CN104561016B

CN104561016B - 先天性白内障pitx3基因新突变

Info

Publication number: CN104561016B
Application number: CN201410842834.7A
Authority: CN
Inventors: 周青; 刘辉; 谌于蓝; 朱健生; 管李萍; 姚登攀
Original assignee: Anhui Women And Child Health Care Hospital; BGI Shenzhen Co Ltd
Priority date: 2014-12-29
Filing date: 2014-12-29
Publication date: 2020-01-21
Anticipated expiration: 2034-12-29
Also published as: CN104561016A

Abstract

本发明涉及疾病相关突变基因领域，特别是遗传疾病基因突变，先天性白内障相关基因突变，更特别是先天性白内障相关PITX3基因突变、其检测方法及其用途。具体而言，本发明公开了具有如下的突变PITX3基因或蛋白：c.608delC/p.A203fs。

Description

先天性白内障PITX3基因新突变

技术领域

本发明涉及疾病相关突变基因领域，特别是遗传疾病基因突变，先天性白内障相关基因突变。

背景技术

任何因素引起的晶状体混浊使其透明性下降都可以称为白内障(cataract),估计全球约25％的人患有白内障，大多数人晶状体混浊较少，没有明显地影响视力。但白内障仍是全球第一位致盲的眼病，每年新增加的白内障盲人或视残患者有125万人。白内障根据发病年龄分为先天性白内障(congenital cataract,CC)和老年性白内障(age-relatedcataract)。先天性白内障是指出生前即存在、或出生后逐渐形成的在出生后一年内发生的晶体部分或全部混浊。虽然先天性白内障不如老年性白内障常见，可它却是儿童常见的眼病,在我国新生儿中患病率为0.01％-0.06％，占儿童致盲眼病的第2位。先天性白内障由于在胚胎期晶状体代谢异常而导致其自身透明度下降，任何参与、影响晶状体发育的基因突变都可能导致先天性白内障的发生。

先天性白内障既可独立发病，也可作为眼部或全身其它系统先天性病变综合征的一部分，发病机制十分复杂，其中约1/3为遗传性因素。绝大多数先天性白内障是单基因遗传病，其遗传方式包括常染色体显性遗传(autosomal dominant congenital cataract，ADCC)，常染色体隐性遗传(autosomal recessive congenital cataract，ARCC)和X连锁遗传(X-linked congenital cataract，XLCC)三种。其中以ADCC最为常见，外显率高，研究相对集中。此外，少数先天性白内障可能与染色体结构异常或线粒体病有关。

随着分子遗传学的发展，迄今为止已报道了26个基因及超过40个基因位点与先天性白内障发病相关。包括晶状体蛋白(CRYAA，CRYAB，CRYBA1/A3，CRYBB1，CRYBB2，CRYGC，CRYGD)、缝隙连接蛋白(GJA8，GJA3)、主要内源性蛋白(MIP)、细胞骨架蛋白(BFSP2)和转录因子(PITX3，HSF4和MAF)等。

先天性白内障因晶状体混浊的部位、形态和程度不同，形态学表现各异。常见的有绕核性白内障(perinuclear cataract)又称板层白内障(lamellar cataract)、核性白内障(nuclear cataract)、前极白内障(anterior pole cataract)、后极白内障(posteriorpolecataract)、粉尘状白内障(pulverulent cataract)、点状白内障(punctatecataract)、膜性白内障(membrane cataract)、盘状白内障(disciform cataract、Coppockcataract)、缝状白内障(sutural catatract)、珊瑚状白内障(coralline cataract)、花冠状白内障(coronal cataract)以及全白内障(total cataract)等表型。资料显示先天性白内障具有高度的遗传异质性：表型相同的先天性白内障可能是由不同基因突变或相同基因的不同突变造成的，而同一基因的相同或不同突变可有不同的临床表现，可能与其它修饰基因或环境因素有关。先天性白内障表型和基因型的关系，至今仍不明确。还有许多定位后未发现致病基因和许多候选基因没有在人类得到证实。

