CN103571846A - Atp6v1b2基因突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分离的编码ATP6V1B2突变体的核酸、分离的多肽、筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的生物样品的方法、筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的生物样品的系统以及用于筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的生物样品的试剂盒。其中，分离的编码ATP6V1B2突变体的核酸，与SEQ ID NO：1相比，具有c.C1516T突变。通过检测该突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征。

Description

ATP6V1B2基因突变体及其应用

技术领域

本发明涉及ATP6V1B2基因突变体及其应用。具体地，本发明涉及分离的编码ATP6V1B2突变体的核酸、分离的多肽、筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的生物样品的方法、筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的生物样品的系统以及用于筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的生物样品的试剂盒。

背景技术

先天性耳聋伴甲发育不良综合征（deafness and onychodystrohy syndrome,DOD）按遗传方式通常可分为两个特殊群体：常染色体隐性遗传的DOOR综合征（deafness–onychodystrohy–osteodystrophy-mental retardation syndrome）和常染色体显性遗传的DDOD综合征（dominant deafness and onychodystrohy syndrome）。DOOR综合征主要表现为先天性感音神经性聋、甲发育不良或缺失、拇指三节指骨以及不同程度的智力发育缓慢、癫痫、哑症等。此外，大多数DOOR综合征病人尿及血浆中α-酮戊二酸浓度增高。而DDOD综合征具有较轻的以上症状，即表现为先天性耳聋，甲发育不全，通常不涉及智力发育迟缓，无尿及血浆α-酮戊二酸的改变，圆锥形发育不全的牙齿也是DDOD综合征特点之一。而智力发育障碍是DOOR和DDOD综合征鉴别的重要特征。

然而，现阶段对先天性耳聋伴甲发育不良综合征，尤其是DDOD综合征，尚无有效的诊断、治疗方法，且DDOD综合征的致病基因尚未明确，因此，目前对DDOD综合征的研究仍有待深入。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出DDOD综合征（有时也称为“常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征”）的致病基因及其致病突变。

本发明是基于发明人的下列工作而完成的：发明人通过高通量外显子组测序联合候选基因突变验证的方法确定了常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的致病基因及其致病突变（ATP6V1B2，c.C1516T）。

根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的编码ATP6V1B2突变体的核酸。根据本发明的实施例，该核酸与SEQ ID NO：1相比，具有c.C1516T突变。根据本发明的实施例，发明人确定了ATP6V1B2的突变体，该突变体与DDOD综合征的发病密切相关，从而通过检测该突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征。

根据本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，该多肽与SEQ ID NO：2相比，具有p.R506X突变。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征。

根据本发明的第三方面，本发明提出了一种筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的生物样品的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：从生物样品提取核酸样本；确定所述核酸样本的核酸序列；所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，具有c.C1516T突变是所述生物样品易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的指示。通过根据本发明实施例的筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征（即DDOD综合征）的生物样品的方法，可以有效地筛选易感DDOD综合征的生物样品。

根据本发明的第四方面，本发明提出了一种筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的生物样品的系统。根据本发明的实施例，该系统包括：核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本；核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，是否具有c.C1516T突变，判断所述生物样品是否易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征。利用该系统，能够有效地实施前述筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的生物样品的方法，从而可以有效地筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的生物样品。

根据本发明的第五方面，本发明提出了一种用于筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒含有：适于检测ATP6V1B2基因突变体的试剂，其中与SEQ ID NO：1相比，所述ATP6V1B2基因突变体具有c.C1516T突变。利用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的生物样品。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明实施例的筛选易感DDOD综合征的生物样品的系统及其组成部分的示意图，其中，A为根据本发明实施例的筛选易感DDOD综合征的生物样品的系统的示意图，B为根据本发明实施例的核酸提取装置的示意图，C为根据本发明实施例的核酸序列确定装置的示意图；以及

图2显示了根据本发明实施例的对2个患者家系成员的ATP6V1B2基因突变位点c.C1516T突变的Sanger测序验证峰图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

