CN110146571B - 双金属有机框架复合材料适体传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种双金属有机框架复合材料及其制备方法、适体传感器及其制备方法和应用，属于电化学传感器技术领域。本发明提供了一种双金属有机框架复合材料，所述双金属有机框架复合材料为铁配合物和附着在铁配合物表面的铽配合物。本发明的双金属有机框架复合材料结合了Fe‑MOF良好的生物相容性和强的锚定作用，以及Tb‑MOF的高电化学活性和荧光性，提高了传感性能，双金属有机框架复合材料对核酸适体具有较强锚定作用，具有优异的生物相容性、良好的胞吞作用和强荧光，得到的适体传感器具有良好的选择性、稳定性、重现性、再生性和适用性，且检测限低。

Description

双金属有机框架复合材料适体传感器及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种双金属有机框架复合材料及其制备方法、适体传感器及其制备方法和应用，属于电化学传感器技术领域。
背景技术
癌症的早期诊断对癌症的治疗极为重要。癌症标志物可以在血液、组织和体液中发现，是临床癌症的重要诊断依据。CA 125于1983年首次作为肿瘤抗原被发现，被认为是一种肿瘤标志物，主要用于监测卵巢癌患者的治疗结果。在健康人群中，血清中CA 125水平小于 35UmL-1。卵巢上皮癌患者血清中CA 125升高已被证实，血清中CA 125在诊断、预后、疾病监测及治疗随访中具有重要价值。此外，CA 125不仅是卵巢癌的特异性标志物，输卵管腺癌、子宫内膜癌、宫颈癌、胰腺癌、肠癌、乳腺癌和肺癌患者CA 125的水平也会升高。
核酸适体是用配体指数富集法系统演化(SELEX)技术从人工体外合成的随机寡核苷酸序列库中反复筛选得到的能以极高的亲和力和特异性与靶分子结合的一段寡核苷酸序列。可以是RNA，单链DNA或者双链DNA。核酸适体与靶分子的结合和抗原-抗体作用相似，核酸适体具有明显优于抗体的许多特性。具有靶分子范围广、与配体作用亲和力高、特异性强、高度稳定性、安全经济、制备方法简单等优点。经过十几年的发展，核酸适体技术开始广泛应用于分子识别、实验诊断、疾病治疗和药物研究等领域。
MOFs是金属有机骨架化合物(英文名称Metal organic Framework)的简称。是由无机金属中心(金属离子或金属簇)与桥连的有机配体通过自组装相互连接，形成的一类具有周期性网络结构的晶态多孔材料。MOFs是一种有机-无机杂化材料，也称配位聚合物(coordination polymer)、金属-有机框架材料，它既不同于无机多孔材料，也不同于一般的有机配合物。兼有无机材料的刚性和有机材料的柔性特征。使其在现代材料研究方面呈现出巨大的发展潜力和诱人的发展前景。
适体传感器结合了电化学分析方法和核酸适体各自的特点，具有体积小、成本效率高、操作方便、选择性高、灵敏度高等优点，得到了广泛的应用。电化学阻抗谱(EIS)已被开发为一种有效的技术，用于通过探测电极/电解质界面来研究固定在电极表面上的生物分子之间的复合物形成的有效技术，其通常用于开发适体传感器和检测各种癌症标志物。适体传感器主要由生物识别元件和信号传感器组成，其中传感器由修饰层、电极基片和电子检测系统组成。通常，有机分子和/或纳米材料(例如碳纳米材料，量子点，聚合物膜和有机纳米粒子) 被用作连接适体探针和基质的支撑材料。然而，大多纳米材料通常表现出相对较少的锚定位点和较低的检测灵敏度。基于这些材料的适体传感器在生物传感领域的应用受到了限制。因此，开发用作电化学适体传感器的MOFs纳米材料是提高传感性能的重要且具有挑战性的工作。
发明内容
本发明的目的在于提供一种双金属有机框架复合材料，该双金属有机框架复合材料对核酸适体具有较强锚定作用。
本发明的第二个目的在于提供上述双金属有机框架复合材料的制备方法。
本发明的目的还在于提供一种适体传感器，该适体传感器具有较强的检测灵敏度。
本发明的第四个目的在于提供上述适体传感器的制备方法。
本发明的第五个目的在于提供上述适体传感器在检测癌症标志物或活癌细胞中的应用。
本发明的技术方案如下：
一种双金属有机框架复合材料，所述双金属有机框架复合材料为铁配合物和附着在铁配合物表面的铽配合物；
其中，所述铁配合物是由铁元素与金属有机框架材料形成的配合物，所述铽配合物是由铽元素与金属有机框架材料形成的配合物。
需要说明的是，铁配合物记为Fe-MOF，铽配合物记为Tb-MOF，双金属有机框架复合材料记为Tb-MOF-on-Fe-MOF。A-on-B指的是A附着在B表面，且A未将B完全包覆，此处， Tb-MOF-on-Fe-MOF指的是Tb-MOF附着在Fe-MOF表面，且Tb-MOF未将Fe-MOF完全包覆。
本发明的双金属有机框架复合材料(Tb-MOF-on-Fe-MOF)结合了Fe-MOF良好的生物相容性和强的锚定作用，以及Tb-MOF的高电化学活性和荧光性，提高了传感性能， Tb-MOF-on-Fe-MOF对核酸适体具有较强锚定作用，具有优异的生物相容性、良好的胞吞作用和强荧光，锚定在Tb-MOF-on-Fe-MOF表面的核酸适体和抗原之间可形成稳定性较高的结构，由Tb-MOF-on-Fe-MOF得到的适体传感器具有良好的选择性、稳定性、重现性、再生性和适用性，且检测限低。例如，Tb-MOF-on-Fe-MOF对CA 125抗原核酸适体具有较强的锚定作用，锚定在Tb-MOF-on-Fe-MOF表面的CA 125抗原核酸适体与CA 125之间能够形成稳定性较高的G-四链体，由Tb-MOF-on-Fe-MOF得到的适体传感器具有良好的选择性、稳定性、重现性、再生性和适用性，在100mU·mL-1至200U·mL-1的宽线性范围内，对CA 125的检出限极低，仅为58mU·mL-1；此外，由Tb-MOF-on-Fe-MOF与CA 125抗原核酸适体得到的适体传感器检测MCF-7细胞具有良好的灵敏度，检测限低，仅为每毫升21个细胞。
优选地，所述铁配合物中的铁元素为Fe2+和/或Fe3+；所述铽配合物中的铽元素为Tb3+和 /或Tb4+。
优选地，所述双金属有机框架复合材料中的铁元素与铽元素的摩尔比为1-2：1-2。摩尔比为1-2：1-2的铁元素与铽元素组成的双金属有机框架复合材料可使得制备的Tb-MOF完全包裹Fe-MOF，铁元素或铽元素含量过少将导致该金属有机框架材料晶型缺陷。
优选地，所述铁配合物中的铁元素与金属有机框架材料的摩尔比为1-2：1-2。摩尔比为 1-2：1-2的铁元素与金属有机框架材料组成的铁配合物可使得Fe-MOF晶体生长完整，铁元素或金属有机框架材料含量过少将导致Fe-MOF无法形成。
优选地，所述铽配合物中的铽元素与金属有机框架材料的摩尔比为1-2：1-2。摩尔比为 1-2：1-2的铽元素与金属有机框架材料组成的铽配合物可使得Tb-MOF晶体生长完整，铽元素或金属有机框架材料含量过少将导致Tb-MOF无法形成。
优选地，所述金属有机框架材料为芳香族多羧酸化合物。芳香族多羧酸化合物作为有机框架材料有利于金属有机框架材料的形貌形成。
优选地，所述芳香族多羧酸化合物为对苯二甲酸和1,3,5-苯三甲酸。对苯二甲酸和1,3,5- 苯三甲酸作为有机框架材料更有利于金属有机框架材料的形貌形成。
优选地，所述芳香族多羧酸化合物为1,3,5-苯三甲酸。1,3,5-苯三甲酸作为有机框架材料更有利于金属有机框架材料的形貌形成。
一种上述双金属有机框架复合材料的制备方法，包括以下步骤：