由于先天性白内障在早期即可以发生剥夺性弱视，因此其治疗又不同于一般成人白内障。目前对该病的治疗以手术为主，虽然手术的方式和技巧在不断的改进，但由于儿童的眼睛结构解剖特点和对手术的反应情况与成人有很大差别，手术并发症和后遗症的机率要高得多。例如：后发性白内障，晶体瞳孔夹持，继发性青光眼等，且术后不可逆性弱视、无晶体眼高度远视的屈光状态和人工晶体眼无调节的屈光状态都对患者有很大的影响，而且手术治疗，费用昂贵。因此先天性白内障的治疗仍是眼科的难题。通过先天性白内障致病机制的研究，寻找基因突变中的致病机理，探索一种简捷有效的药物治疗途径，攻克人类第一大眼病，对人类意义重大。

全外显子组测序是利用特制的DNA序列探针将全基因组中的外显子区域捕获下来，然后针对每个外显子进行深度测序的技术，与传统的连锁分析、候选基因关联分析技术相比，外显子组测序技术针对基因组内编码蛋白质的外显子区域，目标集中，测序深度和精度更高。2009年，美国Sarah B Ng等人利用外显子组测序成功定位出mile综合症的基因DHODH。我国Wang等人利用外显子组测序发现了小脑共济失调的新的突变基因TGM6。近期，随着外显子组测序技术的广泛应用，一批新的致病突变基因被相继发现，极大地推动了相关疾病及治疗措施的研究进展。

确定新的先天性白内障相关基因的致病突变，对开展先天性白内障的分子诊断具有重要意义。

发明内容

本发明采用新一代的全外显子组测序技术，针对一个中国汉族常染色体显性遗传的先天性白内障患病家系进行了全部外显子区域的高通量测序，结合生物信息分析发现PITX3基因上的c.608delC(p.A203fs)突变与先天性白内障(CC)有关，并通过共分离实验等方法验证了这一变异，将会为CC发病机制的研究奠定重要基础，也有可能为CC患者治疗提供全新的理论依据，丰富和完善CC疾病的诊断流程，从而对CC患者的临床诊断提供更多的支持和参考，为开发有效的早期致病基因筛查和干预治疗措施提供科学依据。

因此，本发明涉及先天性白内障基因的突变，具体为：PITX3基因上的c.608delC/p.A203fs。

在第一方面，本发明涉及先天性白内障的生物标记物，即PITX3的突变，所述生物标记物是具有如下的突变PITX3基因或蛋白：c.608delC/p.A203fs。

在一个实施方案中，本发明的突变PITX3基因为具有以下突变的SEQ ID NO:3：c.608delC，突变的PITX3基因的cDNA编码区序列为SEQ ID NO:3的序列表示。

在一个实施方案中，本发明的突变PITX3蛋白为具有以下突变的SEQ ID NO:4：p.A203fs，突变的PITX3蛋白为SEQ ID NO:4的序列表示。

在一个实施方案中，本发明还涉及包含突变PITX3基因的构建体或重组细胞，所述突变是：c.608delC，例如所述突变PITX3基因为SEQ ID NO:3。

在第二方面，本发明涉及一种检测先天性白内障的方法，所述方法包括检测受试者的PITX3基因或蛋白中是否存在突变位点，如果有突变位点，则所述受试者被鉴定为患有先天性白内障，或者其后代会患有先天性白内障或易患先天性白内障，所述突变为c.608delC/p.A203fs。

在一个实施方案中，PITX3基因的cDNA编码区序列为SEQ ID NO:1的序列表示，突变的PITX3基因的cDNA编码区序列为SEQ ID NO:3的序列表示。

在一个实施方案中，PITX3蛋白为SEQ ID NO:2的序列表示，突变的PITX3蛋白为SEQ ID NO:4的序列表示。

在一个实施方案中，本发明的检测先天性白内障的方法包括如下引物扩增的步骤：

SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；

在一个实施方案中，本发明的检测先天性白内障的方法中检测突变位点通过选自如下的技术进行：测序、电泳、核酸杂交、PCR、逆转录酶链反应和变性高效液相色谱，基于荧光标记技术的DNA测序。

