CN103509800A - 常染色体隐性非综合征型耳聋致病基因 - Google Patents

Abstract

本发明涉及常染色体隐性疾病，更具体而言本发明涉及常染色体隐性非综合征型耳聋致病基因。

Description

常染色体隐性非综合征型耳聋致病基因

技术领域

本发明涉及常染色体隐性疾病，更具体而言本发明涉及常染色体隐性非综合征型耳聋致病基因。

背景技术

耳聋（hearing loss,HL）是导致语言交流障碍的最常见疾病，一般新生儿耳聋的发病率可达到1/1000，在不发达国家中新生儿耳聋发病率甚至可高达1/500¹。作为有着13亿人口的中国，每年有近3万名先天性神经感音性耳聋患儿出生。鉴定分离导致耳聋的致病基因，明确耳聋发生的分子机制，通过产前基因诊断和预防等有效措施来降低耳聋的发生率，是防聋治聋的根本途径之一。

单基因遗传的耳聋占全部耳聋50%，其中70％是以耳聋为唯一临床表现的非综合征耳聋。非综合征型耳聋具有高度的遗传异质性，80%是常染色体隐性遗传²。占比例最大的常染色体隐性非综合征型耳聋（autosomal recessive nonsyndromic hearing loss,ARNSHL）,是利用经典的耳聋家系定位和鉴定分离致病基因的研究热点。据HereditaryHear Loss Homepage（HHH）提供的最新信息可知，已定位或分离的ARNSHL基因有63个，其中克隆分离到的致病基因有39个，已被定位但未分离到基因的有24个。

2002年本发明人从山东省遗传病调查中收集到一个近亲婚配导致的ARNSHL耳聋家系。我们在排除已知耳聋基因的基础上，利用纯合子定位法，将该家系耳聋基因定位于17q11.2-12的D17S1850和D17S1818之间5.07cM区域。

该基因的发现将有助于对耳聋发生机制的进一步研究，为耳聋的基因诊断和预防等提供帮助。

发明内容

2001年收集到山东临沂一耳聋家系，经临沂市人民医院协助确诊为非综合征性耳聋。家系图如图1。在此基础上，发明人利用外显子组测序技术，对患者进行分析，在位于候选区域内的TMEM132E基因(transmembrane protein 132E)第7外显子检测到一个错义突变，该突变被进一步证实在家系中与耳聋症状共分离；正常群体中分析排除是SNP多态位点；突变位点氨基酸在多物种进化高度保守。这些结果提示TMEM132E基因是该山东临沂ARNSHL耳聋家系的致病基因，而且是一个新的耳聋致病基因。

在第一方面中，本发明涉及突变的TMEM132E基因，该基因与野生型TMEM132E基因相比有一个或多个有义突变。

有义突变是造成TMEM132E基因编码氨基酸序列变化的突变，特别是引起TMEM132E蛋白功能变化的突变。所述功能变化，包括功能增强、减弱或消失。

在一个实施方案中，本发明涉及TMEM132E基因第420位密码子CGA→CAA，导致其编码蛋白的第420位氨基酸由精氨酸→谷氨酰胺（p.R420Q，表示蛋白质序列第420位由R变成Q）。

在一个实施方案中，突变TMEM132E基因为SEQ ID NO:1的序列表示。

在第二方面中，本发明的突变TMEM132E蛋白，该蛋白与野生型相比有一个或多个氨基酸变化。

优选地，所述一个或多个氨基酸变化引起TMEM132E蛋白功能变化。所述功能变化，包括功能增强、减弱或消失。

在一个实施方案中，本发明涉及TMEM132E蛋白第420位氨基酸由精氨酸→谷氨酰胺（p.R420Q）。

在另一个实施方案中，突变TMEM132E蛋白为SEQ ID NO:2的序列表示。

在第三方面中，本发明涉及一种检测耳聋或阴性携带者的方法，所述方法包括检测受试者的TMEM132E基因或TMEM132E蛋白中是否存在突变，如果有纯合突变位点，则所述受试者被鉴定为患有耳聋，如果有杂合突变位点，则所述受试者被鉴定为耳聋阴性携带者。

