CN107121402A - 一种基于金属有机骨架化合物模拟酶催化特性的水体中氯霉素检测方法 - Google Patents
一种基于金属有机骨架化合物模拟酶催化特性的水体中氯霉素检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种基于金属有机骨架化合物模拟酶催化特性的水体中氯霉素检测方法。将待测水体样品与纳米金核酸适体在磷酸缓冲溶液中混合;将得到的混合溶液与Fe‑MIL‑53溶液、醋酸缓冲液、TMB溶液和H2O2混合反应;待测样品中的氯霉素与纳米金核酸适体形成稳定的发夹结构包覆在金属有机骨架化合物(Fe‑MIL‑53)表面;Fe‑MIL‑53被发夹结构包覆后引起3,3',5,5'‑四甲基联苯胺在451nm处的紫外吸收峰强度减弱;基于TMB吸光度强度变化,通过校准曲线法可确定所述样品中氯霉素的浓度。本发明检测方法灵敏度、选择性、重现性良好,使用便携型紫外分光光度计可实现水体中氯霉素的野外或现场测定。
Description
技术领域
本发明属于环境分析检测技术领域,具体涉及一种检测水体中氯霉素的紫外分光光度法。
背景技术
氯霉素(chloramphenicol,CAP)是一种广谱抗生素,是世界上首种完全由合成方法大量制造的抗生素,对革兰氏阳性、阴性菌均有抑制作用,是畜禽疾病防治的常用药。但因其严重的毒副作用(如抑制造血机能,引起不可逆转的再生障碍性贫血),使通过生活污水、养殖废水、农业粪肥灌溉径流等不同途径排放入水体中的氯霉素成为危害微生物、动植物,破坏生态系统平衡,甚至威胁人类健康的污染物。在我国,黄浦江、珠江、渤海湾、维多利亚湾等流域都曾经检测出氯霉素残留。鉴于抗生素严重的毒副作用,简便、快速、特异性的水环境中氯霉素测定方法变得尤为重要。
水体中氯霉素现有的测定方法主要有微生物法、色谱分析法、免疫分析法等。如中国专利申请号CN101685066A公开利用鳆发光杆菌定量检测氯霉素的微生物检测法,氯霉素添加浓度为0.1ng/g时,回收率仅为40.34%,误差较大。
色谱法目前主要有气相色谱法和液相色谱法,如广东省地方标准DB44/T568-2008中规定气相色谱法测定水体中的氯霉素,需使用乙酸乙酯、氯化钠、正己烷、丙酮等前处理试剂提取试样中的氯霉素,再用硅烷化试剂(包括六甲基二硅烷、三甲基氯硅烷和吡啶)衍生后,用气相色谱仪进行测定。液相色谱法尤其是液相色谱-质谱联用方法目前被用于水体中氯霉素的测定。如中国专利申请号CN104483427A公开了利用液相色谱-质谱联用法测定水体中氯霉素的方法,该方法虽然具有灵敏度高,检测目标物多的特点,但需要繁琐的样品前处理手段,包括加入螯合剂、固相萃取、真空干燥、洗脱液洗脱、收集洗脱液氮气干燥、有机溶液溶解并加入内标等多个前处理步骤。中国专利申请号CN105699537A公布了基于LC-MS/MS的水环境中多种残留药物的检测方法,该法要经过玻璃纤维过滤、HLB固相萃取、甲醇洗脱、C13标记的磺胺嘧啶内标等多步前处理才能完成测定。色谱法虽具有灵敏度高、可同时测定多种目标物的特点,但采用色谱法测定水体中的氯霉素时,前处理复杂、操作过程较为繁琐,仪器昂贵、检测成本高,限制色谱方法针对野外或现场的快速简便测定的应用。
