CN103695551A - 基于聚合物电化学发光信号放大的核酸检测方法 - Google Patents

基于聚合物电化学发光信号放大的核酸检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种基于聚合物电化学发光信号放大的核酸检测方法。该方法包括如下步骤：三联吡啶钌的合成与活化、聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物的制备、DNA探针标记聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物和磁捕捉检测目标DNA序列；本发明是将基于聚合物电化学发光信号放大技术运用于核酸检测，有机多聚物（如聚赖氨酸）具有较好的物理及化学性质，可运用到电化学发光信号放大领域；本发明采用聚赖氨酸作为三联吡啶钌信号放大的连接骨架，体系稳定，不易发生聚集且容易保存；DNA探针标记的聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物性质稳定，便于修饰及储存。该方法操作简单、快速、稳定、可控，不仅适用于核酸检测，也可作为免疫分析中抗体标记的方法，以提高灵敏度。

Description

基于聚合物电化学发光信号放大的核酸检测方法
技术领域
本发明属于核酸电化学检测技术领域，特别涉及一种基于聚合物电化学发光信号放大的核酸检测方法。
背景技术
核酸电化学检测技术是重要的检测手段，广泛运用于免疫诊断、病原微生物筛查及环境监控等领域。该方法以分子生物学技术为检测基础（常利用核酸扩增技术）、以电化学发光原理为支撑，旨在于构建高灵敏度、快速及可靠的检测方法。得益于电化学发光原理的优越性，该方法具有较宽的检测范围、高灵敏度、反应体系可控及高信噪比等特点。
然而，核酸电化学检测技术以单个三联吡啶钌为发光基团。因此，建立一种多个三联吡啶钌发光基团，对于提高核酸电化学检测技术的灵敏度具有积极作用。目前，电化学发光信号的放大常采用纳米金放大技术，在单个胶体金表面标记多个三联吡啶钌发光基团，以达到提高检测灵敏度的目的。
但是，纳米金放大技术存在一些不足：（1）纳米金放大技术以巯基与金球表面形成硫-金键，反应过程复杂、耗时；（2）纳米金放大技术在探针制备时，纳米金表面常标记多个DNA探针，且不可控，导致单个纳米金球上标记上多个DNA探针，因此，不能达到理想的放大效果；（3）纳米金放大技术在标记过程，常发生纳米金聚集，标记过程不稳定且与纳米金合成的质量好坏直接相关。因此，该过程技术要求较高。终上所述，发展一种简单、快速、稳定、可控的电化学发光信号放大技术，对于核酸电化学发光检测技术具有重要意义。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种基于聚合物电化学发光信号放大的核酸检测方法。本发明是将基于聚合物电化学发光信号放大技术运用于核酸检测，通过研究发现，有机多聚物（如聚赖氨酸）具有较好的物理及化学性质，运用到电化学发光信号放大领域，将具有以下优点：（1）分子量可控，可根据实际需求，选择合适的分子量，以控制三联吡啶钌的标记量；（2）性质稳定，便于修饰及储存，操作简单；（3）标记可控，可实现聚赖氨酸与DNA探针按1:1的比例标记。该方法简单、快速、稳定、可控。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种基于聚合物电化学发光信号放大的核酸检测方法，包括以下具体步骤：
（1）三联吡啶钌的合成：
①称取：二氯双(2,2'-联吡啶)钌（Ru(bpy)2Cl2）0.05g，NaHCO30.05g，4-羧酸-2,2'-联吡啶0.0375g；
②加入10mL体积分数80%甲醇水溶液，混合液在硅油浴下回流；
③所得溶液在冰浴（冰水混合物）中冷却2h；
④用1mol/L的H2SO4将pH值调到4.4（精密pH试纸定标），形成沉淀；
⑤形成的沉淀进行过滤，收集滤液；
⑥向⑤中所得滤液中加入3.125mL NaPF6溶液（2.5g NaPF6溶于12.5mL水中），搅拌后置于4℃环境中挥发滤液，观察晶体产生；可反复加入纯甲醇，使其重结晶，收集所得结晶即为二（2,2'-联吡啶）（4-羧酸-2,2'-联吡啶）钌的二（六氟磷酸盐）（紫红色）；
