CN113981040B - 一种dna修饰二氧化硅材料的方法及其产物和产物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种DNA修饰二氧化硅材料的方法及其产物和产物的应用,属于材料技术领域。本发明的公开方法是使用金属离子辅助DNA简单、快速、稳定地将短链DNA固定在二氧化硅材料表面,通过对金属离子的全面筛选,发现一些金属离子可有效介导短链DNA分子修饰于二氧化硅材料表面,且DNA修饰密度可通过改变DNA或金属离子的浓度进行调节。本发明方法制备的DNA修饰二氧化硅材料的方法及制得的产物可以应用于DNA微阵列及生物传感,具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于材料技术领域,更具体地说,涉及一种DNA修饰二氧化硅材料的方法及其产品和产品的应用。
背景技术
二氧化硅纳米颗粒(SiNPs)具有尺寸可调控性和高度的生物相容性,是生命科学中最具吸引力的纳米材料之一。鉴于DNA分子可实现分子组装、生物催化、生物传感、基因调控、药物输送等多种生物学应用,利用寡核苷酸DNA分子对SiNPs进行功能化有效提高了其利用率。
通常,所合成的SiNPs对DNA分子呈惰性,因为它们两者都是高度亲水性和带负电的,难以直接将DNA链固定在SiNPs表面。目前,主要有两种方法可以在SiNPs表面修饰DNA链。一种常用的方法是利用硅烷化学共价固定DNA链。硅烷偶联剂如氨基丙基三乙氧基硅烷(Aptes),氧化丙甲基三甲氧基硅烷(OMTMS),乙烯基三甲氧基硅烷(VTMS),3-巯基丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)可改变SiNPs的表面化学,并产生大量官能团如氨基、环氧基、乙烯基、硫醇基团等用于固定DNA。同时,还需对DNA分子进行基团修饰来完成交联反应。尽管其具有高稳定性,但制备过程相对复杂,通常需要较长时间(>6小时),这可能导致SiNPs的不可逆团聚,降低其生物利用度。此外,大量化学试剂的使用和DNA的基团修饰不可避免地提高了成本。更重要的是,鉴于DNA结构的多样性和复杂性,难以选择合适偶联基团,且SiNPs表面的DNA密度也难以控制,进一步限制其实际应用。另一种方法是通过静电相互作用进行物理吸附,利用带正电荷的氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)或阳离子聚合物如聚乙烯亚胺(PEI)预处理SiNPs,使其易于吸附DNA分子。该方法简单、快速,但在复杂的生物介质中吸附量较低,且状态不稳定,寡聚核苷酸易脱落。此外,阳离子聚合物的细胞毒性可能会阻碍这种方法在细胞中的应用。
金属离子作为必需的生物元素,在调节多种生命活动中起着至关重要的作用。近年来,随着DNA纳米技术的发展,人们发现许多金属离子对DNA分子的活性有很大影响。例如,许多金属离子如Na+、Mg2+、Zn2+和Pb2+是DNA酶的辅助因子;K+可以控制G-四链体的形成;汞离子和银离子介导T-Hg-T和C-Ag-C结构的形成,且已广泛应用于生物传感和废水处理。然而,金属离子介导的纳米材料表面DNA组装研究仍很少。大多数已开发的方法都集中于在硅材料上吸附长链DNA(例如遗传DNA、质粒等),而短链DNA片段(<100bp)与硅材料之间的相互作用很少被探索。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题,本发明所要解决的技术问题在于提供一种DNA修饰二氧化硅材料的方法,能够在纳米二氧化硅或玻璃片表面稳固修饰DNA。本发明所要解决的另一技术问题在于提供前述方法制备得到的产物。本发明所要解决的最后一技术问题在于提供前述产物的具体应用。
为了解决上述技术问题,本发明所采用的技术方案如下:
一种DNA修饰二氧化硅材料的方法,将DNA、金属离子溶液与二氧化硅材料混合后孵育,使DNA固定于二氧化硅材料表面。
进一步地,所述的二氧化硅材料为纳米二氧化硅或玻璃片。
进一步地,所述的金属离子是Zn2+、Al3+、Y3+、Zr4+、La3+、Dy3+或Lu3+。
进一步地,DNA的修饰密度通过改变DNA或金属离子的浓度进行调节。
所述的DNA修饰二氧化硅材料的方法制备得到的产物。
所述的产物在核酸分子纯化、核酸分子传递、生物传感或生物成像中的应用。
相比于现有技术,本发明的有益效果为:
