CN107759799B - 一种三联吡啶钌-赖氨酸聚合物固相合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种三联吡啶钌‑赖氨酸聚合物固相合成方法，包括以下过程：将合成原料包含有赖氨酸的第一反应底物经过固相预处理过程，得到硫醇化的单体，再将硫醇化的单体与金基质固定，此为第二反应底物，第二反应底物在去氨基保护后与第一反应底物发生固相聚合过程，形成固定聚合物后，固定聚合物脱落金基质，得到目标产物，目标产物经过产物纯化过程即为三联吡啶钌‑赖氨酸聚合物。本发明首创了一种基于固相合成原理合成三联吡啶钌‑赖氨酸聚合物的方法，通过改变赖氨酸氨基保护位置，获得了线性或者树状聚合物。所得三联吡啶钌‑赖氨酸聚合物的聚合度可调，而且发光强度稳定均一，为基于电化学发光原理的衡量分析方法提供有力的发光强度支持。

Description

一种三联吡啶钌-赖氨酸聚合物固相合成方法
技术领域
本发明属于电化学发光聚合物合成技术领域，特别涉及一种三联吡啶钌-赖氨酸聚合物固相合成方法。
背景技术
作为一种被广泛应用的电化学发光基团，三联吡啶钌分子在免疫分析及分子诊断领域发挥着日益重要的作用。然而，单个的三联吡啶钌分子无法为痕量分析技术提供足够的发光强度支持。因此，开发新型的具有电化学放大功能的线性三联吡啶钌聚合物具有重要意义。申请人前期受聚赖氨酸聚合物启发，构建了一种线性三联吡啶钌聚合的合成方法，并将其成功的运用于肿瘤分子诊断领域，现已获得授权(ZL)。但该方法所得产物聚合度无法做到绝对均一，波动范围较宽，无法得到单体数目均一的产物，从而出现发光强度不一致的现象，为了使线性三联吡啶钌聚合物在分子诊断、生物分析相关领域得到更好的应用及推广，申请人开发了一种分子量均一可控、自动化的线性三联吡啶钌聚合物合成方法。
发明内容
为了解决现有技术的缺点与不足，本发明在于提供一种电化学发光性能稳定、分子量可控的一种三联吡啶钌-赖氨酸聚合物固相合成方法，为电化学发光相关分子诊断及生物分析方法提供了有效的信号给出基团。
本发明的目的通过以下技术方案实现：线性三联吡啶钌-赖氨酸聚合物固相合成方法包括合成反应过程、固相预处理过程、固相聚合过程以及产物纯化过程，如图1所示，其具体过程如下：
合成反应过程：三联吡啶钌-赖氨酸单体的合成由羧基活化的三联吡啶钌(TBR)和单一氨基保护的赖氨酸通过酰胺键形成稳定连接而实现，此为第一反应底物。羧基活化三联吡啶钌和单一氨基保护的赖氨酸摩尔比为1:1，反应条件为37℃过夜孵育搅拌12h。
固相预处理过程包括单体的硫醇化和单体链端的固定。单体的硫醇化通过以下两个步骤实施：
第一步，单体羧基活化：三联吡啶钌-赖氨酸单体和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的摩尔比为1:10～1:100，优选为1:100，在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的催化条件下，60℃搅拌孵育1h。
第二步，单体的硫醇化：羧基活化的三联吡啶钌-赖氨酸单体与氨基乙硫醇之间通过酰胺键连接，二者反应的摩尔比为1:1。
单体链端的固定：采用金-硫键连接硫醇化的三联吡啶钌-赖氨酸单体和金基质，此为第二反应底物。第二反应底物通过金-硫键连接使后续的延伸过程、终止过程以及纯化过程得以简化。
固相聚合过程：固相合成的聚合以固定后的单体链端为起始，通过程序化控制，使三联吡啶钌-赖氨酸单体逐个聚合形成线性链，主要过程包括氨基去保护过程、聚合过程和终止过程：
氨基去保护过程：向第二反应底物中加入反式脂肪酸(TFA)溶液，搅拌反应五分钟后，用双蒸水清洗，得到氨基去保护的第二反应底物。第二反应底物的链端被Boc氨基保护，能够通过加入反式脂肪酸(TFA)定点打开和封闭，从而实现精确的分子间连接。
聚合过程：去氨基保护的第二反应底物与第一反应底物通过酰胺键实现连接。去氨基保护的第二反应底物中的氨基与第一反应底物末端的羧基通过脱水缩合生成酰胺键，从而完成一个单体的链接，生成三联吡啶钌-赖氨酸二聚物，三联吡啶钌-赖氨酸二聚物再经过氨基去保护后与第一反应底物进行酰胺反应，得到金固定的三联吡啶钌-赖氨酸三聚物。如此氨基去保护过程与聚合过程循环下去，经过循环n次即可得到聚合度为n+1的固定聚合物。