（2）三联吡啶钌的活化：（称量是根据晶体量调整的）
①称取：二环己基碳二亚胺（DCC）1.1635g，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）0.5947g；
②搅拌条件下溶解于7.7568mL二甲基甲酰胺（DMF）中，然后冰浴冷却1h；
③加入0.1616g步骤（1）合成的二（2,2'-联吡啶）（4-羧酸-2,2'-联吡啶）钌的二（六氟磷酸盐），混合物冰浴搅拌混匀；
④室温下密封振荡；
⑤通过吸滤装置除去所得沉淀，滤液中含有活性的钌配合物，即活化三联吡啶钌；
（3）聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物的制备：
①取一管聚赖氨酸固体粉末离心；
②打开管盖，并加入75μL0.1M硼酸钠，调整pH值至8.5，盖上管盖；
③充分上下振荡5min，离心收集；
④加入30μL的步骤（2）⑤中所得到的活化三联吡啶钌；
⑤室温避光孵育12h；
⑥用超滤管分离除去体系中的小分子化合物；
⑦离心，倒去滤液，加入0.5mL预冷无水乙醇，放入超低温冰箱中1h,用超滤管分离除去体系中的小分子化合物；
⑧离心，倒去滤液，加入1mL预冷体积分数80%乙醇水溶液，放入超低温冰箱中1h,用超滤管分离除去体系中的小分子化合物；
⑨离心，倒去滤液，加入1mL预冷体积分数80%乙醇水溶液，放入超低温冰箱中1h,用超滤管分离除去体系中的小分子化合物；
⑩离心，将所得沉淀，加100μL水稀释，得到聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物，放入-20℃冰箱保存；
（4）DNA探针标记聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物：
该反应体系中，将聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物、DNA探针及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）混匀，调整pH值至6；避光孵育；最后，用超滤管离心除去小分子化合物；得到DNA探针标记的聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物，并用纯水保存在-20℃冰箱；
（5）磁捕捉检测目标DNA序列：
本部分以传统的磁捕捉及“sandwich”模型为基础，构建了一种以聚赖氨酸-三联吡啶钌为信号放大基团的核酸检测方法；
（Ⅰ）取生物素探针、靶序列溶解于水中，终浓度为10μM；
（Ⅱ）构建磁捕捉核酸检测体系：体系总体积为100μL，生物素探针及聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物的终浓度为100nM，PBS缓冲液的终浓度为1×，加水补充至100μL；
（Ⅲ）信号检测：将步骤（Ⅱ）的产物，放入分析仪中检测电化学发光信号。
步骤（1）②所述的回流的条件优选为80℃下回流加热10h；
步骤（1）⑤中所述的过滤优选为用滤纸过滤；
步骤（2）中所述的室温优选为20～30℃；
步骤（2）④所述的振荡的条件优选为在1500r/min下振荡5h；
步骤（3）①所述的聚赖氨酸固体粉末优选为5mg；
步骤（3）①和步骤（3）③中所述的离心的条件优选为12000r/min离心5min；
步骤（3）②和步骤（4）所述的调整pH值优选用稀盐酸调整；
步骤（3）中所述的超低温冰箱的温度优选为-60℃以下；
步骤（3）⑦、⑧、⑨、⑩中所述的离心的条件优选为在4℃下，12000rpm离心20min；
步骤（3）和步骤（4）中所述的超滤管的截留分子量优选为100KDa；步骤（3）⑤和步骤（4）中所述的避光优选为用黑胶布或锡箔纸进行避光；
