CN108318693B - 脱碱基核酸内切酶磁性分子印迹纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脱碱基核酸内切酶磁性分子印迹纳米颗粒及其制备方法和应用。将二氧化硅包覆的磁核作为载体，将与APE1有强亲和作用的亲和素作为功能单体修饰在二氧化硅包覆的磁核表面，以APE1为模板分子、以聚合材料作为单体和交联剂形成印迹层，最后将APE1模板洗脱形成印迹空腔，从而得到磁性分子印迹纳米颗粒。该方法制备的磁性分子印迹纳米颗粒对模板蛋白APE1具有亲和性高、选择性好、抗干扰能力强及结合和解吸附速度快的优点。该制备技术过程简单、反应可控且印迹效率高。本发明制备的磁性分子印迹纳米颗粒可以对复杂生物样品中的低丰度APE1进行选择性识别、分离和富集，具有工业化生产价值。

Description

脱碱基核酸内切酶磁性分子印迹纳米颗粒及其制备方法和 应用

技术领域

本发明属于材料制备技术领域，涉及磁性分子印迹纳米颗粒的制备、表征及其在目标蛋白的专一性识别、分离和富集等方面的应用，具体涉及脱碱基核酸内切酶磁性分子印迹纳米颗粒及其制备方法和应用。

背景技术

脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1/氧化还原效应因子-1(简称脱碱基核酸内切酶 1，APE1)是DNA碱基切除修复中的一种重要的核酸修复酶，主要存在于细胞核内，对维持基因的稳定性和人体的健康有着重要的意义。APE1亦作为体内的氧化还原因子，调控细胞的氧化应激响应(Evans A R,Limp-Foster M,Kelley M R. Going APE over ref-1.MutationResearch/DNA Repair(2000),461(2):83-108.)。

近年来的研究表明，APE1的表达量及其在细胞内分布的变化与癌细胞(如非小细胞肺癌，乳腺癌和前列腺癌等)的增殖、分化和凋亡等密切相关。比如， APE1在非小细胞肺癌肿瘤中高表达，与肿瘤恶性程度、肿瘤放疗、化疗以及靶向治疗耐药相关；在正常乳腺组织中，APE1主要定位于细胞核，而在乳腺癌细胞中，APE1同时分布于细胞核和细胞质内。此外，APE1只在核内分布与良好的预后特征相关，比如代表着更好的分化，低血管生成和阴性淋巴结状态等； APE1在细胞质的分布及其在细胞核与细胞质内均有分布则与不良预后因素相关。在甲状腺癌和前列腺癌中也观察到APE1在细胞核和细胞质内分布比例发生变化(M.R.Kelley,L.Cheng,R.Foster,R.Tritt,J.Z.Jiang,J.Broshears,M.Koch, Elevatedand altered expression of the multifunctional DNA base excision repair andredox enzyme Ape1/ref-1 in prostate cancer.Clin Cancer Res.,2001,7,824-830；H.H.Wu,Y.W.Cheng,J.T.Chang,T.C.Wu,W.S.Liu,C.Y.Chen,H.Lee, Subcellularlocalization of apurinic endonuclease 1 promotes lung tumor aggressivenessvia NF-kappa B activation.Oncogene,2010,29,4330-4340；M.L. Fishel,Y.He,A.M.Reed,H.Chin-Sinex,G.D.Hutchins,M.S.Mendonca,M.R. Kelley,Knockdown of theDNA repair and redox signaling protein Ape1/Ref-1 blocks ovarian cancer celland tumor growth.DNA Repair 2008,7,177-186；S. Kakolyris,L.Kaklamanis,K.Engels,S.B.Fox,M.Taylor,I.D.,Hickson,K.C. Gatter,A.L.Harris,Human APendonuclease 1(HAP1)protein expression in breast cancer correlates with lymphnode status and angiogenesis.Br J Cancer.1998,77, 1169-1173；F.Puglisi,F.Barbone,G.Tell,G.Aprile,B.Pertoldi,C.Raiti,M.R. Kelley,G.Damante,A.Sobrero,C.A.Beltrami,C.Di Loreto,Prognostic role of Ape/Ref-1 subcellular expressionin stage I–IIIbreast carcinomas.Oncol Rep.2002, 9,11–17)。

