CN101445799A

CN101445799A - 中国人群遗传性耳聋基因slc26a4的突变类型和突变频率及其用途

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Publication number: CN101445799A
Application number: CNA2007101781535A
Authority: CN
Inventors: 戴朴; 袁永一; 韩东一
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2007-11-27
Filing date: 2007-11-27
Publication date: 2009-06-03

Abstract

本申请涉及中国人群耳聋相关SLC26A4基因特有突变类型图谱86种，相对热点突变类型图谱及其频率信息27种，热点突变类型图谱及其频率信息13种，最热点突变类型及其频率信息2种；中国人群新发现的SLC26A4基因突变类型59种，其中导致SLC26A4基因编码蛋白氨基酸改变或影响基因转录和翻译的突变类型47种，导致碱基改变、氨基酸不改变的突变类型6种，SLC26A4基因内含子突变类型6种。上述发现对研制符合中国耳聋人群遗传特征的SLC26A4基因诊断芯片和试剂盒具有重要的实际意义。

Description

中国人群遗传性耳聋基因SLC26A4的突变类型和突变频率及其用途

背景技术

SLC26A4基因由Everett等在一个常染色体隐性遗传性疾病——Pendred综合征(大前庭水管或伴内耳畸形，神经性聋和甲状腺肿)的家系中首先发现，后来Usami等对单纯大前庭水管家系进行SLC26A4基因筛查，同样发现该基因存在突变。SLC26A4基因又称PDS基因(Pendredsyndrome，PDS)，位于人类染色体7q31，含有21个外显子，编码含有780个氨基酸的蛋白质Pendrin。SLC26A4基因mRNA全长4930bp(SEQ ID NO：1)，开放阅读框架2343bp。SLC26A4基因开放阅读框架起始于2号外显子，分布穿越剩余20个外显子。除21号外显子(2380bp)外，其它外显子长度约为55-231bp。第21号外显子中只有部分碱基参与编码氨基酸，其余不参与蛋白的编码，功能上属于5’UTR区，第1号外显子功能上属于3’UTR区。

作为PDS基因的表达产物，Pendrin主要由780个疏水性氨基酸组成，是一种跨膜蛋白，属于离子转运体家族，有12个跨膜区，N末端和C末端位于细胞内。Pendrin参与转运机体内氯/碘离子，氯/甲酸根、氯/碳酸氢根离子和蔗糖转运。Pendrin主要表达于甲状腺，在内耳、胎肾和胎脑中也有分布。在甲状腺，Pendrin表达于滤泡上皮细胞顶端亚膜单位。Royaux认为Pendrin作为甲状腺上皮细胞内碘的顶端转运子，将细胞内碘转运到滤泡腔，与甲状腺过氧化物酶作用导致碘的有机化，并与甲状腺球蛋白结合，维持甲状腺的正常功能。在内耳，Pendrin表达于内淋巴管、内淋巴囊、椭圆囊、球囊以及Corti’s器外沟细胞、根细胞、螺旋突上皮细胞和血管纹梭形细胞等处。内淋巴管和内淋巴囊与内淋巴液代谢有关，Pendrin可能作为氯离子转运体调节内淋巴液的离子平衡，同时作为碳酸氢根离子转运体将血管纹内空间的碳酸氢根分泌入内淋巴液，碳酸氢根的堆积将限制保护性谷胱甘肽的产生从而增加自由基压力，碳酸氢根的移除有助于保护血管纹免受自由基损伤，维持其正常功能。

近年来多项研究表明SLC26A4基因突变与Pendred综合征和单纯大前庭水管有密切关系。大前庭水管是儿童感音性耳聋中能够通过影像学手段明确诊断的较为常见的疾病，Valvassori和Clemis 1978年在对3700例颞骨连续分层扫描中发现有50例大前庭水管。此病出生时可能听力正常，或伴有轻度至中重度的听力损失，患儿早期多有较好的言语能力，听力逐渐下降。听力下降的诱发因素多为头部外伤、颅内压增高、感冒等，因堕床、儿童玩耍或体育活动中的轻度碰撞可能造成明显的听力下降。此类患儿残余听力较好，语言学习能力强于聋哑学生的平均水平，明确的诊断有利于及时采取适当的生活监护措施防止外伤而保护残余听力。

据估计，世界范围内儿童语前聋患者中4-10％由Pendred综合征导致，但在我国Pendred综合征的报道还较少。高分辨率颞骨CT扫描发现20％儿童感音神经性聋患者伴有内耳畸形，其中以大前庭水管和Mondini畸形最为常见。

Reardon等报道在家族性大前庭水管患者中SLC26A4基因突变检出率高于散发病例。在大前庭水管或Mondini畸形患者中，82％多发患者家庭和30％单发患者家庭能检测到SLC26A4基因突变。