步骤（4）所述的将聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物、DNA探针、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺混匀优选按照聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物：DNA探针：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺为体积比1：10：2000的比例混匀；
步骤（4）中所述的避光孵育的条件优选为37℃避光孵育12h；
步骤（5）中所述的生物素探针优选为DNA探针；
步骤（5）（Ⅲ）所述的分析仪优选为罗氏Elecsys2010电化学发光全自动免疫分析仪；
本发明相对于现有技术具有如下的优点：
（1）本发明采用聚赖氨酸作为三联吡啶钌信号放大的连接骨架，体系稳定，不易发生聚集且容易保存。
（2）本发明严格按照聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物：DNA探针=1:1的标准标记DNA探针，体系可控。
（3）本发明的DNA探针标记的聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物性质稳定，便于修饰及储存，操作简单。
（4）适用于核酸检测：该实验原理可用于DNA及RNA的检测。
（5）本发明亦可作为免疫分析中抗体标记的方法，以提高灵敏度。
附图说明
图1为聚合物/电化学发光探针的合成制备过程图。
图2为实施例1获得的活化三联吡啶钌的吸收光谱图。
图3为实施例2获得的聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物的吸收光谱图。
图4为实施例3的磁捕捉核酸检测实验数据结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1三联吡啶钌的合成及活化
（1）三联吡啶钌的合成过程如下：
①电子天平称取：二氯双(2,2'-联吡啶)钌（Ru(bpy)2Cl2）（CAS:15746-57-3）0.05g，NaHCO30.05g，2,2'-联吡啶-4,4'二羧酸（dcbpy）（CAS:6813-38-3）0.0375g于50mL圆底烧瓶中。
②加入10mL体积分数80%甲醇水溶液（MeOH），混合液在硅油浴80℃下回流加热10h。
③所得溶液在冰浴（冰水混合物）中冷却2h。
④用1mol/L的H2SO4将pH值调到4.4（精密pH试纸定标），形成沉淀。
⑤形成的沉淀用滤纸过滤，收集滤液。
⑥向⑤中所得滤液中加入3.125mL NaPF6（CAS:21324-39-0）溶液（2.5gNaPF6溶于12.5mL水中），搅拌后置于冰箱4℃环境中挥发滤液，观察晶体产生。可反复加入纯甲醇，使其重结晶，收集所得结晶即为Ru(bpy)2(dcbpy)(PF6)2（紫红色）。
（2）三联吡啶钌的活化：
①电子天平称取：（称量是根据晶体量调整的）
二环己基碳二亚胺（DCC）（CAS:538-75-0）1.1635g，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）（CAS:6066-82-6）0.5947g；
②搅拌条件下溶解于7.7568mL二甲基甲酰胺（DMF）中，然后冰浴冷却1h。
③加入0.1616g步骤（1）合成的二（2,2'-联吡啶）（4-羧酸-2,2'-联吡啶）钌的二（六氟磷酸盐），混合物冰浴搅拌混匀。
④室温下密封振荡5h。
⑤通过吸滤装置除去所得沉淀，滤液中含有活性的钌配合物，即活化三联吡啶钌；可用于标记DNA、蛋白或抗体。
将所得活化三联吡啶钌用吸收光谱去表征质量的好坏；活化三联吡啶钌在480nm处具有明显的吸收峰，实验结果如图2所示。
实施例2聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物的制备：
①取一管聚赖氨酸固体粉末（5mg）12000r/min离心5min，使粘在管壁上的聚赖氨酸固体粉末落入管底。
②轻轻的打开管盖，并迅速加入75μL0.1M硼酸钠（用稀盐酸调整pH值至8.5），立即盖上管盖。
③充分上下振荡5min，12000r/min离心5min收集，使粘在管壁上的液体落入管底。