在一个实施方案中，本发明的检测耳聋或阴性携带者的方法包括，获得TMEM132E基因的部分或全长基因序列并进行测序的步骤。优选地，获得TMEM132E基因的部分或全长基因序列通过PCR扩增进行。优选地，所述测序使用测序仪进行。

优选突变是有义突变，即造成TMEM132E基因编码氨基酸序列变化的突变，特别是引起TMEM132E蛋白功能变化的突变。所述功能变化，包括功能增强、减弱或消失。

在一个实施方案中，所述突变是该基因第420位密码子CGA→CAA，或其编码蛋白的第420为氨基酸由精氨酸→谷氨酰胺（p.R420Q）。

在一个实施方案中，本发明的检测耳聋或阴性携带者的方法包括以可扩增TMEM132E基因部分或全长的引物对进行扩增的步骤。

在一个实施案中，所述引物对为：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。

在第四方面，本发明涉及通过PCR检测突变TMEM132E基因中使用的引物对，所述引物对可扩增TMEM132E基因部分或全长。优选地，所述引物对的扩增产物涵盖所述突变。

在一个实施方案中，所述突变是该基因第420位密码子CGA→CAA，或其编码蛋白的第420为氨基酸由精氨酸→谷氨酰胺（p.R420Q），所述引物对分别基于该基因第420位密码子前后设计，使得扩增产物涵盖该位置。

在一个实施方案中，所述引物对是SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。

在第五方面，本发明涉及与突变TMEM132E基因全长或部分互补的核苷酸序列，所述互补区序列涵盖所述突变。优选所述核苷酸序列较短，可以作为核酸探针，探测所述突变TMEM132E基因。

在一个实施方案中，所述突变是该基因第420位密码子CGA→CAA，或其编码蛋白的第420为氨基酸由精氨酸→谷氨酰胺（p.R420Q），所述核酸探针与该基因的互补区包括该基因第420位密码子。

在第六方面，本发明涉及检测突变TMEM132E基因的试剂盒，所述试剂盒包含可扩增TMEM132E基因部分或全长的引物对。优选地，所述引物对的扩增产物涵盖所述突变。

在一个实施案中，所述引物对为：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。

所述突变是该基因第420位密码子CGA→CAA，或其编码蛋白的第420为氨基酸由精氨酸→谷氨酰胺（p.R420Q），所述引物对分别基于该基因第420位密码子前后设计，使得扩增产物涵盖该位置。

在一个实施方案中，所述引物对是SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。

在第七方面，本发明涉及检测突变TMEM132E基因的试剂盒，所述试剂盒包含全长或部分互补的核苷酸序列，所述互补区序列含有一个或多个突变。优选所述核苷酸序列较短，可以作为核酸探针，探测所述突变TMEM132E基因。

在一个实施方案中，所述突变是该基因第420位密码子CGA→CAA，或其编码蛋白的第420为氨基酸由精氨酸→谷氨酰胺（p.R420Q），所述核酸探针与该基因的互补区包括该基因第420位密码子。

TMEM132E是新的耳聋致病基因；该突变位点可用于耳聋的基因诊断。

附图说明

图1山东临沂一耳聋家系图。其中空心圆（○）表示表型正常女性；空心正方形（□）表示表型正常男性；实心正方形（■）表示男性患者；实心圆（●）表示女性患者。I、II、III和IV分别表示该家系中的第1代、第2代、第3代和第4代。图中1、2和3用于区分同一代中各成员。

图2验证实施例结果。其中，N1、N2、和N3是正常人的酶切结果；III1、III2、IV1、IV2和IV3是山东临沂ARNSHL家系成员的酶切结果，IV1和IV3是患者，其他是携带者。