因此，APE1既可以作为肿瘤诊断的生物标志物，也逐渐成为抗肿瘤治疗的新靶点。与APE1相关的研究引起人们越来越多的关注。然而，现有的能特异性结合APE1的分子和材料都非常有限，不能满足对APE1蛋白进行选择性提取纯化的要求，也无法实现对体内外APE1活性的特异性调控，制约了相关领域研究的进程和生物医药产品的研发。

分子印迹技术是一类以特定目标分子为模板，通过人工合成获得对该分子具有选择性和亲和力的聚合物材料的方法。该方法获得的分子印迹聚合物 (molecularlyimprinted polymer，简称MIP)材料具有制备方法简单、成本低廉、适用目标物广泛、稳定性好、可重复使用等，已被广泛用于分离富集、化学传感、药物运输及生物催化等领域。但是对于蛋白质分子的印迹目前还面临多种挑战，主要原因是蛋白质的分子量大、结构复杂、构象灵活多变，在印迹过程中可能发生变性或被包埋，导致材料的吸附和解吸过程影响因素复杂，结合位点可控性差。为了解决这些问题，已发展出多种蛋白质分子印迹技术，例如表面印迹法(Kempe M,Glad M,Mosbach K.An approach towards surface imprinting usingthe enzyme ribonucleaseA.Journal of molecular recognition(1995),8(1‐2):35-39；Liu Y,Fang S,Zhai J,et al.Construction of antibody-like nanoparticles forselective protein sequestration in living cells.Nanoscale(2015),7(16):7162-7167.)和分层印迹法 (Nematollahzadeh A,Sun W,Aureliano C S A,et al.High‐Capacity Hierarchically Imprinted Polymer Beads for Protein Recognition andCapture.Angewandte Chemie(2011),123(2):515-518.)等。但这些方法仍未能完全解决印迹位点均一性差、亲和力较低等问题。

到目前为止，国内外仍没有以APE1为目标蛋白的印迹聚合物被报道合成。开发能够选择性捕获、分离并富集APE1的亲和材料，不仅可用于体外生产表达 APE1时蛋白的分离纯化，还能将其用于活细胞内APE1活性的调控，为研究癌症发生发展的机理、开发抗癌药物、优化治疗方案等提供重要的手段。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种脱碱基核酸内切酶(APE1)磁性分子印迹纳米颗粒及其制备方法和应用。首先通过APE1与亲和素的强相互作用，将 APE1固定在磁核表面并保持空间位置和构象相对稳定，然后利用多巴胺粘附性强和室温下易发生自聚反应的性质在温和条件下对APE1进行印迹，可在不破坏 APE1结构的条件下在其周围形成印迹位点。该磁性分子印迹纳米颗粒对APE1 具有高亲和力和特异性识别能力，可直接从复杂生物样品(如血清、细胞裂解液等)中分离并富集APE1。

本发明采用如下技术方案：

一种脱碱基核酸内切酶磁性分子印迹纳米颗粒，由内向外依次包括磁核、二氧化硅层、亲和素层和聚合层。

进一步的，所述磁核的直径为20-30nm，所述二氧化硅壳层的厚度为10-15 nm，所述亲和素层的厚度小于或等于6nm，所述聚合层的厚度为5-10nm。

进一步地，所述磁核包括铁磁性纳米颗粒，还可将其换成金纳米粒子， NaMF4:Yb/Ln上转换纳米粒子(其中M为Y或Gd，Ln为Er或Tm)，量子点 (QD)等纳米粒子；优选Fe₃O₄磁性纳米颗粒或γ-Fe₂O₃磁性纳米颗粒。

进一步地，所述聚合层的材料选自多巴胺、丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺，二甲氨基丙基甲基丙烯酰胺传统单体或多聚糖、蛋白质等生物相容性大分子；优选多巴胺。

