CN104865216A

CN104865216A - 一种基于纳米金核酸适配体比色检测氯霉素的方法

Info

Publication number: CN104865216A
Application number: CN201510312565.8A
Authority: CN
Inventors: 王立梅; 朱颖越; 蔡义林; 袁爱梦; 凌旭; 齐斌
Original assignee: Changshu Institute of Technology
Current assignee: Changshu Institute of Technology
Priority date: 2015-06-10
Filing date: 2015-06-10
Publication date: 2015-08-26

Abstract

本发明涉及一种基于纳米金核酸适配体比色检测氯霉素的方法，包括：（1）将金纳米颗粒、能够对氯霉素特异性识别的核酸适配体和阳离子聚合物混合，阳离子聚合物和核酸适配体形成稳定的复合物；（2）将待测样品和上述混合物混合，待测样品中的氯霉素与核酸适配体形成稳定的发夹结构，释放出阳离子聚合物；（3）金纳米颗粒在阳离子聚合物的作用下团聚成较大颗粒，导致不同波长处的紫外吸收峰强度减弱或增强以及相对应的颜色变化；（4）基于步骤（3）中颜色的变化，确定所述样品中的氯霉素浓度。本发明设计了一种氯霉素生物传感器，用以实现溶液中氯霉素的简单、快速、高灵敏检测。

Description

一种基于纳米金核酸适配体比色检测氯霉素的方法

技术领域

本发明属于食品安全技术和分析化学技术领域，涉及一种检测样品中氯霉素浓度的方法，特别涉及一种基于纳米金核酸适配体比色检测氯霉素的方法。

背景技术

氯霉素是一种白色针状的结晶粉末，在水溶液中比较稳定难以分解，作为一种广谱抗菌素，它可以与核糖体结合，达到抑制细菌蛋白质合成的作用。因其效高价廉，在畜牧业中得到广泛的应用。但是氯霉素具有较强的副作用和毒性，长期接触容易导致再生障碍性贫血和粒细胞缺乏症，此外，长期微量摄入氯霉素，也可使大肠杆菌、沙门氏菌等产生耐药性，引起机体正常菌落的失调，是人们易感染各种疾病。氯霉素可在食用动物中残留，可通过食物链传给人类，对人类的健康造成危害。世界上许多国家禁止此药用于生产食品动物，并规定了其在畜产品中最高残留限量。发达国家对检出限的要求越来越严格，其检测限问题已成为人们关注的焦点。目前氯霉素的检测方法分为微生物法、免疫分析方法、色谱法和其他方法。

核酸适配体是通过指数富集配体的系统进化技术( SELEX) 筛选而来的，选择性地绑定到各种具有高亲和力的目标物如小分子、蛋白质和药物等。与传统的分子识别系统相比，核酸适配体由于易合成而有很大的优势，而且其容易被标记，可以长期稳定存储，具有优良的稳定性,、广泛的适用性以及高敏感特性。因此,它们的优异属性使其在医学诊断、环境监测、生物分析方面的应用有很大潜力。金纳米粒子具有独特的光学特性和较好的生物相容性，已在共振散射光谱，紫外吸收光谱等分析中得到应用，已有研究基于核酸适配体修饰的纳米金与共振瑞利散射光谱，实现了对靶分子、等的高灵敏度高选择性的检测。基于氯金酸制备得到的纳米金溶液呈现出酒红色，少量的电解质存在时能诱导金纳米颗粒团聚，相对应的溶液的颜色会从酒红色逐渐变为蓝紫色。所以在金纳米溶液中加入适量的阳离子聚合物时会引起溶液吸光度的变化。