将铁配合物悬浮液与铽盐溶液混合，然后加入金属有机框架材料和羧酸盐，加热反应得到双金属有机框架复合材料。
可以理解的是，金属有机框架材料为形成铽配合物的金属有机框架材料。
本发明的双金属有机框架复合材料的制备方法只需要将铁配合物悬浮液与铽盐溶液混合，然后加入金属有机框架材料和羧酸盐，羧酸盐的存在有利于Tb-MOF晶体形成，加热反应即可制备得到双金属有机框架复合材料，反应效率高，具有可控性，通过先将铁配合物悬浮液与铽盐溶液混合，使得铽元素与铁配合物混匀，然后加入金属有机框架材料和羧酸盐，得到铽配合物附着在铁配合物表面的Tb-MOF-on-Fe-MOF，充分发挥Tb-MOF和Fe-MOF的协同作用；该方法简单，易操作，制备过程中无副反应的发生，得到的双金属有机框架复合材料纯度高。
优选地，所述铽盐溶液中的铽盐为TbCl3或Tb(NO3)3。TbCl3、Tb(NO3)3为可溶性盐。
可以理解的是，对于铽盐的结合水的个数不作限定，例如，TbCl3可以是TbCl3·6H2O， Tb(NO3)3可以是Tb(NO3)3·6H2O。
优选地，所述铁配合物悬浮液的溶剂为N，N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜；所述铽盐溶液的溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、水或无水乙醇。
优选地，所述羧酸盐为甲酸盐或乙酸盐。
优选地，所述加热反应的温度为70-120℃，所述加热反应的时间为21-36h。在此反应条件下，反应效率高，反应可控性强，更有利于得到双金属有机框架复合材料 Tb-MOF-on-Fe-MOF。
优选地，所述铁配合物中的铁元素与金属有机框架材料的摩尔比为1-2：1-2。若铁元素或金属有机框架材料含量过少，将导致Fe-MOF无法形成。
一种适体传感器，所述适体传感器包括电极、涂覆在电极表面的双金属有机框架复合材料和锚定在双金属有机框架复合材料表面的核酸适体；
其中，所述双金属有机框架复合材料为铁配合物和附着在铁配合物表面的铽配合物；所述铁配合物是由铁元素与金属有机框架材料形成的配合物，所述铽配合物是由铽元素与金属有机框架材料形成的配合物。
本发明的适体传感器包括电极、Tb-MOF-on-Fe-MOF和核酸适体，该适体传感器具有良好的选择性、稳定性、重现性、再生性和适用性，且检测限低。例如，由裸金电极、 Tb-MOF-on-Fe-MOF和CA 125抗原核酸适体得到的适体传感器具有良好的选择性、稳定性、重现性、再生性和适用性，在100U·mL-1至200U·mL-1的宽线性范围内，对CA 125的检出限极低，仅为58U·mL-1；此外，检测MCF-7细胞具有良好的灵敏度，检测限低，仅为每毫升 21个细胞。由Tb-MOF-on-Fe-MOF得到的适体传感器在肿瘤的早期诊断中提供了有意义且有希望的潜力，拓宽了MOF的应用。
优选地，所述核酸适体为抗原核酸适体。
优选地，所述抗原核酸适体为CA 125抗原核酸适体。
优选地，所述双金属有机框架复合材料在电极表面的涂覆量为1-2μg/mm2。电极表面的涂覆量为1-2μg/mm2的双金属有机框架复合材料有利于核酸适体链的固定及扩大对蛋白的检测范围。
优选地，所述电极为裸金电极或玻碳电极。
一种上述适体传感器的制备方法，包括以下步骤：
将双金属有机框架复合材料分散液涂覆在电极表面，干燥后得到修饰电极，然后将核酸适体锚定在修饰电极表面，得到适体传感器。
本发明的适体传感器的制备方法只需将Tb-MOF-on-Fe-MOF分散液涂覆在电极表面，然后在修饰电极表面锚定核酸适体，即可制备得到适体传感器，制备效率高，方法简单，易操作。
一种上述适体传感器在检测癌症标志物或活癌细胞中的应用。
优选地，所述癌症标志物为CA 125抗原；所述活癌细胞为MCF-7细胞。
附图说明
图1为双金属有机框架复合材料的实施例1的Tb-MOF-on-Fe-MOF的SEM、TEM和 HR-TME图，图1a、图1b和图1c依次为Tb-MOF-on-Fe-MOF的SEM图、TEM图和HR-TME 图；
图2为对比例1的Fe-MOF、对比例2的Tb-MOF和双金属有机框架复合材料的实施例1的Tb-MOF-on-Fe-MOF的XRD图和FT-IR光谱，图2a为Fe-MOF、Tb-MOF和 Tb-MOF-on-Fe-MOF的XRD图，图2b为Fe-MOF、Tb-MOF和Tb-MOF-on-Fe-MOF的FT-IR 光谱；
图3为双金属有机框架复合材料的实施例1的Tb-MOF-on-Fe-MOF的XPS光谱，图3b1和图3b2分别为Tb-MOF-on-Fe-MOF的高分辨率Fe 2p和Tb 3d三维XPS光谱；
图4为EIS奈奎斯特图，图4a为Zview2软件分析EIS图谱时的等效电路，图4b为EIS奈奎斯特图；
图5为AE、Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE、Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE和CA 125/Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE的EIS奈奎斯特图；
图6为对比例1的AE、Fe-MOF/AE、Apt/Fe-MOF/AE和CA 125/Apt/Fe-MOF/AE的EIS奈奎斯特图；
图7为对比例2的AE、Tb-MOF/AE、Apt/Tb-MOF/AE和CA 125/Apt/Tb-MOF/AE的EIS奈奎斯特图；
图8为用于检测CA 125的基于不同MOF的制造过程中每个阶段的Rct值的变化；
图9为适体传感器的实施例1的适体传感器检测不同CA 125浓度的EIS图；
图10为ΔRct和CA 125浓度之间的相应校准曲线；
图11为适体传感器的实施例1的适体传感器的特异性；
图12为适体传感器的实施例1的适体传感器检测CA 125的再现性；
图13为适体传感器的实施例1的适体传感器检测CA 125的稳定性；
图14为适体传感器的实施例1的适体传感器的可再生性；
图15为双金属有机框架复合材料的实施例1的Tb-MOF-on-Fe-MOF对MCF-7细胞的细胞活力；
图16为MCF-7细胞中时间依赖性Tb-MOF-on-Fe-MOF的荧光图像；
图17为AE、Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE、Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE和 MCF-7/Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE的EIS奈奎斯特图；
图18为AE、Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE、Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE和 MCF-7/Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE的氧化还原CV曲线；
图19为适体传感器的实施例1的适体传感器在不同MCF-7细胞浓度下的EIS反应；
图20为ΔRct对MCF-7细胞浓度的依赖性；
图21为适体传感器的实施例1的适体传感器对MCF-7细胞检测的再现性；