免疫分析方法操作简便、选择性高,多个基于免疫分析方法的氯霉素检测技术已见报道(李艳艳等.饮用水中抗生素残留检测方法的研究进展[J].化学通报,2016,第3期:213-219; 余权等.水产品中氯霉素的ELISA、GC、HPLC-MS测定方法的比较研究[J].广东化工,2016,第15期:101-103; 刘小云等.水中抗生素污染现状及检测技术研究进展[J].中国卫生检验杂志,2005,第8期:1011-1014.)。但酶联免疫法必须使用自然酶(如辣根过氧化物酶,葡萄糖氧化酶等)和蛋白质(如载体蛋白、牛血清蛋白等),易受到环境和外界因素如温度、pH、光照等影响变性失活,从而严重影响测试结果的准确性。如中国专利申请号CN101685066A公开了一种检测氯霉素的酶联免疫试剂盒,其中包含酶标记抗体、氯霉素抗原、酶标记抗体或抗抗体,试剂盒载体为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清蛋白等各类蛋白,酶标记物为辣根过氧化物酶。该方法中各类抗体、抗原或酶标记蛋白不仅需要单克隆合成,储存、使用过程均需特定的pH、温度和样品前处理,试剂盒的使用寿命有限。再如中国专利申请号CN103575878A公开了一种用于检测水产品中氯霉素残留的化学发光酶联免疫检测试剂盒。试剂盒中包括氯霉素抗体、载体蛋白、酶标体、包被抗原等多种蛋白质和自然酶,试剂盒需保存在4 ℃下且需锡箔纸真空密封,使用中还需避免光线直射,在孵育过程中需用锡箔纸遮光。何方洋等报道了一种化学发光酶联免疫法测定氯霉素,该方法在常规的酶联免疫(ELISA)基础上,用辣根过氧化物酶标记氯霉素与牛血清白蛋白偶联后免疫小鼠制得单克隆抗体后应用于氯霉素的检测(何方洋等. 氯霉素化学发光酶联免疫检测方法的建立[J].中国兽药杂志,2012,第46期:25-29.)此类方法虽然克服前几类方法前处理复杂、仪器设备价格高体积大、检测时间长的难点,但大量使用蛋白质和自然酶,严重制约了基于酶联免疫方法的氯霉素检测方法,复杂的前处理过程更制约了针对水体中氯霉素的检测应用。
相比于自然酶和蛋白容易受环境因素制约变性失活的缺点,人工模拟酶既有自然酶的高效性又比自然酶在结构和性质上更稳定,在操作过程中不易受到外界环境因素的影响而失去活性或者变质变性。金属有机骨架化合物(Metal-Organic Framework,缩写为MOF)是近年来发展起来的一种由无机金属离子与有机配体通过无限配位方式连接起来的具有无限网络结构的聚合物多孔材料,部分MOF材料具有良好的模拟酶催化性能,其中Fe-MIL-53具有过氧化物酶催化性能,被用于双氧水的检测,具有良好的检测效果(Ai L, LiL, Zhang C, Fu J, Jiang J. MIL-53(Fe): a metal-organic framework withintrinsic peroxidase-like catalytic activity for colorimetric biosensing[J].Chemistry. 2013, 19(45):15105-8.)。另有研究报道Fe-MIL-88A的过氧化物酶活性并将其应用于凝血酶的检测(Wang Y, Zhu Y, Binyam A, Liu M, Wu Y, Li F. Discoveringthe Enzyme Mimetic Activity of Metal-Organic Framework (MOF) for Label-freeand Colorimetric Sensing of Biomolecules[J]. Biosensors and Bioelectronics.),进一步证实了MOF类材料的模拟酶性质及其在检测分析领域中的应用价值。
本发明就是利用MOF材料具有模拟酶催化性能的特点,并利用氯霉素核酸适体的高选择性,建立了一种灵敏度高、选择性好的水体中氯霉素检测方法。截止目前,利用MOF模拟酶催化性能实现水体中氯霉素检测的方法还未见报道。
发明内容
本发明提供一种基于金属有机骨架化合物模拟酶催化特性的水体中氯霉素检测方法,用于准确可靠、选择性强地实现水体中氯霉素的检测。为实现上述目的,发明利用了金属有机骨架化合物Fe-MIL-53、生物素亲和素、纳米金颗粒和氯霉素核酸适体各物质间的相互作用关系,设计出一种利用紫外分光光度法实现水体中氯霉素的检测方法。
