CN107574226A - 一种基因检测探针及基因检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基因检测探针及基因检测方法。所述的基因检测探针包括灭活核酸酶蛋白、连接在灭活核酸酶蛋白上的标记分子，以及连接在灭活核酸酶蛋白上的引导RNA；所述的灭活核酸酶蛋白为灭活Cas9蛋白或灭活Cpf1蛋白。所述的基因检测方法包括将待检测基因与权利要求1所述的基因检测探针在室温下进行孵育，得到基因‑探针复合物，通过对所得的基因‑探针复合物进行信号检测，实现所述的基因检测。本发明所述的基因检测探针能够在常温下与待检测基因进行杂交，并且对待检测基因具有高度的亲和力和识别特异性，杂交速度快、灵敏度高，可实现基因的快速、准确检测。
Description
技术领域
本发明属于生化分析技术领域，具体的说，涉及一种基因检测探针及基因检测方法。
背景技术
准确、灵敏、特异性的分析生物功能分子(如核酸和蛋白)在生命科学和生物医学研究以及疾病的临床诊断领域具有十分重要的科学意义。常规的生化分析与医学诊断经历了放射学、放射免疫学、免疫光学等标志性技术的发展，近年来，逐渐过渡到分子诊断学的范畴。进入21世纪来，得益于多学科合成，核酸探针及传感技术得到了更深、更广阔的发展。比如通过发展免疫PCR(Immune-PCR)、适配体探针技术，核酸探针已经能够扩展应用到蛋白、小分子、重金属离子等的检测。通过发展多样化的核酸扩增检测技术，传统的实验室基础的核酸分子诊断逐渐走向了现场化检测的趋势。比如，基于纸平台的核酸检测技术，基于等温扩增技术的核酸分析等等。总言之，核酸探针与传感研究领域已经或即将成为一个活跃的研究领域和发展前沿，并最终在医学诊断、环境监测、农业及食品安全检测领域得以应用。
现有的核酸检测技术主要依赖于核酸扩增技术，比如PCR(聚合酶链式反应)、NASBA(核酸序列依赖性的扩增)、LAMP(环介导等温扩增)、RCA(滚环扩增)等，通过将这些扩增产物结合荧光、化学发光或者电化学发光等检测技术，可以实现高灵敏度核酸检测。然而，所有这些方法的前提是：都需要核酸杂交探针与扩增产物进行特异性杂交，然后通过检测杂交探针上标记的光学或者电化学等检测基团来反映初始扩增产物的浓度或者有无。尽管基于核酸探针杂交的检测方法已经成为基因分析的一个金标准，但其依然面临如下几个问题：1)核酸探针的杂交需要一个温度变换过程，例如通常需要对基因扩增产物加热变性，核酸变性后成两条单链，然后检测探针再和产物特异性杂交，再复性恢复到室温，因变性步骤需要有一个温度控制器，从而使得检测步骤复杂化；2)常规的核酸杂交方法通常需要高浓度的杂交探针，这是因为通常需要加入高浓度的探针，使得热力学反应平衡利于杂交的方向而不是复性的方向，此外，即使使用高浓度的探针，其杂交效率也往往很低，这是因为扩增产物的长度往往大于探针长度，从而使得核酸的复性和杂交之间产生一个竞争；3)常规的杂交方法通常比较缓慢，往往费时一小时以上，低浓度的靶基因杂交往往需要过夜反应。
CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic RepeatSequences)簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族，其序列由一个前导区(Leader)、多个短而高度保守的重复序列区(Repeat)和多个间隔区(Spacer)组成。CRISPR/Cas9复合物是一种新的DNA靶向编辑工具，其包括一个Cas9蛋白(Cas9核酸酶)和一条引导RNA(sgRNA)。其中，sgRNA负责识别外源DNA并与之杂交，而Cas9含有在氨基末端的RuvC和蛋白质中部的HNH两个独特的活性位点，在双链DNA剪切中发挥作用。sgRNA和Cas9组成复合体，识别并结合与sgRNA互补的序列，然后解开DNA双链，形成R-loop，使sgRNA与互补链杂交，另一条链保持游离的单链状态，然后由Cas9中的HNH活性位点剪切sgRNA的互补DNA链，RuvC活性位点剪切非互补链，最终引入DNA双链断裂。CRISPR/Cas9的剪切位点位于sgRNA互补序列下游邻近的PAM区(Protospacer Adjacent Motif)的5'-GG-N18-NGG-3'特征区域中的NGG位点，这种特征序列在每128bp的随机DNA序列中就重复出现一次。