图22为适体传感器的实施例1的适体传感器对MCF-7细胞检测的稳定性。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。
本发明的双金属有机框架复合材料中，所述金属有机框架材料为1,3,5-苯三甲酸或对苯二甲酸。
本发明的双金属有机框架复合材料的制备方法中，所述铁配合物悬浮液由铁配合物溶于 N，N-二甲基甲酰胺中制得。
优选地，所述铁配合物与N，N-二甲基甲酰胺的重量体积比为30:6-8mg/mL。优选为30:7mg/mL。
本发明的双金属有机框架复合材料的制备方法中，所述铽盐溶液由铽盐溶于溶剂中制得。
优选地，所述溶剂为N，N-二甲基甲酰胺和水的混合液。优选地，所述N，N-二甲基甲酰胺和水的体积比为5:4。
优选地，所述铽盐与溶剂的重量体积比为209：15-25mg/mL。优选为209：18mg/mL。
本发明的双金属有机框架复合材料的制备方法中，所述铽盐与金属有机框架材料的重量比为200-220：40-45。
本发明的双金属有机框架复合材料的制备方法中，所述金属有机框架材料与羧酸盐的重量比为40-45：100-115。
本发明的双金属有机框架复合材料的制备方法中，所述反应的温度为80℃。所述反应的时间为24h。
本发明的双金属有机框架复合材料的制备方法中，反应后得到的双金属有机框架复合材料还包括后处理步骤，包括将反应产物利用乙醇洗涤，然后置于60℃烘箱中干燥。
本发明的适体传感器的制备方法中，将双金属有机框架复合材料分散在PBS中，得到双金属有机框架复合材料分散液。
优选地，所述PBS的pH＝7.4，PBS中含有0.14M的NaCl和0.1M的KCl。
优选地，双金属有机框架复合材料与PBS的重量体积比为1:1mg/mL。
本发明的适体传感器的制备方法中，双金属有机框架复合材料分散液在电极表面的涂覆量为5.0μL。
本发明的适体传感器的制备方法中，修饰电极还包括以下后处理步骤：室温下干燥3-5h。
本发明的适体传感器的制备方法中，对于核酸适体锚定在修饰电极表面的具体操作方式不作限定，可以采用本领域的常规操作即可，例如，可以将修饰电极浸入适体溶液中20-40min，或将适体溶液涂覆在修饰电极表面。
本发明的适体传感器的制备方法中，得到的适体传感器还包括后处理步骤，所述后处理步骤为Milli-Q水洗涤。
实施例和试验例所用材料和化学药品：Fe-MOF的有机配体是邻苯二甲酸。Tb-MOF的有机配体是均苯三甲酸。六水合氯化铽(III)(TbCl3·6H2O)购自国药集团化学试剂有限公司。 1,3,5-苯三甲酸(H3BTC)购自阿拉丁试剂有限公司(中国上海)。K3[Fe(CN)6]购自风船化学试剂科技有限公司(中国天津)。N,N-二甲基甲酰胺(DMF)购自索莱宝科技有限公司(中国北京)。碳水化合物抗原125(CA 125)，碳水化合物抗原19-9(CA19-9)，血管内皮生长因子(VEGF)，免疫球蛋白G(IgG)，癌胚抗原(CEA)，粘蛋白1(MUC1)，表皮生长因子受体(EGFR)，猪血清白蛋白(PSA)和甲胎蛋白(AFP)购自索莱宝生物科技有限公司(中国上海)。所用的所有其他化学品均为分析试剂级，无需进一步纯化即可使用。使用的水为 Milli-Q水(≥18.2Ωcm)。CA 125抗原核酸适体的来源于上海碧云天生物技术有限公司，CA 125 靶向适体序列是5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGACAAGAATAAACGCTCAATATCGTTAATTCGGTCG-3'。
双金属有机框架复合材料的实施例1
本实施例的双金属有机框架复合材料(Tb-MOF-on-Fe-MOF)为铁配合物和附着在铁配合物表面的铽配合物；
其中，铁配合物是由铁元素与金属有机框架材料形成的配合物，铽配合物是由铽元素与金属有机框架材料形成的配合物。
铁配合物中的铁元素为Fe2+和/或Fe3+，金属有机框架材料为邻苯二甲酸；铽配合物中的铽元素为Tb3+和/或Tb4+，金属有机框架材料为均苯三甲酸。
双金属有机框架复合材料中的铁元素与铽元素的摩尔比为1：1，铁配合物中的铁元素与金属有机框架材料的摩尔比为1：1，铽配合物中的铽元素与金属有机框架材料的摩尔比为1： 1。
双金属有机框架复合材料的制备方法的实施例1
本实施例的双金属有机框架复合材料的制备方法，步骤如下：
(1)利用铁配合物(Fe-MOF)作为模板，将Fe-MOF(30mg)分散在7mL的N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)中，形成均匀的悬浮液，即为Fe-MOF悬浮液。
(2)将209mg的TbCl3·6H2O溶解在DMF和水的混合溶液(DMF和水的体积比为5：4，共18mL)中，得到均匀溶液，即为TbCl3溶液。
(3)将Fe-MOF悬浮液与TbCl3溶液混合，然后加入42mg的1,3,5-苯三甲酸(H3BTC)和108.9mg无水乙酸钠，得到混合溶液，然后将混合溶液转移到特氟龙内衬的不锈钢高压釜(50mL)中并在80℃下加热24小时，将产物用乙醇洗涤，并在60℃的烘箱中干燥12h，得到产物双金属有机框架复合材料(Tb-MOF-on-Fe-MOF)。
适体传感器的实施例1
本实施例的适体传感器为裸金电极、涂覆在裸金电极表面的双金属有机框架复合材料的实施例1的Tb-MOF-on-Fe-MOF和锚定在Tb-MOF-on-Fe-MOF表面的CA 125抗原核酸适体，本实施例的适体传感器记为Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE(将CA 125抗原核酸适体简写为Apt)。
Tb-MOF-on-Fe-MOF在电极表面的修饰量为1.5μg/mm2。
适体传感器的制备方法的实施例1
本实施例的适体传感器的制备方法，步骤如下：
(1)裸金电极(AE)的预处理
清洁直径为3mm的裸金电极。用0.05μm氧化铝浆料抛光AE，然后分别在食人鱼溶液(体积比为3:1的H2SO4和H2O2的混合溶液)、乙醇和水中超声处理15分钟。然后，通过氧化和还原循环在-0.2至1.6V的0.5M的H2SO4中电化学洗涤AE，然后用超纯水漂洗并在氮气下干燥。
(2)适体溶液
采用PBS(pH＝7.4，0.01M)作为制备适体的储备溶液，将CA 125抗原核酸适体(Apt) 溶于PBS中，得到CA 125抗原核酸适体含量为100μm·mL-1的适体溶液。
(3)适体传感器
将1mg的Tb-MOF-on-Fe-MOF分散在1mL的PBS(0.1M，pH＝7.4)中，形成 Tb-MOF-on-Fe-MOF浓度为1mg/mL的分散液。
将5.0μL的Tb-MOF-on-Fe-MOF的分散液滴加到预处理的AE上，在室温下干燥4小时，得到修饰电极，记为Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE。
将Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE浸入适体溶液(100nM)中30分钟，将CA 125抗原核酸适体锚定在Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE表面，然后用Milli-Q水洗涤，得到适体传感器，即为 Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE。
对比例1