大前庭水管患者中SLC26A4基因突变检出率分别为：中国人97.9％；日本人78.1％；韩国人92.31％；高加索人40％。由SLC26A4基因突变导致或与其相关的非综合征耳聋患者的比例分别是：东亚至少5％的语前聋病人携带SLC26A4基因突变；南亚约5％的常染色体隐性遗传性耳聋病人携带SLC26A4基因突变；高加索人约4％；英国3.5％；中国14.54％。

SLC26A4基因突变表现出广泛的等位基因异质性，目前报道的SLC26A4基因突变类型已达160余种，其中以错义突变最为常见，还包括无义突变、剪切点突变、移码突变等形式。不同种族的耳聋人群中SLC26A4基因热点突变不同。在欧洲，T416P和L236P是Pendred综合征患者最常见的两种突变类型；在东亚，IVS7-2A>G和H723R是韩国人中突变频率较高的类型，H723R和L676Q分别是日本人和蒙古人中突变频率较高的类型。

综上所述，目前需要提供一种对各种族SLC26A4基因突变谱和热点突变的研究方法，该方法能有助于根据不同种族的具体情况制定有针对性的筛查方案、设计专门的检测方法及其检测工具。

定义

在本说明和权利要求中，为了便于引用，本发明的SLC26A4基因突变类型采用下述的命名法：

如本文中所述的术语IVS，也称作intraveningsequence，表示剪切序列。

如本文中所述的术语Intron，表示内含子。

如本文中所述的术语ins，表示插入突变。

如本文中所述的术语del或Δ，表示缺失突变。

当给定位点的碱基被其它碱基取代时，表示为原碱基：位点：用于取代的碱基，例如C68A，表示在SLC26A4基因的编码区第68位点处发生碱基A替换C；

当在给定位点插入其它碱基时，表示为“位点编号ins插入碱基”。例如1548insC，表示在SLC26A4基因的编码区第1548位点处插入碱基C，其相当于^*1548C；

当缺失给定位点的碱基时，表示为“位点编号del缺失碱基”，例如1520delT，表示在SLC26A4基因的编码区第1520位点处缺失碱基T，其相当于Δ1520T；

当在多个给定位点取代、插入或缺失1个或多个碱基时，表示为“多个位点编号突变类型1个或多个突变碱基”。例如，234_235delC，表示在SLC26A4基因的编码区第234或235位点缺失1个碱基C，相当于Δ234-235C；1181_1183delTCT，表示在SLC26A4基因的编码区第1181-1183的3个位点缺失3个碱基TCT，相当于Δ1181-1183TCT；43-44insG，表示在SLC26A4基因的编码区第43或44位点插入1个碱基G，相当于^*43-44G。

另外，本发明还涉及剪切序列和内含子的各种突变，其中：

在SLC26A4基因剪切序列或内含子取代突变中，IVS剪切序列所在内含子编号+/-(位点编号X)原碱基>取代碱基(其中紧跟剪切序列所在内含子编号后的符号“+”表示从内含子起始端出发，符号“-”表示从内含子末端出发，下同)，表示在该剪切序列所在内含子起始端/末端的第X个碱基位点处发生取代。例如，IVS4+2T>C，表示SLC26A4基因第4内含子起始端剪切序列第2个碱基处位点T被C取代；IVS7-2A>G，则表示SLC26A4基因第7内含子末端剪切序列第2个碱基处(即距离下一外显子的第2个碱基处)位点A被G取代；又例如，Intron4-12T>A，表示SLC26A4基因第4内含子末端第12个碱基处(即距离第5外显子第12个碱基处)位点T被A取代。

基于相似原则，在SLC26A4基因内含子缺失突变中，Intron内含子编号+/-(位点编号Z)del缺失碱基，表示在该内含子起始端/末端第Z个碱基处缺失所示的碱基(1个或多个)。例如，Intron7+(44-46)delACA表示SLC26A4基因第7内含子起始端第44-46个碱基处缺失碱基ACA。又如Intron9-(28_35)delTTTGTAGG，表示SLC26A4基因第9内含子末端第28-35个碱基处(即距离第10外显子第28-35个碱基处)缺失碱基TTTGTAGG；

基于相似原则，在SLC26A4基因内含子插入突变中，Intron内含子编号+/-(位点编号N)ins插入碱基，表示在该内含子起始端/末端第N个碱基位点处插入所示的碱基(1个或多个)。例如，Intron12-(7_13)insT，表示SLC26A4基因第12内含子末端第7-13个碱基处(即距离第13外显子第7-13个碱基处)插入一个碱基T。

另外，本发明还涉及非翻译区UTR的突变：例如，2343+69C>A表示从5’UTR区起始端第69碱基处(即编码区最后一个碱基也即从编码区第2343碱基后方紧邻的碱基开始计数第69碱基处)，发生碱基A取代C。

无义突变是指碱基替换后，编码的氨基酸的密码子变为不编码任何氨基酸的终止密码子(UAG、UAA、UGA)，造成多肽链合成的提前终止，肽链长度缩短，成为无活性的多肽片段。