在本发明第二方面的方法中，优选检测PITX3基因的突变c.608delC(即PITX3蛋白的突变p.A203fs)。

在第三方面，本发明涉及一种突变PITX3基因的筛选系统，所述筛选系统包括检测受试者的PITX3基因(蛋白)中是否存在PITX3基因的突变c.608delC(即蛋白的突变p.A203fs)。

在一个实施方案中，PITX3基因为SEQ ID NO:1的序列表示，突变的PITX3基因的cDNA编码区序列为SEQ ID NO:3的序列表示。

在一个实施方案中，本发明的突变PITX3基因的筛选系统包括如下引物：

SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。

在一个实施方案中，本发明的检测突变PITX3基因的方法中检测突变位点通过选自如下的技术进行：测序、电泳、核酸杂交、PCR、逆转录酶链反应和变性高效液相色谱,基于荧光标记技术的DNA测序。

在第四方面，本发明涉及通过PCR检测突变PITX3基因中使用的引物对，所述突变是PITX3基因的突变c.608delC(即蛋白的突变p.A203fs)。

其中所述引物对分别基于选自如下的位置在基因组序列或cDNA编码区序列上前后设计，使得扩增该位置：PITX3基因cDNA编码区序列第608位。

在第五方面，本发明涉及与突变PITX3基因互补的核酸探针，所述突变是PITX3基因的突变c.608delC。

所述探针与突变PITX3基因的互补区包括选自如下的基因组序列或cDNA编码区序列上的位置：PITX3基因cDNA编码区序列第608位。

在第六方面，本发明涉及检测突变PITX3基因的试剂盒，包含一组或多组引物对，其中所述突变是PITX3基因的突变c.608delC(即蛋白的突变p.A203fs)。

其中所述引物对分别基于选自如下的位置在基因组序列或cDNA编码区序列上设计，使得其扩增产物涵盖该位置：PITX3基因cDNA编码区序列第608位。

在一个实施方案中，所述检测突变PITX3基因的试剂盒包括如下引物：

SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。

在第七方面，本发明涉及检测突变PITX3基因的试剂盒，包含一个或多个核酸探针，所述突变是PITX3基因的突变c.608delC。

所述探针与突变PITX3基因上包含选自如下位置的基因组序列或cDNA编码区序列上的区域互补：PITX3基因cDNA编码区序列第608位。

本发明的PITX3基因中的突变，可以用于先天性白内障的检测和诊断。本发明发现了先天性白内障相关基因的突变，对这些基因突变的检测可能用于先天性白内障患者的辅助诊断，并且可能有利于明确先天性白内障患者的分子诊断。因此，本发明的检测突变PITX3基因(蛋白)的方法可以用于诊断先天性白内障的目的，例如产前诊断、植入前遗传学诊断(PGD)、患者筛查。然而，本发明的方法并不仅限于用于诊断疾病的目的。

因此，本研究丰富了PITX3基因的致病突变谱，对开展先天性白内障的分子诊断具有重要意义。

附图说明

图1.先天性白内障家系图。空白圆形：正常女性；空白方形：正常男性；实心圆形：女性患者；实心方形：男性患者；实心带斜线：已过世患者；箭头所指为家系内先证者。

图2.CC家系患者与正常对照测序峰图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做详细说明，所述的实施例是对本发明的解释而不是限定。

实施例1

本实施例采用新一代的全外显子组测序技术，针对一个中国汉族常染色体显性遗传的先天性白内障患病家系进行了全部外显子区域的高通量测序，结合生物信息分析发现PITX3基因上的c.608delC(p.A203fs)突变与先天性白内障(CC)有关，并通过共分离实验等方法验证了这一变异。