ATP6V1B2基因突变体

根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的编码ATP6V1B2突变体的核酸。根据本发明的实施例，与SEQ ID NO：1相比，该核酸具有c.C1516T突变。在本文中所使用的表达方式“编码ATP6V1B2突变体的核酸”，是指与编码ATP6V1B2突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受特别限制，可以是任何包含与ATP6V1B2突变体的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。根据本发明的一个具体示例，前面所述的编码ATP6V1B2突变体的核酸为DNA。根据本发明的实施例，发明人确定了ATP6V1B2基因的突变体，该突变体与常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的发病密切相关，从而通过检测该突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征，也可以通过检测该突变体在生物体中是否存在，可以有效地预测生物体是否易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征。

该编码ATP6V1B2突变体的核酸，是本申请的发明人通过高通量外显子组测序联合候选基因突变验证的方法确定的常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的致病基因上的突变。并且，在现有技术中并未见ATP6V1B2基因及其c.C1516T突变与DDOD综合征相关的报道。

野生型ATP6V1B2基因的cDNA具有如下所示的核苷酸序列：atggcgttgcgagcgatgcggggaatcgtgaacggggccgcacccgaactgcccgtgcccaccggtgggccgatggccggagctcgggagcaggcgctggcggtgagccggaactacctatcccagcctcgtctcacctacaagactgtctctggggtgaatggtccactagtgatcctagatcatgtgaagtttcccagatacgctgagattgtccacttgacattaccagatggcacaaagagaagtgggcaagtcctagaagttagtggctccaaagcagtggttcaggtatttgaagggacatctggtatagacgccaagaaaacatcctgtgagtttactggagatattctccgaacaccagtgtctgaggatatgcttggtcgagtattcaacggatcaggaaaacccattgaccgaggccctgtggtgctggctgaagacttccttgacatcatgggtcagccaatcaaccctcagtgtcggatctatccagaagagatgattcagacgggcatttccgccatcgatggcatgaacagtattgctaggggacagaaaatccccatcttttctgctgctggattaccacacaacgagattgcagctcagatctgtcgccaggctggtttggtaaagaaatccaaagatgtagtggactatagtgaagaaaattttgccattgtgtttgctgctatgggagtaaacatggaaacagcccggttctttaaatctgactttgaagaaaatggctcaatggacaatgtctgcctttttttgaatctggctaatgacccaaccattgagcggatcatcactcctcgcctggctctgaccacggccgagtttctggcatatcagtgtgagaagcacgtgctggtgatcctgacggacatgagctcctacgctgaagcgctgcgagaggtttcagctgccagggaagaggtccctggtcggcgaggcttcccaggctacatgtataccgacttagccacaatctatgaacgtgccggtcgagtggaaggtagaaacggctctattacccaaatccctattctcaccatgcccaatgacgatatcactcatcccatccctgacttgactgggtacattactgagggccagatctatgtggacagacagctgcacaacagacagatttaccctcctattaatgtgctgccctcactctctcggttaatgaagtcagctatcggagaaggaatgaccagaaaggatcacgctgatgtgtctaaccagttgtatgcgtgctatgccatcggtaaggacgtgcaagccatgaaagccgtggtgggagaggaagccctgacctcagatgatctcctttacctggaatttctgcagaagtttgagaagaacttcattactcagggtccctatgaaaaccgaactgtttatgagactttggacattggctggcagttgcttcgaatcttccccaaagaaatgctgaagagaatccctcagagcaccctgagcgaattttaccctcgagactctgcaaaacactag（SEQ ID NO：1），

其编码的ATP6V1B2蛋白具有如下所示的氨基酸序列：

MALRAMRGIVNGAAPELPVPTGGPAVGAREQALAVSRNYLSQPRLTYKTVSGVNGPLVILDHVKFPRYAEIVHLTLPDGTKRSGQVLEVSGSKAVVQVFEGTSGIDAKKTSCEFTGDILRTPVSEDMLGRVFNGSGKPIDRGPVVLAEDFLDIMGQPINPQCRIYPEEMIQTGISAIDGMNSIARGQKIPIFSAAGLPHNEIAAQICRQAGLVKKSKDVVDYSEENFAIVFAAMGVNMETARFFKSDFEENGSMDNVCLFLNLANDPTIERIITPRLALTTAEFLAYQCEKHVLVILTDMSSYAEALREVSAAREEVPGRRGFPGYMYTDLATIYERAGRVEGRNGSITQIPILTMPNDDITHPIPDLTGYITEGQIYVDRQLHNRQIYPPINVLPSLSRLMKSAIGEGMTRKDHADVSNQLYACYAIGKDVQAMKAVVGEEALTSDDLLYLEFLQKFERNFIAQGPYENRTVFETLDIGWQLLRIFPKEMLKRIPQSTLSEFYPRDSAKH（SEQ ID NO：2）。