本发明公开了一种简单、快速和高效的DNA分子修饰二氧化硅材料的方法,二氧化硅材料可以是SiNPs或玻璃片,该方法只需一步孵育即可实现,不需要任何复杂的化学修饰和耗时的步骤,修饰过程可以在几分钟内完成,且金属离子介导形成的DNA-SiNPs稳定性很高,只需改变DNA或金属离子的浓度,就可以对DNA密度进行调节。SiNPs和DNA不需要任何化学改性且不涉及任何昂贵或有害的试剂,有利于其生物学应用。将金属离子介导的SiNPs表面DNA分子组装原理成功应用于DNA微阵列构建及生物传感。通过简单调整金属离子和DNA的种类,即可灵活地实现不同生物学应用,在生物分子纯化、核酸传递、生物传感和生物成像等领域具有很大的潜力。
附图说明
图1为金属离子筛选结果图;
图2为DNA修饰密度调节结果图;
图3为DNA微阵列构建及其生物传感应用结果图;
图4为金属离子介导的SiNPs表面DNA分子组装原理示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
实施例1:SiNPs合成与表征
SiNPs按照常规的法制备。将含有无水乙醇、氨(28-30%)和去离子水的溶液搅拌5分钟,以确保完全混合。然后在上述溶液中加入原硅酸四乙酯无水乙醇溶液,在室温下反应24小时。合成的SiNPs在室温下储存于乙醇溶液中。
使用前,通过在12000rpm下离心10分钟来收集SiNPs,并用Milli-Q水清洗三次,然后重新分散在Milli-Q水中进行后续实验。使用Malvern Zetasizer Nano ZS系统测量SiNPs的尺寸分布和zeta电位,并使用透射电子显微镜(TEM)表征其形态。
透射电子显微镜(TEM)和动态光散射(DLS)的结果表明成功制备了具有均匀尺寸(直径=400nm)的球形SiNPs。由于SiNPs不是荧光淬灭剂,因此可以通过灵敏的荧光技术快速分析DNA分子的吸附情况。
实施例2:筛选介导DNA修饰SiNPs表面的金属离子
(1)DNA修饰SiNPs方法
将10nM FAM/Cy3标记的DNA(pH7.4,10mM HEPES)、100μg mL-1 SiNP(pH7.4,10mMHEPES)和不同浓度的金属离子混合(pH7.4,10mM HEPES),在室温下孵育5分钟,离心后用缓冲液(10mM HEPES,1mM金属离子,pH7.4)清洗纳米颗粒3次。使用荧光光谱仪记录吸附的DNA的荧光光谱(Ex=490nm,Em=518nm)。
(2)金属离子筛选
将荧光团6-羧基荧光素(FAM)标记在25-mer DNA聚腺苷链5′端(FAM-A25),筛选可以有效介导DNA与SiNPs表面组装的金属离子。只需将FAM-A25、SiNPs和金属离子混合,在紫外光(365nm)照射下即可得到均匀的绿色溶液。离心后,SiNPs沉淀并在管底部显示亮绿光,而未检测到上清液的荧光,表明DNA分子有效吸附在SiNPs表面。
筛选周期表中的阳离子元素:金属离子如Hg2+、pb2+、Cr6+、Cd2+等,对生物体极为有害,所以没有对它们进行进一步实验。此外,Ni2+、Cu2+、Fe3+和一些镧系金属离子,即使在低浓度下也能强烈淬灭FAM的荧光(图1.A)。为了排除FAM淬灭带来的假阳性结果,采用氰化物染料(Cy3)代替FAM,结果表明,Zn2+、Al3+、Y3+、Zr4+和一些镧系金属离子(如La3+、Dy3+和Lu3+)可有效地将DNA固定在SiNPs表面(图1.B);此外,这种金属离子辅助的DNA组装方法对纳米级SiNPs与宏观玻璃片均有效(图1.C)。
(3)DNA修饰密度调节及修饰性能实验
锌离子与其它有效金属离子相比具有更高的生物相容性,因此以Zn2+为模型佐剂,系统地考查了DNA对SiNPs的功能化修饰。
在1mM Zn2+和100μg mL-1 SiNPs条件下,测量了FAM-A25 DNA吸附等温线。随着DNA浓度从0nM增加到300nM,DNA吸附量逐渐增加(图2.A),数据拟合呈Langmuir等温线,表明DNA单层吸附。当DNA浓度为100nM时,100μg mL-1 SiNPs(d=400nm)可以达到7.92×104链/μm2的饱和负载,相当于3.86×104链/纳米颗粒,且其负载力与共价组装DNA方法的负载力相当。
实验考查不同浓度的Zn2+对FAM-A25修饰二氧化硅纳米颗粒的影响:如图2.B所示,DNA吸附量随着Zn2+浓度的增加而增加,并在1mM Zn2+时达到峰值。吸附于SiNPs表面的DNA密度可以在0-3.86×104链/纳米颗粒线性范围内进行调节,该线性范围明显宽于传统方法。
