CN102757790B - 表面修饰的荧光量子点/二氧化硅复合微球，其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗生物吸附的表面修饰的荧光量子点/二氧化硅复合微球，其制备方法和生物应用。本发明的方法的特征在于：首先采用反相微乳液法制备出荧光量子点/二氧化硅复合微球，继而在其表面共修饰生物相容性分子和活性功能基团。该方法具有工艺简单、操作简便的特点。表面修饰后的荧光量子点/二氧化硅复合微球不仅可以克服其对生物分子和细胞的非特异性相互作用，而且可以实现其对生物分子的共价耦联，从而构建了表面生物功能化的分子荧光探针。该分子荧光探针可进一步应用于细胞生物学，细菌检测，生物大分子检测和免疫荧光分析等领域。
Description
技术领域
本发明所属技术领域为材料化学、纳米科学、表面化学、化学生物学及生物医学领域，特别涉及一种抗生物吸附的荧光量子点/二氧化硅复合微球的制备方法及其生物应用，更具体地说，利用共修饰方法将生物相容性分子和活性功能基团同时修饰在荧光量子点/二氧化硅复合微球表面，从而构建可抗生物吸附的荧光量子点/二氧化硅荧光复合微球，然后对其共价耦联上具有不同生物功能的生物分子，获得表面生物功能化的可抗生物吸附的荧光量子点/二氧化硅荧光复合微球。
背景技术
基于无机半导体荧光纳米晶体(又称为荧光量子点)的分子荧光探针所具备的独特光学性质使其作为一种分子探针材料在生物医学领域显示出了巨大的应用前景。然而作为分子探针材料，由有机配体稳定的量子点表面具有动态性，因此，首先必须解决其生物相容性，表面可反应性，光化学稳定性以及细胞毒性等问题。半导体纳米晶体的荧光强烈依赖于拥有大量不饱和键的表面，因此构建合适的表面化学结构是解决量子点固有缺点和提高其荧光稳定性的有效途径。除了荧光强烈的表面依赖性，量子点虽然纳米晶体与传统染料相比具有很好的光稳定性，但是容易受到化学环境不利因素或光氧化条件的影响而分解产生有毒的重金属离子，并降低纳米晶体的荧光稳定性。此外，量子点在极端介质中易表现出化学或胶体的不稳定性，这些都限制了量子点在生物分析中的应用。纳米晶体的和生物相容性是纳米材料生物应用的前提条件。表面可反应性使纳米晶体耦联上生物大分子，为特异性识别其它生物分子提供条件。
在以上背景下，在量子点表面包覆一层特殊材料是最有效和最直接的解决办法。在众多包覆材料当中，二氧化硅被美国食品和药物管理局(FDA)认定为一般认为安全物质(GRAS)，因而基于二氧化硅的复合材料引起了人们极大的兴趣，且纳米结构的二氧化硅材料由于容易制备和具有广泛的用途从而在科学研究工作中占据着重要的地位。二氧化硅因此也被引入纳米晶体领域作为有效的包覆量子点的惰性材料之一，它一方面可以使油溶性量子点具有很好的水分散性，另一方面二氧化硅表面成熟的硅化学还为其进一步实现羧基，巯基，氨基和聚乙二醇等功能基团的修饰提供了丰富的选择。因此，二氧化硅包覆为构建适合于不同用途，种类丰富的基于量子点的荧光生物探针提供了一个理想的平台。因此，含有碲化镉量子点的二氧化硅微球可方便地与生物分子耦联，有望用于体外、体内标记生物分子，在生物分析上有广阔的应用前景。
为了充分利用量子点优异的光学性质，两个最重要的研究领域即纳米技术和生物技术的交叉研究工作，即纳米材料在生物医药领域中的应用尤为吸引人们的注意力。最近，核壳结构可控的复合有量子点的二氧化硅荧光纳米微粒已经取了一系列的研究成果(Adv.Mater.2005，17，2354；Chem.Mater.2007，19，4123；Chem.Mater.2010，22，420；200410009941)，然而这些高荧光效率的复合微球不能直接作为荧光探针，因为抗非特异性吸附和表面具有活性反应基团是制备基于纳米粒子的分子探针的必须条件。为了进一步将其应用于生物分析领域如细胞标记和生物检测，必须克服二氧化硅纳米微粒和生物分子及细胞表面的非特异性吸附的问题，并同时使二氧化硅纳米粒子的表面可以共价耦联上具有生物靶向的生物分子如抗体，受体，核酸和多肽等。
发明内容
1.本发明要解决的技术问题
本发明需要解决的技术问题是提供一种可抗生物吸附的荧光量子点/二氧化硅复合微球，其制备方法和生物应用，以克服现有纳米材料生物应用过程中面临的问题如与生物分子和细胞的非特异性相互作用，并且可以实现其与生物分子的共价耦联并明确保持生物分子的生物学活性。
2.用于解决技术问题的技术方案
本发明的一个方面提供一种表面共修饰有生物相容性分子和活性功能基团的荧光量子点/二氧化硅复合微球，其中：复合微球中含有单个或多个荧光量子点；壳层为二氧化硅材料；复合微球的粒径是15～200纳米。
在本发明的复合微球中，荧光量子点选自碲化镉、硒化镉、硫化镉中的任意一种。生物相容性分子包括分子中具有聚乙二醇部分的硅氧烷，所述的聚乙二醇的分子量为300～50000。生物相容性分子含有的硅氧基团可与二氧化硅微球表面的硅氧基团进行水解缩合聚合反应而修饰于微球表面，生物相容性分子优选选自：2-[甲氧基(聚氧乙烯)丙基]三甲氧基硅烷，2-[羟基(聚氧乙烯)丙基]三乙氧基硅烷；2-[乙酰氧基(聚氧乙烯)丙基]三乙氧基硅烷；3-[甲氧基聚(乙氧基)]丙基-甲基-双(三甲基硅氧基)硅烷；O-[烯丙基(聚氧乙烯)丙基]三甲氧基硅烷。