发明人发现的ATP6V1B2基因突变体与SEQ ID NO：1相比，具有c.C1516T突变，即相对于野生型ATP6V1B2基因，本发明的ATP6V1B2基因突变体的cDNA中第1516位的C突变为T，由此，其所编码的产物与野生型ATP6V1B2蛋白（SEQ ID NO：2）相比，具有p.R506X突变，其中X表示翻译提前终止，即R506的密码子突变为终止密码子，翻译终止于506位。

已知，ATP6V1B2位于第8号染色体，编码V型H+-ATPase，后者是一个特殊的多亚基质子泵，水解ATP逆浓度梯度转运氢离子。V型H+-ATPase在内耳中主要是维持淋巴囊内的高钾状态。V型H+-ATPase的分子量接近于900kDa，一般认为它对一些细胞内的过程是必需的，如蛋白质的排序，发酵菌的活化，受体调节的内吞作用，顺着质子梯度的突触泡的产生。此外，有观点认为它不仅是第二大能量传输装置，也是重要的膜交换的调节器。V型H+-ATPase至少由13个不同的亚基组成，在哺乳动物的组织中经常以复合体的形式出现。分为跨膜区(V0，240 000)和胞质区(V1，640 000)两个功能区，V0包含跨膜区，V1没有跨膜区，通过与V0的部分区域相作用而锚定在膜上。其中V0区由a、d、c”、C等不同的亚基组成；而Vl区由8个不同的亚基(A3、B3、C、D、E2、F、G2、H)组成。V型H+-ATPase的少数几个亚基具有多个同分异构体，其中B亚基包括B1和B2亚型。B1主要表达在泌尿系统、内耳、眼和肺中。B2在大多数细胞中都有表达，目前有研究证实其在嗅觉上皮细胞和神经纤维细胞中高表达。目前发现ATP6V1B1和ATP6V0A4的突变会引起感音神经性耳聋。但尚无ATP6V1B2在内耳表达的文献记录。

根据本发明的第二方面，本发明提出了一种分离的多肽。根据本发明的实施例，与SEQID NO：2相比，该分离的多肽具有p.R506X突变。根据本发明的一些具体示例，该多肽是由前述分离的编码ATP6V1B2突变体的核酸编码的。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征，也可以通过检测这些多肽在生物体中是否存在，可以有效地预测生物体是否易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征。

筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的生物样品的方法

根据本发明的第三方面，本发明提出了一种筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的生物样品的方法。根据本发明的实施例，该筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的生物样品的方法可以包括以下步骤：

首先，从生物样品提取核酸样本。根据本发明的实施例，生物样品的类型并不受特别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品ATP6V1B2是否存在突变的核酸样本即可。根据本发明的实施例，生物样品可以为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种。由此，可以方便地进行取样和检测，从而能够进一步提高筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的生物样品的效率。根据本发明的实施例，这里所使用的术语“核酸样本”应做广义理解，其可以是任何能够反映生物样品中ATP6V1B2是否存在突变的样本，例如可以是从生物样品中直接提取的全基因组DNA，也可以是该全基因组中包含ATP6V1B2编码序列的一部分，可以是从生物样品中提取的总RNA，也可以是从生物样品中提取的mRNA。根据本发明的一个实施例，所述核酸样本为全基因组DNA。由此，可以扩大生物样品的来源范围，并且可以同时对生物样品的多种信息进行确定，从而能够提高筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的生物样品的效率。另外，根据本发明的实施例，针对采用RNA作为核酸样本，从生物样品提取核酸样本可以进一步包括：从生物样品提取RNA样本，优选RNA样本为mRNA；以及基于所得到的RNA样本，通过反转录反应，获得cDNA样本，所得到的cDNA样本构成核酸样本。由此，可以进一步提高利用RNA作为核酸样本筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的生物样品的效率。