1.样本采集

先天性白内障家系包含30个成员，其中先天性白内障患者9名(图1)。在家系中选取3位先天性白内障患者和1位正常对照作为外显子测序样本(表1)，每个样本采集外周血样品2ml，加入EDTA抗凝，-80摄氏度保存。后又收集家系内4位患者和4位正常对照个体作为二次验证样本(表2)，每位采集外周血样品2ml,加入EDTA抗凝，-80摄氏度保存。

表1.先天性白内障家系外显子测序样本基本情况表

编号	性别	民族	年龄	患病情况
					II-5	男	汉	55	患者
IV-1	男	汉	16	患者
					IV-6	女	汉	6	患者
IV-7	女	汉	5	正常

表2.先天性白内障家系验证样本基本情况表

编号	性别	民族	年龄	患病情况
					IV-2	男	汉	5	正常
III-9	女	汉	35	正常
					II-2	男	汉	60	患者
III-2	女	汉	30	患者
					III-3	女	汉	33	患者
III-11	男	汉	36	患者
					III-8	女	汉	41	正常
IV-5	男	汉	5	正常

2实验技术流程

2.1.DNA提取

采用OMEGA Blood DNA Midi Kit全血DNA提取试剂盒从外周血样品中提取DNA,所涉及试剂均由试剂盒提供，操作标准参考试剂盒说明书(http://omegabiotek.com/store/wp-content/uploads/2013/04/D3494-Blood-DNA-Midi-K it.pdf)，提取步骤如下：

(1)取2ml全血样本，加入150ul OB Protease，2.1ml Buffer BL和20ul RNase A，最大速度漩涡1分钟，彻底混匀。

(2)65摄氏度水浴15-20分钟，并在水浴过程中漩涡5次。

(3)加入2.2ml无水乙醇，最大速度漩涡30秒，彻底混匀。

(4)将3.5ml裂解液移入带过滤柱的15ml离心管，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱。

(5)将第3步剩余裂解液加入带过滤柱的15ml离心管，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱。

(6)加入3ml HB Buffer，洗涤过滤柱，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱。

(7)加入3ml DNA Wash Buffer，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱。

(8)再次加入3ml DNA Wash Buffer，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱。

(9)4000转离心15分钟，甩干过滤柱。

(10)将过滤柱移至新的15ml离心管，加入500ul 70摄氏度的Elution Buffer，室温静置5分钟，4000转离心5分钟，收集含有DNA的过滤液。

(11)再次将过滤柱移至新的15ml离心管，加入500ul 70摄氏度的ElutionBuffer，室温静置5分钟，4000转离心5分钟，收集含有DNA的过滤液。

2.2.外显子捕获与测序

我们收集到一个先天性白内障家系，主要表现为出生时眼内白内障，视力低下或完全丧失，家族中疾病呈常染色体显性遗传。我们挑选了表1的三名患者和一名正常对照进行外显子组测序及数据分析，具体做法如下。

首先，发明人用NimbleGen SeqCap EZ Exome(71M)全外显子捕获平台，结合高通量测序技术，对上述这个CC患者家系中的4个样本均进行了全外显子捕获测序，具体步骤如下：

(1)样品制备

分别取上述CC家系中3名患者和1名正常对照的外周血，利用上述2.1所示方法抽提基因组DNA，并利用分光光度计及凝胶电泳法测量DNA的浓度及纯度，所得的每个标本基因组DNA的OD260/OD280均位于1.7-2.0之间，浓度不少于200ng/μl，总量不少于30μg，备用。

(2)文库构建及测序

利用自适应高聚焦超声技术(Covaris)将各基因组DNA样本随机打断成150-200bp左右的片段，随后按照制造商提供的操作说明书，在片段两端分别连接上接头制备文库(可参见：http://www.illumina.com/提供的Illumina/Solexa标准建库说明书，通过参照将其全文并入本文)。文库经纯化后经过Ligation-mediated PCR(LM-PCR)的线性扩增与捕获试剂NimbleGen SeqCap EZ Exome(71M)array进行杂交富集，再经过LM-PCR的线性扩增，文库检测合格后即可上机测序，以便获得原始测序数据。其中，参照Illumina标准的成簇和测序的protocol进行测序，测序平台为Illumina Hiseq2000，读取长度为90bp，样本的平均测序深度为100X。

