因筛查试剂盒，其特征在于还包括主要由SAP酶、Exon I酶与配套缓冲液组成的纯化试剂。
4.根据权利要求1-2中任一项所述的中国人群耳聋基因筛查试剂盒，其特征在于还包括SNaPshot Multiplex混合液。
5.根据权利要求1-2中任一项所述的中国人群耳聋基因筛查试剂盒，其特征在于还包括单个位点纯合、杂合突变的阳性对照标本和/或阴性对照标本。
6.根据权利要求1-2中任一项所述的中国人群耳聋基因筛查试剂盒，其特征在于针对GJB2基因35、109、176、235、299位点，SLC26A4基因1174、1226、1229、1975、2027、2162、2168和IVS7-2位点，线粒体DNA基因1494、1555、3243、7444位点而设计的延伸引物的序列分别如SEQ ID No.17～SEQ ID No.33所示。
7.根据权利要求6所述的中国人群耳聋基因筛查试剂盒，其特征在于针对GJB2基因35、109、176、235、299位点，SLC26A4基因1174、1226、1229、1975、2027、2162、2168和IVS7-2位点，线粒体DNA基因1494、1555、3243、7444位点而设计的延伸引物的终浓度分别为0.36、0.7、0.14、0.72、0.8、0.08、0.04、0.1、0.1、0.12、0.16、0.1、0.4、0.04、0.1、0.8、0.1μM。
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