移码突变同样会导致终止密码子提前出现，多肽链合成的提前终止，肽链长度缩短，成为无活性的多肽片段。

错义突变是指碱基替换后使mRNA的密码子变成编码另一个氨基酸的密码子，改变了氨基酸的序列，影响蛋白质的功能。

剪切点突变会导致剪切功能异常从而影响转录和翻译。

静止变异不会造成氨基酸的改变，对蛋白功能一般无影响。但反映人群DNA序列的多态性。

UTR区变异不直接造成氨基酸的改变，但可能通过调控作用对蛋白的结构和功能产生影响。

内含子变异不直接造成氨基酸的改变，但可以提示人群某一基因的多态改变。

发明内容

一.中国人群SLC26A4基因突变类型

本发明的第一个发明目的是提供SLC26A4基因的86种突变类型，其中无义突变7种，移码突变13种，错义突变48种，剪切点突变5种，UTR区变异1种，静止变异6种，内含子变异6种(intron7+(44_46)delACA、intron9-(28_35)delTTTGTAGG、intron18-(53_56)delCAAA、intron19-25T>A、intron4-12T>A、intron12-(7_13)insT)。

在一个具体实施方案中，所述的SLC26A4基因为说明书附属的序列表中SEQ ID NO：1所述的序列，并且该SLC26A4基因序列还具有选自下列突变位点的一个或多个突变：

43_44insG、C68A、G87C、G109T、C200G、C225G、A230T、234_235delC、G249A、G259T、T279A、C281T、413_414delT、IVS4+2T>C、IVS4+7A>G、Intron4-12T>A、G589A、G665T、T678C、T754C、A757G、Intron7+44_46delACA、916_917insG、IVS7-2A>G、C941T、1019_1020delT、C1079T、A1124G、C1173A、A1174T、1181_1183delTCT、C1225T、G1226A、C1229T、A1238G、G1240A、Intron9-(28_35)delTTTGTAGG、C1245A、A1262C、G1327C、1299_1300insC、G1327C、T1334G、C1336T、1339_1340delA、C1343A、G1409A、T1472C、T1517G、1520delT、1548insC、Intron12-(7_13)insT、IVS13+5G>A、T1586G、A1594C、G1595T、1645_1646insA、A1667G、G1678A、1687_1693insA、IVS15+5G>A、T1790C、1733_1735delATA、T1826G、G1897A、G1905A、G1975C、T1979G、C1983A、G1985A、G1988A、C1991T、A1993G、G2044T、C2162T、C2167G、Intron18-(53_56)delCAAA、A2168G、A2176G、T2205G、A2217G、T2228A、Intron19-25T>A、A2283G、C2326G、非翻译区2343+69C>A。

其中，在所述86种突变类型中，59种为尚未见报道的类型，其中无义突变5种，移码突变9种，错义突变30种，剪切点突变2种，UTR区变异1种，静止变异6种，内含子变异6种(表1)。

在上述具体实施方案的基础上，其中所述的一个或多个突变进一步选自：

IVS7-2A>G、A2168G、A1174T、C1229T、T2027A、IVS15+5G>A、G589A、A1238G、T1826G、C281T、G1226A、C1336T、1548insC、G1975C、G259T、T279A、G665T、C1079T、1181_1183delTCT、C1225T、G1595T、1299_1300insC、1339_1340delA、C1343A、1687_1693insA、C2162T、C2167G，其中这些突变的等位基因占全部突变等位基因的93.04％。

IVS7-2A>G、A2168G、A1174T、C1229T、T2027A、IVS15+5G>A、G589A、A1238G、T1826G、C281T、G1226A、C1336T、1548insC，其中这些种突变的等位基因占全部突变等位基因的88.29％。

IVS7-2A>G和A2168G(导致发生H723R氨基酸突变)，其中这2种突变的等位基因占全部突变等位基因的76.06％。

另外，对于上述SLC26A4基因突变类型的研究发现，中国人群SLC26A4基因各种突变/变异形式(不计内含子变异)按种类排序由多到少为：错义突变、移码突变、无义突变、剪切点突变、静止变异、UTR区变异。

以下具体讨论SLC26A4基因的各种突变/变异形式。新发现的编码区的无义突变和移码突变

新发现的编码区的无义突变(5种，C68A、G249A、1520delT、G2044T、T2228A)和移码突变(9种，43_44insG，234_235delC，413_414delT，1019_1020delT，1299_1300insC，1339_1340delA，1645_1646insA，1687_1693insA，1733_1735delATA)一般会导致蛋白功能明显异常。新发现错义变异保守性分析