序列表说明

本发明中使用了如下序列：

实施例中检测的突变TMEM132E基因的序列（SEQ ID NO:1）（下划线标明突变位置）：

AT Ggccccgggg atgtcgggcc gcggcggcgccgccctgctc tgcctctcag cgctactcgc ccacgcctct ggccgctccc acccggccagccccagcccg ccggggccgc aggccagccc ggtgctgcca gtcagctacc gcctgtcgcacacgcggctg gccttcttcc tgcgggaggc gcggcccccg tcacccgcgg tcgccaacagctctctgcag cgctccgagc ccttcgtggt gttccagacc aaggagctgc cggtcctcaacgtctctctg gggcccttca gcaccagcca ggtggtggcg cgggagctcc tgcagccgtccagcaccctg gacatccccg agcgcctgac ggtgaactgg aaggtgcggg ccttcatcgtccgctcgcac gtgcccgcct cgcagcccgt ggtccaggtg ctgttctacg tagccggccgggactgggac gacttcggcg tcaccgagcg gctgccctgt gtccgcctgc atgccttccgggatgcccgg gaacaccccc tgctgcgcat cgggagcatc agcctgttcc gcccgccccccaggaggacc ctgcaggagc acaggctgga cagcaacctg atgatccgcc tgccagaccggcccctcaag cccggggaag tgctcagcat cctcctctat ctggccccca actcctcctcgccctccagc cccagcgtgg agcacttcac actcagggtg aaggccaaga agggtgtgacccttttaggt accaagtcac ggagtggcca gtggcatgtg acctcggagc tgctgactggggcaaagcac tcaacagcca ccgtggatgt ggcctgggct cagagcacac ccctgccccccagggagggc cagggcccct tggagatctt gcagctggac tttgaaatgg agaacttcaccagccagtca gtcaagcgga ggatcatgtg gcacattgac taccgtggcc acggcgccctgcctgacctg gagcgggcag tcactgagct gacggtcatt cagcgggatg tgcaagccatcctgcccctg gccatggaca cagagatcat caacacggcc attctgactg gccggacagtggccatccct gtcaaggtca ttgccatcga ggtgaatggc ctcgtcctgg acatctccgccctagtggaa tgcgagtctg acaatgaaga catcatcaag gtatccagca gctgtgactacgtgtttgtg agtggaaaag agtctcAagg gtccatgaac gccagggtca ccttccgctacgacgtcctc aatgctcccc tggaaatgac agtctgggtc cccaagctgc ccttgcacattgagctctca gatgcccgcc tcagccaagt gaagggctgg agggtaccta tcctccccgaccggaggtca gtccgggaaa gcgaggatga ggatgaggag gaggaggagc ggcggcagagtgcaagccgt ggctgcaccc tgcagtacca gcatgccacc ctgcaggtct tcacccagttccacacgaca tcatccgagg gcactgacca ggtggtcacc atgttaggcc cggactggctggtggaggtc accgacctag tcagtgactt catgcgggtg ggcgatcccc gagtggcacacatggtggac agcagcacgc tggcaggact ggagccaggc accaccccct ttaaggtggtgtctccgctg acggaggctg tgctcgggga gacgctgctg acggtgactg aggagaaggtcagcatcaca cagcttcagg cccaggtggt ggccagcctg gccctctccc tgcggcccagccctgggagc agccacacca tcctagccac cacagctgcc caacagacct tgagcttcctcaagcaggaa gccctactga gcctctggct ctcctacagt gatggcacca cagccccactctccctctac agcccacgag actatggact gctagtgagc agcctggatg agcatgtggccactgtgacc caggaccggg ccttccctct ggtagtggct gaggccgagg ggtcaggggagctgcttcgc gcagagctaa ccatcgctga gagctgccag aaaaccaaac gcaagagtgtgctcgccacg acccctgtgg gcctgcgggt gcactttggg agggacgagg aggaccccacttatgactac ccgggcccca gccaaccagg gcccggcggg ggcgaggacg aggcccggggagctggcccg ccgggctctg cgctacccgc accggaggct ccaggcccgg gcaccgccagccccgtcgtg ccacccacag aagacttcct gccgctgccc accggcttcc tgcaggtgccacggggtctg acagacctgg agatcggcat gtacgcgctg ctgggcgtct tctgcctcgccatcctcgtc ttcctcatca actgcatcgt ttttgtgctg cgctaccggc acaagcgcatcccgcccgag ggccagacca gcatggacca ctctcaccac tgggtgttcc tgggcaacgggcagccgctg cgggtgcaag gagagctgtc gccgccagca ggcaacccgc tggaaaccgtgcccgccttc tgccacggcg accaccacag cagcggcagc tcgcagacca gcgtccagagccaggtgcac ggcaggggcg acggctcctc gggcggctca gcccgagacc aagccgaggaccccgccagc tcgcccacct ccaagcgcaa gcgggtcaag ttcaccacct tcaccacgctgccgtcagag gagctggcct atgactcggt gcccgcgggc gaagaggacg aggaggaggaagaggacctg ggttggggct gcccggatgt ggcgggcccc acgcggccca ctgcacccccggacctgcac aattacatgc gcagaatcaa agagattgca TAG；