采用CRISPR/Cas9系统，可以方便、准确地对基因组的任何基因进行编辑和修饰，从而达成通过基因工程改造生物体的目的。此外，近期发现的CRISPR/Cpf1系统，具有与CRISPR/Cas9系统相似的DNA靶向编辑功能，并具有比Cas9更强的灵活性。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于，提供一种基因检测探针及基因检测方法，该探针能够在常温下与待检测基因进行杂交，并且对待检测基因具有高度的亲和力和识别特异性，杂交速度快、灵敏度高，可实现基因的快速、准确检测。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种基因检测探针，其包括灭活核酸酶蛋白、连接在灭活核酸酶蛋白上的标记分子，以及连接在灭活核酸酶蛋白上的引导RNA；所述的灭活核酸酶蛋白为灭活Cas9蛋白或者灭活Cpf1蛋白。
进一步地，所述的引导RNA包含待检测基因的靶向序列和核酸酶蛋白的锚定序列。
进一步地，所述的标记分子包括化学发光分子(如三联吡啶钌等)、荧光分子(如异硫氰酸荧光素FITC、酞菁类荧光分子Cy5等)、荧光量子点、荧光纳米簇、纳米金等。
本发明所述的基因检测探针的制备方法，包括以下步骤：
1)将标记分子连接到灭活核酸酶蛋白上，得到灭活核酸酶蛋白-标记分子复合物；
2)根据待检测基因的序列，合成与之靶向的引导RNA；
3)将灭活核酸酶蛋白-标记分子复合物与引导RNA进行孵育，得到灭活核酸酶蛋白-标记分子-引导RNA探针，即本发明所述的基因检测探针。
进一步地，所述的灭活核酸酶蛋白为灭活Cas9蛋白(dCas9蛋白)；所述的标记分子为三联吡啶钌-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Ru(bpy)3 2+-NHS)。
进一步地，所述三联吡啶钌-N-羟基琥珀酰亚胺酯的制备方法包括以下步骤：以顺-二氯二(2,2'-联吡啶)钌(II)和2,2'-联吡啶-4,4'-二羧酸为原料，在甲醇/水混合溶剂中进行反应，得到羧基化三联吡啶钌；随后加入六氟磷酸钠，得到三联吡啶钌六氟磷酸盐；然后加入N-羟基琥珀酰亚胺和N,N’-二环己基碳二亚胺，以DMF为溶剂进行反应，得到三联吡啶钌-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Ru(bpy)3 2+-NHS)。
进一步地，所述步骤1)具体包括：将灭活Cas9蛋白加入弱碱性的PBS缓冲液中，然后加入三联吡啶钌-N-羟基琥珀酰亚胺酯的DMF溶液，在密封、避光条件下振荡反应，然后加入甘氨酸终止反应，得到灭活Cas9蛋白-三联吡啶钌复合物(dCas9-Ru(bpy)3 2+复合物)。
进一步地，步骤2)中，所述的待检测基因为荧光蛋白GFP基因；所述引导RNA的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。
进一步地，所述步骤3)具体包括：将等浓度的灭活核酸酶蛋白-标记分子复合物与引导RNA加入PBS缓冲液中进行孵育，即得到灭活核酸酶蛋白-标记分子-引导RNA探针(dCas9-Ru(bpy)3 2+/sgRNA探针)。
一种基因检测方法，包括以下步骤：将待检测基因与本发明所述的基因检测探针在室温下进行孵育，得到基因-探针复合物，通过对所得的基因-探针复合物进行信号检测，实现所述的基因检测。
本发明所述的基因检测探针，具有搜索基因序列、靶向基因序列以及检测基因序列的功能，其能够在常温下与待检测基因进行杂交，无需进行变温杂交，无需使用温控仪器，操作简单方便；此外，其对待检测基因具有高度的亲和力和识别特异性，且杂交速度快、灵敏度高，因而能够实现快速、准确的基因检测，可广泛应用于病原微生物快速诊断、食品安全检测、环境监测等领域。其中，通过将Cas9的酶切位点定点突变，使得其酶切功能失活，能够仅应用其精确的靶向功能，实现核酸检测的技术，而避免了Cas9酶切功能对待检测基因进行剪切等不良作用。
附图说明
图1是dCas9-Ru(bpy)3 2+/sgRNA探针的合成和检测流程示意图；