基于氯霉素与其对应核酸适配体的特异作用，阳离子聚合物性质和金纳米特性分析可知：阳离子聚合物与核酸适配体能够形成稳定的复合物，不能引起金纳米颗粒的聚集。但在氯霉素存在下，核酸适配体优先与氯霉素结合形成发夹结构，从而不能结合阳离子聚合物。溶液中多余的阳离子聚合物会引起金纳米颗粒的聚集，导致体系的紫外吸收值发生变化。因此，结合体系产生吸光信号的强度与氯霉素浓度的关系，本实验研究结合以上原理设计一种测定氯霉素的生物比色传感新方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于纳米金核酸适配体比色检测氯霉素的方法，用以实现溶液中氯霉素的简单、快速、高灵敏检测。

本发明通过以下技术方案来实现：一种基于纳米金核酸适配体比色检测氯霉素的方法，包括：

（1）将金纳米颗粒、能够对氯霉素特异性识别的核酸适配体和阳离子聚合物混合，阳离子聚合物和核酸适配体形成稳定的复合物；

（2）将待测样品和上述混合物混合，待测样品中的氯霉素与核酸适配体形成稳定的发夹结构，释放出阳离子聚合物；

（3）金纳米颗粒在阳离子聚合物的作用下团聚成较大颗粒，导致不同波长处的紫外吸收峰强度减弱或增强以及相对应的颜色变化；

（4）基于步骤（3）中颜色的变化，确定所述样品中的氯霉素浓度。

进一步的，所述的能够对氯霉素特异性识别的核酸适配体的DNA序列具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行氯霉素浓度检测的效率和灵敏度。

进一步的，所述的核酸适配体的浓度为15nM。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行氯霉素浓度检测的效率和灵敏度。

进一步的，所述的阳离子聚合物选用PDDA。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行氯霉素浓度检测的效率和灵敏度。

进一步的，所述的PDDA的浓度为15nM。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行氯霉素浓度检测的效率和灵敏度。

进一步的，所述的氯霉素浓度为0-10000 nM。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行氯霉素浓度检测的效率和灵敏度。

进一步的，所述的氯霉素浓度为50-4000 nM。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行氯霉素浓度检测的效率和灵敏度。

进一步的，基于下列线性方程，确定所述样品中氯霉素的浓度：

Y=0.3056LOG(C)-0.1282，

(Y=A₆₈₀/A₅₂₀）为不同氯霉素浓度下紫外吸收值比率，C为相应氯霉素的浓度。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行氯霉素浓度检测的效率和灵敏度。

根据本发明的实施例，基于体系的颜色变化，确定所述样品中的氯霉素浓度是通过将所述体系的紫外可见吸收光谱与标准曲线进行比较而完成的，其中，所述标准曲线是基于已知氯霉素浓度分别为0 nM、10 nM、50 nM、100 nM、500 nM、1000 nM、2000 nM、4000 nM、6000 nM、10000 nM的标准样品进行平行实验而建立的。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行氯霉素浓度检测的效率和灵敏度。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1是利用不同氯霉素浓度标准样品进行检测的吸收光谱图；

图2是利用不同氯霉素浓度标准样品进行检测所绘制的标准曲线图；

图3显示了根据本发明一个实施例的特异性分析图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制：

实施例1设计与合成相应的寡核苷酸片段

通过查阅相关文献，设计一段能够对氯霉素特异性识别的DNA片段，序列通过DNA合成仪制备。

DNA探针（TBA）序列：5’-ACT TCA GTG AGT TGT CCC ACG GTC GGC GAG TCG GTG GTA G-3’（ SEQ ID NO：1）

实施例2纳米金的制备

根据文献报道，以柠檬酸钠还原氯金酸获得直径为17 nm的金纳米粒子，获得的金纳米溶液的浓度为2.1 nM，冷却至室温，在4℃下保存。

实施例3实验条件的优化

为使实验传感条件最优化，取6个小离心管，均加入500 μL 磷酸缓冲液（0.2 M PBS, pH 7.4），在每个试管中加入聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)，使其最终浓度分别为0，5，10，15，20和25 nM，然后向其中加入1000 μL的金纳米溶液。紫外可见光图谱显示，当PDDA的浓度为15 nM时，可见光吸收值最低，金纳米粒子团聚程度最大，可知PDDA的最优浓度为15 nM。再取6个离心管，均加入500μL PBS的缓冲液和终浓度为15 nM 的PDDA，将TBA加入到各离心管中，使其最终浓度分别为0，5，10，15，20和25 nM，混合并在室温下稳定20 min，然后向每个离心管中加入1000 μL的金纳米溶液，由可见光吸收图谱可知TBA的最优浓度为15 nM。故以下实验中PDDA与TBA的浓度均选用15 nM作为最优反应条件探测溶液中的氯霉素。