本对比例为铁配合物(Fe-MOF)，Fe-MOF中的金属离子为Fe2+、Fe3+。
Fe-MOF同双金属有机框架复合材料的制备方法的实施例1中的Fe-MOF。
本对比例的适体传感器为裸金电极、修饰在裸金电极表面的Fe-MOF和锚定在Fe-MOF 表面的CA 125抗原核酸适体。Fe-MOF在电极表面的修饰量为1.5μg/mm2。
本对比例的适体传感器的制备方法同适体传感器的制备方法的实施例1，具体为：
将1mg的Fe-MOF分散在1mL的PBS(0.1M，pH＝7.4)中，形成Fe-MOF浓度为1mg/mL 的均匀分散液。将5.0μL的Fe-MOF的均匀分散液滴加到预处理的AE上，在室温下干燥4 小时，得到修饰电极，记为Fe-MOF/AE。将Fe-MOF/AE浸入适体溶液(100nM)中30分钟，然后用Milli-Q水洗涤，得到适体传感器，记为Apt/Fe-MOF/AE。
对比例2
本对比例为铽配合物(Tb-MOF)，Tb-MOF中的金属离子为Tb3+、Tb4+。
本对比例的适体传感器为裸金电极、修饰在裸金电极表面的Tb-MOF和锚定在Tb-MOF 表面的CA 125抗原核酸适体。Tb-MOF在电极表面的修饰量为1.5μg/mm2。
本对比例的适体传感器的制备方法同适体传感器的制备方法的实施例1，具体为：
将1mg的Tb-MOF分散在1mL的PBS(0.1M，pH＝7.4)中，形成Tb-MOF浓度为1mg/mL 的均匀分散液。将5.0μL的Tb-MOF的均匀分散液滴加到预处理的AE上，在室温下干燥4 小时，得到修饰电极，记为Tb-MOF/AE。将Tb-MOF/AE浸入适体溶液(100nM)中30分钟，然后用Milli-Q水洗涤，得到适体传感器，记为Apt/Tb-MOF/AE。
试验例1
1、形貌和微观结构
利用SEM、TEM和HR-TME分析双金属有机框架复合材料的实施例1的 Tb-MOF-on-Fe-MOF，得到的结果如图1所示，图1a为Tb-MOF-on-Fe-MOF的SEM图，图 1b为Tb-MOF-on-Fe-MOF的TEM图，图1c为Tb-MOF-on-Fe-MOF的HR-TME图。
对于Tb-MOF-on-Fe-MOF，由于在Fe-MOF表面附着了Tb-MOF，结构也从Fe-MOF的具有统一分布的八面体变为不规则形状。Tb-MOF纳米颗粒附着在Fe-MOF表面上(如图1a)。通过TEM(图1b)进一步证实了这种结构变化。此外，由于低结晶度，图1c没有获得明显的晶格条纹，可促进生物分子锚定。
2、XRD和FT-IR
分别对双金属有机框架复合材料的实施例1的Tb-MOF-on-Fe-MOF、对比例1的Fe-MOF、对比例2的Tb-MOF进行XRD和FT-IR表征，得到的结果如图2所示，图2a为Fe-MOF， Tb-MOF和Tb-MOF-on-Fe-MOF的XRD图，图2b为Fe-MOF，Tb-MOF和Tb-MOF-on-Fe-MOF 的FT-IR光谱。
图2a中，Fe-MOF的XRD图谱与文献(Epoxidation of styrene over Fe(Cr)-MIL-101 metal–organic frameworks)报道的MIL-101家族图谱较为接近，但强度较低，说明对比例1 的Fe-MOF的结晶度较低。对比例2的Tb-MOF的XRD图谱与文献(A Series of(6,6)-Connected Porous Lanthanide-Organic Framework Enantiomers with HighThermostability and Exposed Metal Sites:Scalable Syntheses,Structures,andSorption Properties)报道的峰值相似，证实了所得 Tb-MOF的晶体结构。另外，Tb-MOF-on-Fe-MOF的XRD图谱与Tb-MOF的XRD图谱相近。
图2b中的FT-IR光谱中也观察到类似的结果，在约3400cm-1处的宽带归因于O-H带的伸缩振动，并且在Tb-O晶格振动中在400cm-1-780cm-1范围内存在一系列特征吸附带，在Tb-MOF有。在Fe-MOF和Tb-MOF-on-Fe-MOF中，3100cm-1-3500cm-1附近的峰值表示存在 N-H伸缩振动。除了差异之外，其余峰值位置在四个样本中相似，因为位于1383cm-1和 1640cm-1的两个峰分别归因于C＝O和C-O伸缩振动。同时，位于1574cm-1和1431cm-1处的峰对应于苯环上C＝C键的伸缩振动。指纹峰(772cm-1，712cm-1和565cm-1)归因于苯环的 C-H键的变形振动。
3、XPS
对双金属有机框架复合材料的实施例1的Tb-MOF-on-Fe-MOF进行XPS表征，得到的结果如图3所示，图3b1和图3b2分别为Tb-MOF-on-Fe-MOF的高分辨率Fe 2p和Tb 3d三维XPS光谱。
对于Tb-MOF-on-Fe-MOF，出现了清晰的Tb 3d信号(图3b2)，其中观察到Tb3+和Tb4+离子的组合。且观察到较弱的Fe 2p信号强度(图3b1)，Fe2+和Fe3+离子的共存。显示出的Tb-MOF-on-Fe-MOF的结构与图1a对应，Tb-MOF附着未完全包覆在Fe-MOF表面，因此， Tb-MOF-on-Fe-MOF出现了清晰的Tb 3d信号和较弱的Fe 2p信号强度。
试验例2电化学测量
1、电化学测量实验条件
所有电化学测量均在CHI760E电化学工作站(中国上海晨华)上进行，配备有通用的三电极系统。AE用作工作电极，Pt丝用作对电极，Ag/AgCl(饱和KCl)用作参比电极。循环伏安法(CV)在-0.2V至0.8V下以100mVs-1的扫描速率，在5mM的K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](K3[Fe(CN)6]与K4[Fe(CN)6]的摩尔比为1：1中进行，混合物在0.1M的PBS(含有0.14M 的NaCl和0.1M的KCl的pH＝7.4)中作为氧化还原探针。在0.01Hz-100kHz的频率范围内记录电化学阻抗谱(EIS)，振幅为5mV。
2、电化学测量结果
采用双金属有机框架复合材料的实施例1的Tb-MOF-on-Fe-MOF作为传感器纳米材料，用于锚定CA 125抗原核酸适体并检测CA 125，整个过程由电化学技术(EIS、CV)确定。使用 Zview2软件处理和分析所有EIS数据。模拟等效电路由四个元件组成，包括溶液电阻(Rs)，电荷转移电阻(Rct)，恒定相位元件(CPE)和Warburg阻抗(Wo)，如图4所示，图4a为Zview2软件分析EIS图谱时的等效电路，Rs为溶液电阻，Rct为电荷转移电阻，CPE1为恒定相位元件，Wo为Warburg阻抗；图4b为EIS奈奎斯特图。此外，每次电化学测量重复至少三次，并使用不同的电极进行至少三次重复测试，以确保实验数据的准确性。
通过等效电路确定并模拟用于检测实施例1中预处理过的裸金电极(AE)、 Tb-MOF-on-Fe-MOF的分散液涂覆在电极表面得到的修饰电极(Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE)、修饰电极浸入适体溶液中得到的适体传感器(Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE)和适体传感器检测CA125(CA 125/Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE)的EIS奈奎斯特图，如图5所示。图5为 AE、Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE、Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE和CA 125/Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE的EIS奈奎斯特图。