接下来，在得到核酸样本之后，可以对核酸样本进行分析，从而能够确定所得到核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，确定所得到核酸样本的核酸序列的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的具体实施例，可以通过测序方法，确定核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，可以用于进行测序的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的实施例，可以采用第二代测序技术，也可以采用第三代以及第四代或者更先进的测序技术。根据本发明的具体示例，可以利用选自Hiseq2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种对核酸序列进行测序。由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而，能够提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。由此，根据本发明的实施例，确定核酸样本的核酸序列可以进一步包括：首先，针对所得到的核酸样本，构建核酸测序文库；以及对所得到的核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。根据本发明的一些实施例，可以采用选自Hiseq2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种对所得到的核酸测序文库进行测序。另外，根据本发明的实施例，可以对核酸样本进行筛选，富集ATP6V1B2外显子，该筛选富集可以在构建测序文库之前，构建测序文库过程中，或者构建测序文库之后进行。根据本发明的一个实施例，针对核酸样本，构建核酸测序文库进一步包括：利用ATP6V1B2基因外显子特异性引物，对核酸样本进行PCR扩增；以及针对所得到的扩增产物，构建核酸测序文库。由此，可以通过PCR扩增，富集ATP6V1B2外显子，从而能够进一步提高筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的生物样品的效率。根据本发明的实施例，ATP6V1B2基因外显子特异性引物的序列不受特别限制，根据本发明的优选实施例，这些ATP6V1B2基因外显子特异性引物具有SEQ ID NO：3-28所示的核苷酸序列。

发明人惊奇地发现，通过采用这些引物，可以在PCR反应体系中通过显著有效地完成对ATP6V1B2外显子的扩增。需要说明的是，这些SEQ ID NO：3-28所示的核苷酸序列是本发明的发明人在付出了艰苦的劳动后，意外获得的。

关于针对核酸样本，构建测序文库的方法和流程，本领域技术人员可以根据不同的测序技术进行适当选择，关于流程的细节，可以参见测序仪器的厂商例如Illumina公司所提供的规程，例如参见Illumina公司Multiplexing Sample Preparation Guide（Part#1005361;Feb2010）或Paired-End SamplePrep Guide（Part#1005063；Feb2010），通过参照将其并入本文。根据本发明的实施例，从生物样品提取核酸样本的方法和设备，也不受特别限制，可以采用商品化的核酸提取试剂盒进行。

需要说明的是，在这里所使用的术语“核酸序列”应作广义理解，其可以是在对核酸样本进行测序得到的测序数据进行组装后，得到的完整的核酸序列信息，也可以是直接采用通过对核酸样本进行测序所得到的测序数据（reads）作为核酸序列，只要这些核酸序列中含有对应ATP6V1B2的编码序列即可。

最后，在确定核酸样本的核酸序列之后，将所得到的核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1的序列相比对。如果在所得到的核酸序列中具有c.C1516T突变，则指示生物样品易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征。由此，通过根据本发明实施例的筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的生物样品的方法，可以有效地筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的生物样品。根据本发明的实施例，对核酸序列与SEQ ID NO：1进行比对的方法和设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作，根据本发明的具体实例，可以采用SOAP软件进行比对。

需要说明的是，根据本发明实施例的“筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的生物样品的方法”的用途不受特别限制，例如可以用作非诊断目的的筛选方法。

筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的生物样品的系统和试剂盒

根据本发明的第四方面，本发明提出了一种能够有效实施上述筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的生物样品的方法的系统。

参考图1，根据本发明的实施例，该筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的生物样品的系统1000包括：核酸提取装置100、核酸序列确定装置200以及判断装置300。

根据本发明的实施例，核酸提取装置100用于从生物样品提取核酸样本。如前所述，根据本发明的实施例，核酸样本的类型并不受特别限制，对于采用RNA作为核酸样本，则核酸提取装置进一步包括RNA提取单元101和反转录单元102，其中，提取单元101用于从生物样品提取RNA样本，反转录单元102与RNA提取单元101相连，用于对RNA样本进行反转录反应，以便获得cDNA样本，所得到的cDNA样本构成核酸样本。