(3)变异检测及注释

将上述测序产出数据依次进行初步统计分析、SNP检测和注释及氨基酸替换的预测，主要步骤如下：

①基本数据分析统计：

将测序产出数据进行基本数据分析统计：测得的序列reads长度分析、统计reads数量和数据的产量、reads序列与参考基因组序列的比对、统计目标区域比对到所要参考的基因组reads的覆盖度(Coverage)与测序深度(Depth)等。然后，根据以上基本数据的统计结果，得到通过外显子捕获的样本基本信息，并判断捕获的数据是否符合要求。

②SNP检测：

将各样本的高质量的原始reads通过SOAPaligner比对软件比对到参考基因组(hg19)上。然后，将比对到参考基因组上的reads用于后续的SNP标注等的分析。然后，利用SOAPsnp软件将SOAP aligner(Version:2.21)比对软件比对之后的reads结果进行一致序列组装，以得到每个位点的基因分型情况，进而进行SNP的检测。通过SOAPsnp软件组装可得到组装后的一致性序列CNS文件(*.cns)文件，其中包含位点的基因分型等详细信息的*.snp文件与按一定过滤标准(如深度、质量值等)进行过滤后所得到的具有高可信度的SNP结果*.snp.filter文件。其中，前述过滤的标准为：1)质量值≥20(Q20)；2)总测序深度4≤depth≤500；3)位点附近区域平均拷贝数约<2；4)相邻两个SNPs的距离≥5b。

对于最终所检测出的*.snp.fllter结果，进行注释分类，包括SNP类型、质量值、碱基位置、可信度等，最后得到包含SNP详细信息的*.gff文件。

③Indel检测：

将各样本的高质量的原始reads通过bwa比对软件比对到参考基因组(hg19)上。在允许存在gap的情况下比对到参考基因组上的reads用于后续的Indel的分析。然后，将Bwa(Version:0.5.9-r16)比对软件比对之后的reads结果进行过滤，之后利用GATK(Version：v1.0.4705)软件对过滤后的结果进行Indel检测。其中，过滤的标准为：1)支持数≥4；2)支持indel的reads比例≥70％定义为纯合突变，否则为杂合突变。

④Sanger测序：

Sanger测序被用于验证PITX3基因上全外显子测序检出的缺失，扩增突变所在区域的PCR引物采用Primer3(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)设计。扩增的片段使用ABI3100(Applied Biosystems,Foster City,CA)遗传分析仪，采用ABI BigDyeTerminator cycle sequencing kit v3.1(Applied Biosystems,Foster City,CA)进行测序。

然后，将测序结果采用Lasergene程序包的SeqManII程序实现患者和正常人的比较。并将发现的突变在尽可能多的先证者的家庭成员中进行测序，其中的罕见突变还要在家系外正常人中进一步评估。突变采用序列变异的方式描述(HGVS:http://www.hgvs.org/mutnomen)。突变的保守性采用Phastcons_score(http://varianttools.sourceforge.net/Annotation/PhastCons)评估，错义突变的功能采用SIFT(http://sift.jcvi.org/)和Polyphen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)进行分析。剪切位点变化采用Berkeley Drosophila Genome Project(BDGP)(http://www.fruitfly.org/)进行预测。

3实验结果

全外显子组捕获测序及生物信息信息分析发现三名患者共有的变异中有27291位于编码区或者剪切位点等位置的非同义突变及2619个插入/缺失。结合已知的CC致病基因及dbSNP、千人、HapMap、YH1数据库筛选出候选的致病位点。在此基础上，为了去除外显子测序的假阳性结果，通过sanger测序的方法得到变异位置的真实序列，通过家系内的共分离实验及患者与对照本中的表型信息证明，PITX3基因上的c.608delC(p.A203fs)突变与先天性白内障有关。

