CN110092592B - 一种用于生物分子固定的活化炔修饰表面玻璃材料及表面改性方法 - Google Patents

一种用于生物分子固定的活化炔修饰表面玻璃材料及表面改性方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物化学的技术领域，公开了一种用于生物分子固定的活化炔修饰表面玻璃材料及表面改性方法。方法：1)对玻璃材料进行表面羟基化处理，获得表面羟基化玻璃材料；2)采用氨基硅烷化试剂处理表面羟基化玻璃材料，获得氨基修饰的玻璃材料；3)采用二元炔基化合物处理氨基修饰的玻璃材料，获得活化炔修饰的玻璃材料。本发明通过表面改性成功在玻璃表面修饰了活化炔，并将其用于固定生物分子，实现了蛋白和多肽的表面化学固定。同时本发明的表面改性方法，条件温和，反应迅速，操作简单，而且在固定生物分子时不用对生物分子进行前修饰，无需催化剂，反应高效。

Description

一种用于生物分子固定的活化炔修饰表面玻璃材料及表面改 性方法
技术领域
本发明涉及生物化学领域，具体涉及一种玻璃材料表面改性方法及利用该改性方法获得的活化炔修饰表面的玻璃材料，并将活化炔修饰表面的玻璃材料用于固定生物分子。
背景技术
表面改性技术是一种强有力的工具，它可以改变材料表面的各种特性，如亲水性，表面电荷，生物相容性，反应性等。用于小分子和生物分子的表面固定的技术为生物传感，药物筛选，组织工程和其他化学和生物应用提供了有用的平台。由于生物系统的复杂性和这种技术的多功能性，开发简单有效的方法来丰富该领域具有重要意义。自组装单分子层(SAMs)，可以将不同的官能团修饰到基体表面。通常，分子可以通过两种方法固定在表面上：物理吸附和化学共价相互作用。基于静电和疏水相互作用的物理吸附操作简单，但吸附不稳定。相比之下，化学共价相互作用更稳定和精确。因此，开发简单有效的共价固定方法具有重要意义。
传统的用于表面生物分子固定的共价相互作用方法主要有：琥珀酰亚胺酯-氨基反应，醛基-氨基反应，环氧基-氨基反应，硫醇-马来酰亚胺反应等。然而，这部分反应或低效，或易于水解，或需要苛刻的反应条件，这些缺点限制了它们在生物分子固定中的实用性。近年来，快速，有效且仅需要简单反应条件的点击反应在表面改性中引起了更多的关注。几种经典的点击反应，如Huisgen叠氮化物环加成反应，Staudinger反应和Diels-Alder反应已被用于固定表面上的生物分子。然而，利用这些方法，生物分子需要预先修饰特定的官能团，这不仅加大了操作的复杂性，也可能对生物分子自身的活性造成影响。由于生物分子的多样性，开发新方法来实现其固定十分重要。
本发明通过炔胺点击反应对载玻片表面进行改性，该方法的条件温和，且无需任何催化剂，能够对多种生物分子进行固定，无需对蛋白等生物分子进行前修饰，无需催化剂，反应高效。
发明内容
为了克服现有技术的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种基于炔-胺点击反应的表面改性方法。该方法成功实现了对载玻片表面修饰活化炔，反应条件温和，无需催化剂。
本发明的另一目的在于提供由上述表面改性方法获得的活化炔修饰表面的玻璃材料。本发明通过表面改性，玻璃材料的表面修饰了活化炔基团，活化炔基团可以进一步与带氨基的小分子或生物分子发生反应而将其固定于表面。