评估一种错义变异是否为有害突变需要对其编码的氨基酸进行物种进化保守性比对，如果在不同物种中相应位点的氨基酸高度保守，则说明该氨基酸在进化过程中变化较小，其对蛋白功能的贡献稳定，那么基因突变导致的氨基酸改变一般会导致蛋白异常，相对应的基因变异多为有害突变；如果在不同物种中相应位点的氨基酸非高度保守，则说明该氨基酸在进化过程中变化较大，其对蛋白功能的贡献不稳定，那么基因突变导致的氨基酸改变对蛋白的影响可能小于高度保守的氨基酸，相对应的基因变异有害突变的可能性减低。

在人类、猩猩、大鼠、小鼠、爪蟾等物种中进行Pendrin蛋白的进化保守性比对。编码区新发现的所有30种错义突变中，C200G(对应氨基酸变化T67S)，A1124G(对应氨基酸变化Y375C)，A1993G(对应氨基酸变化I665V)，A2283G(对应氨基酸变化T761T)等4种突变对应的氨基酸不保守；T1472C(对应氨基酸变化I491T)，G1595T(对应氨基酸变化S532Y)，T1979G(对应氨基酸变化L660R)，G1985A(对应氨基酸变化C662Y)等4种突变对应的氨基酸在人类、猩猩、大鼠、小鼠、爪蟾等物种中的一个不保守；其余22种突变在上述各物种中高度保守。

这意味着如果某一突变位点对应的氨基酸在各物种高度保守，提示这一氨基酸在进化过程中变化少，是各物种中该基因编码蛋白结构中的重要部分，是维持蛋白功能的重要位点；如果某一突变位点对应的氨基酸在各物种不保守，则提示这一氨基酸在进化过程中变化多，非维持蛋白功能的重要位点。

新发现的剪切点变异发生后剪切功能预测

为了验证剪切点变图变对剪切功能的影响，利用BDGP网站提供的剪切点功能预测工具对2种新发现的剪切点突变进行正常序列和突变后序列的评估比较，当原有剪切点的评分降到小于0.4时，说明该突变可能会影响原剪切点的剪切功能。2种剪切点突变后评分不同程度的下降。IVS4+2T>C和IVS13+5G>A突变使原有剪切点消失而影响蛋白质的正常翻译过程。同时对3种已有报道的致病性明确的剪切点突变进行突变后剪切功能预测发现：IVS4+7A>G和IVS7-2A>G突变使原有剪切点消失而影响蛋白质的正常翻译过程，而IVS15+5G>A可能导致原有剪切功能改变从而影响蛋白质的翻译过程。新发现的2种剪切点突变剪切功能预测结果与已知致病性明确的剪切点突变剪切功能预测结果类似，进一步提示新发现剪切点突变为致病突变的可能性(表2)。

表2 SLC26A4基因剪切点突变功能预测

在我们研究中发现的47种剪切区突变和造成编码区氨基酸改变的突变类型目前尚未见报道，是中国人群特有的突变类型。根据正常对照组和前庭水管扩大病人SLC26A4基因筛查结果总结SLC26A4基因编码区错义突变、移码突变和剪切点突变性质为多态改变的可能性较小，并且80％在物种进化中高度保守，因此认为它们极有可能对表型有所贡献。

新发现的静止变异和内含子变异

新发现的静止变异(6种，C225G，T678C，G1905A，T2205G，A2217G，A2283G)和内含子变异(6种，intron7+(44_46)delACA、intron9-(28_35)delTTTGTAGG、intron18-(53_56)delCAAA、intron19-25T>A、intron4-12T>A、intron 12-(7_13)insT)虽然未直接对蛋白质的结构功能造成影响，但其存在可以协助鉴别突变位于哪条等位基因上。

新发现的UTR区变异

新发现了1种UTR区变异(2343+69C>A)，该变异位于第21号外显子的非编码区，功能上属于SLC26A4基因的5’UTR区，它不直接造成Pendrin氨基酸的改变，但可能通过调控作用对蛋白的结构和功能产生影响，其致病性虽尚不明确，但为进一步研究提供了新的方向。

二.中国人群SLC26A4基因突变频率

本发明的第二个发明目的是提供中国人群SLC26A4基因突变频率。中国民族众多，不同民族热点突变也存在差别，我们经过对2352名中国耳聋人群进行SLC26A4基因筛查，发现中国人群SLC26A4基因突变频率(具体参见实施例1-2和表3)，有效地证实了本发明与中国人群SLC26A4基因突变以及中国人群遗传学耳聋的显著相关性。

三、本发明的应用

本发明第三个目的是根据前述的研究结果，在所得的突变等位基因频率及各种突变占全部突变的比例信息的基础上，提供用于检测与遗传性耳聋相关的SLC26A4基因的诊断(筛查)方法和工具(产品)。

其中，所述的工具(产品)包括各种常规的诊断(筛查)的制品，例如直接针对突变等位基因频率及各种突变占全部突变的比例信息的基因(蛋白)芯片、试剂或试剂盒等。

所述的基因芯片又称芯片，属于生物芯片的一种。其工作原理是经过标记的待测样本通过与芯片上特定位置的探针杂交，可根据碱基互补配对的原则确定靶序列，经激光共聚集显微镜扫描，以计算机系统对荧光信号进行比较和检测，并迅速得出所需的信息。基因芯片技术比常规方法效率高几十到几千倍，可在一次试验中间平行分析成千上万个基因，是一种进行序列分析及基因表达信息分析的强有力工具。