实施例4复合反应及标准曲线的建立

取10个离心管，将TBA (15nM)和PDDA (15nM)加入到500μL的PBS缓冲液中，向离心管中加入氯霉素，使其终浓度分别为0,10,50，100,500,1000,2000，4000,6000,10000 nM，混合并在室温下稳定20min，然后向每个离心管中加入1000 μL的金纳米溶液，扫描其紫外可见吸收光谱（图1），根据测定的不同氯霉素浓度下的光吸收值比率绘制氯霉素浓度的标准曲线（图2），本传感器的线性范围50-4000 nM，检测限为17 nM。标准曲线的线性方程为Y=0.3056LOG(C)-0.1282，(Y=A₆₈₀/A₅₂₀）为不同氯霉素浓度下紫外吸收值比率，C为相应氯霉素的浓度，线性相关性>0.98。

实施例5氯霉素的特异性测定

取4个小离心管，将TBA(15 nM)和PDDA(15 nM)加入到500μL的PBS缓冲液中，向各离心管中分别加入氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素、硫酸链霉素，使加入类似物的最终浓度为4000 nM，混合并在室温下反应20分钟，然后向每个离心管中加入1000μL的金纳米溶液，在特定波长处测量可见光吸收值。由实验结果得知这种基于比色检测技术的氯霉素检测传感器具有很高的特异性。结果如图3。

实施例6实际添加样品的测定

向自来水样品中分别添加100、200、500及1000 nM的氯霉素，采用基于比色技术的氯霉素检测新方法测定实际样本中的氯霉素的添加回收率，结果如表1：

表1 氯霉素水样品的测定

结果显示，采用基于比色技术的氯霉素检测新方法测定实际样本中的氯霉素的添加回收率在96.6%-103.3%之间，能够满足现实生活中对氯霉素的检测需求。

序列表

<110> 常熟理工学院

<120> 一种基于纳米金核酸适配体比色检测氯霉素的方法

<130> xb15061002

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 能够对氯霉素特异性识别的DNA片段

<400> 1

acttcagtga gttgtcccac ggtcggcgag tcggtggtag

Claims

1.一种基于纳米金核酸适配体比色检测氯霉素的方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的基于纳米金核酸适配体比色检测氯霉素的方法，其特征在于：所述的能够对氯霉素特异性识别的核酸适配体的DNA序列具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的基于纳米金核酸适配体比色检测氯霉素的方法，其特征在于：所述的核酸适配体的浓度为15nM。

4.根据权利要求1所述的基于纳米金核酸适配体比色检测氯霉素的方法，其特征在于：所述的阳离子聚合物选用PDDA。

5.根据权利要求1所述的基于纳米金核酸适配体比色检测氯霉素的方法，其特征在于：所述的PDDA的浓度为15nM。

6.根据权利要求1所述的基于纳米金核酸适配体比色检测氯霉素的方法，其特征在于：所述的氯霉素浓度为0-10000 nM。

7.根据权利要求6所述的基于纳米金核酸适配体比色检测氯霉素的方法，其特征在于：所述的氯霉素浓度为50-4000 nM。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：基于下列线性方程，确定所述样品中氯霉素的浓度：

Y=0.3056LOG(C)-0.1282，

(Y=A₆₈₀/A₅₂₀）为不同氯霉素浓度下紫外吸收值比率，C为相应氯霉素的浓度。