CN104807865B - 应用于肌红蛋白检测的电化学适配体传感器的制备方法 - Google Patents

Abstract

应用于肌红蛋白检测的电化学适配体传感器的制备方法，涉及一种电化学传感器技术领域，将多肽和HAuCl₄溶解于去离子水中，置于‑15℃搅拌12小时后在0～5℃环境下与NaBH₄反应，取得多肽‑Au纳米复合材料；将多肽‑Au纳米复合材料修饰在电极表面，再通过共价连接肌红蛋白适配体，即得应用于肌红蛋白检测的适配体传感器。该电化学适配体传感器检测范围宽，重现性好，避免了肉品中常见干扰物质的影响，结果准确，能够应用于肉品中肌红蛋白的检测。

Description

应用于肌红蛋白检测的电化学适配体传感器的制备方法

技术领域

本发明涉及一种可应用于肉品中肌红蛋白检测的电化学适配体传感器。

技术背景

肌红蛋白是存在于动物肌肉组织细胞中储存氧和分配氧的色素蛋白质，由一条多肽链构成的珠蛋白和一个血红素辅基（一个卟啉环与Fe的络合物）构成，肌红蛋白含量与肉类颜色的深浅呈正相关，相关研究也是近20年才逐渐兴起，主要集中在生理和医学领域，如肌肉损伤外科指标、心肌梗死早期诊断及预后估计等。

传统的肌红蛋白检测方法主要是比色法和免疫分析法。比色法是通过测定肌红蛋白溶液中卟啉环的吸光值并应用朗伯-比尔定律（A = εbc）来计算肌红蛋白的含量。由于血红蛋白与肌红蛋白结构非常相似，因而该方法在抗干扰、定量的准确程度等方面存在一定的缺陷。免疫分析法操作繁琐、抗体价格昂贵且检测时间较长，因此发展一种高特异性、高灵敏的肌红蛋白定量检测方法有着重要的意义。

电化学传感器是由相互密切联系的物理换能器与敏感材料（生物活性分子）组成的传感装置，它可将被测物质的浓度信息转换成可测量的光电信号，以提供定性和定量分析信息。与传统分析检测技术相比，电化学传感器具有高特异性和灵敏度、响应时间快等明显优势。核酸适配体是一段脱氧核糖核酸（DNA）或者核糖核酸（RNA）序列，是利用体外筛选技术——指数富集的配体系统进化技术（Systematic evolution of ligands byexponcntial enrichment，SELEX），从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段。适配体具有很多优点，如易分离，能与多种目标物质高特异性、高选择性地结合。近些年研究表明，相比抗体而言，核酸适配体的特异性和亲和性较好且易于合成、纯化及修饰，可以根据不同传感器的需求灵活设计；并且其性质稳定，不易受外界环境影响，易于保存，结合适配体的电化学传感器，能够将生物信号转换成电化学信号，检测目标物快速，灵敏和高效。

发明内容

针对电化学适配体传感器肌红蛋白检测的必要和重要性，本发明目的在于提供一种应用于肌红蛋白检测的电化学适配体传感器的制备方法。

本发明将多肽和HAuCl₄溶解于去离子水中，置于-15℃搅拌12小时后在0～5℃环境下与NaBH₄反应，取得多肽-Au纳米复合材料；将多肽-Au纳米复合材料修饰在电极表面，再通过共价连接肌红蛋白适配体，即得应用于肌红蛋白检测的适配体传感器。

进一步地，本发明所述多肽、HAuCl₄、去离子水和NaBH₄的混合体积比为1：3～5：100：3。

本发明制成的多肽-Au纳米复合材料具有良好的生物相容性，将多肽-Au纳米复合材料修饰到电极表面，在纳米材料表面固定好肌红蛋白适配体，当目标检测物肌红蛋白出现时，自组装电极最外层的肌红蛋白适配体会自动捕获目标物肌红蛋白，增大了电极表面的电阻，抑制了电子的传导，从而导致差分脉冲伏安（DPV）信号的降低。制成的电极能将肌红蛋白适配体接枝到电极表面，固定高比例的肌红蛋白适配体，增强了检测信号。同时多肽-Au纳米复合材料能够有效得传递电子，产生电流信号。该电化学适配体传感器检测范围宽，重现性好，避免了肉品中常见干扰物质的影响，结果准确，能够应用于肉品中肌红蛋白的检测。本发明拓宽了生物传感器在肉品品质评价方面的应用。