在本发明的复合微球中，所述活性功能基团是衍生自含羧基、氨基和巯基的硅氧烷中的一种。所述含羧基的硅氧烷包括：三羟基硅基乙酸钠，1，3-双(3-羧基丙基)四甲基二硅氧烷，三乙氧基硅基乙酸；所述含氨基的硅氧烷包括：3-氨基丙基三甲氧基硅烷，N-氨乙基-γ-氨丙基三乙氧基硅烷，3-氨基丙基二甲基乙氧基硅烷或氨基丙基三乙氧基硅烷；所述含巯基的硅氧烷包括：巯基异丙基三甲氧硅烷或巯基异丙基三乙氧基硅烷。
本发明的另一方面提供一种用于制备本发明的荧光量子点/二氧化硅复合微球的方法，所述方法包括使荧光量子点/二氧化硅复合微球与生物相容性分子和带有活性功能基团的分子反应，以得到表面共修饰有生物相容性分子和活性功能基团的荧光量子点/二氧化硅复合微球。
在本发明的方法中，荧光量子点/二氧化硅复合微球是通过反相微乳液法制备的。并且，荧光量子点/二氧化硅复合微球与生物相容性分子的摩尔比在1∶3.0×103～1∶3.0×107之间，优选1∶3.0×104～1∶3.0×106；荧光量子点/二氧化硅复合微球与活性功能基团的摩尔比在1∶5.0×103～1∶8.0×106之间，优选1∶1.0×104～1∶3.0×106。
本发明的又一方面提供本发明的荧光量子点/二氧化硅复合微球的生物应用，其特征是：表面共修饰有生物相容性分子和活性功能基团的荧光量子点/二氧化硅荧光复合微球可以共价耦联生物分子，如蛋白质，多肽，生物素，氨基酸，DNA的氨基衍生物或DNA的羧基衍生物及带有氨基或羧基的碳水化合物，且能同时保持生物分子的生物学活性。
3.本发明的有益效果
本发明的抗生物吸附的荧光量子点/二氧化硅荧光复合微球，具有光学性质稳定，胶体稳定性好的优点，充分提高了原始量子点在极端物理化学条件下的稳定性。
本发明的表面共化学修饰生物相容性分子和活性功能基团的操作简单，可重复性高，使大规模生产成为可能。
本发明的高度抗生物吸附的荧光量子点/二氧化硅荧光复合微球，该复合微球不但可以成功克服与生物分子的非特异性相互作用，还能够成功与生物分子进行共价耦联并保持生物分子的生物学活性。
本发明的高度抗生物吸附的荧光量子点/二氧化硅荧光复合微球的具有高度的生物相容性，且与生物分子的耦联物具有高度的生物学活性，在生物标记和生物分析检测领域具有巨大的应用价值。
本发明的高度抗生物吸附的荧光量子点/二氧化硅荧光复合微球共价耦联上抗体，受体，核酸等生物分子，可以广泛应用与各种生物分析领域中。
本发明将纳米材料，表面化学，化学生物学和生物医学有机结合，对构建基于纳米材料的抗生物吸附的并可实现与生物分子共价耦联的分子探针提供了重要的基础，同时为进一步拓展纳米材料的应用范围提供了可能性。
附图说明
图1本发明实施例1所得碲化镉荧光量子点的荧光光谱图。
图2本发明实施例4所得荧光量子点/二氧化硅复合微球的透射电镜(TEM)照片。
图3本发明实施例4所得的荧光量子点/二氧化硅复合微球水溶液的紫外吸收和荧光光谱图。
图4本发明实施例5所得荧光量子点/二氧化硅复合微球的透射电镜(TEM)照片。
图5本发明实施例6所得荧光量子点/二氧化硅复合微球的透射电镜(TEM)照片。
图6本发明实施例7的荧光量子点/二氧化硅复合微球在表面化学共修饰聚乙二醇和羧基基团前后的琼脂糖电泳荧光照片。
图7本发明实施例8的荧光量子点/二氧化硅复合微球在表面化学共修饰聚乙二醇和羧基基团前后的琼脂糖电泳荧光照片。
图8本发明实施例9的荧光量子点/二氧化硅复合微球在表面化学共修饰聚乙二醇和羧基基团前后的琼脂糖电泳荧光照片。
图9本发明实施例14表面生物功能化的抗特异性吸附荧光量子点/二氧化硅复合微球的琼脂糖电泳荧光照片。
图10本发明实施例15表面生物功能化的抗特异性吸附荧光量子点/二氧化硅复合微球的琼脂糖电泳荧光照片。
图11本发明实施例16表面生物功能化的抗生物吸附的荧光量子点/二氧化硅复合微球的琼脂糖电泳荧光照片。
图12本发明实施例16UM-SCC-22B癌细胞与抗生物吸附的荧光量子点/二氧化硅复合微球和抗EGFR单克隆抗体的耦联物孵育后的共聚焦显微镜照片。
图13本发明实施例16对照实验中M-SCC-22B癌细胞的共聚焦显微镜照片。
具体实施方式
本发明提供一种抗生物吸附的荧光量子点/二氧化硅荧光复合微球，具备明确的核壳结构：含有单个或多个荧光量子点，壳为二氧化硅材料，二氧化硅表面共修饰有生物相容性分子和带有活性功能基团的分子。两种分子共修饰于二氧化硅微球的表面。复合微球的粒径是15～200纳米。该复合微球具有抗生物非特异性吸附性能，且可以共价耦联生物分子并保持其生物学活性。
在本发明的抗生物吸附的荧光量子点/二氧化硅荧光复合微球中，荧光量子点为II-VI族半导体纳米材料，主要是碲化镉、硒化镉、硫化镉的任意一种。
本发明还提供一种抗生物吸附的荧光量子点/二氧化硅荧光复合微球的制备方法，该技术方法工艺简单，具有可操作性。
本发明另外提供抗生物吸附的荧光量子点/二氧化硅荧光复合微球的生物应用，所述生物应用一方面指该微球表面具有生物相容性分子可以克服微球与生物分子和细胞的非特异性吸附作用，另一方面由于该微球表面同时具有活性功能基团可以与生物分子共价耦联，且保持生物分子的生物学活性。