实施例中检测的突变TMEM132E 蛋白的序列（SEQ ID NO:2）（下划线标明突变位置）：

MAPGMSGRGGAALLCLSALLAHASGRSHPASPSPPGPQASPVLPVSYRLSHTRLAFFLREARPPSPAVANSSLQRSEPFVVFQTKELPVLNVSLGPFSTSQVVARELLQPSSTLDIPERLTVNWKVRAFIVRSHVPASQPVVQVLFYVAGRDWDDFGVTERLPCVRLHAFRDAREHPLLRIGSISLFRPPPRRTLQEHRLDSNLMIRLPDRPLKPGEVLSILLYLAPNSSSPSSPSVEHFTLRVKAKKGVTLLGTKSRSGQWHVTSELLTGAKHSTATVDVAWAQSTPLPPREGQGPLEILQLDFEMENFTSQSVKRRIMWHIDYRGHGALPDLERAVTELTVIQRDVQAILPLAMDTEIINTAILTGRTVAIPVKVIAIEVNGLVLDISALVECESDNEDIIKVSSSCDYVFVSGKESQGSMNARVTFRYDVLNAPLEMTVWVPKLPLHIELSDARLSQVKGWRVPILPDRRSVRESEDEDEEEEERRQSASRGCTLQYQHATLQVFTQFHTTSSEGTDQVVTMLGPDWLVEVTDLVSDFMRVGDPRVAHMVDSSTLAGLEPGTTPFKVVSPLTEAVLGETLLTVTEEKVSITQLQAQVVASLALSLRPSPGSSHTILATTAAQQTLSFLKQEALLSLWLSYSDGTTAPLSLYSPRDYGLLVS SLDEHVATVTQDRAFPLVVAEAEGSGELLRAELTIAESCQKTKRKSVLATTPVGLRVHFGRDEEDPTYDYPGPSQPGPGGGEDEARGAGPPGSALPAPEAPGPGTASPVVPPTEDFLPLPTGFLQVPRGLTDLEIGMYALLGVFCLAILVFLINCIVFVLRYRHKRIPPEGQTSMDHSHHWVFLGNGQPLRVQGELSPPAGNPLETVPAFCHGDHHSSGSSQTSVQSQVHGRGDGSSGGSARDQAEDPASSPTSKRKRVKFTTFTTLPSEELAYDSVPAGEEDEEEEEDLGWGCPDVAGPTRPTAPPDLHNYMRRIKEIA

实施例中使用的引物序列对的序列：

TMEM132E E7F（SEQ ID NO:3）：

GAAGTCCTCCGCACTGCCTCAC；

TMEM132E E7R（SEQ ID NO:4）：

CAAGGGCCTTATACCCATATGC。

具体实施方式

对于本发明说明书和权利要求书中，提及基因序列，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如，提及SEQ ID NO:1，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。