根据本发明的实施例，核酸序列确定装置200与核酸提取装置100相连，用于对核酸样本进行分析，以便确定核酸样本的核酸序列。如前所示，可以采用测序的方法确定核酸样本的核酸序列。由此，根据本发明的一个实施例，所述核酸序列确定装置200可以进一步包括：文库构建单元201以及测序单元202。文库构建单元201用于针对核酸样本，构建核酸测序文库；测序单元202与文库构建单元201相连，用于对核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。如前所述，可以通过PCR扩增，富集ATP6V1B2外显子，进一步提高筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的生物样品的效率。由此，文库构建单元201可以进一步包括PCR扩增模块（图中未示出），在该PCR扩增模块中设置有ATP6V1B2基因外显子特异性引物，以便利用ATP6V1B2基因外显子特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增，根据本发明的具体实施例，ATP6V1B2基因外显子特异性引物具有如SEQ ID NO：3-28所示的核苷酸序列。根据本发明的实施例，测序单元202可以包括选自HISEQ2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种。由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而，提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。

根据本发明的实施例，判断装置300与核酸序列确定装置200相连，适于将核酸样本的核酸序列进行比对，以便基于核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1的区别判断生物样品是否易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征。具体地，基于核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，是否具有c.C1516T突变，判断生物样品是否易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征。如前所述，根据本发明的一个实施例，核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，具有c.C1516T突变，是生物样品易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的指示。如前所述，根据本发明的实施例，对核酸序列与SEQID NO：1进行比对的设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作，根据本发明的具体实例，可以采用SOAP软件进行比对。

由此，利用该系统，能够有效地实施前述筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的生物样品的方法，从而可以有效地筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的生物样品。

根据本发明的第五方面，本发明提出了一种用于筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的生物样品的试剂盒。根据本发明的实施例，该用于筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的生物样品的试剂盒包括：适于检测ATP6V1B2基因突变体的试剂，其中与SEQ ID NO：1相比，该ATP6V1B2基因突变体具有c.C1516T突变。利用根据本发明的实施例的试剂盒，能够有效地筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的生物样品。在本文中，所使用的术语“适于检测ATP6V1B2基因突变体的试剂”应做广义理解，即可以是检测ATP6V1B2编码基因的试剂，也可以是检测ATP6V1B2突变体多肽的试剂，例如可以采用识别特异性位点的抗体。根据本发明的一个实施例，所述试剂为核酸探针，由此，可以高效地筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的生物样品。根据本发明的一些实施例，在本发明的用于筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的生物样品的试剂盒中，所述试剂可以为具有SEQID NO：27-28所示核苷酸序列的寡核苷酸。

需要说明的是，在本文前面筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的生物样品的方法部分中所描述的特征和优点，同样适用于筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的生物样品的系统或者试剂盒，在此不再赘述。

此外，本领域技术人员可以理解，在本文中所使用的术语“核酸序列”，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了描述方便，在本说明书和权利要求书中，多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。具体地，例如，在本文中所使用的表达方式“核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，具有c.C1516T突变是所述生物样品易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的指示”，其中所述的“核酸样本的核酸序列”包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测与其互补的另一条链，反之亦然。并且，在本文中，“核酸序列”包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种形式的序列，则意味着另一种形式的序列也被公开。例如，公开了ATP6V1B2基因的cDNA序列，实际也就公开了其相应的RNA序列。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均与首次标明的内容相同。

实施例1全外显子组测序确定致病基因及突变位点

样本收集：

发明人2011年收集到两个中国DDOD综合征家系。此两家系的先证者具有高度一致的表型：先天性极重度感音神经性耳聋、双足趾甲缺如，双手拇指及小指指甲缺如，双手食指、中指、无名指指甲发育不良（指甲软化、中央凹陷），双手小指第三指骨未发育。两先证者智力发育正常，牙齿发育正常。两家系分别来自吉林和山西，久居当地，确无血亲关系。吉林家系先证者，女性，2岁11个月；山西家系先证者，男性，4岁1个月。

将上述收集的两个中国DDOD综合征家系的成员的基因组DNA样本进行全外显子基因组测序及数据分析，具体步骤如下：

首先，发明人用NimbleGen SeqCap EZ Human Exome Library v2.0全外显子捕获平台结合Illumina Hiseq2000的高通量测序技术对2名患者及其父母的外显子组序列进行了测序，具体如下：