进一步地，上述脱碱基核酸内切酶磁性分子印迹纳米颗粒的表达式为 Fe₃O₄@SiO₂@AVD@PDA或γ-Fe₂O₃@SiO₂@AVD@PDA，其中Fe₃O₄代表四氧化三铁磁核，γ-Fe₂O₃则代表γ-三氧化二铁磁核；SiO₂代表二氧化硅层；AVD代表亲和素层，PDA代表聚多巴胺层。

本发明还提供了上述脱碱基核酸内切酶磁性分子印迹纳米颗粒的制备方法，包括：先在二氧化硅层的外层共价连接上亲和素，然后通过亲和素与APE1的强亲和作用，将APE1固定在二氧化硅层包覆的磁核表面，最后在外层进行聚合反应后洗脱模板分子APE1，得到最终的脱碱基核酸内切酶磁性分子印迹纳米颗粒。

上述制备方法的具体步骤如下：

1)将二氧化硅层包覆的磁核超声分散在纯水中，分别加入EDC和NHS，室温(以下均指15-28℃)下震荡反应，作为溶液A。

2)在溶液A中加入亲和素，室温下震荡反应，磁分离并洗涤除去未反应的物质，然后将得到的反应物重新超声分散在Tris溶液中，作为溶液B。

3)在溶液B中加入APE1，室温下孵育20-30分钟，作为溶液C。

4)在溶液C中加入聚合材料进行聚合反应，磁分离并洗涤除去未反应的物质，然后将得到的反应物重新超声分散，依次用乙醇和Tris溶液洗涤后超声分散在Tris溶液中，得到磁性分子印迹纳米颗粒。

步骤1)中，二氧化硅层包覆的磁核超声分散在纯水中的终浓度为0.5-2 mg/mL；超声时间需超过10分钟；EDC的浓度为0.5-2mg/mL，NHS的浓度为 1-5mg/mL，EDC、NHS与二氧化硅层包覆的磁核的重量比为4:10:1；为使二氧化硅层表面的羧基充分活化，EDC和NHS要加入略过量，活化时间不要过短或过长，根据室温的不同，优选活化时间为15-45分钟。

步骤2)中亲和素的浓度为100-200nM。加入亲和素使纳米颗粒与亲和素在混合溶液中终浓度的比为5：1，室温下震荡反应8-12个小时。在二氧化硅壳层外共价连接亲和素时，为使纳米颗粒充分分散，纳米颗粒的浓度不要过高，优选浓度为0.1-0.5mg/mL。反应结束后，为了除去体系中的未反应物，可以用去离子水洗1-3遍，然后再超声分散在Tris溶液中，超声分散时间为5-10分钟，Tris 溶液的浓度为10-15mM，pH为8.0-8.5。

步骤3)中，APE1的浓度为5-15nM，为使APE1能够最有效地结合在纳米颗粒上，加入的APE1与亲和素在溶液中的浓度比优选为1:10。

步骤4)中，聚合材料的浓度为0.1-0.2mg/mL，聚合反应可在室温下进行，时间可在2-4小时之间，优选3h，用乙醇洗涤的时间为15-30分钟，如不立即使用，则应置于4℃保存。

进一步地，本发明还提供了上述磁性分子印迹纳米颗粒在对实际生物样品(包括但不限于血清、细胞裂解液)中目标蛋白分子APE1进行识别、捕获、分离和富集中的应用。

本发明的有益效果为：

AVD与脱碱基核酸内切酶I(APE1)之间存在特异性的亲和作用，这种相互作用可以使AVD将溶液中的APE1特异性地吸引到纳米颗粒表面，使APE1能够有效地固定在纳米颗粒上并且保持构象稳定和一致。多巴胺具有粘附性强和易反应的性质，可以对构象稳定的APE1进行原位准确有效的印迹；形成的聚多巴胺层不仅有良好的稳定性、亲水性和生物相容性，还提高了印迹材料对目标蛋白的选择性吸附能力，并减少了二氧化硅层表面对APE1的非特异性吸附。此外，印迹材料对目标蛋白的解吸回收更容易，解吸条件更温和，且回收后蛋白仍可保持较高活性。

