CN101008643A - 一种金属螯合纳米磁珠,其制备方法及应用 - Google Patents
一种金属螯合纳米磁珠,其制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种金属螯合纳米磁珠,还公开了其制备方法和应用。本发明采用金属盐和表面包被羟基的纳米磁珠为主要原料,使磁珠表面络合金属离子,获得金属螯合纳米磁珠,然后用于从体液中提取蛋白质和多肽并利用磁场进行分离,提取的蛋白质多肽可直接用于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱和电喷雾串联质谱进行分析。该表面螯合金属离子的纳米磁珠具有十分优异的性能,可大量的从体液中提取蛋白质多肽,分离过程简单,可直接用于质谱分析。
Description
技术领域
本发明涉及一种磁性纳米粒子,尤其涉及一种金属螯合纳米磁珠,还涉及该磁珠的制备方法及应用。
背景技术
蛋白质是生物细胞赖以生存的各种代谢和调控途径的主要执行者,并且疾病的发生可能与蛋白质修饰状态的改变有关,蛋白质组学研究直接定位于蛋白质水平,但与以往蛋白质化学的研究不同,蛋白质组研究的对象不是单一或少数的蛋白,它着重的是从全面、整体、动态、定量的角度去研究基因的功能,利用蛋白质组研究方法从细胞蛋白质表达的整体水平上全景式的透视细胞蛋白质表达变化,将更有助于了解细胞的生物学特征,故利用蛋白质组学技术研究疾病的本质要比在基因组水平上的研究更能说明问题。蛋白质组学技术在研究细胞的增殖、分化、异常转化、肿瘤形成等方面进行了有力的探索,为疾病的早期诊断、药靶的发现、疗效和预后的判断提供了重要依据。许多药物发挥作用靶标分子为蛋白质,药物开发一般基于疾病发生过程中特异性上调或下调的蛋白质的表达为候选靶标。利用蛋白质组学方法研究疾病的发生、发展机制、鉴定新的药靶,以及新的生物标志物,并用于指导临床试验。这不但为治疗各种疾病带来新的思路、策略,而且蕴藏着巨大的市场前景。
蛋白质组学的发展也为新药研究、临床诊断提供了新的思路和方法,由此而产生了“临床蛋白质组学”的概念。“临床蛋白质组学”的主要目标就是利用蛋白质组学中质谱技术高灵敏、高分辨、快速、准确的优点来寻找能够用于疾病预测、诊断及治疗检测等的一组多肽和蛋白质。“临床蛋白质组学”是目前蛋白质组学的重要组成部分,是蛋白质组学中新兴的最有应用前景的学科。临床蛋白质组学的目的就是建立新的具有高灵敏度、高专一性的可靠的疾病早期检测方法。
蛋白质组学能够发展的关键是有关技术的出现,与广义蛋白质组学一样,临床蛋白质组研究的主要技术也包括3个方面:(1)血清样品分离和规模化制备技术;(2)高通量、高灵敏度和高分辨率蛋白质分析和鉴定技术;(3)生物信息学及统计学分析技术。上述3方面的技术发展使得临床蛋白质组学的研究已从小范围、小规模和低通量逐步向“高通量、高灵敏度、高精确度和规模化”方向发展。
目前,临床蛋白质组的质谱技术主要以基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)为主要手段的蛋白质分析技术。SELDI-TOF-MS具有灵敏度和分辨率低的弱点,提供的信息较少。最重要的问题是芯片的成本很高且受厂商的控制,不利于真正的临床应用。SELDI-TOF-MS具有高灵敏度和分辨率且不受芯片的限制,操作简便,易于临床应用。