本发明的再一目的在于提供上述活化炔修饰表面的玻璃材料的应用。所述活化炔修饰表面的玻璃材料用于固定含氨基的生物分子。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种基于炔-胺点击反应的表面改性方法，包括以下步骤：
1)对玻璃材料进行表面羟基化处理，获得表面羟基化玻璃材料；
2)采用氨基硅烷化试剂处理表面羟基化玻璃材料，获得氨基修饰的玻璃材料；所述氨基硅烷化试剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷；
3)采用二元炔基化合物处理氨基修饰的玻璃材料，获得活化炔修饰的玻璃材料；
所述二元炔基化合物的结构为式(I)或(Ⅱ)：
Figure BDA0002030914210000021
其中R1、R2为-(CH2)n-或-(CH2CH2O)n-，n≥1且n为整数。
所述3-氨丙基三乙氧基硅烷的结构为式Ⅲ：
Figure BDA0002030914210000022
步骤1)中所述玻璃材料为载玻片。
步骤1)中所述表面羟基化处理是指采用浓硫酸和双氧水的混合液处理玻璃材料，具体是指采用浓硫酸和双氧水的混合液浸泡玻璃材料；所述浓硫酸与双氧水的体积比为7:3；所述浓硫酸为质量浓度为98％的浓硫酸，双氧水为质量浓度为30％的双氧水。
步骤1)中所述处理的条件为于50-100℃处理1-12小时。
步骤2)中所述处理是指将表面羟基化玻璃材料浸泡于氨基硅烷化试剂的有机溶液中，然后取出，加热处理。所述加热处理的温度为100-120℃，加热处理的时间为1-2h。加热处理前将取出的玻璃材料采用有机溶剂进行清洗，有机溶剂为无水乙醇。
所述浸泡的时间为1-12h，浸泡的温度为常温；所述氨基硅烷化试剂的有机溶液是指将氨基硅烷化试剂溶于有机溶剂中得到，所述氨基硅烷化试剂的有机溶液中氨基硅烷化试剂的质量浓度为1％-10％，所述有机溶剂为无水乙醇或甲苯。
步骤3)中所述处理是指将氨基修饰的玻璃材料浸泡于二元炔基化合物的有机溶液中；所述浸泡的时间为1-12h，浸泡的温度为常温。
所述二元炔基化合物的有机溶液中二元炔基化合物的浓度为10-100mg/mL；二元炔基化合物的有机溶液是指将二元炔基化合物溶于有机溶剂得到，所述有机溶剂为四氢呋喃、二氯甲烷或甲苯中一种以上。
步骤3)中采用二元炔基化合物处理氨基修饰的玻璃材料后，将玻璃材料依次用四氢呋喃，无水乙醇，水清洗。
所述活化炔修饰的玻璃材料通过上述方法得到。
所述活化炔修饰的玻璃材料用于固定含氨基的生物分子。所述含氨基的生物分子为牛血清蛋白、人免疫球蛋白G或环肽RGD中一种以上。
所述应用，包括以下步骤：将含氨基的生物分子配成溶液，将溶液点样在活化炔修饰的玻璃材料表面或者将活化炔修饰的玻璃材料浸泡于溶液中，室温反应，清洗，含氨基的生物分子固定在活化炔修饰的玻璃材料表面。
本发明的活化炔表面修饰方法是基于活化炔与氨基的自发点击反应实现的，且该活化炔修饰后的表面可以进一步与生物分子上的氨基反应，实现对生物分子如蛋白，多肽等的表面固定。
本发明将活性炔修饰的玻片用于固定生物分子，从以下几个方面进行应用：1)在活化炔修饰的玻片表面固定牛血清蛋白，牛血清蛋白用FITC标记，通过对固定后的表面荧光信号来表征这种活化炔表面对牛血清蛋白的固定效果。2)对活化炔修饰的玻片固定人免疫球蛋白G(人IgG)，用Cy5标记的羊抗人IgG与表面固定的人IgG作用，通过对反应后的表面荧光信号来表征这种活化炔修饰的玻片对人IgG的固定效果。3)对活化炔修饰的玻片固定cRGDfk短肽，并对固定了cRGDfk后的表面做了细胞黏附实验，通过对表面细胞黏附密度的实验来表征这种活化炔修饰的玻片对cRGDfk的固定效果。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