其中，基因芯片根据所用载体材料不同分为玻璃芯片和硅芯片等；根据载体上所固定的种类可分为cDNA和寡核苷酸芯片两种；根据其用途可分测序芯片、表达谱芯片、诊断芯片等。近年来，已研究开发出以各种结构微阵列芯片，如生物电子芯片、药物控释芯片、通道型微阵列芯片、基因扩增芯片、集成芯片、生物传感器芯片。

应当指出，如果根据第二发明目的和实施例以及表3所述的突变频率，在设计基因芯片中，根据各个突变位点的突变频率，适当调整突变位点所对应探针在芯片的浓度或量，通过计算机所检测到信号的颜色(波长)和强弱，从而可检测出究竟是哪种突变位点，从而更好地为诊断和治疗与SLC26A4基因具体突变类型相关的遗传学耳聋。

在一个具体实施方案中，在对耳聋人群进行SLC26A4基因基因芯片初筛时，可以首先选择筛查IVS7-2A>G和A2168G(导致发生H723R氨基酸改变)两个位点，通过常规的光蚀刻技术或显微打印技术，将含有上述两个位点的DNA探针有序地固定在支持物表面上，然后通过计算机分析芯片与样品的杂交信号，最终得到诊断或筛查结果。其中，根据实施例1-3和表3的突变频率(分别是IVS7-2A>G(64.01％)和A2168G(12.05％)，下同)，如果相应调整它们在芯片上的浓度或量，通过其与标准样品的信号的颜色(波长)和强度相比，从而制备可检测具体突变位点的基因芯片；

在上述研究的基础上，如果进行进一步筛查，可设计小规模基因芯片(包含10～15个检测位点)。即选用IVS7-2A>G(64.01％)、A2168G(12.05％)、A1174T(2.21％)、C1229T(2.04％)、T2027A(1.53％)、IVS15+5G>A(1.19％)、G589A(1.02％)、A1238G(1.02％)、T1826G(0.85％)、C281T(0.69％)、G1226A(0.69％)、C1336T(0.51％)、1548insC(0.51％)等13种突变位点，来制备可定性的基因芯片，最终获得诊断或筛查结果；

在上述研究的基础上，如果还进行进一步筛查，可设计中等规模基因芯片，即选用IVS7-2A>G(64.01％)、A2168G(12.05％)、A1174T(2.21％)、C1229T(2.04％)、T2027A(1.53％)、IVS15+5G>A(1.19％)、G589A(1.02％)、A1238G(1.02％)、T1826G(0.85％)、C281T(0.69％)、G1226A(0.69％)、C1336T(0.51％)、1548insC(0.51％)、G1975C(0.34％)、G259T(0.34％)、T279A(0.34％)、G665T(0.34％)、C1079T(0.34％)、1181_1183delTCT(0.34％)、C1225T(0.34％)、G1595T(0.34％)、1299_1300insC(0.34％)、C2162T(0.34％)、1339_1340delA(0.34％)、C1343A(0.34％)、1687_1693insA(0.34％)、C2167G(0.34％)等27种突变位点，来制备可定性的基因芯片，最终获得诊断或筛查结果。

在所述的试剂或试剂盒中，主要涉及针对单个位点突变的单引物序列和多个突变位点的多重引物序列。

应当指出，多重PCR技术是在常规PCR的基础上发展而来的。因此，其基本原理和常规PCR没有差别，所不同的是多重PCR技术是在同一个体系中加入多对引物，同时检测多个目标序列的存在。因此在知晓具体突变位点的前提下，设计针对该位点或多个位点的引物或多重引物序列，对于本领域技术人员而言，属于本领域的常规技术，因此并不需要特意指明其序列组成。

四、有益效果：

1.提供了中国人群遗传性耳聋基因SLC26A4基因的86种突变新类型；

2.在上述中国人群遗传性耳聋基因SLC26A4基因的86种突变新类型中，进一步提供了占全部突变基因的93.04％的27种突变新类型；

3.在上述中国人群遗传性耳聋基因SLC26A4基因的86种突变新类型中，更进一步提供了占全部突变基因的88.29％的13种突变新类型；

4.在上述中国人群遗传性耳聋基因SLC26A4基因的86种突变新类型中，更进一步提供了占全部突变基因的76.06％的2种突变新类型；

5.根据上述突变类型在中国人群中的突变频率，提供了该突变频率的新用途，即设计用于诊断与SLC26A4基因突变频率相关的遗传学耳聋的各种产品，极大地提高了诊断范围和诊断效率。