本发明提出的一种基于金属有机骨架化合物模拟酶催化特性的水体中氯霉素检测方法,具体步骤如下:
(1)建立标准样品的校准曲线
(1.1)将氯霉素标准样品与氯霉素纳米金核酸适体在室温下反应1 h,控制氯霉素的含量在0-100 ng/mL;
(1.2)将步骤(1)得到的混合溶液与Fe-MIL-53溶液、醋酸缓冲液、TMB 溶液和H2O2混合反应,40℃反应20分钟;使氯霉素标准样品中的氯霉素与纳米金核酸适体形成稳定的发夹结构包覆在金属有机骨架化合物(Fe-MIL-53)表面;
(1.3)由于Fe-MIL-53被发夹结构包覆后引起3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)在451nm处的紫外吸收峰强度减弱,反应结束后,向步骤(1.2)所得混合液中加入H2SO4,轻微震荡后将显色溶液倒入10mm的比色皿中,用分光光度计在波长451纳米处测定吸光度;
(1.4)以蒸馏水作为空白,溶液的吸光度扣除空白吸光度后的吸光度差值与氯霉素浓度呈线性关系,建立吸光度与氯霉素浓度线性关系回归方程;
(2)对被测水样中氯霉素进行检测
(2.1)将被测水样与氯霉素纳米金核酸适体混合,室温下反应1 h;
(2.2)将步骤(1)得到的混合溶液与Fe-MIL-53溶液、醋酸缓冲液、TMB 溶液和H2O2混合反应;40℃反应20分钟;
(2.3)反应结束后,向步骤(2.2)所得混合液中加入H2SO4,轻微震荡后将显色溶液倒入10mm的比色皿中,用分光光度计在波长451纳米处测定吸光度;将测定值代入步骤(1.5)所得的线性回归方程,可以推算出被测水样中氯霉素的浓度C;
被测水体中氯霉素含量x (单位ng/mL)的计算公式为:
V:被测水样的体积,单位ml;C:从校准曲线上得到的氯霉素的含量。
本发明中,步骤(1.1)中:向1.5mL离心管中加入20 μL氯霉素纳米金核酸适体和50μL不同浓度计算量的氯霉素标准溶液,控制氯霉素的含量在0-100 ng/mL。
本发明中,步骤(2.1)中:取水体样品VmL(1mL<V<10mL),置于250mL容量瓶中,加入纯水稀释至刻度,摇匀后用0.22μm滤膜过滤,即得待测水样。
本发明中,步骤(1.1)和步骤(2.1)中所述氯霉素纳米金核酸适体的制备方法为:将30μL纳米金溶液和100μL氯霉素核酸适体(1 μM)加入到870μL的磷酸缓冲液中,混合后在室温下反应30 min,得到氯霉素纳米金核酸适体。
本发明中,步骤(1.2)和步骤(2.2)中所述Fe-MIL-53的浓度为0.01mg/mL-0.05mg/mL。
本发明中,步骤(1.2)和步骤(2.2)中所述醋酸缓冲溶液的pH值为2.5-6。
本发明中,步骤(1.2)和步骤(2.2)中所述TMB溶液的浓度为10 mmol/L。
本发明中,步骤(1.2)和步骤(2.2)中所述H2O2溶液浓度为0-400mmol/L。
步骤(1.1)和步骤(2.1)中,所述能够对氯霉素特异性识别的核酸适体序列具有如CAPA所示的核苷酸序列,CAPA=5'-ACT TCA GTG AGT TGT CCC ACG GTC GGC GAG TCG GTGGTAG-biotin-3'。由上海生工生物工程公司合成。
步骤(1.1)和步骤(2.1)中,所述纳米金核酸适体是通过生物素-亲和素方法将CAPA序列与纳米金颗粒链接,制备方法为将30μL0.05%亲和素纳米金溶液和100μL生物素氯霉素核酸适体溶液(1μM)加入到870μL磷酸缓冲溶液中,混合后在室温下反应30 min,得到1mL氯霉素纳米金核酸适体溶液。所述亲和素纳米金溶液购于上海西格玛试剂公司。