本发明报道了一种脱碱基核酸内切酶磁性分子印迹纳米颗粒及其制备方法和应用。该磁性分子印迹纳米颗粒直径为50±5nm，对目标蛋白APE1具有较高的选择性和亲和力，从而可对复杂生物样品中的APE1进行识别、捕获、分离和富集。另外本发明中的材料制备方法简单，成本低廉，生物相容性好，可在磁场作用下快速地导入到活细胞中，可实现对活细胞内APE1的捕获和活性抑制。

附图说明

图1是制备磁性分子印迹纳米颗粒的示意图。

图2为磁性纳米颗粒Fe₃O₄@SiO₂@AVD(SiMNP@AVD-100)与磁性分子印迹纳米颗粒(MIP-100)的透射电镜图，其中，图2A表示磁性纳米颗粒 Fe₃O₄@SiO₂@AVD(SiMNP@AVD-100)，图2B表示磁性分子印迹纳米颗粒 (MIP-100)。

图3是磁性分子印迹纳米颗粒的蛋白结合量与聚合时间的关系。

图4是磁性分子印迹纳米颗粒对APE1的结合量随亲和素浓度变化的关系。

图5是对比不同制备方法得到的磁性分子印迹纳米颗粒对APE1的吸附容量。

图6是MIP-100、NIP-100和SiMNP@AVD-100对APE1的等温吸附曲线。

图7为磁性分子印迹纳米颗粒MIP-100、NIP-100和SiMNP@AVD-100对各种常见核酸酶的选择性。其中，图7A表示三种磁性纳米颗粒对APE1及其它4 种核酸酶的吸附容量对比，图7B表示从三种磁性纳米颗粒上解吸下来的APE1 和其它4种核酸酶的量。吸附实验中各种酶的浓度分别为APE1:10nM；Exo III: 10nM；DNase I:30nM；Lambda exo:10nM；T5:10nM。

图8是磁性分子印迹纳米颗粒MIP-100、NIP-100对血清样品中的APE1进行富集的测试曲线。

图9是细胞裂解液、超滤液和磁性分子印迹纳米颗粒MIP-100纯化液对APE1 的加标回收率。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明做详细说明。但本领域的技术人员应当理解，以下具体实施方式将有助于理解发明，但并不限制本发明的内容。在本发明的精神和实质范围内，可以做各种修改和变动，本发明的保护范围应视所附权利要求书而定。

本发明制备磁性分子印迹纳米颗粒的过程如图1所示，具体包括以下步骤：

先在硅包磁纳米颗粒的外层共价连接上亲和素，然后通过亲和素与APE1的强亲和作用，将模板分子APE1固定在硅包磁纳米颗粒表面，最后在外层进行聚合反应后洗脱APE1得到最终的脱碱基核酸内切酶磁性分子印迹纳米颗粒。

实施例1、磁性分子印迹纳米颗粒(MIP-100)的制备

将1.0mg Fe₃O₄@SiO₂在室温，40KHz下(本发明中均采用该超声频率，根据需要调整为不同的超声时间)超声20分钟，分散在2.0mL纯水中配成0.5 mg/mL的溶液，加入4.0mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺(EDC)和10.0 mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧基，室温下震荡反应30分钟。加入终浓度为100nM的亲和素，室温下振荡反应8个小时。磁分离，除去未反应的物质，用去离子水洗三次，真空干燥24小时，将得到的材料命名为SiMNP@AVD-100。

将上述材料重新超声分散在2.0mL 10mM Tris(pH 8.0)溶液中。加入终浓度为10nM的APE1，室温下孵育30分钟。加入终浓度为0.1mg/mL的多巴胺， 37℃下聚合反应3个小时。磁分离，用乙醇洗三次，真空干燥24小时。

合成作为对照的非印迹磁性纳米颗粒(NIP-100)时，不加入模板分子APE1，其它步骤都相同。

通过透射电子显微镜表征如图2所示，与磁性纳米颗粒Fe₃O₄@SiO₂@AVD (SiMNP@AVD-100)(图2A)相比,磁性分子印迹纳米颗粒(MIP-100)(图2B) 大小均一，分散性好，表层光滑规整，粒径尺寸约为50nm，最外层薄层约为5nm。可知，原纳米颗粒成功连接上聚多巴胺。