电极表面的电化学活性的变化可以通过其模拟的Rct值来表示。裸AE的Rct值非常小，仅为165.6欧姆，这主要是由于其良好的电导率。当Tb-MOF-on-Fe-MOF涂覆在AE表面上得到的修饰电极(Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE)时，它导致电极的Rct值增加到429.4欧姆，表明Tb-MOF-on-Fe-MOF层的弱电化学传导性。它可以进一步防止电子在电解质溶液和电极之间的界面处转移。当CA 125抗原核酸适体锚定在Tb-MOF-on-Fe-MOF表面得到适体传感器(Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE)时，Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE的Rct值连续升至642.3欧姆，表明CA 125抗原核酸适体被成功固定。锚定的CA 125抗原核酸适体的磷酸基团可以电离成水溶液中的负电荷，这将引起与[Fe(CN)6]3-/4-离子的排斥相互作用。界面处电子转移的困难导致Rct值的增加。在CA 125存在条件下，在界面处CA 125抗原核酸适体和CA 125之间形成G-四链体不断阻碍电子转移，进一步导致Rct值的增加。
为了进行比较，将对比例1的Fe-MOF、对比例2的Tb-MOF对应的适体传感器来检测CA 125，并用EIS进行测量(如图6和图7)。图6为对比例1的AE、Fe-MOF/AE、Apt/Fe-MOF/AE和CA 125/Apt/Fe-MOF/AE的EIS奈奎斯特图。图7为对比例2的AE、Tb-MOF/AE、 Apt/Tb-MOF/AE和CA 125/Apt/Tb-MOF/AE的EIS奈奎斯特图。从他们的EIS数据可以得出与基于Tb-MOF-on-Fe-MOF的适体传感器相似的趋势。表1总结了四种适体传感器的所有模拟Rct值。
表1使用基于Fe-MOF、Tb-MOF和Tb-MOF-on-Fe-MOF的适体传感器在CA 125的检测程序期间每个步骤的Rct值
Figure GDA0002126982920000121
可以看出，随着不同MOFs对裸AE的修饰、适体的固定以及CA 125的检测顺序的增加，电极的计算Rct值增加。由每个步骤引起的Rct值的差异可以表示添加层的负载量。因此，根据每个步骤的Rct值的相对变化，即新层涂层前后Rct值(ΔRct)的差异(ΔRct＝Rct,i+1-Rct,i)，评估了四种适体传感器的传感性能(如图8)。图8为用于检测CA 125的基于不同MOF的制造过程中每个阶段的Rct值的变化，ΔRct1＝Rct,MOF-Rct,AE指的是AE表面涂覆MOF后的Rct 值与裸AE的Rct值的差异，ΔRct2＝Rct,AE-Rct,Apt指的是固定适体后的Rct值与AE表面涂覆MOF后的Rct值的差异，ΔRct3＝Rct,Apt-Rct,CA指的是检测CA 125时的Rct值与固定适体后的 Rct值的差异。
就基于Fe-MOF的适体传感器而言，Fe-MOF修饰电极相对于裸AE导致Rct值(242.7欧姆)的增加最大，表明Fe-MOF的电化学传导率最低。
Tb-MOF修饰电极的Rct值变化最小，仅为36.2欧姆，表明Tb-MOF与Fe-MOF相比具有优异的电化学活性。因此，Tb-MOF的存在可以增强固-液界面处的电子转移。很明显，适体固定在Fe-MOF/AE(Apt/Fe-MOF/AE)上导致Rct(428.9欧姆)的变化大。然而，当检测 CA 125时，仅获得CA15/Apt/Fe-MOF/AE的Rct的差异小(85.2欧姆)。相比之下，观察到由适体锚定在Tb-MOF/AE上引起的ΔRct小得多，为154欧姆。用于检测CA 125的使用基于Tb-MOF的适体传感器的ΔRct为88.5欧姆。由此可知，适体链(CA 125抗原核酸适体的适体链)锚定在Fe-MOF电极上，大多数形成的G-四链体从平台上移除，显示出差的稳定性。相反，G-四链体对基于Tb-MOF的适体传感器表现出更高的稳定性，表明Tb-MOF平台表现出与形成的复合物更强的相互结合作用。因适体链不仅可以固定在MOF表面上，而且可以渗透到MOF的空腔中。文献显示，Fe-MOF的孔隙体积为0.72cm3g-1(F Tan,M Liu,K Li,et al. Facile synthesis ofsize-controlled MIL-100(Fe)with excellent adsorption capacity for methyleneblue.Chemical Engineering Journal,2015,281:360-367.)，大于Tb-MOF的孔隙体积0.31cm3g-1 (A Jamali,AA Tehrani,F Shemirani,A Morsali,Lanthanide metal–organicframeworks as selective microporous materials for adsorption of heavy metalions,Dalton Trans.,2016,45, 9193-9200)。当适体链通过复杂的相互作用吸附在MOF上时，例如π-π*堆积，有机配体和适体链之间的氢键，金属离子与适体链主链之间的配位力，以及静电力，由于其大孔径，更多的适体链锚定在Fe-MOF上。然而，由于使用的CA 125抗原核酸适体链的长序列，57聚体，适体和CA 125之间的强相互作用迫使形成的G-四链体从Fe-MOF中除去。就Tb-MOF 而言，由于适体链的Tb3+和G碱基的配位，适体链可以通过G-Tb3+-G复合物的形成紧密地锚定在Tb-MOF表面上。因此，它可以稳定适体和CA 125的G-四链体。
如图8所示，对于Tb-MOF-on-Fe-MOF的适体传感器，由Tb-MOF-on-Fe-MOF和适体固定化的修饰引起的ΔRct值分别为263.8和212.9欧姆。Tb-MOF-on-Fe-MOF电极与Tb-MOF 相比仅表现出差的电化学活性，与基于Fe-MOF的适体传感器相比，适体固定较少，使用基于Tb-MOF-on-Fe-MOF的适体传感器检测CA 125产生相当大的ΔRct值308.7欧姆。所有这些结果证实，基于Tb-MOF-on-Fe-MOF的适体传感器表现出优于其他适体传感器的传感性能。
试验例3适体传感器的实施例1的Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE检测CA 125的传感性能
在电化学测量期间将适体传感器的实施例1的Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE浸入具有不同浓度的CA 125溶液中以确定适体传感器的检测限(LOD)。