步骤(2.1)中,所述待测水样是取实际水体样品VmL(1mL<V<10mL,视具体待测样品决定样品体积),置于250mL容量瓶中,加入纯水稀释至刻度,摇匀后用0.22μm滤膜过滤,即得待测水样。
步骤(2.2)和步骤(2.2)中,所述磷酸缓冲液是将93.2mg氯化钾、1.46g氯化钠和47.6mg氯化镁标准品于250mL容量瓶中,加入超纯水稀释至刻度配置得到的。
步骤(1.2)和步骤(2.2)中,所述Fe-MIL-53为一种金属有机骨架化合物的水溶液,浓度为0.01mg/mL-0.05mg/mL之间,制备过程为:将0.17g对苯二甲酸和0.27gFeCl3∙6H2O加入到5mL二甲基甲酰胺溶液中,室温下搅拌10 min转移至反应釜中加热至150ºC反应6 h;反应结束后离心得到黄色反应产物,干燥后即得到Fe-MIL-53粉末0.16g。称取适量该粉末溶于10mL超纯水中形成浓度为0.01mg/mL-0.05mg/mL的Fe-MIL-53溶液。所述超纯水是指用Milli-Q超纯水仪制备的电导率为18.2 MΩ•cm-1的纯水。所述Fe-MIL-88A溶液的储存温度为常温储存。
步骤(1.2)和步骤(2.2)中,所述醋酸缓冲溶液是称取醋酸钠5.1g,加冰醋酸22ml,超纯水溶解均匀并定容至250mL,得pH为3醋酸钠缓冲溶液,利用适量碱液可调节醋酸缓冲溶液的pH在2.5-6之间。
步骤(1.2)和步骤(2.2)中,所述TMB溶液的浓度为10 mmol/L,制备方法为将TMB标准物质120mg用乙醇溶液溶解并定容至50mL,混合均匀后得到。
步骤(1.2)和步骤(2.2)中,所述H2O2溶液浓度为0-400mmol/L,制备方法为将30%的H2O2母液适量用超纯水稀释并定容至250mL,得0-400mmol/L的H2O2溶液。
本发明中的水体中氯霉素的定量检测方法,是将标记了纳米金颗粒的氯霉素核酸适体添加到待测水样中,水样中的氯霉素分子与氯霉素核酸适体特异性结合,形成发夹结构后,包覆在金属有机骨架化合物Fe-MIL-53表面,阻碍了Fe-MIL-53对TMB的催化显色反应,表现为TMB在451nm处的紫外吸收峰强度减弱,根据检测信号相对强度与氯霉素浓度的一一对应关系,测得氯霉素溶液的浓度,实现对水体中氯霉素的定量检测。
工作原理是:在了Fe-MIL-53、TMB、H2O2以及其他检测条件一定的情况下,TMB在451nm处的紫外吸收峰强度与水体中氯霉素的浓度成正相关,在此基础上实现了定量检测。
如上所述,本发明所述的一种基于金属有机骨架化合物模拟酶催化特性的水体中氯霉素检测方法,操作简单,标记纳米金颗粒的核酸适体溶液和其他反应溶液都可以提前准备好,操作时只需将待测样品与各类检测液依次混合反应即可,反应结束后可以马上进行检测,这可以满足环境监测部门的要求,具有广泛的实用性。本发明提供的检测方法检测范围为50-200 nmol/L(16.2-64.6 ng/mL),检测限为25 nmol/L(8.1 ng/mL)。利用不同抗生素作为干扰物质,表明本方法对于水体中的氯霉素具有高效选择性,利用自来水中氯霉素加标回收实验,测定氯霉素的回收率在104%至108%之间,相对标准偏差在3%至5%之间。
附图说明
图1是利用不同氯霉素浓度标准样品进行检测的吸收光谱图;
图2是利用不同氯霉素浓度标准样品进行检测的校准曲线;
图3是根据本发明一个实施例的特异性检测氯霉素分析图。
具体实施方式