④加入30μL实施例1得到的活化三联吡啶钌。
⑤缠上黑胶布，置离心管架上室温避光孵育12h。
⑥用超滤管（100KDa）分离除去体系中的小分子化合物。
⑦离心，12000rpm，4℃，20min。
⑧倒去橙色溶液，加入0.5mL预冷无水乙醇，放入超低温冰箱中1h，用超滤管（100KDa）分离除去体系中的小分子化合物。
⑨离心，12000rpm，4℃，20min。
⑩倒去浅黄色溶液，加入1mL预冷体积分数80%乙醇水溶液，放入超低温冰箱中1h，用超滤管（100KDa）分离除去体系中的小分子化合物。
Figure BDA0000445000440000061
离心，12000rpm，4℃，20min。
Figure BDA0000445000440000062
倒去溶液，加入1mL预冷体积分数80%乙醇水溶液，放入超低温冰箱中1h，用超滤管（100KDa）分离除去体系中的小分子化合物。
离心，12000rpm，4℃，20min，收集沉淀。
Figure BDA0000445000440000064
将
Figure BDA0000445000440000065
中的沉淀加100μL水稀释，得到聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物，放入-20℃冰箱保存。
将所得产物用吸收光谱去表征质量的好坏，实验结果如图3所示。结果显示，得到的聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物在480nm处有明显的吸收峰。
实施例3磁捕捉检测目标DNA序列：
本部分以传统的磁捕捉及“sandwich”模型为基础，构建了一种以聚赖氨酸-三联吡啶钌为信号放大基团的核酸检测方法。
（Ⅰ）取生物素探针、靶序列溶解于水中，终浓度为10μM。
（Ⅱ）构建磁捕捉核酸检测体系：体系总体积为100μL，生物素探针及聚赖氨酸的终浓度为100nM，PBS缓冲液的终浓度为1×，加水补充至100μL。
（Ⅲ）信号检测：将步骤（Ⅱ）的产物，放入罗氏Elecsys2010电化学发光全自动免疫分析仪中检测电化学发光信号，并记录数据。实验结果如图4所示。结果显示，以聚赖氨酸-三联吡啶钌为信号放大基团，电化学发光信号明显增强。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于聚合物电化学发光信号放大的核酸检测方法，其特征在于包括以下具体步骤：
（1）三联吡啶钌的合成：
①称取：二氯双(2,2'-联吡啶)钌0.05g，NaHCO30.05g，4-羧酸-2,2'-联吡啶0.0375g；
②加入10mL体积分数80%甲醇水溶液，混合液在硅油浴下回流；
③所得溶液在冰浴中冷却2h；
④用1mol/L的H2SO4将pH值调到4.4，形成沉淀；
⑤形成的沉淀进行过滤，收集滤液；
⑥向⑤中所得滤液中加入3.125mL NaPF6溶液，搅拌后置于4℃环境中挥发滤液，观察晶体产生；收集所得结晶即为二（2,2'-联吡啶）（4-羧酸-2,2'-联吡啶）钌的二（六氟磷酸盐）；
（2）三联吡啶钌的活化：
①称取：二环己基碳二亚胺1.1635g，N-羟基琥珀酰亚胺0.5947g；
②搅拌条件下溶解于7.7568mL二甲基甲酰胺中，然后冰浴冷却1h；
③加入0.1616g步骤（1）合成的二（2,2'-联吡啶）（4-羧酸-2,2'-联吡啶）钌的二（六氟磷酸盐），混合物冰浴搅拌混匀；
④室温下密封振荡；
⑤通过吸滤装置除去所得沉淀，滤液中含有活性的钌配合物，即活化三联吡啶钌；
（3）聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物的制备：
①取一管聚赖氨酸固体粉末离心；
②打开管盖，并加入75μL0.1M硼酸钠，调整pH值至8.5，盖上管盖；
③充分上下振荡5min，离心收集；
④加入30μL的步骤（2）⑤中所得到的活化三联吡啶钌；
⑤室温避光孵育12h；
⑥用超滤管分离除去体系中的小分子化合物；
⑦离心，倒去滤液，加入0.5mL预冷无水乙醇，放入超低温冰箱中1h,用超滤管分离除去体系中的小分子化合物；
⑧离心，倒去滤液，加入1mL预冷体积分数80%乙醇水溶液，放入超低温冰箱中1h,用超滤管分离除去体系中的小分子化合物；