本发明首先制备高质量的荧光量子点，然后以荧光量子点、氨水混合物为水相，非极性有机溶剂为油相，非离子型表面活性剂和助乳化剂为混合乳化剂及阳离子聚电解质形成反相微乳液，常温下水解硅氧烷形成复合微球，纯化后得到荧光量子点/二氧化硅荧光复合微球。在以上复合微球的缓冲液中共同加入生物相容性分子和带有活性功能基团的分子，室温反应后纯化后即可获得表面生物相容性分子和活性功能基团的荧光复合微球。
本发明的抗生物吸附的含有荧光量子点/二氧化硅荧光微球的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)含有荧光量子点/二氧化硅复合微球的制备方法按照已有文献制备(M.Y.Gao et al，J.Phys.Chem.，1998，102，8360；Y.J.Gong et al，Chem.Mater.，2005，17，2648；Y.H.Yang et al，Adv.Mater.，2005，17，2354；L.H.Jing et al，Chem.Mater.，2010，22，420-427)，制备荧光量子点的具体过程如下：将镉盐(包括高氯酸镉、氯化镉、醋酸镉)配制成0.001mol/L～0.15mol/L，优选0.005mol/L～0.05mol/L之间的溶液，随后加入巯基修饰剂(镉盐与巯基修饰剂的摩尔比在1∶1～1∶5之间，优选1∶1.0～1∶2.5之间)，调节其pH值在10～13范围，优选11.0～12.5。然后将碲(硫，硒)源前躯体直接引入上述镉盐前躯体溶液中(镉与碲(硫，硒)的摩尔比在1∶0.2～1∶1之间，优选1∶0.2～1∶0.6)，搅拌反应10～30分钟后加热回流该溶液。控制回流时间，得到尺寸可调的荧光发射峰位几乎覆盖整个可见光区的荧光量子点。
荧光量子点/二氧化硅复合微球的具体制备过程(反相微乳液法)如下：向荧光量子点水溶液中加入氨水溶液，混合形成量子点的碱溶液，其中量子点水溶液与氨水的体积比在1∶0.1～1∶10之间，优选1∶0.5～1∶8，量子点溶液的浓度在0.000001～0.001mol/L之间，优选0.0001～0.001mol/L之间；氨水终浓度在0.25wt％～5wt％。将荧光量子点与氨水碱溶液作为水相与非离子型表面活性剂和乳化剂和非极性有机溶剂(加或不加阳离子聚合物电解质水储备液混合)形成油包水型(W/O)反相微乳液。其中水与非离子型表面活性剂的摩尔比在2∶1～40∶1之间，优选4∶1～30∶1；水与非极性有机溶剂的体积比在1∶5～1∶50之间，优选1∶10～1∶25；助乳化剂与非离子型表面活性剂的体积比在0～1∶10之间，优选1∶1～1∶5；阳离子聚电解质溶液与水相的体积比在0～1∶500之间，优选0～1∶200；阳离子聚合物电解质水储备液的浓度在1.0×10-2wt％～4.0×10-1wt％之间，优选4.0×10-2wt％～1.0×10-1wt％；水与硅氧烷的摩尔比在4∶1～100∶1之间，优选10∶1～50∶1。搅拌反应1～6天后，加入异丙醇或丙酮作为破乳剂，其中的破乳剂的体积是反相微乳液体积的1～5倍；沉淀出二氧化硅荧光复合微球，经过醇和水离心洗涤分离纯化后重新分散在水中，形成稳定的荧光量子点/二氧化硅荧光复合微球的水溶液体系。
(2)将步骤(1)所得到的荧光量子点/二氧化硅荧光复合微球分散于pH值为6.0～9.5的缓冲液中，然后向该溶液中同时加入生物相容性分子和带有活性功能基团的分子，室温反应1～24小时。其中荧光复合微球与生物相容性分子的摩尔比在1∶3.0×103～1∶3.0×107之间，优选1∶3.0×104～1∶3.0×106；荧光复合微球与活性功能基团的摩尔比在1∶5.0×103～1∶8.0×106之间，优选1∶1.0×104～1∶3.0×106。反应结束后，将产物离心纯化之后重新分散于缓冲液中，形成表面共修饰有生物相容性分子和活性功能基团的，可抗生物吸附的荧光量子点/二氧化硅荧光复合微球。
所述生物相容性分子是分子中具有聚乙二醇部分的硅氧烷，其中所述的聚乙二醇部分的分子量为300～50000。所述硅氧烷分子上的硅氧基团通过与二氧化硅微球表面的硅氧基团进行水解缩合反应而修饰到复合微球表面。分子中具有聚乙二醇部分的硅氧烷可以从美国Gelest公司购买得到，其具体例子如2-[甲氧基(聚氧乙烯)丙基]三甲氧基硅烷(2-[methoxy(polyethyleneoxy)-propyl]trimethoxysilane)，2-[羟基(聚氧乙烯)丙基]三乙氧基硅烷([hydroxy(polyethylyeneoxy)propyl]triethoxysilane)；2-[乙酰氧基(聚氧乙烯)丙基]三乙氧基硅烷(2-[(acetoxy(polyethyleneoxy)propyl]triethoxysilane)；2-[甲氧基(聚氧乙烯)]丙基-甲基-双(三甲基硅氧基)硅烷(2-[methoxy(polyethyleneoxy)propyl]heptamethyltrisiloxane)；O-[烯丙基(聚氧乙烯)丙基]三甲氧基硅烷(O-allyloxy(polyethyleneoxy)trimethylsilane)。