图2是dCas9-Ru(bpy)3 2+/sgRNA探针与DNA-Ru(bpy)3 2+探针的检测效率比较图，其中，1为对照品，2为dCas9-Ru(bpy)3 2+/sgRNA探针，3为DNA-Ru(bpy)3 2+探针；
图3是dCas9-Ru(bpy)3 2+/sgRNA探针与DNA-Ru(bpy)3 2+探针的杂交效率比较图，其中，A为dCas9-Ru(bpy)3 2+/sgRNA探针，B为DNA-Ru(bpy)3 2+探针；1为0分钟，2为10分钟，3为20分钟，4为40分钟，5为80分钟；
图4是dCas9-Ru(bpy)3 2+/sgRNA探针与DNA-Ru(bpy)3 2+探针的检测灵敏度比较图，其中，A为DNA-Ru(bpy)3 2+探针，B为dCas9-Ru(bpy)3 2+/sgRNA探针；1为0nM，2为20nM，3为40nM，4为80nM，5为160nM。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例一：制备三联吡啶钌-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Ru(bpy)3 2+-NHS)
1、合成三联吡啶钌六氟磷酸盐(Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2)
将0.2g顺-二氯二(2,2'-联吡啶)钌(II)、0.15g 2,2'-联吡啶-4,4'-二羧酸、0.2g碳酸氢钠、32mL甲醇和8mL去离子水加入到三颈烧瓶中，安装冷凝器，在磁力搅拌下，于硅油浴中加热至80℃，并加热回流反应10小时，反应溶液逐渐由紫褐色变为橙红色。反应结束后用浓硫酸将反应溶液的pH值调至4.4，在黑暗环境下于冰浴中降温2小时，以将过量的2,2'-联吡啶-4,4'-二羧酸沉淀析出，然后抽真空过滤，收集滤液，得到羧基化三联吡啶钌滤液。向羧基化三联吡啶钌滤液中加入12.5mL浓度为0.2g/mL的六氟磷酸钠溶液，搅拌5分钟后，于冰浴中降温2小时，形成栗色沉淀物。将溶液和沉淀物转移至15mL离心管中，在4℃下以5000rmp离心5分钟，收集栗色沉淀物，冷冻干燥后得到三联吡啶钌六氟磷酸盐。
2、三联吡啶钌-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Ru(bpy)3 2+-NHS)
将0.12g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和0.23g N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)溶于2mLN,N’-二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌，在0℃冰水浴中冷却降温，然后加入0.19g三联吡啶钌六氟磷酸盐，在0℃下搅拌反应30分钟后，在室温下搅拌反应5小时，所有反应物需先经无水处理。反应结束后，在4℃下以5000rmp离心5分钟，收集上清液，冷冻干燥后，得到产物三联吡啶钌-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Ru(bpy)3 2+-NHS)。将产物置于棕色玻璃瓶中，在冷冻、干燥、避光的环境下保存备用。
实施例二：Ru(bpy)3 2+-NHS修饰灭活Cas9蛋白
将灭活Cas9蛋白(dCas9蛋白，购自上海吐露港生物科技有限公司)加入弱碱性的PBS缓冲液中，使其终浓度为7μM/L；将Ru(bpy)3 2+-NHS加入DMF溶剂中，使其终浓度为2mmol/L；然后将Ru(bpy)3 2+-NHS溶液加入dCas9蛋白溶液中，并确保Ru(bpy)3 2+-NHS与dCas9蛋白的摩尔比为20∶1，在密封、避光条件下轻微振荡反应1小时后，加入20μL浓度为2mol/L的甘氨酸，孵育15分钟，终止反应。然后用PBS缓冲液平衡该反应体系，最后用Zeba离心式脱盐柱(40kDaMWCO)过滤，除去未反应的Ru(bpy)3 2+-NHS。收集产物Ru(bpy)3 2+-NHS标记的dCas9蛋白(dCas9-Ru(bpy)3 2+复合物)，然后测量Ru(bpy)3 2+-NHS的吸收光谱，计算Ru(bpy)3 2+-NHS的标记浓度；并用BCA蛋白浓度测定方法测定标记后的dCas9蛋白的浓度。将dCas9-Ru(bpy)3 2+复合物储存于0.1％(wt/vol)的牛血清白蛋白(BSA)溶液中。