⑨离心，倒去滤液，加入1mL预冷体积分数80%乙醇水溶液，放入超低温冰箱中1h,用超滤管分离除去体系中的小分子化合物；
⑩离心，将所得沉淀，加100μL水稀释，得到聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物，放入-20℃保存；
（4）DNA探针标记聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物：
该反应体系中，将聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物、DNA探针及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺混匀，调整pH值至6；避光孵育；最后，用超滤管离心除去小分子化合物；得到DNA探针标记的聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物，并用纯水保存在-20℃；
（5）磁捕捉检测目标DNA序列：
以传统的磁捕捉及“sandwich”模型为基础，构建了一种以聚赖氨酸-三联吡啶钌为信号放大基团的核酸检测方法；
（Ⅰ）取生物素探针、靶序列溶解于水中，终浓度为10μM；
（Ⅱ）构建磁捕捉核酸检测体系：体系总体积为100μL，生物素探针及聚赖氨酸的终浓度为100nM，PBS缓冲液的终浓度为1×，加水补充至100μL；
（Ⅲ）信号检测：将步骤（Ⅱ）的产物，放入分析仪中检测电化学发光信号。
2.根据权利要求1所述的基于聚合物电化学发光信号放大的核酸检测方法，其特征在于：步骤（4）所述的将聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物、DNA探针、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺混匀按照聚赖氨酸-三联吡啶钌复合物：DNA探针：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺为体积比1：10：2000的比例混匀。
3.根据权利要求1所述的基于聚合物电化学发光信号放大的核酸检测方法，其特征在于：步骤（2）中所述的活化三联吡啶钌用于标记DNA、蛋白或抗体。
4.根据权利要求1所述的基于聚合物电化学发光信号放大的核酸检测方法，其特征在于：步骤（5）中所述的生物素探针为DNA探针。
5.根据权利要求1所述的基于聚合物电化学发光信号放大的核酸检测方法，其特征在于：步骤（3）和步骤（4）中所述的超滤管的截留分子量为100KDa。
6.根据权利要求1所述的基于聚合物电化学发光信号放大的核酸检测方法，其特征在于：步骤（1）②所述的回流的条件为80℃下回流加热10h。
7.根据权利要求1所述的基于聚合物电化学发光信号放大的核酸检测方法，其特征在于：
步骤（1）⑥所述的NaPF6溶液是将2.5g NaPF6溶于12.5mL水中得到的；
步骤（1）⑤中所述的过滤为用滤纸过滤；
步骤（2）中所述的室温为20～30℃；
步骤（2）④所述的振荡的条件为在1500r/min下振荡5h。
8.根据权利要求1所述的基于聚合物电化学发光信号放大的核酸检测方法，其特征在于：步骤（3）①所述的聚赖氨酸固体粉末为5mg；
步骤（3）①和步骤（3）③中所述的离心的条件为12000r/min离心5min；
步骤（3）②和步骤（4）所述的调整pH值用稀盐酸调整。
9.根据权利要求1所述的基于聚合物电化学发光信号放大的核酸检测方法，其特征在于：步骤（3）⑦、⑧、⑨、⑩中所述的离心的条件为在4℃下，12000rpm离心20min。
10.根据权利要求1所述的基于聚合物电化学发光信号放大的核酸检测方法，其特征在于：步骤（3）⑤和步骤（4）中所述的避光为用黑胶布或锡箔纸进行避光；
步骤（4）中所述的避光孵育的条件为37℃避光孵育12h；
步骤（5）（Ⅲ）所述的分析仪为罗氏Elecsys2010电化学发光全自动免疫分析仪。
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