1、本发明使用活化炔作为活性反应位点，既完成了炔与玻片表面氨基的反应，又实现了炔对含氨基的生物分子的表面固定；
2、本发明的表面改性方法，条件温和，反应迅速，操作简单，无荧光背景；
3、本发明将活性炔修饰的材料用于表面固定生物分子，无需对蛋白等生物分子进行前修饰，无需催化剂，反应高效。
附图说明
图1为实施例1中基于炔-胺点击反应的表面改性方法的原理示意图；
图2为荧光小分子与实施例1中修饰的玻片反应的示意图；(a)为带活化炔的荧光小分子与氨基修饰的玻片反应的示意图；(b)为带氨基的荧光小分子与活化炔修饰的玻片表面反应的示意图；
图3为带羟基的荧光分子和带活化炔的荧光小分子分别与实施例1中羟基化和氨基修饰的玻片反应后的荧光强度曲线；其中，羟基化的玻片+2(a)表示羟基化的玻片与带羟基的荧光分子反应，2(a)中(a)为对应的荧光图a，2表示带羟基的荧光分子；羟基化的玻片+3(b)表示羟基化的玻片与带活化炔的荧光分子反应，3(b)中(b)为对应的荧光图b，3表示带活化炔的荧光分子；氨基修饰的玻片+2(c)表示氨基修饰的玻片与带羟基的荧光分子反应，2(c)中(c)为对应的荧光图c，2表示带羟基的荧光分子；氨基修饰的玻片+3(d)表示氨基修饰的玻片与带活化炔的荧光分子反应，3(d)中(d)为对应的荧光图d，3表示带活化炔的荧光分子；
图4为带氨基的荧光小分子分别与实施例1中氨基修饰的玻片和活化炔修饰的玻片反应后的荧光强度曲线；其中，氨基修饰的玻片+4(e)表示氨基修饰的玻片与带氨基的荧光小分子反应，4(e)中(e)为对应的荧光图e，4表示带氨基的荧光小分子；活化炔修饰的玻片+4(f)表示活化炔修饰的玻片与带氨基的荧光小分子反应，4(f)中(f)为对应的荧光图f，4表示带氨基的荧光小分子；
图5为氨基硅烷化试剂(3-氨丙基三乙氧基硅烷)与二元炔基化合物(1,6-己二醇二丙炔酸酯)反应产物的红外光谱图；其中(a)为氨基硅烷化试剂的红外谱图，(b)为二元炔基化合物的红外谱图，(c)为氨基硅烷化试剂和二元炔基化合物反应产物的红外谱图；
图6为实施例1中不同活化表面的x射线光电子能谱图；其中(a)为氨基修饰的玻片和活化炔修饰的玻片表面的元素分析图，(b)为活化炔修饰的玻片表面的碳元素峰图，(c)为氨基修饰的玻片表面的碳元素峰图；
图7为实施例1中活化炔修饰的玻片固定含氨基的生物分子的荧光表征图；其中，(a)为活化炔修饰的玻片固定不同浓度的FITC标记的BSA(BSA-FITC)的荧光强度柱状图，图中上部的图为不同浓度下的荧光图；(b)为活化炔修饰的玻片固定BSA-FITC，其固定时间与荧光强度的关系曲线；(c)为活化炔修饰的玻片分别固定人IgG和BSA后，再与Cy5标记的羊抗人IgG(羊抗人IgG/Cy5)反应后的荧光强度柱状图，图中上部的图分别为对应生物分子的荧光图；(d)为活化炔修饰的玻片固定不同浓度人IgG后，再与Cy5标记的羊抗人IgG(羊抗人IgG/Cy5)反应后的荧光强度柱状图，图中上部的图为对应浓度下的荧光图；