Ru(bpy)3 2+-NHS上的NHS基团能够与dCas9蛋白上的赖氨酸氨基，在弱碱性环境下发生酰胺缩合脱水反应，形成共价连接，从而能够将Rμ(bpy)3 2+共价标记到dCas9蛋白分子上。
实施例三：制备dCas9-Ru(bpy)3 2+/sgRNA探针
1、转录sgRNA
本发明设计T7转录体系进行sgRNA的转录。sgRNA序列按其功能可分为两部分：一部分用于与dCas9蛋白结合，以维持dCas9/sgRNA体系的稳定性；另一部分为靶向区，用于基因的搜索和靶向。根据目的基因的序列，设计T7启动子的下游区域，使得最终转录出来的RNA序列包含sgRNA的完整序列。
根据荧光蛋白GFP基因序列，设计一对特异性引物，如下：
正向引物：gaaattaatacgactcactatagggaaggaggacggcaacatcctgttttagagctagaaatagc；(斜体部分是T7启动子序列，下划线部分是sgRNA的GFP靶向序列)
反向引物：aaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaacttgctatttctagctctaaaac。
该引物对的正向引物包含T7启动子和20个碱基的GFP靶向序列，反向引物包含一段80个碱基的的反向寡核苷酸。通过填充PCR技术(fill-in PCR)对上述正、反向引物进行PCR扩增，所得扩增产物作为转录模板。该转录模板序列按功能可分为三个区域：分别是转录启动子区域、sgRNA的基因靶向序列以及dCas9蛋白的铆定序列。
fill-in PCR反应体系如下(25μL)：
fill-in PCR反应条件如下：95℃预变性2分钟，95℃变性20秒，60℃退火30秒，72℃延伸15秒，35个循环，最后72℃延伸10分钟。
所得的PCR产物(125bp)经纯化处理后，作为转录模板，用T7RNA聚合酶介导的转录反应体系进行转录。
转录反应体系如下(20μL)：
1×RNA聚合酶缓冲液。
转录反应条件如下：37℃下转录反应6小时。
转录得到的sgRNA经纯化后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行分析，并用超微量紫外分光光度计进行定量，随后于-80℃储存。
转录得到的sgRNA序列如下：
aaggaggacggcaacauccuguuuuagagcuagaacggaauaaaauugaacgauauaguccguuaucaacuugaaagccacggugaaagucggugcuuuu
2、制备dCas9-Ru(bpy)3 2+/sgRNA探针
取一定量的dCas9-Ru(bpy)3 2+复合物母液与一定量的sgRNA母液，分别加至PBS缓冲液中，并使dCas9-Ru(bpy)3 2+与sgRNA的浓度相等，将溶液混合均匀，孵育，得到终浓度为10nM的dCas9-Ru(bpy)3 2+/sgRNA探针。
实施例四：dCas9-Ru(bpy)3 2+/sgRNA探针在基因检测中的应用
1、荧光蛋白GFP基因的扩增
根据荧光蛋白GFP基因序列，设计一对特异性引物，对GFP基因进行PCR扩增，其中正向引物采用生物素标记，以使扩增产物的一端生物素化，可用于下游的基于链霉亲和素的分离和光学检测。该引物对序列如下：
正向引物：Biotin-atggtgagcaagggcgag；
反向引物：ttacttgtacagctcgtccatgc。
PCR反应体系如下(25μL)：
PCR反应条件如下：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸60秒，35个循环，最后72℃延伸10分钟。
2、GFP基因扩增产物与dCas9-Ru(bpy)3 2+/sgRNA产物的结合
将10μL 25pM的GFP基因扩增产物加入离心管中，加入5μL 100nM的dCas9-Ru(bpy)3 2+/sgRNA探针，补充PBS缓冲液至30μL，室温下振荡孵育10分钟，得到dCas9-Ru(bpy)3 2+/sgRNA/GFP复合物。