具体实施方式

现在仅用参考下面非限制性的实施例的方式进一步描述本发明。但是应当理解，下面的实施例仅仅是作为例证的，不应以任何方式当作对上述本发明总体的限制。除非有其它说明，本发明的实施例使用本领域中的传统分子生物学、细胞生物学、PCR扩增和突变技术等等。这些技术是技术人员熟知的，并在文献中有详细解释。参见，例如，

Sambrook and Russell″Molecular Cloning：ALaboratory Manual″(2001)；Cloning：A PracticalApproach，″Volumes I and II(D.N.Glover，ed.，1985)″；T.A Brown“Genome”BIOS ScientificPublishers Limited；Subramanya RD，Luccheseg G，Kanduc D，et al.Clinical applications of DNAmicroarray analysis[J].J Exp Thero Oncol，2003，3：297-304.

实施例1：

本发明人在国内首先报道对3例散发大前庭水管患者进行SLC26A4基因筛查，发现1例G316X突变杂合子，2例IVS7-2A>G纯合子，随后又在两个大前庭水管家系中检测到SLC26A4基因突变，初步证实了SLC26A4基因与大前庭水管的相关性。

在该研究中，根据我们前期在来自35个家庭的38例患大前庭水管的病例研究中发现，SLC26A4基因IVS7-2A>G突变是中国人大前庭水管综合征中的高发突变，占突变总数的63.5％，在71.9％的大前庭水管患者中可以发现此突变，1％的正常人携带此种杂合突变。

因此，针对此特定突变，我们设计了一系列的诊断筛查方法及工具，通过该筛查研究，我们快速地发现在携带此突变的大前庭水管患者。利用SLC26A4基因IVS7-2A>G筛查策略结合颞骨CT进行的内蒙赤峰地区大前庭水管综合征的流行病学调查显示，在141例(134例来自不同家庭的耳聋患者加7例同在一个学校的直系兄弟姐妹)聋哑学生中，20例携带SLC26A4基因IVS7-2A>G纯合或杂合突变，对其中18例携带SLC26A4基因IVS7-2A>G突变的患者进行颞骨CT检查，16例均由CT证实为前庭水管扩大，证明上述基因筛查方法和工具可以遴选出带有常见突变的大前庭水管综合征患者；在内蒙赤峰134例来自不同家庭的耳聋患者中完成SLC26A4基因编码区全序列筛查后发现热点突变区域筛查(外显子7+8，19，10)能诊断出90％的大前庭水管患者。

实施例2：

为了解SLC26A4基因在中国重度-极重度耳聋人群的突变情况及其与耳聋的关系，在上述研究的基础上，我们展开了全国范围的SLC26A4基因热点突变区域筛查，对其中检测到的单杂合突变携带者进一步行全序列筛查、测序，寻找可能存在的另外的突变，筛选方法包括根据前述的SLC26A4基因的可能的86种突变类型，根据常规方法设计多重PCR引物或其试剂盒，进行PCR或多重PCR检测或测序。研究对象为双侧重度-极重度耳聋患者，选自北京、上海、黑龙江省牡丹江、吉林省吉林、山西省大同、河南省安阳、河北省高碑店和涿州、广东省佛山、广西壮族自治区柳州、福建省福州、云南省昆明和临沧、贵州省贵阳、内蒙古自治区赤峰、甘肃省兰州、宁夏回族自治区银川、青海省西宁、陕西省西安、新疆维吾尔族自治区乌鲁木齐、库尔勒和焉耆、江苏省南通、湖北省武汉、安徽省阜阳、四川省成都、西藏自治区拉萨等27个省市自治区的聋哑学校，共计2352例(不包括同一父母所生的兄弟姐妹)，男1315人，女1038人，年龄分布1.8～24岁，平均年龄14.17±4.41岁。共涉及22个民族，汉族1903人，藏族119人，回族89人，维吾尔族69人，蒙古族33人，壮族25人，彝族23人，白族14人，佤族12人，满族12人，苗族12人，布依族9人，土家族7人，拉祜族5人，侗族5人，傣族5人，朝鲜族2人，瑶族2人，撒拉族2人，布朗族2人，木化族1人，哈尼族1人。

结果如下：

我们发现IVS7-2A>G突变是在中国汉族、回族、蒙古族耳聋人群SLC26A4基因第一高发突变，其等位基因频率及占突变等位基因的比例见表3；A2168G突变虽然等位基因频率较IVS7-2A>G相差较远，但较其他突变类型仍具明显优势，为中国汉族、回族、蒙古族耳聋人群的第二高发突变。IVS7-2A>G和A2168G两种突变共占突变等位基因的76.06％，它们是SLC26A4基因在中国人群的最热点突变；IVS7-2A>G、A2168G、A1174T、C1229T、T2027A、IVS15+5G>A、G589A、A1238G、T1826G、C281T、G1226A、C1336T、1548insC等13种突变占全部突变等位基因的88.29％，这组突变中后11种是SLC26A4基因在中国人群的热点突变；IVS7-2A>G、A2168G、A1174T、C1229T、T2027A、IVS15+5G>A、G589A、A1238G、T1826G、C281T、G1226A、C1336T、1548insC、G1975C、G259T、T279A、G665T、C1079T、1181_1183delTCT、C1225T、、G1595T、C1343A、1299_1300insC、1339_1340delA、1687_1693insA、C2162T、C2167G等27种突变占全部突变等位基因的93.04％，这组突变中后14种是SLC26A4基因在中国人群的相对热点突变。