终止过程：可根据实际需求设定固相合成延伸循环次数，在完成设定的循环数后，为了使聚合反应终止，不向反应体系中加入TFA溶液，使固定聚合物末端的Boc无法脱落，不能形成去保护的氨基，无法继续聚合，从而终止固相聚合反应。接着再向反应体系中加入谷胱甘肽，谷胱甘肽作为还原性，谷胱甘肽与固定聚合物反应，使得固定聚合物中线性三联吡啶钌-赖氨酸聚合物从金基质上脱落，收集液态的线性三联吡啶钌-赖氨酸聚合物，即为目标产物。
产物纯化过程：将上述所述收集液态目标产物，通过超滤管离心过滤，目标产物中线性三联吡啶钌-赖氨酸聚合物聚集于过滤膜上层，通过双蒸水清洗即可得到较纯的反应产物。接着，将所得反应产物存放于-20℃过夜，使其冻结，并经过冷冻干燥过程处理6小时，即可得到干粉状的线性三联吡啶钌聚合物产物，从而使其能够长期保存。使用时并可根据实际需求称取溶解得到水溶液。
树状三联吡啶钌-赖氨酸聚合物固相合成方法主要由金基质的制备、固相预处理过程、固相聚合过程、合成反应过程以及产物纯化过程。
金基质的制备：包括负电荷载玻片预处理、Au3+吸附及晶体种子的生成以及金基质的形成。
载玻片预处理：首先，取干净的负电荷载玻片先用1mL丙酮浸洗1-3分钟取出；其次，用1mL异丙醇冲洗，后浸入1mL的异丙醇溶液中处理1-3分钟；最后，取出负电荷载玻片并用1mL甲醇清洗，后浸入1mL的甲醇中处理1-3分钟。
Au3+吸附及晶体种子的生成：首先，取3mM的HAuCl4溶液8mL，将负电荷载玻片浸入HAuCl4溶液当中，往其中加入192μL质量分数为25％的NH4OH溶液(24μL/mL，0.6％)的同时，剧烈振荡溶液反应1min，溶液呈棕黄色的浑浊状态，此时金离子以氨水-金的阳离子复合物的形式沉积在负电荷载玻片的表面，复合物形式：Au(NH3)2(H2O)2-x(OH)x (3-x)+；然后，将负电荷载玻片从溶液中分离出来后，用超纯水轻轻浸没载玻片并清洗2次；最后，将上述负电荷载玻片放入1mM的NaBH4溶液中浸泡5min，直至基底表面变成紫黑色，将基底放入超纯水中浸洗，其中本申请中1M表示1mol/L；
金基质的形成：首先，基底用超纯水清洗干净后，浸入1:1的HAuCl4和NH2OH的混合溶液中(混合溶液中HAuCl4和NH2OH的浓度均为750μM)，并在摇床上摇晃5min；然后，通过静置10min使得纳米金岛完成生长步骤，形成金固相基质，静置后洗净基底并置于超净台上自然风干，避免空气颗粒污染。
固相预处理过程：树状三联吡啶钌聚合物的合成通过改变赖氨酸单体Boc保护位点，将所有氨基基团都保护起来，再通过时序性的去保护，使得单体逐步聚合，原理图如图2所示，主要过程包括单体的硫醇化、单体链端的固定：
单体的硫醇化通过以下两个步骤实施：
第一步，单体氨基保护及羧基活化：取相同浓度的(Boc)2O与赖氨酸单体以1:1体积比混匀，60℃加热10min即完成反应，此为第一反应底物。第一反应底物再经过NHS活化羧基，活化完成后。NHS的活化条件与线性三联吡啶钌聚合物的活化条件相同，赖氨酸单体和NHS的摩尔比为1:10～1:100，优选为1:100。
第二步，单体的硫醇化：加入氨基乙硫醇，使得氨基乙硫醇与羧基活化赖氨酸单体反应生成酰胺键，为后续的金基质固定提供连接位点。
单体链端的固定：通过金-硫键将硫醇化的单体和金固相基质连接起来，此为第二反应底物。第二反应底物通过金-硫键连接使后续的延伸、合成终止及纯化过程得以简化。
固相聚合过程：固相合成的聚合以固定后的单体链端为起始，通过程序化控制，使三联吡啶钌单体逐个聚合形成树状链，主要过程包括氨基去保护过程、聚合过程和终止过程：
氨基去保护过程：向第二反应底物中加入反式脂肪酸(TFA)溶液，搅拌反应五分钟后，用双蒸水清洗，得到氨基去保护的第二反应底物。第二反应底物的链端被Boc氨基保护，能够通过加入反式脂肪酸(TFA)定点打开和封闭，从而实现精确的分子间连接。
