CN110551812B - 一种诊断脊髓性肌萎缩症的CRISPR-Cas系统及其应用 - Google Patents

一种诊断脊髓性肌萎缩症的CRISPR-Cas系统及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种诊断脊髓性肌萎缩症的CRISPR‑Cas系统，包括Cas12。优选地，所述CRISPR‑Cas系统包括Cas12、crRNA、dsDNA和报告RNA链。同时本发明还公开了所述CRISPR‑Cas系统在制备诊断脊髓性肌萎缩症试剂盒中的用途。本发明提供的CRISPR‑Cas系统可快速对脊髓性肌萎缩症致病基因SMN1基因的突变情况进行检测，具有特异性和灵敏度高，结果可直观分析，正确率高达100％等优点，非常适用于大规模的临床样本检测。

Description

一种诊断脊髓性肌萎缩症的CRISPR-Cas系统及其应用
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种诊断脊髓性肌萎缩症的CRISPR-Cas系统及其应用。
背景技术
脊髓性肌萎缩症(Spinal Muscular Atrophy,SMA)，又称脊肌萎缩症，是常染色体隐性遗传性疾病，病理特点是脊髓前角细胞及脑干运动神经核变性，临床表现为进行性肌无力和肌萎缩，患者最终死于呼吸衰竭和肺部感染，居致死性常染色体遗传病第二位。该病在新生婴儿中的发病率约1/6000至1/10000，正常人群的携带率约1/40至1/50。按发病年龄、预后和遗传方式分为四型，儿童型有3上临床型(Ⅰ～Ⅰ型)，Ⅳ型为成人型。
研究表明，该病的主要致病基因是运动神经元存活基因1(survival motorneuron,SMN1)，定位于5号染色体长臂1区3带。SMN1基因在全身组织中普遍表达，大部分细胞可以耐受低水平的SMN蛋白，但脊髓前角细胞(脊髓运动神经元)无法耐受低水平的SMN蛋白。人类基因组存在一个和SMN1高度同源的SMN2基因，两者的外显子区域只存在两个碱基的差异，分别是7号外显子上的C/T和8号外显子上的G/A。SMN1基因的缺失会导致SMA发生，SMN2基因的缺失不导致SMA发生，但其拷贝数的多少与SMA表型的轻重呈负相关，即SMN2的拷贝数越多，产生的功能SMN蛋白也越多，病情越轻。
SMA的常规辅助检查包括肌电图、肌酸磷酸激酶、肌肉活检等，但是SMA的临床变异性大，肌电图在儿童患者易出现不配合检查，活检为有创检查，缺乏特异性易出现误诊。基因诊断能够无创检测致病基因SMN1基因的改变，可以很好地辅助SMA的诊断，用于常规检查或产前诊断。目前，用于SMA基因突变的检测的方法主要包括限制性片段长度多态性、PCR、变性高效液相色谱技术和Sanger测序等，上述方法由于自身的缺点，例如检测周期长，所需仪器昂贵和检测成本高等，并不适用于临床大规模推广使用。
发明内容
基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种诊断脊髓性肌萎缩症的CRISPR-Cas系统，其具有特异性、灵敏度和准确率高等优点，成本低，无需特殊装置，可快速检测进行SMA的诊断，非常适用于大规模的临床样本检测。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种诊断脊髓性肌萎缩症的CRISPR-Cas系统，包括Cas12。
优选地，所述CRISPR-Cas系统包括Cas12、crRNA、dsDNA和报告RNA链。
更优选地，所述crRNA序列如SEQ ID No.1所示；所述dsDNA扩增引物包括如SEQ IDNo.2所示的上游引物和SEQ ID No.3所示的下游引物；所述报告RNA链序列如SEQ ID No.4所示，且报告RNA链的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有猝灭基团。
SEQ ID No.1：5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGTAATTTCTACTAAGTGTAGATAGACAAAATCAAAAAGAAGG-3’；
SEQ ID No.2：5’-TATAAAGCTATCTATATATA-3’；
SEQ ID No.3：5’-AGGTGCTCACATTCCTTAAATTA-3’；
SEQ ID No.4：5’-TTATT-3’。
优选地，所述crRNA制备方法包括以下步骤：(1)设计并合成序列如SEQ ID No.1所示的crRNA；(2)用T7启动子转录试剂盒对步骤(1)获得的crRNA进行转录，即得所述crRNA。
优选地，所述dsDNA制备方法包括以下步骤：(1)提取待检测样本DNA，然后利用如SEQ ID No.2所示的上游引物和SEQ ID No.3所示的下游引物进行PCR扩增；(2)PCR扩增产物回收，即得所述dsDNA。
优选地，所述Cas12a为FnCas12a，本申请发明人经过研究发现，当选择FnCas12a时检测效果更好，灵敏度更高。
优选地，所述报告RNA链修饰的荧光基团为FAM，猝灭基团为BHQ，即SEQ ID No.4：5’FAM-TTATT-BHQ1 3’。
本发明还提供了所述的诊断脊髓性肌萎缩症的CRISPR-Cas系统在制备脊髓性肌萎缩症诊断试剂盒中的用途。
本发明提供的CRISPR-Cas系统可用于检测SMN1基因的突变情况，从而判断被检测者是否患脊髓性肌萎缩症，因此，可用于制备脊髓性肌萎缩症诊断试剂盒。