野生型PITX3cDNA编码区序列(SEQ ID NO:1)：

ATGGAGTTCGGCCTGCTCAGCGAGGCAGAGGCCCGGAGCCCTGCCCTGTCGCTGTCAGACGCTGGCACTCCGCACCCCCAGCTCCCAGAGCACGGCTGCAAGGGCCAGGAGCACAGCGACTCAGAAAAGGCCTCGGCTTCGCTGCCCGGCGGCTCCCCAGAGGACGGTTCGCTGAAAAAGAAGCAGCGGCGGCAGCGCACGCACTTCACCAGCCAGCAGCTACAGGAGCTAGAGGCGACCTTCCAGAGGAACCGCTACCCCGACATGAGCACGCGCGAGGAGATCGCCGTGTGGACCAACCTCACCGAGGCCCGCGTGCGGGTGTGGTTCAAGAACCGGCGCGCCAAATGGCGGAAGCGCGAGCGCAGCCAGCAGGCCGAGCTATGCAAAGGCAGCTTCGCGGCGCCGCTCGGGGGGCTGGTGCCGCCCTACGAGGAGGTGTACCCCGGCTACTCGTACGGCAACTGGCCGCCCAAGGCTCTTGCCCCGCCGCTCGCCGCCAAGACCTTTCCATTCGCCTTCAACTCGGTCAACGTGGGGCCTCTGGCTTCGCAGCCCGTCTTCTCGCCACCCAGCTCCATCGCCGCCTCCATGGTGCCCTCCGCCGCGGCTGCCCCGGGCACCGTGCCAGGGCCTGGGGCCCTGCAGGGCCTGGGCGGGGGCCCCCCCGGGCTGGCTCCGGCCGCCGTGTCCTCCGGGGCCGTGTCCTGCCCTTATGCCTCGGCCGCCGCCGCCGCCGCGGCTGCCGCCTCTTCCCCCTACGTCTATCGGGACCCGTGTAACTCGAGCCTGGCCAGCCTGCGGCTCAAAGCCAAACAGCACGCCTCCTTCAGCTACCCCGCTGTGCACGGGCCGCCCCCGGCAGCCAACCTTAGTCCGTGCCAGTACGCCGTGGAAAGGCCCGTATGA

野生型PITX3所编码蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)：

MEFGLLSEAE ARSPALSLSD AGTPHPQLPE HGCKGQEHSD SEKASASLPG GSPEDGSLKKKQRRQRTHFT SQQLQELEAT FQRNRYPDMS TREEIAVWTN LTEARVRVWF KNRRAKWRKRERSQQAELCKGSFAAPLGGL VPPYEEVYPG YSYGNWPPKA LAPPLAAKTF PFAFNSVNVGPLASQPVFSP PSSIAASMVPSA

AAPGTVP GPGALQGLGG GPPGLAPAAV SSGAVSCPYASAAAAAAAAA SSPYVYRDPC NSSLASLRLKAKQHASFSYP AVHGPPPAAN LSPCQYAVER PV*

突变型PITX3(c.608delC)cDNA编码区序列(SEQ ID NO:3):