聚合过程：去氨基保护的第二反应底物与第一反应底物通过酰胺键实现连接。去氨基保护的第二反应底物中的氨基与第一反应底物末端的羧基通过脱水缩合生成酰胺键，从而完成一个单体的链接，生成赖氨酸二聚物，赖氨酸二聚物再经过氨基去保护后与第一反应底物进行酰胺反应，得到赖氨酸三聚物。如此氨基去保护过程与聚合过程循环下去，经过循环n次即可得到聚合度为n+1的固定聚合物。
终止过程：可根据实际需求设定固相合成延伸循环次数，在完成设定的循环数后，为了使聚合反应终止，不向反应体系中加入TFA溶液，使树状赖氨酸聚合物的末端Boc脱落，不能形成去保护的氨基，无法继续聚合，从而终止固相聚合反应。接着再加入谷胱甘肽，谷胱甘肽作为还原性，谷胱甘肽与固定聚合物反应，使得树状赖氨酸聚合物从金基质上脱落，收集树状赖氨酸聚合物。
合成反应过程：将活化三联吡啶钌与树状聚赖氨酸聚合物按1:1000的分子数比混匀，在硼酸钠缓冲液(pH>8.5)中完成三联吡啶钌与树状赖氨酸聚合物的反应，反应条件为37℃避光过夜孵育12小时，即为目标产物。
产物纯化过程：将上述所得收集液态目标产物，通过超滤管离心过滤，目标产物中树状三联吡啶钌-树状赖氨酸聚合物聚集于过滤膜上层，通过双蒸水清洗即可得到较纯的反应产物。最后，将所得产物存放于-20℃过夜，使其冻结，并经过冷冻干燥过程处理6小时，即可得到干粉状的树状三联吡啶钌-赖氨酸聚合物，从而使其能够长期保存。使用时可根据实际需求称取溶解得到水溶液。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明首创了一种基于固相合成原理合成三联吡啶钌-赖氨酸聚合物的方法，通过改变赖氨酸单体氨基保护的位置，获得线性或者树状的聚合物。所得三联吡啶钌-赖氨酸聚合物通过控制反应的循坏次数而得到有效的控制，继而得到聚合度基本一致的线性或者树状聚合物，最终获得发光强度均一的电化学发光探针，为基于电化学发光原理的衡量分析方法提供有力的发光强度支持。
本发明所设计的合成过程简单，基于固相合成原理的聚合物合成方法操作方便，纯化步骤简洁，通过超滤管过滤即可得到高纯度的三联吡啶钌-赖氨酸聚合物。本发明的所有反应步骤均可通过控制器程序化控制，简化了反应操作，为精确控制聚合度提供了有力可行性保障。
附图说明
图1为本发明线性三联吡啶钌-赖氨酸聚合物固相合成原理图；
图2为本发明线性三联吡啶钌-赖氨酸聚合物的探针构建图；
图3为本发明树状三联吡啶钌-赖氨酸聚合物固相合成原理图；
图4为单个三联吡啶钌-赖氨酸与线性聚合物的发光强度对比图；
图5为线性三联吡啶钌-赖氨酸聚合物的发光强度随聚合度变化关系图；
图6为单个三联吡啶钌-赖氨酸与树状聚合物与的发光强度对比图；
图7为树状三联吡啶钌-赖氨酸聚合物的发光强度随聚合度变化关系图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
线性三联吡啶钌-赖氨酸聚合物固相合成方法包括金基质的制备、合成反应过程、固相预处理过程、固相聚合过程以及产物纯化过程，如图1所示，其具体过程如下：
(1)金基质的制备：包括负电荷载玻片预处理、Au3+吸附及晶体种子的生成以及金基质的形成。
载玻片预处理：首先，取干净的负电荷载玻片先用1mL丙酮浸洗1-3分钟取出；其次，用1mL异丙醇冲洗，后浸入1mL的异丙醇溶液中处理1-3分钟；最后，取出负电荷载玻片并用1mL甲醇清洗，后浸入1mL的甲醇中处理1-3分钟。
Au3+吸附及晶体种子的生成：首先，取3mM的HAuCl4溶液8mL，将负电荷载玻片浸入HAuCl4溶液当中，往其中加入192μL质量分数为25％的NH4OH溶液(24μL/mL，0.6％)的同时，剧烈振荡溶液反应1min，溶液呈棕黄色的浑浊状态，此时金离子以氨水-金的阳离子复合物的形式沉积在负电荷载玻片的表面，复合物形式：Au(NH3)2(H2O)2-x(OH)x (3-x)+；然后，将负电荷载玻片从溶液中分离出来后，用超纯水轻轻浸没载玻片并清洗2次；最后，将上述负电荷载玻片放入1mM的NaBH4溶液中浸泡5min，直至基底表面变成紫黑色，将基底放入超纯水中浸洗，其中本申请中1M表示1mol/L；