图8为不同活化表面下骨髓间充质干细胞黏附量的细胞图，其中(a)-(d)分别为实施例1中羟基化的玻片、氨基修饰的玻片、活化炔修饰的玻片和实施例4中固定cRGDfk的玻片。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行具体地描述，但本发明的保护范围不限于以下实施例。
实施例1
一种基于炔-胺点击反应的玻璃表面改性方法(基于炔-胺点击反应的表面改性方法)，包括以下步骤：
(1)将玻片用超声清洗仪超声清洗20分钟，然后用氮气吹干后浸泡于浓硫酸(98％浓硫酸)和双氧水(30％双氧水)的混合溶液(浓硫酸与双氧水体积比为7:3)中，于99℃水浴锅中加热1小时，取出，用大量去离子水冲洗，并用氮气吹干，获得羟基化的玻片；
(2)将羟基化玻片浸泡于质量浓度为5％的氨基硅烷化试剂的乙醇溶液(氨基硅烷化试剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷)中，保持1小时后，取出用无水乙醇润洗三遍，再置于烘箱中，120℃烘烤1小时，获得氨基修饰的玻片；
(3)用50mg/mL的二元炔基化合物(1,6-己二醇二丙炔酸酯)的四氢呋喃溶液浸泡氨基修饰的玻片5小时，并依次用四氢呋喃、无水乙醇和去离子水冲洗，并用氮气吹干，获得活化炔修饰的玻片。
1,6-己二醇二丙炔酸酯的结构为
Figure BDA0002030914210000061
图1为实施例1中基于炔-胺点击反应的表面改性方法的原理示意图。本发明对羟基化的玻片先用氨基硅烷化试剂处理得到氨基修饰的玻片，然后再用二元炔基化合物处理氨基修饰的玻片，由于氨基和活化炔容易发生加成反应而将二元炔基化合物固定于表面，即可得到活化炔修饰的玻片。
为了验证实施例1中玻片表面成功修饰了氨基、炔基，现利用带有不同基团的荧光小分子与不同表面的玻片进行反应，并进行荧光效果的测定，测试结果如图2～4所示。
荧光小分子包括带羟基的荧光小分子，带活化炔的荧光小分子，带氨基的荧光小分子；荧光小分子的结构为
Figure BDA0002030914210000062
(2)：带羟基的荧光小分子，(3)：带活化炔的荧光小分子，(4)：带氨基的荧光小分子。
图2为荧光小分子与实施例1中修饰的玻片反应的示意图；(a)为带活化炔的荧光小分子与氨基修饰的玻片反应的示意图；(b)为带氨基的荧光小分子与活化炔修饰的玻片表面反应的示意图；图中“3”处的荧光小分子为带活化炔的荧光小分子(即上面所述的带活化炔的荧光小分子)；图中“4”处的荧光小分子为带氨基的荧光小分子(即上面所述的带氨基的荧光小分子)。
图3为带羟基的荧光分子和带活化炔的荧光小分子分别与实施例1中羟基化和氨基修饰的玻片反应后的荧光强度曲线；其中，羟基化的玻片+2(a)表示羟基化的玻片与带羟基的荧光分子反应，2(a)中(a)为对应的荧光图a，2表示带羟基的荧光分子(即上面所述的带羟基的荧光小分子)；羟基化的玻片+3(b)表示羟基化的玻片与带活化炔的荧光分子反应，3(b)中(b)为对应的荧光图b，3表示带活化炔的荧光分子(即上面所述带活化炔的荧光小分子)；氨基修饰的玻片+2(c)表示氨基修饰的玻片与带羟基的荧光分子反应，2(c)中(c)为对应的荧光图c，2表示带羟基的荧光分子；氨基修饰的玻片+3(d)表示氨基修饰的玻片与带活化炔的荧光分子反应，3(d)中(d)为对应的荧光图d，3表示带活化炔的荧光分子；