实施例四获得的sgRNA序列的靶向区与GFP基因的一段序列互补，并使得其识别区的下游具有一个-NGG-的PAM位点，将dCas9-Ru(bpy)3 2+/sgRNA探针与待检测的生物素化的GFP基因扩增产物在室温下进行孵育，dCas9-Ru(bpy)3 2+/sgRNA探针即可搜索GFP基因中与其互补的区域，并迅速结合，形成dCas9-Ru(bpy)3 2+/sgRNA/GFP复合物。
3、电化学发光信号检测
按照本实施例步骤2的方法，分别将浓度为0pM、1pM、5pM、25pM、125pM的GFP基因扩增产物，与dCas9-Ru(bpy)3 2+/sgRNA探针进行孵育，所得到的dCas9-Ru(bpy)3 2+/sgRNA/GFP复合物分别加入10μL浓度为100nM的链霉亲和素包被磁珠溶液，在室温下孵育20分钟，所得到的探针-基因-磁珠复合物分别加入电化学发光池进行磁珠富集、清洗，然后加入三丙胺缓冲液进行电化学发光信号检测，读取各复合物的电化学发光信号值。
按照本方法测定待测基因样品的电化学发光信号值，根据标准浓度的基因序列的电化学发光信号值进行计算，即可对待测基因样品进行定量检测。
dCas9-Ru(bpy)3 2+/sgRNA/GFP复合物中的GFP序列上含有生物素标记，其与磁珠上的链霉亲和素具有高特异性、高亲和力的相互作用，从而使dCas9-Ru(bpy)3 2+/sgRNA/GFP复合物能够快速、准确地被磁珠识别、捕获。
实施例五：效果比较
1、dCas9-Ru(bpy)3 2+/sgRNA探针与DNA-Ru(bpy)3 2+探针的检测效率比较
根据荧光蛋白GFP基因序列，设计与之靶向的DNA探针，并进行Ru(bpy)3 2+标记，获得DNA-Ru(bpy)3 2+探针。
对GFP基因进行10×103拷贝数的PCR扩增，取等量的基因扩增产物，分别与等量的dCas9-Ru(bpy)3 2+/sgRNA探针、DNA-Ru(bpy)3 2+探针进行孵育、杂交，所得产物分别进行电化学发光信号检测，检测结果如图2所示。检测结果表明，dCas9-Ru(bpy)3 2+/sgRNA探针的电化学发光强度明显高于DNA-Ru(bpy)3 2+探针的电化学发光强度，即dCas9-Ru(bpy)3 2+/sgRNA探针具有更高的检测效率。
2、dCas9-Ru(bpy)3 2+/sgRNA探针与DNA-Ru(bpy)3 2+探针的杂交效率比较
取原始拷贝数为1×103的GFP基因，分别与等量的dCas9-Ru(bpy)3 2+/sgRNA探针、DNA-Ru(bpy)3 2+探针进行孵育、杂交，分别在0分钟、10分钟、20分钟、40分钟、80分钟下测定所得产物的电化学发光信号，检测结果如图3所示。检测结果表明，dCas9-Ru(bpy)3 2+/sgRNA探针的基因杂交速度明显高于DNA-Ru(bpy)3 2+探针的基因杂交速度，即dCas9-Ru(bpy)3 2+/sgRNA探针具有更快的基因杂交速率。
3、dCas9-Ru(bpy)3 2+/sgRNA探针与DNA-Ru(bpy)3 2+探针的检测灵敏度比较
取原始拷贝数为5×103的GFP基因，分别与0nM、20nM、40nM、80nM、160nM的dCas9-Ru(bpy)3 2+/sgRNA探针、DNA-Ru(bpy)3 2+探针进行孵育、杂交60分钟，所得产物分别进行电化学发光信号检测，检测结果如图4所示。检测结果表明，在探针浓度相同、杂交时间相同的情况下，dCas9-Ru(bpy)3 2+/sgRNA探针的电化学发光强度明显高于DNA-Ru(bpy)3 2+探针的电化学发光强度，即dCas9-Ru(bpy)3 2+/sgRNA探针具有更高的检测灵敏度。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 广州博徕斯生物科技有限公司
<120> 一种基因检测探针及基因检测方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaggaggacg gcaacauccu guuuuagagc uagaacggaa uaaaauugaa cgauauaguc 60