本发明还提供了一种脊髓性肌萎缩症诊断试剂盒，包含所述的诊断脊髓性肌萎缩症的CRISPR-Cas系统。
优选地，所述试剂盒组分在检测体系中的含量为：Cas12a 45nM、crRNA67.5nM、dsDNA 100ng、报告RNA链125nM。
优选地，所述试剂盒的检测程序为：选择报告RNA链5’端修饰的荧光基团对应的激发波长和发射波长，在酶标仪上每隔1min检测一次荧光。
本发明优选的FAM激发波长为494nm，发射波长518nm；每隔1min检测一次荧光。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明提供的CRISPR-Cas系统可快速检测样本中SMN1基因的突变情况，从而判断被检测者是否患脊髓性肌萎缩症，具有特异性和灵敏度高，结果可直观分析，正确率高达100％等优点，且成本低，无需特殊装置，非常适用于大规模的临床样本检测。
附图说明
图1为本发明所述试剂盒检测SMN1基因突变来诊断脊髓性肌萎缩症时正常人、携带者和患者样本的荧光图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
实施例1
本发明所述脊髓性肌萎缩症诊断试剂盒的一种实施例，所述试剂盒包括以下组分：FnCas12a、crRNA、dsDNA和报告RNA链；所述crRNA序列如SEQ ID No.1所示；所述dsDNA扩增引物包括如SEQ ID No.2所示的上游引物和SEQ ID No.3所示的下游引物；所述报告RNA链序列如SEQ ID No.4所示，且报告RNA链的5’端修饰有荧光基团FAM，3’端修饰有猝灭基团BHQ1。
SEQ ID No.1：5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGTAATTTCTACTAAGTGTAGATAGACAAAATCAAAAAGAAGG-3’；
SEQ ID No.2：5’-TATAAAGCTATCTATATATA-3’；
SEQ ID No.3：5’-AGGTGCTCACATTCCTTAAATTAA-3’。
SEQ ID No.4：5’FAM-TTATT-BHQ1 3’。
所述crRNA制备方法包括以下步骤：(1)设计并合成序列如SEQ ID No.1所示的crRNA；(2)用T7启动子转录试剂盒对步骤(1)获得的crRNA进行转录，即得所述crRNA。
所述dsDNA制备方法包括以下步骤：(1)提取待检测样本DNA，然后利用如SEQ IDNo.2所示的上游引物和SEQ ID No.3所示的下游引物进行PCR扩增，PCR退火温度57℃；(2)PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收。
所述试剂盒组分在检测体系中的含量为：FnCas12a 45nM、crRNA 67.5nM、dsDNA100ng、报告RNA链125nM。
所述试剂盒的检测程序为：FAM激发波长为494nm，发射波长518nm，在酶标仪上每1分钟检测一次荧光。
所述试剂盒检测SMN1基因突变来诊断脊髓性肌萎缩症时的结果判定标准(荧光收集时间为1h)如下：(1)正常人：荧光值大于50000；(2)携带者：荧光值15000～50000；(3)患者：荧光值小于15000。图1所示为典型的正常人、携带者和患者样本的荧光图。
实施例2
本实施例利用实施例1所述试剂盒对20例疑似脊髓性肌萎缩症的患者样本进行检测，同时与临床最终诊断结果进行比较。
一、检测方法
1、利用DNA提取试剂盒提取患者唾液样本的DNA，操作步骤严格按照说明书进行；
2、按实施例1所述dsDNA制备方法制备得到各样本对应的dsDNA；
3、配置如下反应体系(100uL)：FnCas12a 45nM、crRNA 67.5nM、dsDNA 100ng、报告RNA链125nM。
4、上机前37℃孵育FnCas蛋白和crRNA 10分钟，在酶标仪上每隔1分钟检测一次荧光。
二、检测结果
检测结果如表1所示：
表1 20例样本检测结果
Figure BDA0002217183170000061
Figure BDA0002217183170000071
由上述结果可知，本发明实施例1提供的试剂盒能有效实现脊髓性肌萎缩症的检测，判断标本来源于正常人、脊髓性肌萎缩症携带者还是脊髓性肌萎缩症患者，且检测结果与临床诊断结果完全一致，正确率高达100％。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 暨南大学；唐佳
<120> 一种诊断脊髓性肌萎缩症的CRISPR-Cas系统及其应用
<130> 2019-9-20
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gaaattaata cgactcacta tagggtaatt tctactaagt gtagatagac aaaatcaaaa 60
agaagg 66
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
tataaagcta tctatatata 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
aggtgctcac attccttaaa tta 23
<210> 4
<211> 5
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ttatt 5