基于Tb-MOF-on-Fe-MOF的适体传感器的LOD和动态范围通过EIS对不同浓度的目标 CA 125进行估算。如图9所示，图9为适体传感器的实施例1的适体传感器检测不同CA125 浓度(0.0001U·mL-1，0.001U·mL-1，0.01U·mL-1，0.1U·mL-1，1U·mL-1，10U·mL-1，100U·mL-1和200U·mL-1)的EIS图，记录了在孵育各种浓度的CA 125溶液之前和之后制备的适体传感器的典型奈奎斯特图。图9表明，引起的ΔRct值取决于CA 125的浓度，其中ΔRct值随着 CA 125浓度的增加而增加。CA 125浓度对ΔRct的对应校准曲线(与CA 125孵育之前和之后的阻抗差异)表明线性动态范围为0.1mU·mL-1至200U·mL-1，R2为0.9941。在CA125浓度大于10U·mL-1后，ΔRct值达到平稳值，表明适体链和CA 125的饱和结合。因此，提出的 CA 125的测定行为基于Tb-MOF-on-Fe-MOF的适体传感器遵循Langmuir-Freundlich等温线。通过考虑包含前四个数据点的陡斜率，从校准曲线图形化地计算LOD，如图10，图10为ΔRct 和CA 125浓度之间的相应校准曲线，图10b为ΔRct的线性拟合图，其为CA 125浓度的对数 (n＝3)的函数。根据IUPAC方法，通过使用以下方法可以将LOD计算为58U·mL-1：
LOD＝3SD/斜率
其中SD表示标准偏差，斜率表示校准图的梯度。
与用于测定CA 125的其他报道的适体传感器相比，本工作表现出极低的LOD和高灵敏度(如表2所示)。基于Tb-MOF-on-Fe-MOF的适体传感器的这种优异的传感性能由以下因素引起：(i)由对Fe-MOF的强生物效率引起的大量锚定适体链，(ii)Tb-MOF的良好电化学活性，和(iii)由于Fe-MOF和Tb-MOF之间的协同效应，在适体链和CA 125之间形成的 G-四链体复合物的高稳定能力。
表2适体传感器的实施例1的Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE与其他生物传感器用于检测CA 125的比较
Figure GDA0002126982920000141
Figure GDA0002126982920000151
参考文献：
文献1：Dual-wavebands-resolved electrochemiluminescence multiplexingimmunoassay with dichroic mirror assistant photomultiplier-tubes asdetectors。
文献2：3D microfluidic origami electrochemiluminescence immunodevicefor sensitive point-of-care testing of carcinoma antigen 125。
文献3：Electrochemical immunosensor based on chitosan-goldnanoparticle/carbon nanotube as a platform and lactate oxidase as a label fordetection of CA 125oncomarker。
文献4：Phosphoserine imprinted nanosensor for detection of CancerAntigen 125。
文献5：One-step preparation of disposable multi-functionalized g-C3N4based electrochemiluminescence immunosensor for the detection of CA 125。
文献6：Hierarchical gold nanostructures modified electrode forelectrochemical detection of cancer antigen CA 125。
文献7：An ultra-sensitive impedimetric immunosensor for detection ofthe serum oncomarker CA-125in ovarian cancer patients。
试验例4适体传感器的实施例1的Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE的特异性、再现性、稳定性和可再生性
1、特异性
使用PBS(pH＝7.4，含有0.14M的NaCl和0.003M的KCl)作为制备适体的储备溶液。在上述PBS中制备适体(100μM)，CA 125(37kU·mL-1)，CA19-9(17kU·mL-1)，VEGF (1mg·mL-1)，IgG(1mg·mL-1)，CEA(1mg·mL-1)，MUC1(1mg·mL-1)，EGFR(1mg·mL-1)， PSA(1mg·mL-1)和AFP(1mg·mL-1)的储备溶液，并在4℃下储存。
通过与CA19-9，血管内皮生长因子(VEGF)，免疫球蛋白G(IgG)，癌胚抗原(CEA)，粘蛋白1(MUC1)，皮生长因子受体(EGFR)，猪血清白蛋白(PSA)和甲胎蛋白(AFP) 在室温下孵育来确定适体传感器的特异性。在不同干扰物(包括CA 199、AFP、IgG、PSA 和CEA)存在以及这些干扰物与CA 125的混合物的情况下，通过EIS技术验证了适体传感器的实施例1的基于Tb-MOF-on-Fe-MOF的适体传感器的特异性，如图11所示。图11表明干扰物存在以及这些干扰物与CA 125的混合物的情况下，通过EIS技术验证了基于 Tb-MOF-on-Fe-MOF的适体传感器的特异性(图11)。很明显，干扰物没有获得实质的EIS 反应，而CA 125及其混合物引起高EIS反应。图11表明，本发明的电化学适体传感器对CA 125表现出良好的选择性，并且不受其他可能的癌症标志物的干扰，这是由于适体链和CA 125 的优异特异性。
2、再现性
适体传感器的实施例1的Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE的再现性通过在相同条件下独立使用五个基于Tb-MOF-on-Fe-MOF的适体传感器来评估。如图12所示，图12为适体传感器的实施例1的适体传感器检测CA 125的再现性，显示出可接受的再现性。
3、稳定性
为了稳定性评估，将适体传感器的实施例1的Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE在4℃下储存 15天并且每天使用EIS进行测量，15天期间的基于Tb-MOF-on-Fe-MOF的适体传感器的储存稳定性如图13。最终检测信号通过使用相同的适体传感器模式保留了检测0.1mU·mL- 1CA 125的初始响应的101.4％，表明适体传感器的实施例1的适体传感器具有良好的储存稳定性。
4、可再生性