临床蛋白质组的样品制备技术,是目前临床蛋白质组研究达到高灵敏度、高专一性和规模化的主要限制因素。由于血清样品十分复杂,样品中含有有机小分子化合物及盐等各种干扰物及成千上万的蛋白质和多肽,蛋白质和多肽量的差异也非常显著,怎样能够通过简单的处理就可以检测到血清中代表性蛋白质和多肽就成为十分关键的问题。真正应用于临床时血清用量不能够很多,因此对微量血清的处理又增加了难度。因此对样品的规模化处理技术已开始受到关注,在国外已成为一个新的技术热点。目前的样品处理方法主要集中于2维凝胶电泳技术(2-DE)和蛋白质芯片技术以及固相萃取小柱等技术,2-DE技术的灵敏度较低而且操作复杂,不适合于大量样品的高通量分析;蛋白质芯片技术是以固定于一种质谱-表面增强激光解吸电离飞行之间质谱的基础上的一种技术,而且蛋白质芯片的市场价格非常昂贵、提取效率也不能达到最大;固相萃取小柱是通过各种固相填料来提取分离多肽,该方法操作也比较复杂,而且提取效率也不高。
磁珠是近年发展起来并已广泛应用于生物医学领域的一种新型多功能试剂。磁珠的结构通常由具磁性的内核及核外包裹的高分子外壳两部分组成。由于磁核对外磁场的响应,磁珠可在磁场中定向移动。利用这一性质可以对磁珠进行定位,或将磁珠从周围介质中迅速分离出来。高分子外壳的表面多样性决定了磁珠可与各种生物活性物质(如抗体、抗原、受体、酶、核酸等)偶联,这些生物活性物质被固定于磁珠上后则可在反应介质中进一步识别相应的抗原或抗体、配体、底物、核酸,从而达到分离或检测目的。因此,磁珠集载体功能和分离功能于一身,利用物理学、化学和生物医学原理,将许多烦琐复杂的操作简单化,使传统测试的周期大大缩短。在细胞学、免疫学、微生物学、分子生物学及临床诊断与治疗等许多领域得到广泛应用。目前磁珠主要用于免疫磁性分离、细胞及细胞器的分离、微生物的检测、核酸杂交利用以及药物合成中有效化合物的筛选和药品的靶向治疗的研制等领域。现有的用于提取蛋白的磁珠主要为免疫磁珠,通过磁珠表面的特异抗原或抗体与相应的蛋白结合,但是该方法提取的蛋白种类单一,不适合于蛋白质组学的应用。
发明内容
为了克服现有技术的缺点,基于目前的质谱分析和临床蛋白质组学的迫切要求,本发明公开了一种用于从体液(血液、尿液、胃液)中提取代表性蛋白质和多肽的金属螯合纳米磁珠。该磁珠利用金属亲和层析原理,配合一套适合于质谱分析的缓冲溶液尽量多的从体液中获得多肽和蛋白质信息,利用磁珠的磁性进行分离,并直接通过质谱进行分析。
本发明所说的磁珠是在表面功能基团为羟基的纳米Fe3O4磁珠,其最外层为螯合的金属,该金属可以为铜,也可以为镍、铁、锌等。金属的含量由ICP-MS检测后为1×108-9×108ppb,磁珠的粒径通过透射电镜观察为10-200nm。。
本发明的另一个目的在于提供上述金属螯合纳米磁珠制备方法。
本发明的构思为:采用FeCl3和PEG-1500为主要原料;热水解法一步合成表面连有羟基的纳米磁珠;以上述得到的纳米磁珠和金属盐为主要原料,经过四步反应得到表面螯合金属的纳米磁珠;用适量表面螯合金属的纳米磁珠和适量体液混合孵育,快速从体液中提取蛋白质、多肽从而直接用于质谱分析。
上述的金属螯合纳米磁珠的制备包括如下步骤:
首先是超顺磁性表面包被羟基的纳米Fe3O4粒子的制备。所说的超顺磁性是指该磁性粒子具有在磁场作用下显示磁性,撤去磁场后则无剩磁的性质。
利用热水解法一步合成表面连有羟基核心为Fe3O4的纳米磁珠。FeCl3溶解于强极性有机溶剂中,并在搅拌条件下加入聚乙二醇PEG-1500,混匀后在氮气保护下加热回流,然后用弱极性有机溶剂沉淀Fe3O4的纳米磁性粒子,一步反应得到表面包被羟基的纳米Fe3O4磁性粒子。所说的强极性有机溶剂可以为吡咯烷酮,弱极性有机溶剂为比例为5∶1的乙醚/丙酮,PEG-1500与FeCl3的摩尔比为1∶1。
然后是表面螯合金属的纳米磁珠的制备。
①在上述的纳米Fe3O4粒子中加入碱液活化,然后离心分离磁珠。其中碱液为无机碱,可以为氨水、氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾等的一种或一种以上,优选的是氢氧化钠、氨水,浓度为3mol/L-8mol/L。碱的加入量使溶液的PH值达到10-14,优选为12-14。该步反应温度在20-80度,得到活化充分的纳米粒子。