为了更好的说明本发明的目的、技术方案和优点,下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。应当理解,本文所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明,并不用于限定本发明。下面实施例中,未注明具体条件和环境的实验方法,通常按照常规条件,或制造厂商所建议的条件。
实施例1
本实施例提供一种基于金属有机骨架化合物模拟酶催化特性的水体中氯霉素检测方法,包括如下步骤:
(1)将30μL纳米金溶液和100μL氯霉素核酸适体(1 μM)加入到870μL的磷酸缓冲液中,混合后在室温下反应30 min,得到氯霉素纳米金核酸适体。
(2)配置一组具有系列浓度梯度的样品液,该标准溶液的浓度范围为0-100 ng/mL,其中0ng/mL的样品液为对照组。
(3)将20μL氯霉素纳米金核酸适体和50μL不同浓度的氯霉素标准溶液在室温下反应1 h。
(4)反应结束后,向上述混合液中加入10μL Fe-MIL-88A(0.4 mg/L),760 μL醋酸缓冲液(pH 3.0),100 μL TMB 溶液(10 mM,乙醇为溶剂)和10 μL H2O2(10 mM),40℃反应20分钟。
(5)反应结束后加入50 μL H2SO4(2M)后利用UV-1700紫外吸收分光光度计测定吸收光谱。
信号采集完毕后通过origin软件对数据进行处理,得到清晰直观的紫外光谱图,参见图1。进一步的,根据氯霉素浓度和紫外信号强度的对应关系,绘制两者之间一一对应的校准曲线,同时建立相应的线性方程为Y=0.00168X-0.02523,其中Y为不同氯霉素浓度时紫外吸光度值(a.u.),X为相应氯霉素浓度(nM),R2=0.995,参见图2。
实施例2
取自来水作为待测水体,采用标准加入法向自来水中加入氯霉素标准溶液并配制成不同浓度的含有氯霉素的自来水样品。每一组加标实验都重复6组平行实验,表1中的最终数据是6组平行实验的平均值。结果表明,氯霉素的回收率在104%至108%之间,相对标准偏差在3%至5%之间。本发明方法准确性和重复性较好,可以满足定量测试需要。
表1 实施例2的氯霉素样品回收率
实施例3
取某养殖场废水,操作方法与实施例1相同,平行实验次数为5次后代入实施例1中的校准曲线方程,测得该实际水体中氯霉素的浓度为25.63 ng/mL。采用辽宁省地方标准DB21/T2410-2015《养殖水体中氯霉素残留量的测定高效液相色谱串联质谱法》对该样品进行测试,测得结果为25.37ng/mL。实施例证明本方法用于环境水样中氯霉素残留的定量分析检测可行且效果理想。
实施例4
为了证明该方法对于氯霉素检测的高选择性,分别选用不同种类常见抗生素进行对照试验,包括:阿莫西林,氨苄西林,磺胺二甲嘧啶,卡那霉素B,氧四环素,四环素。其中,氯霉素的浓度为32.6 ng/mL。进一步的,为了验证本发明的高选择性,其他种类抗生素浓度均大幅高于氯霉素浓度,即阿莫西林为83ng/mL,氨苄西林为75ng/mL,磺胺二甲嘧啶为139ng/mL,卡那霉素B为92 ng/mL,氧四环素为80ng/mL,四环素为122ng/mL。从附图3可以看出,本发明提出的检测方法仅对氯霉素检测时吸光度降低率显著增大;而对其他6种抗生素检测时,其吸光度降低率相比于氯霉素检测没有明显变化。其中,吸光地降低率的计算方法为(A0-AM)/A0,A0为不加样品时的吸光度,Am为加入某样品时其对应的吸光度。实验结果表明本发明提出的水体氯霉素检测方法具有良好的抗干扰性能,具有针对氯霉素的高选择特性。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变,仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (8)