将适体传感器的实施例1的Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE检测CA 125得到的CA 125/Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE在4℃下浸入1.0M的NaOH中2分钟，以使CA 125与适体链解离来验证适体传感器的实施例1的Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE的再生性。在用大量 Milli-Q水冲洗碱液处理过的CA 125/Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE之后，再生得到适体传感器 Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE。随后，将再生的Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE与CA 125溶液 (0.1mU·mL-1)一起温育。CA 125的检测程序重复10次，记录的EIS总结在图14中。得出适体传感器Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE的Rct值没有明显的变化。这意味着适体传感器的实施例1的Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE适体传感器可以容易地在NaOH溶液中再生，而不会明显损失测定信号。
试验例5适体传感器的实施例1的Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE检测活MCF-7细胞
1、细胞培养，细胞成像和体外细胞毒性的实验方法
MCF-7癌细胞获自美国典型培养物保藏中心，并在含有10％热灭活的胎牛血清和抗生素 (每毫升50单位的青霉素和每毫升50单位的链霉素)的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM 培养基)中生长。将细胞保持在37℃，5％CO2中直至使用。
将MCF-7细胞接种在密度为1×105个细胞的激光共聚焦培养皿中，并在37℃和5％CO2下孵育。8小时后，用含有Tb-MOF-on-Fe-MOF(50μg·mL-1)的培养基替换培养基。处理后，用PBS充分洗涤细胞，并用4％多聚甲醛在37℃下固定10分钟。用PBS洗涤后，使用Zeiss710LSM的420nm HeNe激光激发源获得所有图像。
通过3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)测定评估 Tb-MOF-on-Fe-MOF对MCF-7细胞的体外细胞毒性。在用Tb-MOF-on-Fe-MOF处理之前，将细胞接种在96孔板中，密度为8000个细胞，并孵育。24小时后，用含有不同浓度的 Tb-MOF-on-Fe-MOF分散体的新鲜培养基替换培养基，再培养24小时。随后，弃去培养基，而用PBS洗涤MCF-7细胞两次。在培养基中孵育24小时后，加入MTT(5mg·mL-1，20μL)，然后再培养细胞4小时。最后，将二甲基亚砜(150μL)加入板孔中，然后将板振荡15分钟。用酶标仪测量488nm处的吸光度值。
2、生物相容性
为了评估双金属有机框架复合材料的实施例1的Tb-MOF-on-Fe-MOF是否可用作直接检测活癌细胞的平台，通过在体外孵育MCF-7细胞系来确定Tb-MOF-on-Fe-MOF的细胞活力。如图15所示，24小时后Tb-MOF-on-Fe-MOF的细胞毒性略有下降，即使在 Tb-MOF-on-Fe-MOF浓度高达100μg·mL-1时，90％的MCF-7细胞仍存活。因此，双金属有机框架复合材料的实施例1的Tb-MOF-on-Fe-MOF表现出对MCF-7细胞的良好生物相容性，可作为检测活细胞的平台。
3、细胞内吞作用
通过将MCF-7细胞孵育在Tb-MOF-on-Fe-MOF悬浮液中并通过CLSM进行调查来评估Tb-MOF-on-Fe-MOF的细胞摄取。如图16所示，图16中，“细胞核染色”对应的是细胞核染色后的细胞照片，“眀场”对应的是单纯细胞在明场下的照片，“Tb-MOF-on-Fe-MOF”为 Tb-MOF-on-Fe-MOF材料本身的荧光照片，“合并”为前三幅图叠加之后的照片。结果表明，吸附Tb-MOF-on-Fe-MOF的MCF-7细胞被400nm处激光激发后，出现弱绿色荧光，具有Tb-MOF-on-Fe-MOF的荧光特性。合并的照片进一步证明Tb-MOF-on-Fe-MOF优先在癌细胞中积累并且直接显示荧光而不需要使用其他染料。该结果表明Tb-MOF-on-Fe-MOF纳米颗粒可被癌细胞内吞。
4、检测活MCF-7细胞的EIS图和CV测量
双金属有机框架复合材料的实施例1的Tb-MOF-on-Fe-MOF具有良好生物相容性和优异的细胞内吞作用，可将其用作直接检测活癌细胞的平台。利用适体传感器的实施例1的Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE检测MCF-7细胞，并使用EIS和CV测试了整个测定过程。如图17所示，图17为AE、Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE、Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE、 Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE检测MCF-7细胞(MCF-7/Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE)的EIS 奈奎斯特图。
Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE的EIS图得到的Rct值为454.9欧姆。在适体固定后，Rct值升高至632.1欧姆，这是由于锚定的适体在电极表面上的阻断作用。当将所提出的适体传感器应用于检测MCF-7细胞时，Rct值连续增加至700.6欧姆，表明CA 125抗原核酸适体和MCF-7细胞之间的生物识别。对于CV测量也观察到类似的结果，如图18。
5、检测癌细胞的特异性
为了验证所提出的适体传感器检测癌细胞的特异性，使用相同的适体传感器在相同的测量条件下测定正常细胞。结果表明，在检测到L929细胞后没有观察到显着的变异，Rct变化很小，只有40欧姆。它表明适体传感器也对癌细胞表现出高度特异性。
6、检测灵敏度
为了探测所提出的适体传感器对癌细胞的检测灵敏度，使用具有一系列不同浓度的 MCF-7细胞来评估基于Tb-MOF-on-Fe-MOF的生物传感器的分析性能。如图19所示，图19为适体传感器的实施例1的适体传感器在不同MCF-7细胞浓度下(每毫升的细胞个数为100,500,1000,5000,10000和100000)的EIS反应，随着MCF-7细胞浓度在每毫升0-105个细胞范围内增加，引起的ΔRct值(ΔRct＝Rct，MCF-7-Rct，Apt)显著增加。
图20为ΔRct对MCF-7细胞浓度的依赖性，图20b为校准曲线的线性部分，从图20可以看出，引起的ΔRct值与MCF-7细胞浓度的对数之间的良好线性关系在每毫升100至105个细胞的范围内，得到LOD为每毫升21个细胞，(S/N＝3)。线性回归方程可以用ΔRct(千欧姆)＝0.81logConcell-1.47(R2＝0.993)表示。在此，并行进行五次测量以获得平均值。
将适体传感器的实施例1的适体传感器对MCF-7细胞的传感性能与其他报道的工作进行比较，如表3所示，适体传感器的实施例1的适体传感器提供了一个较低的LOD和更大的检测线性范围。
表3与其他报道的活MCF-7细胞检测技术的比较
Figure GDA0002126982920000191