②在上述碱活化后的纳米磁珠中加入无机碱/二甲基亚砜/环氧氯丙烷继续活化磁珠,使其连接上环氧基团,反应完成后分离纳米磁珠。其中无机碱/二甲基亚砜/环氧氯丙烷的比例为2∶4∶5。
③在上述已连接环氧基的磁珠中继续加入络合试剂并在弱碱条件下进行反应,使磁珠表面连接上络合试剂,然后分离纳米磁珠。所选用的络合试剂为亚氨基二乙酸(IDA),所说的弱碱性条件PH值为8-10。
④分离后的纳米磁珠在过量的金属盐溶液中反应使表面络合金属离子,得到纳米金属螯合磁珠。其中金属离子可以为铜离子、镍离子、铁离子、锌离子等金属离子,金属盐溶液为硫酸铜、硫酸镍、硫酸铁、硫酸锌等反应溶液,浓度为0.01-1mol/l。
本发明的目的之三在于上述金属螯合纳米磁珠从体液中提取蛋白质、多肽并直接用于质谱分析中的应用。
上述金属螯合纳米磁珠可用于提取血液、尿液、胃液、脑脊液等体液中的蛋白质和多肽并可直接用于MALDI-TOF-MS检测分析。
具体应用方法如下:
取制备好的金属螯合纳米磁珠,用结合缓冲溶液洗3次,使磁珠处于结合缓冲溶液的条件下,然后加入体液使充分混匀,并在室温孵育10分钟;金属螯合纳米磁珠与体液的加入比例为1∶0.5-1∶5。上述操作完成后,再加入冲洗缓冲溶液洗三次,将未结合的蛋白质、多肽充分洗去,并同时除去体液中的盐以适应质谱的分析需要。接着加入洗脱液将结合的蛋白质、多肽洗脱下来,得到可直接用于质谱分析的蛋白质和多肽样本。
本发明采用FeCl3和PEG-1500为主要原料,通过热水解法一步合成表面连有羟基的纳米磁珠,以纳米磁珠和金属盐为主要原料,经过四步反应得到表面螯合金属的纳米磁珠,用适量表面螯合金属的纳米磁珠和适量体液混合孵育,快速从体液中提取蛋白质、多肽从而直接用于质谱分析。
利用2-DE的方法制备样品,要得到和磁珠提取的多肽种类一样多的样本用于质谱分析,至少需要一周的时间,而利用本发明的金属磁珠的方法在0.5-3小时内即可完成。
本发明的金属螯合纳米磁珠具有十分优异的性能,其可从微量体液中提取足够多的蛋白质和多肽,并且分离过程简单,操作便利。利用本发明的磁珠,可大大简化样品的处理步骤,可使样品的质谱分析达到高通量,高灵敏度,使生物质谱在临床蛋白质组学研究中更好的发挥作用。
附图说明
图1为利用表面螯合金属铜的磁珠从体液中提取的蛋白质和多肽进行质谱分析得到的质谱图。
具体实施方式
实施例一超顺磁性表面包被羟基的纳米Fe3O4粒子的制备
一、材料:
FeCl3:分析纯AR,批号QD2004年3月11日,国药集团化学试剂有限公司生产;PEG 1500:Mr1400-1600,批号:25300-68-3,FLUKA产品;吡咯烷酮(2-pyrrolidone):for synthesis,S34844146,MERCK-Schuchardt产品;乙醚:分析纯,批号:20050315,天津化学试剂有限公司生产;丙酮,分析纯,批号:20041017,北京化工厂生产;透射电镜Philips CM120;Bio-Rad公司FTS-65A傅里叶变换红外光谱仪。
二、方法结果:
利用热水解法一步合成表面连有羟基核心为Fe3O4的纳米磁珠。
将1.35gFeCl3充分溶解在过量吡咯烷酮中,并在搅拌条件下加入聚乙二醇PEG-1500 7.5g,PEG-1500与FeCl3的摩尔比为1∶1,充分混匀后在氮气保护下加热回流,然后用弱极性有机溶剂比例为5∶1的乙醚/丙酮沉淀Fe3O4的纳米磁性粒子,一步反应得到表面包被羟基的纳米Fe3O4磁珠。回流时间应为5小时,得到的超顺磁性纳米粒子通过投射电镜观察直径在10-100nm范围,红外光谱检测表面成功包被聚乙二醇。得到的超顺磁性纳米粒子的尺寸和性能符合要求。