所述活性功能基团是选自羧基、氨基和巯基中的一种。所述羧基、氨基和巯基分别衍生自含羧基、氨基或巯基的硅氧烷。其反应机理是通过含羧基、氨基或巯基的硅氧烷分子上的硅氧基团与二氧化硅微球表面的硅氧基团进行水解缩合反应修饰到复合微球表面。本发明中使用的含羧基、氨基或巯基的硅氧烷可以从美国Gelest公司购买得到。含羧基的硅氧烷的具体例子包括三羟基硅基乙酸钠(carboxyethylsilanetriol，sodium salt)；二氢-3-[3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2，5-二酮(3-(triethoxysilyl)propylsuccinicanhydride)；1.3-双(3-羧基丙基)四甲基二硅氧烷(1，3-bis(3-carboxypropyl)tetramethyldisiloxane)；三乙氧基硅基乙酸(carboxymethyltriethoxysilane)。含氨基的硅氧烷的具体例子包括3-氨基丙基三甲氧基硅烷(3-aminopropyltrimethoxysilane)，N-氨乙基-γ-氨丙基三乙氧基硅烷(N-[3-trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine)，3-氨基丙基二甲基乙氧基硅烷(3-aminopropyldimethylethoxysilane)或氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane)。含巯基的硅氧烷的具体例子包括巯基异丙基三甲氧硅烷((3-mercaptopropyl)trimethoxysilane)或巯基异丙基三乙氧基硅烷((3-mercaptopropyl)triethoxysilane)。
所述的缓冲液是磷酸盐缓冲液(磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(PB)，磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液-钠(钾)盐(PBS)，磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液)，Tris-硼酸缓冲液(TB)，磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液，硼酸-硼砂缓冲液，甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，硼砂-氢氧化钠缓冲液。
所述的量子点是碲化镉，硫化镉和硒化镉荧光量子点中的任意一种，量子点的稳定剂(表面修饰剂)选自巯基乙酸，巯基丙酸，巯基甘油，硫辛酸，二巯基丁二酸中的一种或两种以上的混合物。
所述的非离子型表面活性剂是十二烷基聚氧乙烯醚(polyoxyethylene-(n)-dodecyl ether，如十二烷基四氧乙烯醚)、壬基苯基聚氧乙烯醚(polyoxyethylene-(n)-nonylphenyl ether，如Triton N-42(n＝4)，Triton N-57(n＝5)，Triton N-60(n＝6)，Triton N-101(n＝9～10))、辛基苯基聚氧乙烯醚(polyoxyethylene-(n)-octylphenyl ether，如Triton X-15(n＝1)，Triton X-35(n＝3)，Triton X-45(n＝5)，Triton X-100(n＝9～10))、十二烷基苯基聚氧乙烯醚(polyoxyethylene-(n)-dodecylphenyl ether，如DP-6(n＝6))或1-油酸山梨糖酸酐酯(如span 80)中的任意一种。
所述的助乳化剂是正己醇，戊醇或丁醇中的任意一种。
所述的醇是正己醇，戊醇，丁醇，异丙醇或者乙醇中的任意一种。
所述的非极性有机溶剂是正庚烷，环己烷，正己烷，戊烷，苯，氯苯，甲苯，三氯甲烷或二氯甲烷中的任意一种。
所述的阳离子聚合物电解质是聚二烯丙基二甲基氯化铵(Poly(diallyldimethylammonium chloride))，聚乙烯亚胺(Poly(ethyleneimine)或它们的混合物。
本发明所述的抗生物吸附的含有荧光量子点的二氧化硅荧光微球与生物分子共价耦联，即表面生物功能化的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)将采用常规方法对表面修饰有生物相容性分子和活性功能基团的荧光量子点/二氧化硅荧光复合微球进行共价耦联，首先将表面带有羧基的二氧化硅复合微球或生物分子分散于水介质中，pH为6.5～8.5的生理缓冲液中配成溶液，然后向该溶液中加入耦联活化剂EDC(1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)和Sulfo-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)将二氧化硅表面的羧基基团进行活化，室温下反应10～30min，然后向反应液中加入表面带有氨基，pH值为6.5～8.5的生物分子或二氧化硅复合微球，混匀之后，37℃反应1～4小时，然后将反应产物离心纯化后重新分散于缓冲液中；