Claims (7)

1.一种诊断脊髓性肌萎缩症的CRISPR-Cas系统，其特征在于，所述CRISPR-Cas系统包括Cas12、crRNA、dsDNA扩增引物和报告RNA链；所述crRNA序列如SEQ ID No.1所示；所述dsDNA扩增引物包括如SEQ ID No.2所示的上游引物和SEQ ID No.3所示的下游引物；所述报告RNA链序列如SEQ ID No.4所示，且报告RNA链的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有猝灭基团。
2.根据权利要求1所述的诊断脊髓性肌萎缩症的CRISPR-Cas系统，其特征在于，所述crRNA制备方法包括以下步骤：(1)设计并合成序列如SEQ ID No.1所示的crRNA；(2)用T7启动子转录试剂盒对步骤(1)获得的crRNA进行转录，即得所述crRNA。
3.根据权利要求1所述的诊断脊髓性肌萎缩症的CRISPR-Cas系统，其特征在于，所述dsDNA制备方法包括以下步骤：(1)提取待检测样本DNA，然后利用如SEQ ID No.2所示的上游引物和SEQ ID No.3所示的下游引物进行PCR扩增；(2)PCR扩增产物回收，即得所述dsDNA。
4.根据权利要求1～3任一项所述的诊断脊髓性肌萎缩症的CRISPR-Cas系统在制备脊髓性肌萎缩症诊断试剂盒中的用途。
5.一种脊髓性肌萎缩症诊断试剂盒，其特征在于，包含权利要求1～3任一项所述的诊断脊髓性肌萎缩症的CRISPR-Cas系统。
6.根据权利要求5所述的脊髓性肌萎缩症诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒组分在检测体系中的含量为：Cas12a 45nM、crRNA 67.5nM、dsDNA 100ng、报告RNA链125nM。
7.根据权利要求5所述的脊髓性肌萎缩症诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测程序为：选择报告RNA链5’端修饰的荧光基团对应的激发波长和发射波长，在酶标仪上每隔1min检测一次荧光。
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