1）文库构建及测序

将各基因组DNA样本随机打断成250-300bp左右的片段，随后按照制造商提供的操作说明书，在片段两端分别连接上接头制备文库（可参见：http://www.illumina.com/提供的Illumina/Solexa标准建库说明书，通过参照将其全文并入本文）。文库经纯化后经过Ligation-mediated PCR(LM-PCR)的线性扩增与捕获试剂进行杂交富集，再经过LM-PCR的线性扩增，文库检测合格后即可上机测序，以便获得原始测序数据。其中，测序平台为IlluminaHiseq 2000，读取长度为90bp，每个样本的平均测序深度最少为100×。

2）变异检测、注释及数据库比较

利用Illumina basecalling Software1.7对上述获得的原始测序数据进行处理，并经过过滤去污染后，使用SOAPaligner2.20（可参见：Li R,LiY，Kristiansen K,et al，SOAP:shotoligonucleotide alignment program.Bioinformatics 2008,24(5):713-714；Li R,Yu C,Li Y，ea al,SOAP2:an improved ultrafast tool for short read alignment.Bioinformatics 2009,25(15):1966-1967.，通过参照将其全文并入本文）比对到参考基因组，以便获得比对到基因组上的Unique mapped reads。然后利用SOAPsnp(可参见：Li R,Li Y，Fang X,Yang H,et al,SNP detection for massively parallel whole-genome resequencing.Genome Res 2009,19(6):1124-1132.，通过参照将其全文并入本文)确定靶区域的基因型。

结果，发明别人在病例1中发现有118463个单核苷酸多态性（SNPs）和7143处的插入/缺失，在病例1的父亲中发现有114541个单核苷酸多态性（SNPs）和7457处的插入/缺失，在病例1的母亲中发现有117294个单核苷酸多态性（SNPs）和7564处的插入/缺失。在病例2中发现有110169个单核苷酸多态性（SNPs）和7365处的插入/缺失，在病例2父亲中发现有110385个单核苷酸多态性（SNPs）和7371处的插入/缺失，在病例2母亲发现有111988个单核苷酸多态性（SNPs）和7416处的插入/缺失。随后，发明人通过dbSNP数据库（http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/snp132.txt.gz.）、HapMap数据库（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/hapmap）、千人基因组数据库（ftp://ftp.1000genomes.ebi.ac.uk/vol1/ftp）和炎黄数据库（http://yh.genomics.org.cn/）等公共数据库对上述得到的结果（检测出的变异）进行比较和过滤，去掉所有已知变异。

文献报道DDOD为显性遗传，而发明人的家系小，每个家系只有1人患病，除考虑显性遗传新生突变致病外，不能除外隐性遗传模式致病的可能性，因此在过滤完公共数据库后，又按显性遗传、隐性遗传两种模式分别进行了生物信息学分析。

综合考虑测序质量和生物信息学分析结果，以及SIFT软件对氨基酸突变有害性的预测，发明人将每个家系的1名先证者及其父母的测序结果进行排序，再用优选基因与内耳表达文库（可参见：http://www.bwh.partners.org/Research/labs/BWH_Hearing/Cochlear_ESTs.aspx?sub=0，通过参照将其全文并入本文）中存在的基因进行比对，选取交集。两个家系，按隐性遗传模式分析外显子组测序结果，可锁定9个基因在内耳有表达；按显性遗传模式分析，可锁定13个基因在内耳有表达。进一步，对上述在内耳表达的22个基因的30个变异进行分析，发现在显性遗传模式中，两名先证者均携带ATP6V1B2基因新生无义突变C1516T（R506X）和ACTG1基因错义突变T458G（M153R）。如按隐性遗传模式分析，两名先证者均携带C13orf40、COL12A1、ZNF271基因复合杂合变异，但无共同的变异位点。