本申请中的基因序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。例如提及TMEM132E基因的cDNA序列，实际也包括相应的RNA序列。

取山东临沂的耳聋家系成员的外周血，提取基因组DNA。首先在家系中利用直接测序法对常见的耳聋基因进行了序列分析，排除已知的耳聋基因，然后按20cM的平均间距选择STR位点进行纯合子定位，将家系候选基因定位于17q11.2-12的D17S1850和D17S1818之间5.07cM区域。

随后，发明人用NimbleGen

SeqCap EZ Human Exome Library v2.0全外显子捕获平台结合Illumina Hiseq 2000的高通量测序技术对IV3患者的外显子组序列进行了测序，具体如下：

1）将基因组DNA随机打断成250-300bp左右的片段，随后在片段两端分别连接上接头制备杂交文库（参见http://www.illumina.com/提供的Illumina/Solexa标准建库说明书）。

2）文库经纯化后经过ligation-mediated PCR(LM-PCR)的线性扩增与捕获试剂进行杂交富集，再经过LM-PCR的线性扩增后进行上机测序。测序平台为Illumina Hiseq 2000，读取长度为90bp，样本的平均测序深度最少为57.62X。

3）测序后获得的原始数据由Illumina basecalling Software 1.7进行处理，经过过滤去污染、使用SOAPaligner 2.21（Li R，Li Y,Kristiansen K,et al,SOAP:short oligonucleotide alignment program.Bioinformatics 2008,24(5):713-714；Li R,Yu C,Li Y,ea al,SOAP2:animproved ultrafast tool for short read alignment.Bioinformatics 2009,25(15):1966-1967.）比对参考基因组，获得比对到基因组上的Uniquemapped reads。靶区域的基因型由SOAPsnp(Li R,Li Y,Fang X,YangH,et al,SNP detection for massively parallel whole-genomeresequencing.Genome Res 2009,19(6):1124-1132.)确定。

结果，在病例中发现有55041个单核苷酸多态性（SNPs）和1582处的插入/缺失。随后对结果通过dbSNP数据库（http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/snp132.txt.gz.）,HapMap数据库（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/hapmap）,千人基因组数据库（ftp://ftp.1000genomes.ebi.ac.uk/vol1/ftp），炎黄数据库（http://yh.genomics.org.cn/）等公共数据库的过滤，去掉所有已知的且在数据库中等位基因频率大于0.005的变异。

检测发现在候选区域内的TMEM132E第7外显子中G突变为A,NM_207313中c.1259G>A（即SEQ ID NO:1的1259位由G突变为A），导致第420位密码子CGA→CAA，即第420为氨基酸由精氨酸→谷氨酰胺（p.R420Q）。对家系中其他成员III1、III2、IV1和IV2进行Sanger测序验证，发现III1、III2和IV2是该突变的杂合子，为携带者；IV1患者同IV3患者是该突变的纯合子，为患者。说明该碱基改变在家系中与耳聋症状呈共分离。同时在500正常DNA样本中分析该改变，未发现相同改变，排除是SNP位点。

TMEM132E是一个新的基因，NCBI基因库提供信息认为该基因编码蛋白为一单跨膜蛋白，目前尚无任何功能方面的研究。

实施例

施例1样本的制备

取山东临沂的耳聋家系成员的外周血，提取基因组DNA，送深圳华大基因科技有限公司进行外显子组测序。

实施例2致病基因的检测

对该突变位点的验证，该突变位于第7外显子，设计引物以基因组DNA为模板，PCR扩增后，送深圳华大基因科技有限公司进行测序验证。

PCR引物如下：

TMEM132E E7F 5'GAAGTCCTCCGCACTGCCTCAC 3'（SEQ ID NO:3）；

TMEM132E E7R 5'CAAGGGCCTTATACCCATATGC 3'（SEQ ID NO:4）。

PCR条件：94℃4分钟;94℃40秒，58℃40秒，72℃50秒，共35个循环；72℃10分钟。

对家系中其他成员III1、III2、IV1和IV2进行Sanger测序验证，发现III1、III2和IV2是该突变的杂合子，为携带者；IV1患者同IV3患者是该突变的纯合子，为患者。