1.一种基于金属有机骨架化合物模拟酶催化特性的水体中氯霉素检测方法,其特征在于具体步骤如下:
(1)建立标准样品的校准曲线
(1.1)将氯霉素标准样品与氯霉素纳米金核酸适体在室温下反应1 h,控制氯霉素的含量在0-100 ng/mL;
(1.2)将步骤(1)得到的混合溶液与Fe-MIL-53溶液、醋酸缓冲液、TMB 溶液和H2O2混合反应,40℃反应20分钟;使氯霉素标准样品中的氯霉素与纳米金核酸适体形成稳定的发夹结构包覆在金属有机骨架化合物(Fe-MIL-53)表面;
(1.3)由于Fe-MIL-53被发夹结构包覆后引起3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)在451nm处的紫外吸收峰强度减弱,反应结束后,向步骤(1.2)所得混合液中加入H2SO4,轻微震荡后将显色溶液倒入10mm的比色皿中,用分光光度计在波长451纳米处测定吸光度;
(1.4)以蒸馏水作为空白,溶液的吸光度扣除空白吸光度后的吸光度差值与氯霉素浓度呈线性关系,建立吸光度与氯霉素浓度线性关系回归方程;
(2)对被测水样中氯霉素进行检测
(2.1)将被测水样与氯霉素纳米金核酸适体混合,室温下反应1 h;
(2.2)将步骤(1)得到的混合溶液与Fe-MIL-53溶液、醋酸缓冲液、TMB 溶液和H2O2混合反应;40℃反应20分钟;
(2.3)反应结束后,向步骤(2.2)所得混合液中加入H2SO4,轻微震荡后将显色溶液倒入10mm的比色皿中,用分光光度计在波长451纳米处测定吸光度;将测定值代入步骤(1.5)所得的线性回归方程,可以推算出被测水样中氯霉素的浓度C;
被测水体中氯霉素含量x (单位ng/mL)的计算公式为:
1.jpg
式中V:被测水样的体积,单位ml;C:从校准曲线上得到的氯霉素的含量。
2.根据权利要求1所述的一种基于金属有机骨架化合物模拟酶催化特性的水体中氯霉素检测方法,其特征在于步骤(1.1)中:向1.5mL离心管中加入20 μL氯霉素纳米金核酸适体和50 μL不同浓度计算量的氯霉素标准溶液,控制氯霉素的含量在0-100 ng/mL。
3.根据权利要求1所述的一种基于金属有机骨架化合物模拟酶催化特性的水体中氯霉素检测方法,其特征在于步骤(2.1)中:取水体样品VmL(1mL<V<10mL),置于250mL容量瓶中,加入纯水稀释至刻度,摇匀后用0.22μm滤膜过滤,即得待测水样。
4.根据权利要求1所述的一种基于金属有机骨架化合物模拟酶催化特性的水体中氯霉素检测方法,其特征在于步骤(1.1)和步骤(2.1)中所述氯霉素纳米金核酸适体的制备方法为:将30μL纳米金溶液和100μL氯霉素核酸适体(1 μM)加入到870μL的磷酸缓冲液中,混合后在室温下反应30 min,得到氯霉素纳米金核酸适体。
5.根据权利要求1所述的一种基于金属有机骨架化合物模拟酶催化特性的水体中氯霉素检测方法,其特征在于步骤(1.2)和步骤(2.2)中所述Fe-MIL-53的浓度为0.01mg/mL-0.05mg/mL。
6.根据权利要求1所述的一种基于金属有机骨架化合物模拟酶催化特性的水体中氯霉素检测方法,其特征在于步骤(1.2)和步骤(2.2)中所述醋酸缓冲溶液的pH值为2.5-6。
7.根据权利要求1所述的一种基于金属有机骨架化合物模拟酶催化特性的水体中氯霉素检测方法,其特征在于(1.2)和步骤(2.2)中所述TMB溶液的浓度为10 mmol/L。
8.根据权利要求1所述的一种基于金属有机骨架化合物模拟酶催化特性的水体中氯霉素检测方法,其特征在于(1.2)和步骤(2.2)中所述H2O2溶液浓度为0-400mmol/L。
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