考虑到两先证者高度一致的表型，发明人优先对ATP6V1B2基因和ACTG1基因进行Sanger测序验证，结果确认两名先证者均携带ATP6V1B2基因新生无义突变C1516T（R506X），其父母均未携带该突变，测序结果见图2；先证者及其父母均未携带ACTG1基因T458G（M153R）变异，因此考虑外显子组测序结果中ACTG1基因变异为假阳性。而ATP6V1B2基因新生无义突变C1516T（R506X）与先证者表型共分离。由此，初步判定ATP6V1B2基因新生无义突变——C1516T（R506X）为常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征患者的致病原因（表1）。

表1.所有DDOD综合征患者的基因突变位点

病例	年龄	性别	家族史	基因突变（核苷酸）	蛋白改变(氨基酸)
						1	3岁	女	无	ATP6V1B2c.1516C→T	R506X
2	4岁	男	无	ATP6V1B2c.1516C→T	R506X

实施例2Sanger法测序验证（家系内、家系外、散发等样本验证情况）

采集实施例1中的2例DDOD综合征患者及其父母的外周血，利用白细胞裂解法抽提各外周血白细胞中的基因组DNA，并利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所得的每个标本基因组DNA的OD260/OD280均位于1.7-2.0之间，浓度不少于200ng/μL，总量不少于30μg。

然后，分别对2名患者、4名家系内正常人（即该2例患者的父母，他们均未发病）进行检测，针对ATP6V1B2基因所有外显子序列设计引物，通过PCR扩增，产物纯化，测序的方法获得ATP6V1B2基因有关序列，根据序列测定结果属于突变型还是野生型，验证ATP6V1B2与DDOD综合征之间相关性。此外，发明人还针对突变位点（ATP6V1B2，c.C1516T）对1053名家系外正常人以限制性内切酶分析的方法进行检测，以作为实验的对照。具体方法步骤如下：

1、DNA提取：

分别采取2名家系内患者、4名家系内正常人和1053名家系外正常人外周静脉血按照实施例1的方法提取基因组DNA，分光光度计测定DNA含量。

2、测序引物设计及PCR反应

参考人类基因组序列数据库GRCh37/hg19设计ATP6V1B2基因外显子特异性引物，具体见下表。

a)引物序列：

b)接着，按以下配比分别配置各基因组DNA样本的PCR反应体系：

反应体系：50μL

c)然后，将各PCR反应体系按照以下反应条件分别进行PCR反应：

反应条件：

由此，获得2名家系内患者、4名家系内正常人和1053名家系外正常人的PCR扩增产物。

3、将步骤2中获得的获自2例DDOD综合征患者、4名家系内正常人的的PCR扩增产物直接进行DNA测序；以TaqⅠ酶对1053名家系外正常人的PCR扩增产物进行突变位点的限制性内切酶分析。其中，对1053名家系外正常人的PCR扩增产物进行限制性内切酶分析的步骤如下：

（1）酶切引物设计及PCR反应

a)引物序列如下所示：

酶切	上游引物(5’→3’，SEQ ID NO：)	下游引物(5’→3’，SEQ ID NO：)
				5'AGTTGGAAGTCATTTGCATTTAT3'(29)	5'TGCAAAAGGAATAAAGAAAACA3'(30)

b)按以下配比分别配置各家系外正常人的PCR扩增产物的酶切PCR反应体系，并进行酶切PCR：

酶切PCR反应体系：50μL

由此，获得各家系外正常人的酶切PCR产物。

c）接着，按以下配比分别配置各家系外正常人的酶切PCR产物的酶切反应体系：

酶切反应体系：50μL

d）然后，将各酶切反应体系按照以下反应条件分别进行酶切反应：

酶切反应条件：

由此，获得酶切反应产物。

然后，将各家系外正常人的酶切反应产物于65摄氏度下进行温育1小时后，利用3%琼脂糖凝胶对其进行电泳分析，结果表明1053个家系外正常人中均没有ATP6V1B2，c.C1516T突变。

由结果可知，在患者家族成员中对ATP6V1B2基因所有编码序列及侧翼序列进行突变排查，所有未受累的家族成员均不带有类似突变（是指1516C→T（R506X）突变）。并且，1516C→T（R506X）突变在两个家系中基因型表型共分离。同时，发明人在1053个家族外（同种族比更有说服力，因为他们的基因背景相似）无关正常对照中排查未发现类似突变。