实验考查金属离子介导的DNA修饰SiNPs的时间:结果表明,DNA分子在SiNPs表面的吸附是相当快的,超过90%DNA在前三分钟内被吸附。
实验考查DNA序列及长度对其吸附力的影响:因为G15的合成过程很困难,且容易形成G-四联体结构,因此并未研究其对DNA吸附力的影响。结果表明,Zn2+介导的DNA组装依赖于DNA序列,并且A15和C15的吸附能力明显大于T15;过短的DNA链(如A5)不能有效地吸附在SiNPs的表面,而当长度超过15个核苷酸时,负载力趋于稳定。
实验考查金属离子介导的DNA-SiNPs的稳定性:当缓冲液中没有Zn2+时,大部分的DNA分子仅在储存一天后就开始脱离Si表面;当缓冲液中含有ZnCl2(1mM)时,储存8天后,DNA才会发生微弱的解离,表明金属离子介导的DNA-SiNPs可以长期储存与应用。
实施例3:DNA微阵列构建
使用SpotBot 2微阵列点样器将溶于点样缓冲液(10mM Tris-HCl,100μM ZrCl4,pH 7.4)中的DNA探针打印到干净的玻璃片上。样斑平均直径为100μm,两个斑点之间的距离为50μm。准备就绪的玻片在室温下于恒湿箱中孵育5分钟。随后,用Tris-HCl缓冲液(10mMTris-HCl,pH 7.4)清洗两次,并将玻片在室温下浸入封闭液(含有10μM poly15A的Tris-HCl缓冲液,pH7.4)中5分钟以钝化表面。用Tris-HCl缓冲液清洗两次后,将玻片保存在4℃以备进一步使用。
DNA微阵列已被广泛用于体外DNA分析和临床诊断。传统方法中,DNA探针组装于玻璃片表面主要依赖硅烷化学,操作复杂、耗时。鉴于Zr4+不会对FAM荧光产生影响,并且与Zn2 +相比,其对DNA表现出更高的结合亲和力,因此选择利用Zr4+来辅助制备微阵列传感表面。Zr4+介导的DNA组装使得DNA微阵列的制备更容易。在干净的玻璃片表面共孵育Zr4+和DNA捕获探针,以形成DNA单分子层。不同浓度的FAM-DNA点样于玻璃片上时,均产生均匀、可重复的荧光信号,并且荧光强度随着DNA探针浓度从50到400nM增加而逐渐增加(图3.A)。DNA微阵列制备好后可用于检测目标DNA分子。将与目标DNA半互补的DNA捕获探针在金属离子的辅助下组装于玻璃片表面捕获目标DNA,目标DNA随后与标记有荧光基团的信号探针结合,如图3.B所示,随着目标DNA的增加,微阵列的荧光强度随之增加,这表明玻璃片表面上的DNA探针仍然保持杂交活性。该方法针对目标DNA的检测限低至5nM。微阵列中的DNA序列如下:
捕获探针:5′-AAAAAAAAAAAAAAACGGATCAAGTATGCC-3′;
目标DNA序列:5′-GTAGCGAGTGTCTTTGGCATACTTGATCCG-3′;
信号探针:5′-AAAGACACTCGCTAC-FAM-3′。
综上所述,本发明公开了一种简单、快速和高效的DNA分子修饰二氧化硅材料的方法,只需一步孵育即可实现,不需要任何复杂的化学修饰和耗时的步骤(图4)。只需改变DNA或金属离子的浓度,就可以对DNA密度进行调节,且金属离子介导形成的DNA-SiNPs稳定性很高。修饰过程可以在几分钟内完成,SiNPs和DNA不需要任何化学改性且不涉及任何昂贵或有害的试剂,有利于其生物学应用。可将金属离子介导的二氧化硅材料表面DNA分子组装原理应用于DNA微阵列构建及生物传感中。此外,通过简单调整金属离子和DNA的种类,即可灵活地实现不同生物学应用,在生物分子纯化、核酸传递、生物传感和生物成像等领域具有很大的潜力。
Claims (3)
1.一种DNA修饰二氧化硅材料的方法,其特征在于,将DNA、金属离子与纳米二氧化硅材料在缓冲液中混合后孵育5min,使DNA固定于纳米二氧化硅材料表面;其中,DNA长度为>15bp且<100bp,DNA浓度为不大于300nM;纳米二氧化硅材料的浓度为100μg/mL;金属离子为Zr4+,金属离子的浓度不超过1mM;缓冲液为10mM Tris-HCl,pH7.4;DNA的修饰密度通过改变DNA或金属离子的浓度进行调节。
2.权利要求1所述的DNA修饰二氧化硅材料的方法制备得到的产物。
3.权利要求2所述的产物在核酸分子纯化、核酸分子传递、生物传感或生物成像中的应用。
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