(2)与步骤(1)同步进行，同时作为抗生物吸附的含有荧光量子点的二氧化硅荧光微球对生物分子的非特异性相互作用的考察，以及作为步骤(1)的对照实验。直接将表面共修饰有生物相容性分子和活性功能基团的荧光量子点/二氧化硅荧光复合微球与生物分子简单混合，即不加耦联活化剂EDC和Sulfo-NHS，其他条件完全等同于步骤(1)中耦联反应的参数，最后将混合物用缓冲液离心洗涤得到吸附生物分子后的二氧硅球微球，最后分散于缓冲液中；
(3)用琼脂糖凝胶电泳技术表征表面共修饰有生物相容性分子和活性功能基团的抗生物吸附的荧光量子点/二氧化硅荧光复合微球，抗生物吸附的荧光量子点/二氧化硅荧光复合微球与生物分子的耦联物，抗生物吸附的荧光量子点/二氧化硅荧光复合微球与生物分子混合吸附后。
本发明所述的生物分子包括蛋白质，多肽，生物素，氨基酸，DNA的氨基衍生物或DNA的羧基衍生物及带有氨基或羧基的碳水化合物。
实施例
实施例1：
称取0.631g高氯酸镉(Cd(ClO4)2·6H2O)加入到75mL除氧的二次去离子水中，随后加入0.182g巯基甘油和0.058g巯基乙酸稳定剂，再用NaOH水溶液将其pH值调至12.0，形成含有巯基化合物和镉离子的溶液。另一方面，取7.5mL 0.5mol/L硫酸溶液注入到盛有0.129g碲化铝(Al2Te3)的烧瓶中，将生成的H2Te全部通入上述镉离子溶液中，搅拌30分钟后，加热回流10分钟到10天，得到巯基甘油与巯基乙酸共同稳定、荧光发射中心峰位在510～700纳米之间的碲化镉荧光量子点水溶液。荧光光谱见图1。
实施例2：
称取0.70g高氯酸镉(CdCl2·2H2O)加入到75mL除氧的二次去离子水中，随后加入0.185g巯基乙酸稳定剂，然后按照Cd∶S2-＝1∶0.5加入Na2S水溶液，再用NaOH水溶液将其pH值调至12.0，将溶液加热回流，得到巯基乙酸稳定、荧光发射中心峰位在450～550纳米之间的水溶性硫化镉荧光量子点水溶液。
实施例3：
称取0.495g氯化镉(CdCl2·2.5H2O)加入到75mL除氧的二次去离子水中，随后加入0.213g巯基丙酸稳定剂，再用NaOH水溶液将其pH值调至12.0，形成含有巯基化合物和镉离子的溶液。其余步骤同实施例1，得到巯基丙酸稳定、荧光发射中心峰位在510～750纳米之间的碲化镉荧光量子点水溶液。
实施例4：
取实施例1的巯基甘油-巯基乙酸稳定的碲化镉荧光量子点(荧光发射中心峰位在611纳米)2mL，异丙醇沉淀洗涤一次，重新分散于0.6wt％氨水与15.9×10-3mol/L氢氧化纳所组成的碱溶液中待用。取Triton X-100 5mL，环己烷30mL，正己醇3mL混合得到透明体系，然后在混合液中加入40μL聚二烯丙基二甲基氯化铵水溶液，其浓度为12.8mmol/L。然后将碲化镉量子点/氨水碱溶液的混合液加入到上述体系中，搅拌得到透明的反相微乳液体系。然后加入400μL四乙氧基硅烷继续搅拌反应。反应4天后结束，加入异丙醇沉淀出二氧化硅微球，离心之后将得到离心产物依次用乙醇和水洗涤，除去油相溶剂，表面活性剂，未反应的四乙氧基硅烷和未包覆进去的碲化镉量子点，得到碲化镉荧光量子点/二氧化硅荧光复合微球。由图2电镜照片中可以看到，一个二氧化硅微球中碲化镉荧光量子点的数目平均为6个。图3为复合荧光微球的紫外吸收及荧光光谱图。
实施例5：
取实施例2硫化镉的巯基乙酸稳定的硫化镉荧光量子点(荧光发射中心峰位在550纳米)100μL，稀释到500μL，取250μL与250μL氨水(浓度为2wt％)混合。同时加入Triton X-100 1.77mL，环己烷7.5mL，正己醇1.8mL混合得到透明体系，然后将硫化镉/氨水的混合液480μL加入到上述体系中，搅拌得到透明的反相微乳液。最后加入100μL四乙氧基硅烷继续搅拌。三天后结束反应，加入异丙醇沉淀出二氧化硅微球，纯化过后分散在水中，得到碲化镉量子点/二氧化硅复合荧光微球。由电镜照片图4中可以看到，一个二氧化硅微球中硫化镉荧光量子点的数目为1个。
实施例6：
取实施例1的巯基甘油-巯基乙酸稳定的碲化镉荧光量子点(荧光发射中心峰位在610纳米)100μL，稀释到500μL，取250μL与250μL氨水(浓度为25wt％)混合。向混合液中加入10μL浓度为4×10-3wt％聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液，其余操作与具体实施例4的步骤相同。从所得的电镜照片图5，一个二氧化硅复合微球中碲化镉荧光量子点的数目约为9个。
实施例7：
取实施例4的20mg含有碲化镉荧光量子点/二氧化硅复合微球，分散于1mL的水溶液中，按照硅球与三羟基硅基乙酸钠的优选摩尔比例为1∶264000加入40μL的三羟基硅基乙酸钠，再按照硅球与2-[甲氧基(聚氧乙烯)丙基]三甲氧基硅烷的优选比例1∶143250加入20μL的2-[甲氧基(聚氧乙烯)丙基]三甲氧基硅烷，然后再加入20×PB储备液将反应体系调至为pH＝7.4的1×PB缓冲液中，摇床中室温反应24小时。反应结束后，用PB缓冲液将反应产物离心超生洗涤三次后，最终分散在1mL的超纯水中。图6分别为琼脂糖电泳结束后在紫外灯照射下的荧光照片。其中泳道1为表面修饰前的碲化镉荧光量子点/二氧化硅复合微球，泳道2为表面修饰后的碲化镉荧光量子点/二氧化硅复合微球。