图4为带氨基的荧光小分子分别与实施例1中氨基修饰的玻片和活化炔修饰的玻片反应后的荧光强度曲线；其中，氨基修饰的玻片+4(e)表示氨基修饰的玻片与带氨基的荧光小分子反应，4(e)中(e)为对应的荧光图e，4表示带氨基的荧光小分子(即上面所述带氨基的荧光小分子)；活化炔修饰的玻片+4(f)表示活化炔修饰的玻片与带氨基的荧光小分子反应，4(f)中(f)为对应的荧光图f，4表示带氨基的荧光小分子。
从图2可知，带活化炔的荧光小分子通过活化炔基团与玻片表面的氨基发生加成反应而固定于氨基修饰的玻片表面。说明实施例1中玻片表面成功修饰了氨基。带氨基修饰的荧光小分子通过氨基基团与玻片表面的活化炔基团发生加成反应而固定于活化炔修饰的玻片表面。说明实施例1中玻片表面成功修饰了活化炔。
从图3可知，只有带活化炔的荧光小分子和氨基修饰的玻片作用后有荧光信号，说明活化炔可以和氨基修饰的玻片表面的氨基发生反应。
从图4可知，带氨基的荧光小分子只有和活化炔修饰的玻片反应后有荧光信号，说明玻片表面修饰的活化炔基团和荧光小分子的氨基发生了反应。
为了体现炔基和氨基发生了反应，现对氨基硅烷化试剂与二元炔基化合物混合反应后的产物进行红外谱图的表征，结果如图5所示；同时对氨基修饰的玻片、活化炔修饰的玻片表面进行x射线光电子能谱图表征，结果如图6所示。
图5为氨基硅烷化试剂(3-氨丙基三乙氧基硅烷)与二元炔基化合物(1,6-己二醇二丙炔酸酯)反应产物的红外光谱图；其中(a)为氨基硅烷化试剂的红外谱图，(b)为二元炔基化合物的红外谱图，(c)为氨基硅烷化试剂和二元炔基化合物反应产物的红外谱图。从图5可知，经过反应后，产物中有碳碳双键的产生。
图6为实施例1中不同活化表面的x射线光电子能谱图；其中(a)为氨基修饰的玻片和活化炔修饰的玻片表面的元素分析图，(b)为活化炔修饰的玻片表面的碳元素峰图，(c)为氨基修饰的玻片表面的碳元素峰图。从图6可知，活化炔修饰的玻片表面出现碳氧键的峰。
将实施例1中玻片(未经修饰的玻片)、羟基化的玻片、氨基修饰的玻片以及活化炔修饰的玻片进行水接触角表征，表征结果如表1所示。活化炔修饰的玻片表面的动态接触角最大，说明修饰了活化炔基团后表面化学环境发生了改变。)
表1不同修饰的玻片表面的水接触角表征参数
Figure BDA0002030914210000081
θs为表面静态接触角，θa为前进角，θr为后退角，△θ为动态接触角。
实施例2
将实施例1制备的活化炔修饰的玻片用于固定牛血清蛋白，包括以下步骤：
(1)将FITC标记的牛血清蛋白用1×PBS等倍稀释，依次稀释成1mg/mL、0.1mg/mL、0.01mg/mL和0.001mg/mL；
(2)将不同浓度的牛血清蛋白溶液直接点样在实施例1制备的活化炔修饰的玻片上，室温下于湿盒中反应1小时，然后分别用0.2％SDS溶液和去离子水清洗，各洗两次，每次2分钟。固定牛血清蛋白后的玻片直接置于凝胶成像系统中拍照观察。测试结果如图7(a，b)所示。
实施例3
将实施例1制备的活化炔修饰的玻片用于固定人IgG，包括以下步骤：
(1)将人IgG用1×PBS等倍稀释，依次稀释成10μg/mL、1μg/mL、0.1μg/mL和0.01μg/mL；
(2)将不同浓度的人IgG溶液直接点样在活性炔玻片上，室温下于湿盒中反应1小时，然后分别用0.2％SDS溶液和去离子水清洗，各洗两次，每次两分钟，用1％牛血清蛋白溶液封闭20分钟，再分别用0.2％SDS溶液和去离子水清洗，各洗两次，每次2分钟；
(3)用1×PBS配10μg/mL Cy5标记的羊抗人IgG；