综上，发明人收集到的2例DDOD综合征病例均在ATP6V1B2基因中检测到相同的新生杂合性错义突变位点（ATP6V1B2，c.C1516T）。同时发明人所发现的突变位点在家族正常人及1053例同种族无关正常对照中均未能检测到，提示所检测到的位点很可能并非SNP。同时ATP6V1B2基因的c.C1516T（R506X）突变的在不同物种的同种蛋白中均高度保守，因此，发明人认为ATP6V1B2基因为DDOD综合征的致病基因。

目前发明人从遗传学上证实ATP6V1B2基因为DDOD综合征的致病基因，迄今检索尚未见ATP6V1B2基因与DDOD综合征相关的报道。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种分离的编码ATP6V1B2突变体的核酸，其特征在于，与SEQ ID NO：1相比，所述核酸具有c.C1516T突变，

任选地，所述核酸为DNA。

2.一种分离的多肽，其特征在于，与SEQ ID NO：2相比，所述分离的多肽具有p.R506X突变，

任选地，所述多肽是由权利要求1所述的核酸编码的。

3.一种筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的生物样品的方法，其特征在于，包括以下步骤：

从所述生物样品提取核酸样本；

确定所述核酸样本的核酸序列；

所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，具有c.C1516T突变是所述生物样品易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的指示，

任选地，所述生物样品为选自人体血液、皮肤、毛发和肌肉的至少一种，

任选地，所述核酸样本为全基因组DNA。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，从所述生物样品提取核酸样本进一步包括：

从所述生物样品提取RNA样本，优选所述RNA样本为mRNA；以及

基于所述RNA样本，通过反转录反应，获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样本。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，确定所述核酸样本的核酸序列进一步包括：

针对所述核酸样本，构建核酸测序文库；以及

对所述核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果，任选地，采用选自Hiseq2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种对所述核酸测序文库进行测序，

任选地，针对所述核酸样本，构建核酸测序文库进一步包括：

利用ATP6V1B2基因外显子特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增；以及

针对所得到的扩增产物，构建所述核酸测序文库，

任选地，所述ATP6V1B2基因外显子特异性引物具有如SEQ ID NO：3-28所示的核苷酸序列。

6.一种筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的生物样品的系统，其特征在于，包括：

核酸提取装置，所述核酸提取装置用于从所述生物样品提取核酸样本；

核酸序列确定装置，所述核酸序列确定装置与所述核酸提取装置相连，用于对所述核酸样本进行分析，以便确定所述核酸样本的核酸序列；

判断装置，所述判断装置与所述核酸序列确定装置相连，以便基于所述核酸样本的核酸序列与SEQ ID NO：1相比，是否具有c.C1516T突变，判断所述生物样品是否易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征。

7.根据权利要求6所述的系统，其特征在于，所述核酸提取装置进一步包括：

RNA提取单元，所述RNA提取单元用于从所述生物样品提取RNA样本；以及

反转录单元，所述反转录单元与所述RNA提取单元相连，用于对所述RNA样本进行反转录反应，以便获得cDNA样本，所述cDNA样本构成所述核酸样本。

8.根据权利要求6所述的系统，其特征在于，所述核酸序列确定装置进一步包括：

文库构建单元，所述文库构建单元用于针对所述核酸样本，构建核酸测序文库；以及

测序单元，所述测序单元与所述文库构建单元相连，用于对所述核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果，

任选地，所述文库构建单元进一步包括：

PCR扩增模块，所述PCR扩增模块中设置有ATP6V1B2基因外显子特异性引物，以便利用ATP6V1B2基因外显子特异性引物，对所述核酸样本进行PCR扩增，

任选地，所述ATP6V1B2基因外显子特异性引物具有如SEQ ID NO：3-28所示的核苷酸序列，

任选地，所述测序单元包括选自HISEQ2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种。

9.一种用于筛选易感常染色体显性遗传先天性耳聋伴甲发育不良综合征的生物样品的试剂盒，其特征在于，含有：

适于检测ATP6V1B2基因突变体的试剂，其中与SEQ ID NO：1相比，所述ATP6V1B2基因突变体具有c.C1516T突变，

任选地，所述试剂为具有SEQ ID NO：27-28所示核苷酸序列的寡核苷酸。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂为核酸探针。

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