实施例8：
取实施例4的20mg碲化镉荧光量子点/二氧化硅复合微球，分散于1mL的水溶液中，按照硅球与三羟基硅基乙酸钠的优选摩尔比例为1∶66000加入10μL的三羟基硅基乙酸钠，然后按照硅球与2-[甲氧基(聚氧乙烯)丙基]三甲氧基硅烷的优选比例1∶143250加入20μL的2-[甲氧基(聚氧乙烯)丙基]三甲氧基硅氧烷。其余操作步骤同实施例7。图7分别为琼脂糖电泳结束后在紫外灯照射下的荧光照片。其中泳道1为表面修饰前的碲化镉荧光量子点/二氧化硅复合微球，泳道2为表面修饰后的碲化镉荧光量子点/二氧化硅复合微球。
实施例9：
取实施例4的20mg碲化镉荧光量子点/二氧化硅复合微球，分散于1mL的水溶液中，然后，按照硅球与三羟基硅基乙酸钠的优选摩尔比例为1∶66000加入10μL的三羟基硅基乙酸钠，再按照硅球与2-[甲氧基(聚氧乙烯)丙基]三甲氧基硅烷的优选比例1∶35813加入5μL的2-[甲氧基(聚氧乙烯)丙基]三甲氧基硅烷，其余操作步骤同实施例7。图8为琼脂糖电泳结束后的紫外灯照射下的荧光照片。其中泳道1为表面修饰前的碲化镉荧光量子点/二氧化硅复合微球，泳道2为表面修饰后的碲化镉荧光量子点/二氧化硅复合微球。
实施例10：
取实施例4的20mg碲化镉荧光量子点/二氧化硅复合微球，分散于1mL的水溶液中，然后，按照硅球与三羟基硅基乙酸钠的优选摩尔比例为1∶66000加入10μL的三羟基硅基乙酸钠，再按照硅球与3-[甲氧基(聚乙氧基)]丙基-甲基-双(三甲基硅氧基)硅烷的优选比例1∶35813加入5μL的3-[甲氧基(聚乙氧基)]丙基-甲基-双(三甲基硅氧基)硅烷，其余操作步骤同实施例7。得到表面修饰后的碲化镉荧光量子点/二氧化硅复合微球。
实施例11：
取实施例4的20mg碲化镉荧光量子点/二氧化硅复合微球，分散于1mL的水溶液中，然后，按照硅球与3-氨基丙基三甲氧基硅烷的优选摩尔比例为1∶33000加入5μL的3-氨基丙基三甲氧基硅烷，再按照O-[烯丙基(聚氧乙烯)丙基]三甲氧基硅烷的优选比例1∶35813加入5μL的O-[烯丙基(聚氧乙烯)丙基]三甲氧基硅烷，其余操作步骤同实施例7。得到表面修饰后的碲化镉荧光量子点/二氧化硅复合微球。
实施例12：
取实施例4的20mg碲化镉荧光量子点/二氧化硅复合微球，分散于1mL的水溶液中，然后，按照硅球与巯基异丙基三甲氧硅烷的优选摩尔比例为1∶33000加入5μL的巯基异丙基三甲氧硅烷，再按照O-[烯丙基(聚氧乙烯)丙基]三甲氧基硅烷的优选比例1∶35813加入5μL的O-[烯丙基(聚氧乙烯)丙基]三甲氧基硅烷，其余操作步骤同实施例7。得到表面修饰后的碲化镉荧光量子点/二氧化硅复合微球。
实施例13：
取实施例5的20mg硫化镉荧光量子点/二氧化硅复合微球，分散于1mL的水溶液中，然后，按照硅球与三羟基硅基乙酸钠的优选摩尔比例为1∶66000加入5μL的三羟基硅基乙酸钠，再按照O-[烯丙基(聚氧乙烯)丙基]三甲氧基硅烷的优选比例1∶35813加入5μL的O-[烯丙基(聚氧乙烯)丙基]三甲氧基硅烷，其余操作步骤同实施例7。得到表面修饰后的硫化镉荧光量子点/二氧化硅复合微球。
实施例14：
将实施例8中的表面共修饰有聚乙二醇和羧基基团的碲化镉荧光量子点/二氧化硅荧光微球分散于0.01mol/L PB中配成20mg/mL的溶液，取该溶液0.55mL，加入0.194μL的EDC(1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)和0.589mg的Sulfo-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)将二氧化硅表面的羧基基团进行活化，室温下反应30min，然后向反应液中加入84.7μL10mg/mL的羊抗人二抗(Goat anti-Human IgG，GaHIgG)的1×PB(pH＝7.4)，混匀之后，37℃反应4小时。与此同时，对该样品非特异性吸附进行考察的实验同时也是上述耦联实验的对照实验，将表面共修饰有聚乙二醇和羧基基团的碲化镉荧光量子点/二氧化硅荧光微球与抗体的进行简单混合，与上述耦联反应相比，除了不加EDC和Sulfo-NHS之外，其余实验条件及操作步骤完全相同。反应结束后，耦联产物和对照实验样品进行离心洗涤纯化，最后分散于缓冲液中。然后采用0.5％(w/v)的琼脂糖电泳技术检测上述耦联反应及非特异性吸附实验。附图9为耦联物及其对照样在电泳结束后在紫外照射下的荧光照片。1#是表面共修饰有聚乙二醇和羧基基团的碲化镉荧光量子点/二氧化硅荧光微球；2#是表面共修饰有聚乙二醇和羧基基团的碲化镉荧光量子点/二氧化硅荧光微球与羊抗人二抗的耦联物；3#是表面共修饰有聚乙二醇和羧基基团的碲化镉荧光量子点/二氧化硅荧光微球与羊抗人二抗的混合物。通过比较三个样品的电泳条带发现，耦联物的迁移速率比纯样品和混合物要慢，这是由于抗体耦联在硅球表面之后导致硅球尺寸增加所致；混合物的电泳条带几乎和纯样品没有差异，但是和耦联物的前沿有大差异，条带亦和纯样品及耦联物重叠较小，说明经过聚乙二醇和羧基共修饰后的复合荧光微球与抗体生物分子几乎没有非特异性吸附；通过比较耦联物和混合物的迁移率可以推断，耦联物中的抗体与表面共修饰有聚乙二醇和羧基基团的碲化镉荧光量子点/二氧化硅荧光微球是通过共价耦联的，而不是非特异性相互作用。电泳结果说明表面共修饰有聚乙二醇和羧基基团的碲化镉荧光量子点/二氧化硅复合微球具有较高的生物相容性，抗非特异性吸附生物分子，且其表面可以共价耦联生物分子从而使其表面生物功能化得以实现。