将该适配体传感器应用于定量检测肉品中肌红蛋白的浓度，此类新型生物传感器的电极响应灵敏度也将大大提高。

本发明具体制备修饰有多肽-Au纳米复合材料的电极的方法是：将3-氨丙基三乙氧基硅烷滴涂于洁净的玻碳电极表面，室温干燥后，再将多肽-Au纳米复合材料修饰于电极表面，晾干，即得修饰有多肽-Au纳米复合材料的电极。

本发明具体制备应用于肌红蛋白检测的适配体传感器的方法是：将修饰有多肽-Au纳米复合材料的电极置于肌红蛋白适配体溶液中浸泡4小时后取出，晾干，即得应用于肌红蛋白检测的适配体传感器。

多肽-Au纳米复合材料能够固定高比例的肌红蛋白适配体，增强了检测信号。在目标物肌红蛋白存在时，形成复合物结构，极大地增加了空间位阻，抑制了[Fe(CN)₆]^3-/4-的电子得失。同时多肽-Au纳米复合材料能够有效得传递电子，产生电流信号，因此该电化学适配体传感器检测范围宽，重现性好，结果准确等优点，具有实际应用价值。

附图说明

图1为实施例1制成的多肽-Au纳米复合材料透射电镜结果图。

图2为实施例2制成的多肽-Au纳米复合材料透射电镜结果图。

图3为多肽-Au纳米复合材料的生物相容性评价图。

图4为修饰了多肽-Au纳米复合材料的电化学适配体传感器在不同浓度肌红蛋白中的示差脉冲图。

图5为修饰了多肽-Au纳米复合材料的电化学适配体传感器在不同浓度肌红蛋白中的线性图。

具体实施方式

以下实施例用以说明本发明，而非限定其范围。

一、制备多肽-Au纳米复合材料：

实施例1：制备多肽-Au纳米复合材料（HAuCl₄试剂30 μl）。

将10 µl多肽和30 µl HAuCl₄加到1 ml去离子水中，混合均匀后于-15℃搅拌12小时后，在0～5℃快速搅拌下加入30 µl NaBH₄，反应后得到深酒红色的多肽-Au纳米复合材料。电镜结果见图1，其中链状结构为多肽，黑色颗粒状为金纳米粒子，由图1可见，金纳米粒子被很好地缠绕在多肽链上。

实施例2：制备多肽-Au纳米复合材料（HAuCl₄试剂50 μl）。

将10 µl多肽和50 µl HAuCl₄加到1 ml去离子水中，混合均匀后于-15℃搅拌12小时后，在0～5℃快速搅拌下加入30 µl NaBH₄，反应后得到深酒红色的多肽-Au纳米复合材料。电镜结果见图2。

二、通过圆二色谱实验对多肽-Au纳米复合材料的生物相容性进行评价。

将肌红蛋白适配体、多肽-Au纳米复合材料与肌红蛋白适配体孵化后的混合液以及该混合液与与不同浓度的肌红蛋白相互作用，分别上机检测。圆二色谱测试参数：参比溶液为PBS，石英比色皿厚度为1 mm，扫描范围180-280 nm，步阶为1.0 nm。

实验结果见图3。图3中曲线a为肌红蛋白适配体的圆二色谱图。多肽-Au纳米复合材料与肌红蛋白适配体结合后的峰形峰位置非常相似（如曲线b所示），说明多肽-Au纳米复合材料能够很好地保持肌红蛋白适配体的结构，具有良好的生物相容性；当肌红蛋白出现时，肌红蛋白适配体的构象发生改变（如曲线c所示）；进一步提高肌红蛋白浓度，圆二色谱中峰形强度大幅变化（如曲线d所示）。以上结果反映了多肽-Au纳米复合材料不会影响肌红蛋白适配体构象的转换，具有良好的生物相容性。

三、将多肽-Au纳米复合材料修饰于工作电极表面，再在电极表面固定肌红蛋白适配体，用差分脉冲伏安法进行电化学检测。

玻碳电极依次用0.3和0.05 μm的α-Al₂O₃抛光至镜面，再用乙醇和超纯水超声处理。将7 μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）滴到电极表面，室温下干燥，APTES通过硅氧键偶联到电极表面。将5 μL 多肽-Au纳米复合材料滴到预处理后的电极上，自然晾干。多肽-Au纳米复合材料与APTES末端的氨基相结合固定于电极表面。