实施例2、磁性分子印迹纳米颗粒对APE1的结合量随聚合时间变化关系的考察

将实施例1中MIPs和NIPs的聚合时间分别调整为15分钟，30分钟，45 分钟，1小时，2小时，3小时，4小时，8小时。将所制备的磁性分子印迹纳米颗粒对APE1进行吸附实验，并用DNA探针检测溶液中APE1活性。

在该实施例中，用于检测APE1活性的DNA探针序列如下：

5’-T*T*C*C*T*C*(dT-ROX)AGAGYCGT(dT-BHQ2)C*A*C*T*G*T*AGTTTATA C*A*G*T*GAATCTCTCTAG*T*C*T-3’

其中Y表示脱碱基位点，加星号表示硫代修饰的碱基，ROX和BHQ2分别为5(6)-羧基-X-罗丹明盐酸盐和其对应的猝灭基团。

如不加特殊说明，下文中提到的DNA探针均为此序列。

实验步骤如下：

在200μL八连管中，加入200μL分散在10mM Tris(pH 8.0)溶液中的浓度为0.2mg/mL MIP或NIP磁性纳米颗粒溶液和终浓度为10nM的APE1，在室温下放置15min进行吸附。然后将八连管置于Chemicell公司的 MagnetoFACTOR-96磁板上，放置2分钟，取2μL上清液，加入到已制备好的 DNA混合溶液(在200μLPCR管中，加入5μL 10×Buffer1.1缓冲液，2μL 5μMDNA探针，补加去离子水使得总体积为48μL)中，采用Rotor-Gene Q荧光PCR 仪，激发波长为575nm，发射波长为602nm，37℃下每5s采集一次荧光强度，根据标准工作曲线计算上清液中剩余APE1的浓度，最后计算出每单位磁性纳米颗粒上结合的APE1量。

检测结果如图3所示，当聚合时间为3个小时，MIPs对APE1的结合量最大为48.2nmol/g，NIPs对APE1的结合量较小为8.4nmol/g，磁性分子印迹纳米颗粒的印迹效果最好。

实施例3、磁性分子印迹纳米颗粒对APE1的结合量随亲和素浓度变化关系的考察

实验步骤如下：

将实施例1中亲和素的终浓度分别调整为40nM,400nM和1515nM，将得到的磁性分子印迹纳米颗粒对APE1进行吸附实验，用DNA探针检测溶液中 APE1活性，并与实施例1中的材料进行对照。

实验结果如图4所示，随着亲和素浓度继续增加，MIPs结合APE1的量逐渐增大，当亲和素的浓度为100nM时，MIPs结合APE1的量达到最大，该浓度下，NIPs结合APE1的量较小，磁性分子印迹纳米颗粒的印迹因子可以达到6，印迹效果最好。

实施例4、探究亲和素在磁性分子印迹纳米颗粒制备中的作用

将1.0mg Fe₃O₄@SiO₂在室温，40KHz下超声20分钟，分散在5.0mL 10mM Tris(pH8.0)溶液中配制成0.2mg/mL的溶液。加入终浓度为10nM的APE1，室温下孵育30分钟。加入终浓度为0.1mg/mL的多巴胺，37℃下聚合反应3个小时。磁分离，用乙醇洗三次，真空干燥24小时，将其命名为S-MIP。

合成作为对照的非印迹纳米颗粒(S-NIP)时，不加入模板分子APE1。

将得到的纳米颗粒对APE1进行吸附实验，并与实施例1中的材料进行对照。

结果如图5所示，MIP-100对APE1的结合量远远高于S-MIP,而NIP-100 对APE1的结合量与S-NIP相差不多，说明在制备磁性分子印迹聚合物时加入亲和素是十分必要的。

实施例5、磁性分子印迹纳米颗粒对APE1识别能力的测定

向分散有0.2mg/mL的MIP-100，NIP-100和SiMNP@AVD-100的Tris溶液中分别加入不同浓度的APE1进行吸附试验，APE1的终浓度分别为1nM,2.5 nM,4nM,5nM,7.5nM,10nM,12.5nM,15nM和20nM。吸附完成后，用DNA 探针检测上清液中剩余APE1的浓度。获得的数据通过Scatchard方程分析：