实施例15：
将实施例9中的表面共修饰有聚乙二醇和羧基基团的碲化镉荧光量子点/二氧化硅荧光微球与生物分子进行耦联，同时考察其与生物分子的非特异性吸附。实验操作过程完全同于实施例14。附图10为耦联物及其对照样在电泳结束后在紫外照射下的荧光照片。1#是表面共修饰有聚乙二醇和羧基基团的碲化镉荧光量子点/二氧化硅复合微球；2#是表面共修饰有聚乙二醇和羧基基团的碲化镉荧光量子点/二氧化硅荧光微球与羊抗人二抗的耦联物；3#是表面共修饰有聚乙二醇和羧基基团的碲化镉荧光量子点/二氧化硅荧光微球与羊抗人二抗的混合物。通过比较三个样品的电泳条带发现，耦联物的迁移速率比纯样品要慢得多，这是由于抗体耦联在硅球表面之后导致硅球尺寸增加所致；通过比较耦联物和混合物的迁移率速度可以推断，耦联物中的抗体与表面共修饰有聚乙二醇和羧基基团的碲化镉荧光量子点/二氧化硅复合微球是通过共价耦联的，而不是非特异性相互作用；混合物的电泳条带和纯样品的差异较小，但是和耦联物的电泳条带几乎没有交叠。以上实验说明，说明经过聚乙二醇和羧基共修饰后的复合荧光微球和抗体生物分子没有非特异性吸附，且可以实现共价耦联。
实施例16：
将实施例9中的表面共修饰有聚乙二醇和羧基基团的碲化镉荧光量子点/二氧化硅复合微球与抗EGFR(Epidermal growth factor receptor，表皮生长因子受体)单克隆抗体进行共价耦联。实验操作过程完全同于实施例14。附图11为耦联物的琼脂糖电泳结果。研究表明在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达，且EGFR与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。因此所制备的荧光复合硅球与抗EGFR单克隆抗体的耦联物作为针对EGFR靶点的分子荧光探针，能够竞争性抑制内源性配体与肿瘤细胞组织上过表达的EGFR的结合，阻断由EGFR介导的下游信号传导通路，从而抑制肿瘤细胞增殖、诱导分化，促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤血管生成，增强放、化疗疗效。是目前治疗肿瘤的一种新思路。所制备的荧光硅球与抗EGFR单克隆抗体的耦联物标记过表达有EGFR的细胞的步骤如下：将细胞膜上过表达有EGFR的人类头颈癌细胞UM-SCC-22B首先用1％BSA的1×PBS溶液在37℃孵育1小时，PBS洗涤三次之后，加入100μL的1mg/mL的荧光硅球与抗EGFR单克隆抗体的耦联物，在4℃孵育18小时孵育后，PB洗涤三次，用荧光共聚焦显微镜检测标记效果。附图12为耦联物标记UM-SCC-22B后的荧光共聚焦显微镜图片。图a，图b，分别为暗场和明场图片。从图a可以明显看出，癌细胞已经明显标记上荧光耦联物，明场进一步证明荧光耦联物是标记于细胞膜表面，说明癌细胞已经成功通过荧光微球表面的抗EGFR单克隆抗体与细胞膜表面的EGFR特异性结合作用从而将分子探针标记与细胞膜表面。对照实验，即未抗EGFR单克隆抗体的荧光微球与细胞的相互作用，如图13所示，细胞几乎没有荧光，说明纯样品与细胞没有非特性吸附作用。进一步证实了碲化镉荧光量子点/二氧化硅荧光微球的表面共修饰有聚乙二醇和羧基基团，并且可以与抗EGFR单克隆抗体进行耦联，且能保持抗EGFR单克隆抗体的生物学活性。
实施例17：
将实施例9中的表面共修饰有聚乙二醇和羧基基团的碲化镉荧光量子点/二氧化硅荧光复合微球与抗CEA(carcinoembryonic antigen)单克隆抗体rch 24进行共价耦联。实验参数完全同于实施例14。所获得的表面共修饰有聚乙二醇和羧基基团的碲化镉荧光量子点/二氧化硅荧光复合微球与抗CEA(carcinoembryonic antigen)单克隆抗体rch 24的耦联物，可应用于特异性识别人结肠癌细胞LS 180表面的CEA抗原。
实施例18：
将实施例9中的表面共修饰有聚乙二醇和羧基基团的碲化镉荧光量子点/二氧化硅荧光复合微球与Her-2人源化抗体chC 25进行共价耦联。实验参数完全同于实施例14。所获得的表面共修饰有聚乙二醇和羧基基团的碲化镉荧光量子点的二氧化硅荧光微球与抗Her-2人源化抗体chC 25的耦联物，这种耦联物可特异性识别和人胃癌细胞N 87表面的Her-2抗原。
实施例19：
将实施例9中的表面共修饰有聚乙二醇和羧基基团的碲化镉荧光量子点/二氧化硅荧光复合微球与二抗进行共价耦联。实验操作过程完全同于实施例14。得到的荧光复合微球与二抗耦联物可作为二抗分子荧光探针壳应用于与之识别的一抗的分离，以及各种生物分析和免疫荧光分析检测应用中。
实施例20：