实施例3：

根据上述研究结果，我们设计了三组可定性的基因芯片，分别是

芯片组A：包含IVS7-2A>G和A2168G两个突变位点；

芯片组B：包含IVS7-2A>G、A2168G、A1174T、C1229T、T2027A、IVS15+5G>A、G589A、A1238G、T1826G、C281T、G1226A、C1336T、1548insC等13种突变位点；

芯片组C：包含IVS7-2A>G、A2168G、A1174T、C1229T、T2027A、IVS15+5G>A、G589A、A1238G、T1826G、C281T、G1226A、C1336T、1548insC、G1975C、G259T、T279A、G665T、C1079T、1181_1183delTCT、C1225T、G1595T、1299_1300insC、C2162T、1339_1340delA、C1343A、1687_1693insA、C2167G等27种突变位点。

在分别用三组基因芯片对58例前庭水管扩大患者进行检测(测序检测SLC26A4基因编码区测序共检测到95条突变等位基因)，结果如下：

芯片组	样品数	等位基因数	所检出的SLC26A4突变等位基因数	占所有突变等位基因的比例
芯片组	样品数	等位基因数	所检出的SLC26A4突变等位基因数	占所有突变等位基因的比例	A	58	116	73	76.84％(73/95)
B	58	116	82	86.32％(82/95)	A	58	116	73	76.84％(73/95)
B	58	116	82	86.32％(82/95)	C	58	116	83	87.37％(83/95)

由此可见，利用上述的芯片组，对于SLC26A4基因突变导致的遗传性大前庭水管，其突变等位基因检测(诊断)率分别是76.84％、86.32％、87.37％。这表明使用上述芯片，可以有效检测SLC26A4常见多发突变。

序列表

<110>韩东一戴朴

<120>中国人群遗传性耳聋基因SLC26A4的突变类型和突变频率及其用途

<160>1

<170>PatentIn Version 2.1

<210>1

<211>4930

<212>DNA

<213>智人(Homo Sapiens)

<220>

<222>人遗传性耳聋基因SLC26A4

<220>

<221>3’UTR

<222>(1)...(224)

<220>

<221>CDS

<222>(225)...(2567)

<220>

<221>5’UTR

<222>(2568)...(4390)

<220>

<221>exon1

<222>(1)...(221)

<220>

<221>exon2

<222>(222)...(388)

<220>

<221>exon3

<222>(389)...(528)

<220>

<221>exon4

<222>(529)...(639)

<220>

<221>exon5

<222>(640)...(822)

<220>

<221>exon6

<222>(825)...(989)

<220>

<221>exon7

<222>(990)...(1142)

<220>

<221>exon8

<222>(1143)...(1225)

<220>

<221>exon9

<222>(1225)...(1373)

<220><221>exon10

<222>(1374)...(1487)

<220>

<221>exon11

<222>(1488)...(1565)

<220>

<221>exon12

<222>(1566)...(1661)

<220>

<221>exon13

<222>(1662)...(1768)

<220>

<221>exon14

<222>(1769)...(1838)

<220>

<221>exon15

<222>(1839)...(1931)

<220>

<221>exon16

<222>(1932)...(2027)

<220>

<221>exon17

<222>(2028)...(2258)

<220>

<221>exon18

<222>(2259)...(2313)

<220>

<221>exon19

<222>(2314)...(2459)

<220>

<221>exon20

<222>(2460)...(2543)

<220>

<221>exon21

<222>(2544)...(4923)

<400>1

Claims

1.中国人群遗传性耳聋相关的SLC26A4基因的突变类型，其特征在于所述的SLC26A4基因为SEQ ID NO：1所述的序列，并且该SLC26A4基因序列还具有选自下列突变位点的一个或多个突变：

(1)取代突变：C68A、G87C、109G>T、C200G、C225G、A230T、G249A、G259T、T279A、C281T、G589A、G665T、T678C、T754C、A757G、C941T、C1079T、A1124G、C1173A、A1174T、C1225T、G1226A、C1229T、A1238G、G1240A、C1245A、A1262C、G1327C、G1327C、T1334G、C1336T、T1586G、A1594C、G1595T、A1667G、G1678A、T1790C、C1343A、G1409A、T1472C、T1517G、A2168G、A2176G、T2205G、A2217G、T2228A、A2283G、C2326G、T1826G、G1897A、G1905A、G1975C、T1979G、C1983A、G1985A、G1988A、C1991T、A1993G、G2044T、C2162T、C2167G、IVS4+2T>C、IVS4+7A>G、Intron4-12T>A、IVS7-2A>G、IVS13+5G>A、IVS15+5G>A、Intron19-25T>A、2343+69C>A；