cguuaucaac uugaaagcca cggugaaagu cggugcuuuu 100
<210> 2
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaaattaata cgactcacta tagggaagga ggacggcaac atcctgtttt agagctagaa 60
atagc 65
<210> 3
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaaagcaccg actcggtgcc actttttcaa gttgataacg gactagcctt attttaactt 60
gctatttcta gctctaaaac 80
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggtgagca agggcgag 18
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttacttgtac agctcgtcca tgc 23
Claims (10)
1.一种基因检测探针，其特征在于：包括灭活核酸酶蛋白、连接在灭活核酸酶蛋白上的标记分子，以及连接在灭活核酸酶蛋白上的引导RNA；所述的灭活核酸酶蛋白为灭活Cas9蛋白或者灭活Cpf1蛋白。
2.根据权利要求1所述的基因检测探针，其特征在于：所述的引导RNA包含待检测基因的靶向序列和核酸酶蛋白的锚定序列。
3.根据权利要求1或2所述的基因检测探针，其特征在于：所述的标记分子选自化学发光分子、荧光分子、荧光量子点、荧光纳米簇或者纳米金。
4.权利要求1所述的基因检测探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将标记分子连接到灭活核酸酶蛋白上，得到灭活核酸酶蛋白-标记分子复合物；
2)根据待检测基因的序列，合成与之靶向的引导RNA；
3)将灭活核酸酶蛋白-标记分子复合物与引导RNA进行孵育，得到灭活核酸酶蛋白-标记分子-引导RNA探针。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述的灭活核酸酶蛋白为灭活Cas9蛋白；所述的标记分子为三联吡啶钌-N-羟基琥珀酰亚胺酯。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述三联吡啶钌-N-羟基琥珀酰亚胺酯的制备方法包括以下步骤：以顺-二氯二(2,2'-联吡啶)钌(II)和2,2'-联吡啶-4,4'-二羧酸为原料，在甲醇/水混合溶剂中进行反应，得到羧基化三联吡啶钌；随后加入六氟磷酸钠，得到三联吡啶钌六氟磷酸盐；然后加入N-羟基琥珀酰亚胺和N,N’-二环己基碳二亚胺，以DMF为溶剂进行反应，得到三联吡啶钌-N-羟基琥珀酰亚胺酯。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)具体包括：将灭活Cas9蛋白加入弱碱性的PBS缓冲液中，然后加入三联吡啶钌-N-羟基琥珀酰亚胺酯的DMF溶液，在密封、避光条件下振荡反应，然后加入甘氨酸终止反应，得到灭活Cas9蛋白-三联吡啶钌复合物。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤2)中，所述的待检测基因为荧光蛋白GFP基因；所述引导RNA的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)具体包括：将等浓度的灭活核酸酶蛋白-标记分子复合物与引导RNA加入PBS缓冲液中进行孵育，即得到灭活核酸酶蛋白-标记分子-引导RNA探针。
10.一种基因检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将待检测基因与权利要求1所述的基因检测探针在室温下进行孵育，得到基因-探针复合物，通过对所得的基因-探针复合物进行信号检测，实现所述的基因检测。
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