将肌红蛋白适配体以高纯水稀释，取得肌红蛋白适配体浓度为1μM的肌红蛋白适配体溶液。将已修饰材料的电极浸泡于肌红蛋白适配体溶液中，经过4小时后取出，晾干，肌红蛋白适配体末端的氨基与修饰材料的电极表面共价结合固定，即得到应用于肌红蛋白检测的适配体传感器。应用于肌红蛋白检测的适配体传感器不使用时存储在4℃冰箱中。

以上肌红蛋白适配体的氨基酸序列为：

5’-NH₂-CCCTCCTTTCCTTCGACGTAGATCTGCTGCGTTGTTCCGA-3’。该适配体是在2013年6月发表的硕士毕业论文《核酸探针电化学传感器用于小分子和肌红蛋白检测的研究》中公开过的适配体5’-CCCTCCTTTCCTTCGACGTAGATCTGCTGCGTTGTTCCGA-3’的基础上由生工生物工程（上海）股份有限公司合成5’末端带NH₂的新型肌红蛋白适配体。在保留原有适配体能与肌红蛋白特异性结合的优点外，该肌红蛋白适配体的末端还能与纳米材料共价结合。

示差脉冲伏安法由CHI 660D型电化学工作站完成，采用常规的三电极体系进行检测，工作电极为修饰后的玻碳电极，参比电极为饱和甘汞电极，辅助电极为铂丝。示差脉冲伏安曲线是连续向电解池中加入不同浓度（本试验用的肌红蛋白浓度为：0.002g/L，0.005g/L，0.02g/L，0.05g/L，0.2g/L，0.5g/L，1g/L）的肌红蛋白得到的，其中电解液是含10mM [Fe(CN)₆/Fe(CN)₆]^3-/4-和0.1M KCl 的0.1M PBS（pH=7.0）溶液。

实验结果见图4，表4中曲线a到g分别代表的肌红蛋白浓度为：0.002g/L，0.005g/L，0.02g/L，0.05g/L，0.2g/L，0.5g/L，1g/L。随着肌红蛋白浓度的增加，峰电流逐渐减少，这是由于结合到电极表面的肌红蛋白浓度增大，电极表面的电阻增大，电子转移被抑制所造成的。

实验结果见图5。根据肌红蛋白浓度与电流响应的标准曲线，在肌红蛋白浓度0.002～1 g/L的检测范围内存在良好的线性关系。

以上结果表明该电化学适配体传感器具有较好的性能，能够应用于定量检测肉品中肌红蛋白的浓度。

实验结果如图4、5所示。该方法对肌红蛋白的检测范围宽（0.002～1g/L），检测限达到0.581 μg/L。检测实例见下表。并且该传感器具有很好的抗干扰性能，可以保存15天不失去活性。

NO.	分析仪器参考值 (µmol/g)	修饰了多肽-Au纳米复合材料的电化学适配体传感器检测值(µmol/g)
			1	1.68±0.31	1.56±0.04
2	1.55±0.29	1.43±0.07
			3	0.28±0.26	0.22±0.05
4	2.42±0.37	2.35±0.04

所得数值均是每个样品平行五次测定得到，并取其平均值。

由上表可见：

该电化学适配体传感器测得的数据是与分析仪器中测得的数据结果相吻合。此外，我们认为该电化学适配体传感器测定的数据更接近实际值，这是由于分析仪器检测的结果是基于测定卟啉环的吸光值并通过公式计算所得，在抗干扰、定量的准确程度等方面影响了检测结果。而电化学适配体传感器基于检测肌红蛋白适配体与肌红蛋白特异性结合后电流的变化，因此更接近肉品中的真实值。这些数据均说明了该电化学适配体传感器有潜在的实际应用价值。

Claims (3)

1.应用于肌红蛋白检测的电化学适配体传感器的制备方法，将多肽和HAuCl₄溶解于去离子水中，置于-15℃搅拌12小时后在0～5℃环境下与NaBH₄反应，取得多肽-Au纳米复合材料；将多肽-Au纳米复合材料修饰在电极表面，再通过共价连接肌红蛋白适配体，即得应用于肌红蛋白检测的适配体传感器；将3-氨丙基三乙氧基硅烷滴涂于洁净的玻碳电极表面，室温干燥后，再将多肽-Au纳米复合材料修饰于电极表面，晾干，即得修饰有多肽-Au纳米复合材料的电极。

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述多肽、HAuCl₄、去离子水和NaBH₄的混合体积比为1：3～5：100：3。

3.根据权利要求1或2所述制备方法，其特征在于：将修饰有多肽-Au纳米复合材料的电极置于肌红蛋白适配体溶液中浸泡4小时后取得，晾干，即得应用于肌红蛋白检测的适配体传感器。