金基质的形成：首先，基底用超纯水清洗干净后，浸入1:1的HAuCl4和NH2OH的混合溶液中(混合溶液中HAuCl4和NH2OH的浓度均为750μM)，并在摇床上摇晃5min；然后，通过静置10min使得纳米金岛完成生长步骤，形成金固相基质，静置后洗净基底并置于超净台上自然风干，避免空气颗粒污染。
(2)合成反应过程：三联吡啶钌-赖氨酸单体的合成由羧基活化的三联吡啶钌(TBR)和单一氨基保护的赖氨酸通过酰胺键形成稳定连接而实现，此为第一反应底物。羧基活化三联吡啶钌和单一氨基保护的赖氨酸摩尔比为1:1，反应条件为37℃过夜孵育搅拌12h。
(3)固相预处理过程包括单体的硫醇化和单体链端的固定。单体的硫醇化通过以下两个步骤实施：
第一步，单体羧基活化：三联吡啶钌-赖氨酸单体和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的摩尔比为1:10～1:100，优选为1:100，在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的催化条件下，60℃搅拌孵育1h。
第二步，单体的硫醇化：羧基活化的三联吡啶钌-赖氨酸单体与氨基乙硫醇之间通过酰胺键连接，二者反应的摩尔比为1:1。
单体链端的固定：采用金-硫键连接硫醇化的三联吡啶钌-赖氨酸单体和金基质，此为第二反应底物。第二反应底物通过金-硫键连接使后续的延伸过程、终止过程以及纯化过程得以简化。
(4)固相聚合过程：固相合成的聚合以固定后的单体链端为起始，通过程序化控制，使三联吡啶钌-赖氨酸单体逐个聚合形成线性链，主要过程包括氨基去保护过程、聚合过程和终止过程：
氨基去保护过程：向第二反应底物中加入反式脂肪酸(TFA)溶液，搅拌反应五分钟后，用双蒸水清洗，得到氨基去保护的第二反应底物。第二反应底物的链端被Boc氨基保护，能够通过加入反式脂肪酸(TFA)定点打开和封闭，从而实现精确的分子间连接。
聚合过程：去氨基保护的第二反应底物与第一反应底物通过酰胺键实现连接。去氨基保护的第二反应底物中的氨基与第一反应底物末端的羧基通过脱水缩合生成酰胺键，从而完成一个单体的链接，生成三联吡啶钌-赖氨酸二聚物，三联吡啶钌-赖氨酸二聚物再经过氨基去保护后与第一反应底物进行酰胺反应，得到金固定的三联吡啶钌-赖氨酸三聚物。如此氨基去保护过程与聚合过程循环下去，经过循环n次即可得到聚合度为n+1的固定聚合物。
终止过程：可根据实际需求设定固相合成延伸循环次数，在完成设定的循环数后，为了使聚合反应终止，不向反应体系中加入TFA溶液，使固定聚合物末端的Boc无法脱落，不能形成去保护的氨基，无法继续聚合，从而终止固相合成反应。接着再向反应体系中加入谷胱甘肽，谷胱甘肽作为还原性，谷胱甘肽与固定聚合物反应，使得固定聚合物中线性三联吡啶钌-赖氨酸聚合物从金基质上脱落，收集液态的线性三联吡啶钌-赖氨酸聚合物，即为目标产物。
(5)产物纯化过程：将上述所述收集液态目标产物，通过超滤管离心过滤，目标产物中线性三联吡啶钌-赖氨酸聚合物聚集于过滤膜上层，通过双蒸水清洗即可得到较纯的反应产物。接着，将所得反应产物存放于-20℃过夜，使其冻结，并经过冷冻干燥过程处理6小时，即可得到干粉状的线性三联吡啶钌聚合物产物，从而使其能够长期保存。使用时并可根据实际需求称取溶解得到水溶液。
实施例2
树状三联吡啶钌聚合物固相合成方法主要由金基质的制备、固相预处理过程、固相聚合过程、固相终止过程、合成反应过程以及产物纯化过程，如图3所示。
(1)金基质的制备：包括负电荷载玻片预处理、Au3+吸附及晶体种子的生成以及金基质的形成。
载玻片预处理：首先，取干净的负电荷载玻片先用1mL丙酮浸洗1-3分钟取出；其次，用1mL异丙醇冲洗，后浸入1mL的异丙醇溶液中处理1-3分钟；最后，取出负电荷载玻片并用1mL甲醇清洗，后浸入1mL的甲醇中处理1-3分钟。
Au3+吸附及晶体种子的生成：首先，取3mM的HAuCl4溶液8mL，将负电荷载玻片浸入HAuCl4溶液当中，往其中加入192μL质量分数为25％的NH4OH溶液(24μL/mL，0.6％)的同时，剧烈振荡溶液反应1min，溶液呈棕黄色的浑浊状态，此时金离子以氨水-金的阳离子复合物的形式沉积在负电荷载玻片的表面，复合物形式：Au(NH3)2(H2O)2-x(OH)x (3-x)+；然后，将负电荷载玻片从溶液中分离出来后，用超纯水轻轻浸没载玻片并清洗2次；最后，将上述负电荷载玻片放入1mM的NaBH4溶液中浸泡5min，直至基底表面变成紫黑色，将基底放入超纯水中浸洗，其中本申请中1M表示1mol/L；