实施例3验证过程实施例

因为该突变导致XhoI酶切位点的丢失，所以为了分析该改变的多态性，发明人采用了PCR-RFLP的方法。发明人对500个正常人DNA进行第7外显子的扩增，引物同上，然后XhoI酶切。结果如图2所示，患者酶切后只有371bp DNA条带；正常纯合个体酶切后371bp被切断为114bp和257bp；携带者有三条DNA条带（371bp,257bp和114bp）。对家系成员分析，再次验证突变和症状共分离。采用PCR-RFLP方法，在500人的随机正常人群中分析，发现这1000个TMEM132E突变位点未检测到该突变，说明A等位基因频率远远小于1%，排除是SNP位点。

患者测序结果显示:IV1同IV3患者是该突变的纯合子，都为A碱基；作为对照的正常人测序结果显示：都为G碱基；其他家系中携带者：III1和III2为患者近亲结婚父母，都是杂合子，为A/G碱基杂合；IV2也是突变的杂合子，为携带者。

Claims (9)

1.突变TMEM132E基因或TMEM132E蛋白，该基因与野生型TMEM132E基因相比有一个或多个有义突变，该蛋白与野生型TMEM132E蛋白相比有一个或多个氨基酸变化。

2.权利要求1的突变TMEM132E基因或TMEM132E蛋白，其中所述突变是TMEM132E基因第420位密码子由CGA变成CAA，或者是TMEM132E蛋白的第420位氨基酸由精氨酸变成谷氨酰胺；优选地，所述突变TMEM132E基因序列是SEQ ID NO:1，或者所述突变TMEM132E蛋白的序列是SEQ ID NO:2。

3.一种检测耳聋或阴性携带者的方法，所述方法包括检测受试者的TMEM132E基因或TMEM132E蛋白中是否存在突变，如果有纯合突变位点，则所述受试者被鉴定为患有耳聋，如果有杂合突变位点，则所述受试者被鉴定为耳聋阴性携带者。

4.权利要求3的方法，其中所述突变是TMEM132E基因第420位密码子由CGA变成CAA，或者是TMEM132E蛋白的第420位氨基酸由精氨酸变成谷氨酰胺；优选地，所述突变的TMEM132E基因序列是SEQID NO:1，或者所述突变的TMEM132E蛋白的序列是SEQ ID NO:2。

5.权利要求3或4的方法，包括获得TMEM132E基因的部分或全长基因序列并进行测序的步骤；优选地，获得TMEM132E基因的部分或全长基因序列通过PCR扩增进行，优选以SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的引物进行PCR扩增。

6.扩增突变TMEM132E基因全长或部分的引物序列，所述引物扩增产物涵盖所述突变；优选地，其中所述突变是TMEM132E基因第420位密码子由CGA变成CAA；更优选SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。

7.与突变TMEM132E基因全长或部分互补的核苷酸序列，所述互补区序列涵盖所述突变；优选地，其中所述突变是TMEM132E基因第420位密码子由CGA变成CAA；优选地，所述核苷酸序列较短，可以作为核酸探针，探测所述突变TMEM132E基因。

8.一种检测突变TMEM132E基因的试剂盒，所述试剂盒包含可扩增所述突变TMEM132E基因部分或全长的引物对，所述引物对的扩增产物涵盖所述突变；优选地，其中所述突变是TMEM132E基因第420位密码子由CGA变成CAA；更优选地，所述引物对是SEQ ID NO:3和SEQID NO:4。

9.一种检测突变TMEM132E基因的试剂盒，所述试剂盒包含与TMEM132E基因全长或部分互补的核苷酸序列，所述互补区序列涵盖所述突变；优选地，其中所述突变是TMEM132E基因第420位密码子由CGA变成CAA；更优选地，所述核苷酸序列较短，可以作为核酸探针，探测TMEM132E基因。

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