其中Q与Qmax分别表示单位质量磁性分子印迹纳米颗粒的蛋白吸附量及单位质量磁性分子印迹纳米颗粒的最大蛋白吸附量，C为吸附达到平衡后上清液中蛋白的浓度，Kd为磁性分子印迹纳米颗粒与APE1的解离常数。

根据图6的数据，我们计算出MIP-100，NIP-100和SiMNP@AVD对APE1 的解离常数分别为3.83nM,291.6nM和0.99nM。磁性分子印迹纳米颗粒的解离常数比非印迹磁性纳米颗粒小了76倍，说明MIP-100中存在有对APE1特异性识别的位点，且亲和力非常高。

实施例6、磁性分子印迹纳米颗粒对APE1的选择性

在200μL八连管中，加入200μL分散在10mM Tris(pH 8.0)溶液中的浓度为0.2mg/mL MIP或NIP磁性纳米颗粒溶液和终浓度为10nM的APE1，在室温下放置15min进行吸附。然后磁分离将上清液除去，用10mM Tris(pH 8.0) 溶液洗一遍，加入等体积10×buffer1.1(10×buffer 1.1缓冲溶液的组成为：100mM Bis Tris Propane-HCl,100mM MgCl₂,1000μg/ml BSA，pH 7.0(25℃))进行解吸附30分钟。磁分离，分别用DNA探针检测吸附后和解吸后上清液中APE1的活性，根据标准工作曲线计算上清液中APE1的浓度，最后计算出每单位磁性分子印迹纳米颗粒上能够解吸附的APE1量。

磁性分子印迹纳米颗粒对其它酶结合量的检测过程与此相同，只是将缓冲液和对应DNA探针替换为相应酶的最合适条件(如表一所示)。检测结果如图7 所示，各种酶测定的终浓度分别为APE1:10nM；Exo III:10nM；DNase I:30nM； Lambda exo:10nM；T5:10nM。

由图7A所示的吸附实验数据可以看出，与NIP材料相比，磁性分子印迹纳米颗粒MIP-100和SiMNP@AVD-100对APE1的结合量都很大，接近饱和吸附容量。而对其他4种酶，MIP的结合量明显小于SiMNP@AVD-100，说明印迹过程有效提高了材料的选择性。从图7B所示的解吸附数据可以进一步看出，磁性分子印迹纳米颗粒MIP-100结合的APE1在10×buffer1.1的温和洗脱条件下回收率即可达到80％以上，SiMNP@AVD-100结合的APE1回收率则只有约20％，而 MIP-100对另外4种酶的解吸附量都接近甚至低于NIP。这些数据有力地证明了磁性分子印迹纳米颗粒对APE1有非常高的选择性，而NIP和SiMNP@AVD-100 材料对APE1以及其它蛋白的选择性较差。

实施例7、磁性分子印迹纳米颗粒用于人血清中APE1的选择性捕获与分离

分别将0.2mg磁性分子印迹纳米颗粒MIP-100和非印迹材料NIP-100分散在400μL人血清(来源于北京大学校医院)中，37℃下孵育30分钟后磁分离，将上清液除去。用10mMTris buffer洗一次，然后分散在200μL 10X Buffer 1.1 中孵育30分钟。磁分离，用DNA探针检测上清液中APE1的浓度。加标回收组在人血清中加入终浓度为0.4nM的APE1标准溶液，其他操作完全相同。

结果如图8所示，显然磁性分子印迹纳米颗粒能有效捕获人血清样品中的 APE1，其回收率为82％，说明该材料有良好的专一性识别能力，且回收率高。

实施例8、磁性分子印迹纳米颗粒用于细胞提取液中APE1的纯化

分别将0.2mg磁性分子印迹纳米颗粒MIP-100分散在含有100μL细胞质或细胞核裂解液(约1x10⁷个MCF-7细胞)的1000μL 10mM Tris buffer中，37℃下孵育60分钟后磁分离，将上清液除去。用10mM Tris buffer洗一次，然后分散在100μL 10x Buffer 1.1中孵育30分钟。磁分离后，将得到的溶液命名为MIP 纯化液，用DNA探针检测MIP纯化液中APE1的加标回收率。加标组中APE1 标准溶液的终浓度为0.4nM。