金基质的形成：首先，基底用超纯水清洗干净后，浸入1:1的HAuCl4和NH2OH的混合溶液中(混合溶液中HAuCl4和NH2OH的浓度均为750μM)，并在摇床上摇晃5min；然后，通过静置10min使得纳米金岛完成生长步骤，形成金固相基质，静置后洗净基底并置于超净台上自然风干，避免空气颗粒污染。
(2)固相预处理过程：树状三联吡啶钌聚合物的合成通过改变赖氨酸单体Boc保护位点，将所有氨基基团都保护起来，再通过时序性的去保护，使得单体逐步聚合，原理图如图3所示，主要过程包括单体的硫醇化、单体链端的固定：
单体的硫醇化通过以下两个步骤实施：
第一步，单体氨基保护及羧基活化：取相同浓度的(Boc)2O与赖氨酸单体以1:1体积比混匀，60℃加热10min即完成反应，此为第一反应底物。第一反应底物再经过NHS活化羧基，活化完成后。NHS的活化条件与线性三联吡啶钌聚合物的活化条件相同，赖氨酸单体和NHS的摩尔比为1:10～1:100，优选为1:100。
第二步，单体的硫醇化：加入氨基乙硫醇，使得氨基乙硫醇与羧基活化赖氨酸单体反应生成酰胺键，为后续的金基质固定提供连接位点。
单体链端的固定：通过金-硫键将硫醇化的单体和金固相基质连接起来，此为第二反应底物。第二反应底物通过金-硫键连接使后续的延伸、合成终止及纯化过程得以简化。
(3)固相聚合过程：固相合成的聚合以固定后的单体链端为起始，通过程序化控制，使三联吡啶钌单体逐个聚合形成树状链，主要过程包括氨基去保护过程、聚合过程和终止过程：
氨基去保护过程：向第二反应底物中加入反式脂肪酸(TFA)溶液，搅拌反应五分钟后，用双蒸水清洗，得到氨基去保护的第二反应底物。第二反应底物的链端被Boc氨基保护，能够通过加入反式脂肪酸(TFA)定点打开和封闭，从而实现精确的分子间连接。
聚合过程：去氨基保护的第二反应底物与第一反应底物通过酰胺键实现连接。去氨基保护的第二反应底物中的氨基与第一反应底物末端的羧基通过脱水缩合生成酰胺键，从而完成一个单体的链接，生成赖氨酸二聚物，赖氨酸二聚物再经过氨基去保护后与第一反应底物进行酰胺反应，得到赖氨酸三聚物。如此氨基去保护过程与聚合过程循环下去，经过循环n次即可得到聚合度为n+1的固定聚合物。
终止过程：可根据实际需求设定固相合成延伸循环次数，在完成设定的循环数后，为了使聚合反应终止，不向反应体系中加入TFA溶液，使固定聚合物末端的Boc脱落，不能形成去保护的氨基，无法继续聚合，从而终止固相聚合反应。接着再加入谷胱甘肽，谷胱甘肽作为还原性，谷胱甘肽与固定聚合物反应，使得树状赖氨酸聚合物从金基质上脱落，收集树状赖氨酸聚合物。
(4)合成反应过程：将活化三联吡啶钌与树状聚赖氨酸聚合物按1:1000的分子数比混匀，在硼酸钠缓冲液(pH>8.5)中完成三联吡啶钌与树状赖氨酸聚合物的反应，反应条件为37℃避光过夜孵育12小时，即为目标产物。
(5)产物纯化过程：将上述所得收集液态目标产物，通过超滤管离心过滤，目标产物中树状三联吡啶钌-树状赖氨酸聚合物聚集于过滤膜上层，通过双蒸水清洗即可得到较纯的反应产物。最后，将所得产物存放于-20℃过夜，使其冻结，并经过冷冻干燥过程处理6小时，即可得到干粉状的树状三联吡啶钌-赖氨酸聚合物，从而使其能够长期保存。使用时可根据实际需求称取溶解得到水溶液。
实施例3
在实施例1的基础上，本发明对单个三联吡啶钌-赖氨酸与实施例1中的联吡啶钌-赖氨酸聚合物进行横向比较，各取等量1nM的三联吡啶钌-赖氨酸和联吡啶钌-赖氨酸聚合物(聚合度为100)，在相同的条件下，检测其电化学发光强度，结果如图4所示。线性联吡啶钌-赖氨酸聚合物的发光强度远高于单个三联吡啶钌-赖氨酸，约90倍。由此可见，本发明提出的线性联吡啶钌-赖氨酸聚合物的合成方法可大大增强单个电化学发光探针的发光强度，从而为基于电化学发光技术的痕量分析提供了有力灵敏度性能保障。