ATGGAGTTCGGCCTGCTCAGCGAGGCAGAGGCCCGGAGCCCTGCCCTGTCGCTGTCAGACGCTGGCACTCCGCACCCCCAGCTCCCAGAGCACGGCTGCAAGGGCCAGGAGCACAGCGACTCAGAAAAGGCCTCGGCTTCGCTGCCCGGCGGCTCCCCAGAGGACGGTTCGCTGAAAAAGAAGCAGCGGCGGCAGCGCACGCACTTCACCAGCCAGCAGCTACAGGAGCTAGAGGCGACCTTCCAGAGGAACCGCTACCCCGACATGAGCACGCGCGAGGAGATCGCCGTGTGGACCAACCTCACCGAGGCCCGCGTGCGGGTGTGGTTCAAGAACCGGCGCGCCAAATGGCGGAAGCGCGAGCGCAGCCAGCAGGCCGAGCTATGCAAAGGCAGCTTCGCGGCGCCGCTCGGGGGGCTGGTGCCGCCCTACGAGGAGGTGTACCCCGGCTACTCGTACGGCAACTGGCCGCCCAAGGCTCTTGCCCCGCCGCTCGCCGCCAAGACCTTTCCATTCGCCTTCAACTCGGTCAACGTGGGGCCTCTGGCTTCGCAGCCCGTCTTCTCGCCACCCAGCTCCATCGCCGCCTCCATGGTGCCCTCCGCCG[]GGCTGCCCCGGGCACCGTGCCAGGGCCTGGGGCCCTGCAGGGCCTGGGCGGGGGCCCCCCCGGGCTGGCTCCGGCCGCCGTGTCCTCCGGGGCCGTGTCCTGCCCTTATGCCTCGGCCGCCGCCGCCGCCGCGGCTGCCGCCTCTTCCCCCTACGTCTATCGGGACCCGTGTAACTCGAGCCTGGCCAGCCTGCGGCTCAAAGCCAAACAGCACGCCTCCTTCAGCTACCCCGCTGTGCACGGGCCGCCCCCGGCAGCCAACCTTAGTCCGTGCCAGTACGCCGTGGAAAGGCCCGTATGAGCGGCCCCGCCCGTAG

突变型PITX3(c.608delC)所编码蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)：

MEFGLLSEAEARSPALSLSDAGTPHPQLPEHGCKGQEHSDSEKASASLPGGSPEDGSLKKKQRRQRTHFTSQQLQELEATFQRNRYPDMSTREEIAVWTNLTEARVRVWFKNRRAKWRKRERSQQAELCKGSFAAPLGGLVPPYEEVYPGYSYGNWPPKALAPPLAAKTFPFAFNSVNVGPLASQPVFSPPSSIAASMVPSA

LPRAPCQGLGPCRAWAG APPGWLRPPCPPGPCPALMPRPPPPPRLPPLPPTSIGTRVTRAWPACGSKPNSTPPSATPLCTGRPRQPTLVRAST PWKGPYERPRP*

本发明对先天性白内障相关的PITX3基因上c.608delC(p.A203fs)突变进行了验证，并通过进行病例对照研究，获得结论证明。验证结果发现，其中PITX3基因上存在c.608delC(p.A203fs)新的潜在致病位点。以此为基础，可以发明一种先天性白内障检测技术，快速检测受试者是否携带有致病基因，早期筛查先天性白内障致病突变基因携带者，进而在携带者发病之前进行早期干预治疗；对有家族史等情况的患者进行夫妻双方检测，指导优生优育，在孕妇生产之前对胎儿是否罹患遗传性疾病检测；也可用于先天性白内障患者的分子诊断和鉴别。该技术具有快速、准确、高效、简便、早期诊断率高等优点，检测结果可以为早期诊断、鉴别诊断及开发治疗药物提供科学依据。

实施例2

作为对实施例1的进一步验证，提供了如下的实施例。

1样本制备

采集白内障家系中12个样本(7名患者5名对照)的外周血，利用常规酚-氯仿法抽提外周血白细胞中的基因组DNA，利用分光光度计测量DNA的浓度及纯度，所得的每个标本基因组DNA的OD260/OD280均位于1.7-2.0之间，浓度不少于200ng/ul，总量不少于30μg。

2致病突变基因检测

对12个样本(表1、表2中的7例患者5例对照)的PITX3基因缺失位点进行检测，针对这个已知基因检测出的缺失位点附近序列设计引物，通过PCR扩增，产物纯化，sanger测序的方法获得这个缺失位点附近有关序列，根据序列测定结果属于突变型还是野生型，验证这个已知基因的新突变与先天性白内障之间相关性。具体方法步骤如下：