(2)缺失突变：234_235de1C、413_414delT、1019_1020delT、1339_1340delA、Intron7+44_46delACA、1733_1735delATA、1520delT、1181_1183delTCT、Intron9-(2835)delTTTGTAGG、Intron18-(53_56)delCAAA；

(3)插入突变：43_44insG、916_917insG、1548insC、1299_1300insC、1645_1646insA、1687_1693insA、Intron12-(7_13)insT。

2.权利要求1中所述的基因突变类型，其中所述的一个或多个突变选自：

3.权利要求2所述的基因突变类型，其中所述的一个或多个突变选自：

4.权利要求3所述的基因突变类型，其中所述的一个或多个突变选自：

IVS7-2A>G和A2168G(H723R)，其中这2种突变的等位基因占全部突变等位基因的76.06％。

5.权利要求1中所述的基因突变类型，其中所述的一个或多个突变选自：

43_44insG、C68A、G87C、C200G、C225G、234_235delC、G249A、G259T、T279A、413_414delT、IVS4+2T>C、Intron4-12T>A、G665T、T678C、A757G、Intron7+44_46delACA、C941T、1019_1020delT、C1079T、A1124G、C1173A、C1225T、A1238G、Intron9-(28_35)delTTTGTAGG、G1240A、C1245A、G1327C、1299_1300insC、1339_1340delA、G1409A、T1472C、T1517G、1520delT、Intron12-(7_13)insT、IVS13+5G>A、G1595T、1645_1646insA、G1678A、1687_1693insA、1733_1735delATA、G1897A、G1905A、T1979G、C1983A、G1985A、G1988A、C1991T、A1993G、G2044T、Intron18-(53_56)delCAAA、C2167G、A2176G、T2205G、A2217G、T2228A、Intron19-25T>A、A2283G、C2326G、2343+69C>A，其中这些基因突变类型是中国人群特有的耳聋相关SLC26A4基因的突变类型。

6.权利要求5所述的基因突变类型，其中所述的一个或多个突变选自：

43_44insG、C68A、G87C、C200G、234_235delC、G249A、G259T、T279A、413_414delT、IVS4+2T>C、G665T、A757G、C941T、1019_1020delT、C1079T、A1124G、C1173A、C1225T、A1238G、G1240A、C1245A、G1327C、1299_1300insC、1339_1340delA、G1409A、T1472C、T1517G、1520delT、IVS13+5G>A、G1595T、1645_1646insA、G1678A、1687_1693insA、1733_1735delATA、G1897A、T1979G、C1983A、G1985A、G1988A、C1991T、A1993G、G2044T、C2167G、A2176G、T2228A、C2326G、非翻译区2343+69C>A，其中这些基因突变类型是导致SLC26A4基因编码蛋白氨基酸发生改变或影响基因转录和翻译的突变类型。

7.权利要求6所述的基因突变类型，其中所述的一个或多个突变选自：

A1238G、G259T、T279A、G665T、C1079T、C1225T、1299_1300insC、1339_1340delA、G1595T、1687_1693insA、C2167G，其中这些基因突变类型是突变发生频率超过一次的突变类型。

8.权利要求6所述的基因突变类型，其中所述的一个或多个突变选自：

43_44insG、C68A、23_4235delC、G249A、413_414delT、1019_1020delT、1299_1300insC、1339_1340delA、1520delT、1645_1646insA、1687_1693insA、1733_1735delATA、G2044T、T2228A，其中这些突变类型是导致SLC26A4基因终止密码子提前出现、使编码蛋白质发生明显异常改变的突变类型。

9.权利要求1-8任一项所述的基因突变类型，其在制备用于检测或诊断与SLC26A4基因相关的中国人群遗传性耳聋的产品中的用途。

10.权利要求9所述的用途，是用于检测上述突变类型的试剂、试剂盒或基因芯片。

11.权利要求10所述的用途，其中所述的试剂、试剂盒或基因芯片包含针对突变位点的引物对或多重引物对。

12.权利要求11所述的用途，其中所述的基因芯片在其表面上存在用于检测所述突变位点的特异探针。

13.用于检测权利要求1-8任一项所述基因突变类型的试剂或试剂盒。

14.权利要求13所述的试剂或试剂盒，其中所述的试剂或试剂盒包含针对突变位点的引物对或多重引物对。

15.用于检测权利要求1-8任一项所述基因突变类型的基因芯片。

16.权利要求15所述的基因芯片，其中所述基因芯片通过检测任一突变位点的是否存在，来确定样本是否患有与SLC26A4突变基因相关的中国人群遗传性耳聋疾病。