并且，本发明合成了不同聚合度的线性三联吡啶钌-赖氨酸聚合物，并测试了其发光强度。线性三联吡啶钌-赖氨酸聚合物的聚合度分别设置为10、25、50、75、100，并单独进行了电化学发光强度测试，结果如图5所示。线性三联吡啶钌-赖氨酸聚合物的发光强度随聚合度的增加而增大，并保持良好的线性上升趋势。由此可见，本发明能够有效控制线性三联吡啶钌-赖氨酸聚合物的聚合度。
实施例4
在实施例2的基础上，本发明对单个三联吡啶钌-赖氨酸与实施例2中的联吡啶钌-赖氨酸聚合物进行横向比较，各取等量1nM的三联吡啶钌-赖氨酸和联吡啶钌-赖氨酸聚合物(聚合度为100)，在相同的条件下，检测其电化学发光强度，结果如图6所示。线性联吡啶钌-赖氨酸聚合物的发光强度远高于单个三联吡啶钌-赖氨酸，约95倍。由此可见，本发明提出的树状联吡啶钌-赖氨酸聚合物的合成方法可大大增强单个电化学发光探针的发光强度，从而为基于电化学发光技术的痕量分析提供了有力灵敏度性能保障。
并且，本发明合成了不同聚合度的树状三联吡啶钌-赖氨酸聚合物，并测试了其发光强度。树状三联吡啶钌-赖氨酸聚合物的聚合度分别设置为10、25、50、75、100，并单独进行了电化学发光强度测试，结果如图7所示。树状三联吡啶钌-赖氨酸聚合物的发光强度随聚合度的增加而增大，并保持良好的线性上升趋势。由此可见，本发明能够有效控制树状三联吡啶钌-赖氨酸聚合物的聚合度。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种三联吡啶钌-赖氨酸聚合物固相合成方法，其特征在于，包括以下过程：将合成原料包含有赖氨酸的第一反应底物经过固相预处理过程，得到硫醇化的单体，再将硫醇化的单体与金基质固定，此为第二反应底物，第二反应底物在去氨基保护后与第一反应底物发生固相聚合过程，形成固定聚合物后，固定聚合物脱落金基质，得到目标产物，目标产物经过产物纯化过程即为三联吡啶钌-赖氨酸聚合物；
第一反应底物为羧基活化的三联吡啶钌与单一氨基保护的赖氨酸的反应产物，
所述三联吡啶钌-赖氨酸聚合物为线性三联吡啶钌-赖氨酸聚合物。
2.根据权利要求1所述的一种三联吡啶钌-赖氨酸聚合物固相合成方法，其特征在于：羧基活化的三联吡啶钌与单一氨基保护的赖氨酸的摩尔比为1:1，反应条件为37℃过夜孵育搅拌12h。
3.根据权利要求1所述的一种三联吡啶钌-赖氨酸聚合物固相合成方法，其特征在于：所述固相预处理过程通过以下过程完成，首先，第一反应底物与N-羟基琥珀酰亚胺在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的催化条件下60℃搅拌孵育1h，第一反应底物与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:10～1:100；然后，加入氨基乙硫醇使得单体硫醇化，氨基乙硫醇与第一反应底物的摩尔比为1:1；最后，加入金基质，使得硫醇化的单体与金基质反应进行单体链端的固定，此为第二反应底物。
4.根据权利要求1所述的一种三联吡啶钌-赖氨酸聚合物固相合成方法，其特征在于，所述金基质的制备包括负电荷载玻片预处理、Au3+吸附及晶体种子的生成以及金基质的形成，具体过程如下：
载玻片预处理：首先，取干净的负电荷载玻片先用1mL丙酮浸洗1-3分钟取出；其次，用1mL异丙醇冲洗，后浸入1mL的异丙醇溶液中处理1-3分钟；最后，取出负电荷载玻片并用1mL甲醇清洗，再浸入1mL的甲醇中处理1-3分钟；
Au3+吸附及晶体种子的生成：首先，取3mM的HAuCl4溶液8mL，将负电荷载玻片浸入HAuCl4溶液当中，往其中加入192μL质量分数为25％的NH4OH 溶液的同时，剧烈振荡溶液反应1min，溶液呈棕黄色的浑浊状态；然后，将负电荷载玻片从溶液中分离出来后，用超纯水轻轻浸没载玻片并清洗2次；最后，将上述负电荷载玻片放入1mM的NaBH4溶液中浸泡5min，直至基底表面变成紫黑色，将基底放入超纯水中浸洗；
金基质的形成：首先，基底用超纯水清洗干净后，浸入体积比为1:1的HAuCl4和NH2OH的混合溶液中，并在摇床上摇晃5min；然后，通过静置10min使得纳米金岛完成生长步骤，形成金固相基质，静置后洗净基底并置于超净台上自然风干，避免空气颗粒污染。