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文献13：Sensitive detection of MCF-7human breast cancer cells by usinga novel DNA-labeled sandwich electrochemical biosensor。
7、再现性和稳定性
除了用于检测MCF-7细胞的超低LOD外，还通过EIS研究了适体传感器的实施例1的Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE对MCF-7细胞的再现性和稳定性。还使用相同的 Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE对具有不同细胞浓度的五次重复测试，如图21所示，图21为适体传感器的实施例1的Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE对MCF-7细胞检测的再现性，浓度为每毫升500个细胞，5000个细胞和100000个细胞，研究了Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE的传感重现性。引起的EIS响应显示相对一致的值，得到的RSD分别为3.32％，3.98％和1.76％，这表明其优异的传感重现性。
8、稳定性
在15天内研究了适体传感器的实施例1的Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE对MCF-7细胞的稳定性，图22为适体传感器的实施例1的Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE在15天内对MCF-7 细胞检测(每毫升500个细胞)的稳定性。最终的EIS响应保留为使用相同的适体传感器模式检测每毫升500个细胞的初始响应的115.5％，表明其具有良好的稳定性。
综上所述，适体传感器的实施例1的Apt/Tb-MOF-on-Fe-MOF/AE不仅可以用于癌症标志物CA 125的检测，而且由于其良好的生物相容性和细胞内吞作用，还可以用于确定活癌细胞。
试验例6血清样品中的检测能力
使用人血清来验证适体传感器的适用性，将具有不同浓度的CA 125溶液掺入样品中，用PBS(0.01M，pH＝7.4)稀释500倍。对于开发的适体传感器，与实际样品的孵育时间为60 分钟。
通过在人血清中加入一系列浓度的CA 125，经预处理后稀释500倍，考察了该传感器的可靠性及其在真实血清中的潜在应用。还通过EIS测量确定程序，并根据图10b中所示的校准曲线进行分析。表4中列出的所有回收率表明，基于Tb-MOF-on-Fe-MOF的适体传感器可以在血清样品中获得CA 125检测的良好性能，显示RSD为1.67-4.64％。因此，适体传感器的实施例1的适体传感器表现出高精度并且可以用于实际检测。
表4适体传感器的实施例1的适体传感器检测人血清样品中的CA 125
Figure GDA0002126982920000201
Figure GDA0002126982920000211
综上所述，本发明设计并制备了一种新型Tb-MOF-on-Fe-MOF纳米结构，采用 MOF-on-MOF方法构建，并将其作为锚定CA 125抗原核酸适体同时检测CA 125和活MCF-7 细胞的新平台。结合各自的内在特征，如Tb-MOF的良好的电化学活性，荧光和大孔径以及对适体强结合的亲和力和Fe-MOF的优异生物相容性，基于Tb-MOF-on-Fe-MOF的适体传感器在适体和CA 125之间显示出形成的G-四链体的稳定性更高，并且对比其他类型的适体传感器具有优异的传感性能。
基于Tb-MOF-on-Fe-MOF的适体传感器对CA 125和MCF-7细胞显示出极低的LOD，分别为58UmL-1和每毫升21个细胞，具有良好的选择性，稳定性，再现性和可接受的适用性，为MOFs在生物传感领域的应用提供了广阔的前景。

Claims (19)

1.一种适体传感器，其特征在于，所述适体传感器包括电极、涂覆在电极表面的双金属有机框架复合材料和锚定在双金属有机框架复合材料表面的核酸适体；
其中，所述双金属有机框架复合材料为铁配合物和附着在铁配合物表面的铽配合物；所述铁配合物是由铁元素与金属有机框架材料形成的配合物，所述铽配合物是由铽元素与金属有机框架材料形成的配合物；所述适体传感器应用于检测癌症标志物或活癌细胞。
2.根据权利要求1所述的适体传感器，其特征在于，所述铁配合物中的铁元素为Fe2+和/或Fe3+；所述铽配合物中的铽元素为Tb3+和/或Tb4+。
3.根据权利要求1所述的适体传感器，其特征在于，所述双金属有机框架复合材料中的铁元素与铽元素的摩尔比为1-2:1-2。
4.根据权利要求1所述的适体传感器，其特征在于，所述铁配合物中铁元素与金属有机框架材料的摩尔比为1-2:1-2。
5.根据权利要求1所述的适体传感器，其特征在于，所述铽配合物中铽元素与金属有机框架材料的摩尔比为1-2:1-2。
6.根据权利要求1所述的适体传感器，其特征在于，所述金属有机框架材料为芳香族多羧酸化合物。
7.根据权利要求6所述的适体传感器，其特征在于，所述芳香族多羧酸化合物为对苯二甲酸和1,3,5-苯三甲酸。
8.根据权利要求7所述的适体传感器，其特征在于，所述芳香族多羧酸化合物为1,3,5-苯三甲酸。
9.根据权利要求1所述的适体传感器，其特征在于，所述核酸适体为抗原核酸适体。
10.根据权利要求9所述的适体传感器，其特征在于，所述抗原核酸适体为CA125抗原核酸适体。
11.根据权利要求1所述的适体传感器，其特征在于，所述双金属有机框架复合材料在电极表面的涂覆量为1-2μg/mm2。
12.根据权利要求1所述的适体传感器，其特征在于，所述电极为裸金电极或玻碳电极。
13.根据权利要求1所述的适体传感器，其特征在于，所述癌症标志物为CA125抗原；所述活癌细胞为MCF-7细胞。
14.根据权利要求1所述的适体传感器，其特征在于，所述双金属有机框架复合材料采用包括以下步骤的方法制得：
将铁配合物悬浮液与铽盐溶液混合，然后加入金属有机框架材料和羧酸盐，加热反应得到双金属有机框架复合材料。
15.根据权利要求14所述的适体传感器，其特征在于，所述铽盐溶液中的铽盐为TbCl3或Tb(NO3)3。
16.根据权利要求14所述的适体传感器，其特征在于，所述铁配合物悬浮液的溶剂为N，N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜；所述铽盐溶液的溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、水或无水乙醇。
17.根据权利要求14所述的适体传感器，其特征在于，所述羧酸盐为甲酸盐或乙酸盐。
18.根据权利要求14所述的适体传感器，其特征在于，所述加热反应的温度为70-120℃，所述加热反应的时间为21-36h。
19.一种如权利要求1所述的适体传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将双金属有机框架复合材料分散液涂覆在电极表面，干燥后得到修饰电极，然后将核酸适体锚定在修饰电极表面，得到适体传感器。
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