(4)将10μg/mL Cy5标记的羊抗人IgG点样在固定了人IgG的表面，室温下于湿盒中反应1小时，然后分别用0.2％SDS溶液和去离子水清洗，各洗两次，每次2分钟。清洗后的玻片直接置于凝胶成像系统中拍照观察。
本实施例中用Cy5标记的羊抗人IgG与表面固定的人IgG作用，通过对反应后的表面荧光信号来表征活化炔修饰的玻片对人IgG的固定效果。
为了对比固定效果，将实施例1制备的活化炔修饰的玻片分别固定人IgG和BSA后，再与Cy5标记的羊抗人IgG(羊抗人IgG/Cy5)反应，其荧光表征如图7(c)所示。
活化炔修饰的玻片固定不同浓度人IgG后，再与Cy5标记的羊抗人IgG(羊抗人IgG/Cy5)反应后的荧光表征图如图7(d)所示。
实施例4
将实施例1制备的活化炔修饰的玻片用于固定RGD多肽(cRGDfk)，包括以下步骤：
(1)用DMSO配制0.5mg/mL的cRGDfk溶液；
(2)将实施例1中活化炔修饰的玻片在0.5mg/mL的cRGDfk溶液中浸泡5小时，然后分别用DMSO，无水乙醇和去离子水冲洗，并用氮气吹干，得到cRGDfk修饰的玻片；
(3)将cRGDfk修饰的玻片、实施例1中羟基化的玻片、实施例1中氨基修饰的玻片和实施例1中活化炔修饰的玻片均置于紫外灯下杀菌30分钟，然后将它们浸入细胞培养液中，并将骨髓间充质干细胞种植在其表面，于细胞培养箱中培养3小时，然后取出玻片，并用PBS润洗表面三次。
用显微镜直接观察上述各玻片表面的细胞黏附情况。结果如图8所示。
图7为实施例1中活化炔修饰的玻片固定含氨基的生物分子的荧光表征图；其中，(a)为活化炔修饰的玻片固定不同浓度的FITC标记的BSA(BSA-FITC)的荧光强度柱状图，图中上部的图为不同浓度下的荧光图；(b)为活化炔修饰的玻片固定BSA-FITC，其固定时间与荧光强度的关系曲线；(c)为活化炔修饰的玻片分别固定人IgG和BSA后，再与Cy5标记的羊抗人IgG(羊抗人IgG/Cy5)反应后的荧光强度柱状图，图中上部的图分别为对应生物分子的荧光图；(d)为活化炔修饰的玻片固定不同浓度人IgG后，再与Cy5标记的羊抗人IgG(羊抗人IgG/Cy5)反应后的荧光强度柱状图，图中上部的图为对应浓度下的荧光图。
从图7(a)中可知，随着FITC标记的BSA(BSA-FITC)浓度的增加，表面荧光强度也增强，说明BSA固定量的增加；从图7(b)中可知，随着固定时间的延长，荧光强度增强并于大约30分钟达到饱和；从图7(c)中可知，固定了人IgG的部分有荧光，而固定了BSA的部分没有荧光；从图7(d)中可知，随着人IgG浓度的增加，荧光强度增强，固定的IgG量越多。
图8为不同活化表面下骨髓间充质干细胞黏附量的细胞图，其中(a)-(d)分别为实施例1中羟基化的玻片、氨基修饰的玻片、活化炔修饰的玻片和实施例4中固定cRGDfk的玻片。从图中可知，固定了cRGDfk的表面对细胞的黏附量最多。
本发明将经过活化炔修饰的玻片和蛋白或多肽表面的氨基反应，从而实现对蛋白或多肽的表面固定，首先实现了对牛血清蛋白(BSA)的表面固定，使用荧光素FITC标记的BSA点样到活化炔修饰的玻片表面，点样的区域被清洗后仍有荧光，说明BSA被固定在活化炔修饰的玻片表面；再者实现了对人免疫球蛋白G(人IgG)的表面固定，固定了人IgG后，使用荧光素Cy5标记的羊抗人免疫球蛋白G(羊抗人IgG/Cy5)与表面固定的人IgG反应，通过检测荧光信号可以表征表面反应的进行；最后，实现了对多肽cRGDfk的表面固定，固定了cRGDfk的表面对细胞的粘附性增强，用细胞黏附性实验可以表征表面对cRGDfk的固定效果。