5.根据权利要求1所述的一种三联吡啶钌-赖氨酸聚合物固相合成方法，其特征在于：所述固相聚合过程中，向第二反应底物中加入反式脂肪酸溶液，搅拌后用双蒸水清洗，得到氨基去保护的第二反应底物，再向其中加入第一反应底物，第一反应底物与第二反应底物聚合生成固定聚合物，通过加入反式脂肪酸溶液的量来控制固定聚合物的聚合度；
所述固定聚合物中加入谷胱甘肽，谷胱甘肽与固定聚合物反应，固定聚合物脱落金基质；
所述目标产物通过以下过程纯化，将收集液态目标产物通过超滤管离心过滤，目标产物中的三联吡啶钌-赖氨酸聚合物聚集于过滤膜上层，通过双蒸水清洗将所得反应产物过冷冻干燥，即可得到干粉状的三联吡啶钌聚合物产物。
6.一种三联吡啶钌-赖氨酸聚合物固相合成方法，其特征在于，将合成原料包含有双氨基保护的赖氨酸的第一反应底物经过固相预处理过程，得到硫醇化的单体，再将硫醇化的单体与金基质固定，此为第二反应底物，第二反应底物在去氨基保护后与第一反应底物发生固相聚合过程，形成固定聚合物后，固定聚合物脱落金基质，
与三联吡啶钌在硼酸钠缓冲液中反应形成目标产物，目标产物经过产物纯化过程即为三联吡啶钌-赖氨酸聚合物，所述三联吡啶钌-赖氨酸聚合物为树状三联吡啶钌-赖氨酸聚合物。
7.根据权利要求6所述的一种三联吡啶钌-赖氨酸聚合物固相合成方法，其特征在于：固定聚合物与三联吡啶钌反应的摩尔比为1:1000。
8.根据权利要求6所述的一种三联吡啶钌-赖氨酸聚合物固相合成方法，其特征在于：
所述固相预处理过程通过以下过程完成，单体氨基保护及羧基活化：取相同浓度的(Boc)2O与赖氨酸单体以1:1体积比混匀，60℃加热10min即完成反应，此为第一反应底物；第一反应底物与N-羟基琥珀酰亚胺在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的催化条件下60℃搅拌孵育1h，第一反应底物与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:10～1:100；然后，加入氨基乙硫醇使得单体硫醇化，氨基乙硫醇与第一反应底物的摩尔比为1:1；最后，加入金基质，使得硫醇化的单体与金基质反应进行单体链端的固定，此为第二反应底物。
9.根据权利要求6所述的一种三联吡啶钌-赖氨酸聚合物固相合成方法，其特征在于，所述金基质的制备包括负电荷载玻片预处理、Au3+吸附及晶体种子的生成以及金基质的形成，具体过程如下：
载玻片预处理：首先，取干净的负电荷载玻片先用1mL丙酮浸洗1-3分钟取出；其次，用1mL异丙醇冲洗，后浸入1mL的异丙醇溶液中处理1-3分钟；最后，取出负电荷载玻片并用1mL甲醇清洗，再浸入1mL的甲醇中处理1-3分钟；
Au3+吸附及晶体种子的生成：首先，取3mM的HAuCl4溶液8mL，将负电荷载玻片浸入HAuCl4溶液当中，往其中加入192μL质量分数为25％的NH4OH溶液的同时，剧烈振荡溶液反应1min，溶液呈棕黄色的浑浊状态；然后，将负电荷载玻片从溶液中分离出来后，用超纯水轻轻浸没载玻片并清洗2次；最后，将上述负电荷载玻片放入1mM的NaBH4溶液中浸泡5min，直至基底表面变成紫黑色，将基底放入超纯水中浸洗；
金基质的形成：首先，基底用超纯水清洗干净后，浸入体积比为1:1的HAuCl4和NH2OH的混合溶液中，并在摇床上摇晃5min；然后，通过静置10min使得纳米金岛完成生长步骤，形成金固相基质，静置后洗净基底并置于超净台上自然风干，避免空气颗粒污染。
10.根据权利要求6所述的一种三联吡啶钌-赖氨酸聚合物固相合成方法，其特征在于：所述固相聚合过程中，向第二反应底物中加入反式脂肪酸溶液，搅拌后用双蒸水清洗，得到氨基去保护的第二反应底物，再向其中加入第一反应底物，第一反应底物与第二反应底物聚合生成固定聚合物，通过加入反式脂肪酸溶液的量来控制固定聚合物的聚合度；
所述固定聚合物中加入谷胱甘肽，谷胱甘肽具有还原性，固定聚合物脱落金基质，