同时设置两个对照组，第一组是细胞质或细胞核裂解液直接加标测定回收率。第二组是将细胞质或细胞核裂解液在30k超滤管中4℃和8000rmp条件下超滤15分钟，替换液为0.04％Triton-100，，共超滤6次，得到的超滤液分别命名为细胞质超滤液或细胞核超滤液，并对其进行加标回收实验。

结果如图9所示，细胞裂解液直接加标实验的回收率高达200％，说明细胞裂解液中存在对APE1与DNA底物反应有明显影响的活性物质。经超滤后的加标回收率与直接加标回收相比没有太大变化，说明干扰物质主要为分子量较大的活性物质。而细胞裂解液中APE1经磁性分子印迹纳米颗粒分离纯化后，其加标回收率接近100％，说明磁性分子印迹纳米颗粒能有效富集纯化细胞质或细胞核裂解液中的APE1，消除了干扰物质的影响。

表一：各种酶的缓冲液组成及其pH

Claims (10)

1.一种脱碱基核酸内切酶磁性分子印迹纳米颗粒，由内向外依次包括磁核、二氧化硅层、亲和素层和聚合层，其中所述亲和素层为亲和素，所述聚合层为聚多巴胺。

2.如权利要求1所述的一种脱碱基核酸内切酶磁性分子印迹纳米颗粒，其特征在于，所述磁核为铁磁性纳米颗粒；所述二氧化硅层为表面修饰有羧基的二氧化硅。

3.如权利要求1所述的一种脱碱基核酸内切酶磁性分子印迹纳米颗粒，其特征在于，所述脱碱基核酸内切酶磁性分子印迹纳米颗粒的表达式为Fe₃O₄@SiO₂@AVD@PDA或γ-Fe₂O₃@SiO₂@AVD@PDA，其中Fe₃O₄代表四氧化三铁磁核，γ-Fe₂O₃则代表γ-三氧化二铁磁核；SiO₂代表二氧化硅层；AVD代表亲和素层，PDA代表聚多巴胺层。

4.权利要求1-3任一项所述的一种脱碱基核酸内切酶磁性分子印迹纳米颗粒的制备方法，包括：先在二氧化硅层的外层共价连接上亲和素，然后通过亲和素与APE1的强亲和作用将APE1固定在二氧化硅层包覆的磁核表面，之后在外层进行多巴胺的聚合反应，最后洗脱模板分子APE1，得到最终的脱碱基核酸内切酶磁性分子印迹纳米颗粒。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)将二氧化硅层包覆的磁核超声分散在纯水中，分别加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS，室温下震荡反应，作为溶液A；

2)在溶液A中加入亲和素，室温下震荡反应，磁分离并洗涤除去未反应的物质，然后将得到的反应物重新超声分散在Tris溶液中，作为溶液B；

3)在溶液B中加入APE1，室温下孵育20-30分钟，作为溶液C；

4)在溶液C中加入多巴胺进行聚合反应，磁分离并洗涤除去未反应的物质，然后将得到的反应物重新超声分散，依次用乙醇和Tris溶液洗涤后超声分散在Tris溶液中，得到磁性分子印迹纳米颗粒。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，二氧化硅层包覆的磁核超声分散在纯水中的终浓度为0.5-2mg/mL；EDC的浓度为0.5-2mg/mL，NHS的浓度为1-5mg/mL，EDC、NHS与二氧化硅层包覆的磁核的重量比为4:10:1。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中亲和素的浓度为100-200nM，加入亲和素使纳米颗粒与亲和素在混合溶液中终浓度的比为5：1；Tris溶液的浓度为10-15mM，pH为8.0-8.5。

8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中，APE1的浓度为5-15nM，加入的APE1与亲和素在溶液中的浓度比为1:10。

9.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中，聚合材料的浓度为0.1-0.2mg/mL。

10.权利要求1-3任一项所述的一种脱碱基核酸内切酶磁性分子印迹纳米颗粒在对生物样品中目标蛋白分子APE1进行识别、捕获、分离和富集中的应用。

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