Claims (7)

1.一种活化炔修饰的玻璃材料的应用，其特征在于：所述活化炔修饰的玻璃材料用于固定含氨基的生物分子；所述含氨基的生物分子为牛血清蛋白、人免疫球蛋白G或环肽RGD中一种以上；
所述活化炔修饰的玻璃材料通过以下方法得到，包括以下步骤：
1)对玻璃材料进行表面羟基化处理，获得表面羟基化玻璃材料；
2)采用氨基硅烷化试剂处理表面羟基化玻璃材料，获得氨基修饰的玻璃材料；所述氨基硅烷化试剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷；
3)采用二元炔基化合物处理氨基修饰的玻璃材料，获得活化炔修饰的玻璃材料；
所述二元炔基化合物的结构为式(I)或(Ⅱ)：
Figure FDA0002482468150000011
其中R1、R2为-(CH2)n-或-(CH2CH2O)n-，n≥1且n为整数。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤2)中所述处理是指将表面羟基化玻璃材料浸泡于氨基硅烷化试剂的有机溶液中，然后取出，加热处理。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：步骤2)中，所述加热处理的温度为100-120℃，加热处理的时间为1-2h；
步骤2)中，所述浸泡的时间为1-12h，浸泡的温度为常温；
步骤2)中，所述氨基硅烷化试剂的有机溶液是指将氨基硅烷化试剂溶于有机溶剂中得到；所述氨基硅烷化试剂的有机溶液中氨基硅烷化试剂的质量浓度为1％-10％；所述有机溶剂为无水乙醇或甲苯。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤3)中所述处理是指将氨基修饰的玻璃材料浸泡于二元炔基化合物的有机溶液中；
步骤1)中所述表面羟基化处理是指采用浓硫酸和双氧水的混合液处理玻璃材料，具体是指采用浓硫酸和双氧水的混合液浸泡玻璃材料。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：步骤3)中所述浸泡的时间为1-12h，浸泡的温度为常温；
步骤3)中所述二元炔基化合物的有机溶液中二元炔基化合物的浓度为10-100mg/mL；二元炔基化合物的有机溶液是指将二元炔基化合物溶于有机溶剂得到；所述有机溶剂为四氢呋喃、二氯甲烷或甲苯中一种以上；
步骤1)中，所述浓硫酸与双氧水的体积比为7:3；所述浓硫酸为质量浓度为98％的浓硫酸，双氧水为质量浓度为30％的双氧水。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
步骤1)中所述玻璃材料为载玻片；
步骤1)中所述处理的条件为于50-100℃处理1-12小时；
步骤3)中采用二元炔基化合物处理氨基修饰的玻璃材料后，将玻璃材料依次用四氢呋喃，无水乙醇，水清洗。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：包括以下步骤：将含氨基的生物分子配成溶液，将溶液点样在活化炔修饰的玻璃材料表面或者将活化炔修饰的玻璃材料浸泡于溶液中，室温反应，清洗，含氨基的生物分子固定在活化炔修饰的玻璃材料表面。
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