所述目标产物通过以下过程纯化，将收集液态目标产物通过超滤管离心过滤，目标产物中的三联吡啶钌-赖氨酸聚合物聚集于过滤膜上层，通过双蒸水清洗将所得反应产物过冷冻干燥，即可得到干粉状的三联吡啶钌聚合物产物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116948169A (zh) * 2023-06-14 2023-10-27 华南师范大学 一种基于聚赖氨酸的自增强电化学发光探针在水相中快速合成方法及应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1134154A (zh) * 1994-07-25 1996-10-23 伯伦格·曼海姆有限公司 带有带电连接基的金属配合物
US5817751A (en) * 1994-06-23 1998-10-06 Affymax Technologies N.V. Method for synthesis of diketopiperazine and diketomorpholine derivatives
CN1795202A (zh) * 2003-05-23 2006-06-28 阿普拉根有限责任公司 肽制备用固定于固相载体上的金属螯合物
CN101317093A (zh) * 2005-12-20 2008-12-03 夏普株式会社 用于结合配体的新的捕获试剂
CN101331400A (zh) * 2005-12-20 2008-12-24 夏普株式会社 用于产生结合配体的多聚体捕获试剂的方法
CN103558210A (zh) * 2013-10-25 2014-02-05 江南大学 一种基于共价键结合固定离子型铱配合物的方法
CN103695551A (zh) * 2013-12-24 2014-04-02 华南师范大学 基于聚合物电化学发光信号放大的核酸检测方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2977811B1 (fr) * 2011-07-12 2019-07-05 Universite Claude Bernard Lyon I Materiau pour synthese supportee

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5817751A (en) * 1994-06-23 1998-10-06 Affymax Technologies N.V. Method for synthesis of diketopiperazine and diketomorpholine derivatives
CN1134154A (zh) * 1994-07-25 1996-10-23 伯伦格·曼海姆有限公司 带有带电连接基的金属配合物
CN1795202A (zh) * 2003-05-23 2006-06-28 阿普拉根有限责任公司 肽制备用固定于固相载体上的金属螯合物
CN101317093A (zh) * 2005-12-20 2008-12-03 夏普株式会社 用于结合配体的新的捕获试剂
CN101331400A (zh) * 2005-12-20 2008-12-24 夏普株式会社 用于产生结合配体的多聚体捕获试剂的方法
CN103558210A (zh) * 2013-10-25 2014-02-05 江南大学 一种基于共价键结合固定离子型铱配合物的方法
CN103695551A (zh) * 2013-12-24 2014-04-02 华南师范大学 基于聚合物电化学发光信号放大的核酸检测方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Synthesis, labeling and bioanalytical applications of a tris(2,2 "-bipyridyl) ruthenium(II)-based electrochemiluminescence probe;Zhou, XM et al;《NATURE PROTOCOLS》;20140531;第9卷(第5期);第1146-1159页 *

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