将实施例9中的表面共修饰有聚乙二醇和羧基基团的碲化镉荧光量子点/二氧化硅荧光复合微球与一抗进行共价耦联。实验操作过程完全同于实施例14。得到的荧光复合微球与一抗耦联物可作为一抗分子荧光探针壳应用于与之识别的二抗的分离，以及各种生物分析和免疫荧光分析检测应用中。
实施例21：
将实施例9中的表面共修饰有聚乙二醇和羧基基团的碲化镉荧光量子点/二氧化硅荧光复合微球与细菌的单克隆抗体进行共价耦联。实验操作过程完全同于实施例14。得到的荧光微球与细菌的单克隆抗体的耦联物可作为分子荧光探针标记和检测待测溶液中与之可以特异性结合的细菌上，然后通过分级离心的方法，依次将细菌和未与细菌结合的硅球分离下来，通过检测荧光的方法确定耦联物是否结合与细菌上。由于耦联物是具有抗待检测细菌的特异性抗体的分子荧光探针，因此该检测方法的特异性较高，同时由于细菌表面具有大量的抗原，因此一个细菌上可以结合大量的耦联物，从而使单细菌检测成为可能。
从上述各个实施例以及其余的实验中，我们可以得出以下结论：(1)采用化学共修饰方法可以使荧光量子点/二氧化硅荧光复合微球同时具有聚乙二醇和活性功能基团，所获得的抗生物吸附的荧光量子点/二氧化硅荧光复合微球可以明显克服其与生物分子及细胞的非特异性相互作用(2)抗生物吸附的荧光量子点/二氧化硅荧光复合微球可以成功与生物靶向分子进行共价耦联，并且耦联物仍然具有生物活性，从而成功实现了荧光微球的表面生物功能化；(3)可抗生物吸附的表面生物功能化的荧光量子点/二氧化硅荧光复合微球作为分子荧光探针，可成功应用于免疫荧光检测，细胞标记，以及生物分析等领域。
Claims (12)
1.一种通过反相微乳液法制备表面共修饰有生物相容性分子和活性功能基团的荧光量子点/二氧化硅复合微球的方法，所述方法包括使荧光量子点/二氧化硅复合微球与生物相容性分子和带有活性功能基团的分子反应，其中所述生物相容性分子是分子中具有聚乙二醇部分的硅氧烷，所述带有活性功能基团的分子是含羧基、氨基或巯基的硅氧烷分子，以得到所述荧光量子点/二氧化硅复合微球，其中所述荧光量子点是无机半导体荧光纳米晶体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：荧光量子点/二氧化硅复合微球与生物相容性分子的摩尔比在1∶3.0×103～1∶3.0×107之间；荧光量子点/二氧化硅复合微球与活性功能基团的摩尔比在1∶5.0×103～1∶8.0×106之间。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述荧光量子点/二氧化硅复合微球与生物相容性分子的摩尔比为1∶3.0×104～1∶3.0×106。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述荧光量子点/二氧化硅复合微球与活性功能基团的摩尔比为1∶1.0×104～1∶3.0×106。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述荧光量子点/二氧化硅复合微球与活性功能基团的摩尔比为1∶1.0×104～1∶3.0×106。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述的荧光量子点选自碲化镉、硒化镉、硫化镉中的任意一种。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物相容性分子中包含的聚乙二醇部分的分子量为300～50000。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述分子中具有聚乙二醇部分的硅氧烷选自：2-[甲氧基(聚氧乙烯)丙基]三甲氧基硅烷，2-[羟基(聚氧乙烯)丙基]三乙氧基硅烷；2-[乙酰氧基(聚氧乙烯)丙基]三乙氧基硅烷；3-[甲氧基聚(乙氧基)]丙基-甲基-双(三甲基硅氧基)硅烷；O-[烯丙基(聚氧乙烯)丙基]三甲氧基硅烷。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述含羧基的硅氧烷包括：三羟基硅基乙酸钠，1，3-双(3-羧基丙基)四甲基二硅氧烷，三乙氧基硅基乙酸；所述含氨基的硅氧烷包括：3-氨基丙基三甲氧基硅烷，N-氨乙基-γ-氨丙基三乙氧基硅烷，3-氨基丙基二甲基乙氧基硅烷或氨基丙基三乙氧基硅烷；所述含巯基的硅氧烷包括：巯基异丙基三甲氧硅烷或巯基异丙基三乙氧基硅烷。
10.一种由上述权利要求1-9中任一项所述的方法制备得到的表面共修饰有生物相容性分子和活性功能基团的荧光量子点/二氧化硅复合微球，其中：复合微球中含有单个或多个荧光量子点；壳层为二氧化硅材料；复合微球的粒径是15～200纳米；所述荧光量子点是无机半导体荧光纳米晶体。
11.根据权利要求10所述的荧光量子点/二氧化硅复合微球的生物应用，其特征是：表面共修饰有生物相容性分子和活性功能基团的荧光量子点/二氧化硅荧光复合微球用于与生物分子共价耦联，且能同时保持生物分子的生物学活性。
12.根据权利要求11所述的应用，其中所述生物分子是蛋白质，多肽，生物素，氨基酸，DNA的氨基衍生物或DNA的羧基衍生物及带有氨基或羧基的碳水化合物。
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