2.1DNA提取

取家系内12个样本的外周静脉血按照上述的方法提取基因组DNA，分光光度计测DNA含量。

2.2引物设计及PCR反应

首先，参考人类基因组序列数据库GRCh37.1/hg19，采用Primer5.0分别设计得到PITX3基因外显子特异性引物，具体见下表：

接着，于96孔反应板中，分别按照以下配比配制各基因组DNA样本的PCR反应体系以及进行PCR反应。

反应体系：15μl

然后，于PerkinElmer9700热循环仪上，采用Touchdown方法将配制获得各PCR反应体系按照以下反应条件分别进行PCR反应(不同的突变位点采用相同的反应条件：

反应条件：

1)预变性：94℃5分钟；

2)前12个循环：变性94℃，30秒，

退火63℃，30秒(退火温度每个循环降0.5℃)，

延伸72℃，50秒；

3)后26个循环：变性94℃，30秒，

退火57℃，30秒，

延伸72℃，50秒；

4)最后延伸：72℃，10分钟；

5)4℃保存。

由此，获得上述各受试者的PCR扩增产物。

2.3测序：

将步骤2中获得各受试者的PCR扩增产物，采用sanger测序法进行DNA测序。

基于测序结果，对家系中12个样本PRRT2基因变异位置附近进行测序，通过家系内患者与正常个体的序列结果比较，证明PITX3基因上的c.608delC(p.A203fs)(p.R217Pfs*8)为CC的致病变异的。图2显示了患者家系内的患者以及其家系正常人对照的在PITX3上c.608delC(p.A203fs)突变位点的Sanger测序验证峰图，从峰图可以看出位点突变在患者中杂合缺失一个碱基，一半序列为野生型，一半序列有一个碱基的错位，因此出现套峰的情况，判定患者中存在杂合突变，且该突变在家系内与疾病表型共分离。

实施例3

试剂盒1：检测突变PITX3基因的试剂盒，包含一组或多组引物对，其中所述突变是PITX3基因的突变c.608delC或PITX3蛋白的突变p.A203fs，其中所述引物对分别基于选自如下的位置在基因组序列或cDNA编码区序列上设计，使得其扩增产物涵盖该位置：PITX3基因cDNA编码区序列第608位，所述检测突变PITX3基因的试剂盒包括如下引物：

SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。

试剂盒2：检测突变PITX3基因的试剂盒，包含一个或多个核酸探针，所述突变是PITX3基因的突变c.608delC，所述探针与突变PITX3基因上包含选自如下位置的基因组序列或cDNA编码区序列上的区域互补：PITX3基因cDNA编码区序列第608位。

利用上述试剂盒1检测突变PITX3基因的具体步骤为：按照实施例2的方法提取待测者DNA，以所提取的DNA为模板与上述PITX3基因的外显子特异性引物进行PCR反应，反应体系和反应条件如实施例2所示，并按照本领域常规方法对PCR产物纯化，将纯化的产物进行测序，然后基于测序序列是否具有c.608delC突变，有效地检测本发明的PITX3基因突变的生物标志物在待测者DNA中是否存在，从而能够有效地检测待测者是否易患先天性白内障。。

Claims

1.先天性白内障的生物标记物，所述生物标记物是突变PITX3基因,

所述突变PITX3基因的cDNA编码区序列为SEQ ID NO:3的序列表示。

2.先天性白内障的生物标记物，所述生物标记物是突变PITX3蛋白,

所述突变PITX3蛋白为SEQ ID NO:4的序列表示。

3.与突变PITX3基因互补的核酸探针，所述探针与突变PITX3基因的互补区包括选自如下的基因组序列或cDNA编码区序列上的位置：PITX3基因cDNA编码区序列第608位，所述突变PITX3基因的cDNA编码区为SEQ ID NO:3。

4.检测突变PITX3基因的试剂盒，包含一个或多个核酸探针，所述探针与突变PITX3基因上包含选自如下位置的基因组序列或cDNA编码区序列上的区域互补：PITX3基因cDNA编码区序列第608位，所述突变PITX3基因的cDNA编码区为SEQ ID NO:3。

5.包含突变PITX3基因的构建体或重组细胞，所述突变PITX3基因的cDNA编码区为SEQID NO:3。