实施例二表面螯合金属铜的磁珠的制备
一、材料
氢氧化钠:分析纯,批号20041112北京化工厂;环氧氯丙烷:分析纯,批号981219,天津化学试剂六厂;二甲基亚砜:99.7%,批号A0208798001,ACROS ORGANICS产品;亚氨基二乙酸(IDA):化学纯,批号F20041203,国药集团化学试剂有限公司生产;硫酸铜:分析纯,批号950315,北京化工厂生产;硝酸:分析纯批号20001110,北京李遂化工厂生产;过氧化氢:分析纯,批号20040124,天津东方化工厂,ICP-MS 7500安捷伦科技有限公司;透射电镜Philips CM120。
二、方法结果
(1)表面螯合金属铜的磁珠的制备
①在上述的纳米Fe3O4粒子中加入高浓度氢氧化钠溶液活化,使氢氧化钠浓度达到8mol/L,溶液的PH值为14,活化温度为60度,活化充分后离心分离磁珠。
②在上述碱活化后的纳米磁珠中加入过量一定比例的无机碱/二甲基亚砜/环氧氯丙烷继续活化磁珠使连接上环氧基团;所说的一定比例是指高浓度无机碱/二甲基亚砜/环氧氯丙烷按照2∶4∶5的比例进行活化反应。反应完成后将所得的连接环氧基团的纳米磁性粒子用离心的方法从溶液中分离出来。
③在上述已连接环氧基的磁珠中继续加入络合试剂亚氨基二乙酸(IDA)1g,并用氢氧化钠调PH值为8进行反应,使磁珠表面连接上络合试剂,反应完成后仍用离心方法将纳米磁珠分离。
④分离后的纳米磁珠在过量的0.5mol/l硫酸铜溶液中反应使表面络合铜离子,得到纳米金属螯合磁珠。
(2)表面螯合金属铜的磁珠的检测
①金属铜的含量检测:取干燥的磁珠100mg加入过量的硝酸、过氧化氢进行消解,消解完全后,用去离子水定容到50g,通过ICP-MS对铜离子进行检测,得到铜离子含量为5×108ppb;
②磁珠粒径大小的检测:取适量磁珠溶于无水乙醇溶液中,铺于铜网上使其分散完全,在透射电镜下进行观察,得到的纳米磁珠粒径在10-200nm范围。
实施例三金属铜螯合纳米磁珠的应用
一、材料:
结合缓冲溶液:0.1mol/l磷酸缓冲溶液,PH为4;磷酸氢二钠,分析纯,批号020422,北京化学试剂公司;磷酸二氢钠,分析纯,批号000404,北京化学试剂公司;冲洗缓冲溶液:0.1%的甲酸水溶液,甲酸:分析纯,批号000815,北京化学试剂公司;洗脱液:0.1%的甲酸和50%乙腈水溶液,乙腈,色谱纯,批号401103135邯郸市林峰精细化工有限公司;血清样品来自解放军总医院。
二、方法结果:
取制备的金属铜螯合纳米磁珠20μL,用结合缓冲溶液洗3次,使磁珠处于结合缓冲溶液的条件下,每次用磁场进行分离,然后加入10μL血清样品使充分混匀,并在室温孵育10分钟,然后再通过磁场进行分离;所说的通过磁场进行分离是纸将样品放于Ependorf管并使其一侧贴近磁铁,磁珠被磁铁吸附过去,使液体与磁珠进行分离。
上述操作完成后,再加入冲洗缓冲溶液洗三次,将未结合的蛋白质、多肽及血清中的盐充分洗去,以适应质谱的分析需要。接着加入洗脱液将结合的蛋白质、多肽洗脱下来,得到可直接用于质谱分析的蛋白质和多肽样本。整个操作所需时间仅为1小时。
若通过2-DE的方法来提取分离蛋白和多肽至少需要一天,并且不能直接用于质谱分析,还需酶切等复杂步骤的处理才可用于质谱分析,所以要得到与磁珠方法相比质谱中同样多的蛋白和多肽峰,则至少需要1周的时间。
因此该磁珠提取蛋白的效率高,所需时间短,可通量化。通过本试验得到的质谱图见附图1。
Claims (9)
1.一种金属螯合纳米磁珠,其特征在于在表面功能基团为羟基的纳米Fe3O4磁珠表面螯合有金属离子,其中金属离子为铜离子、镍离子、铁离子或锌离子,金属离子含量为1×108-9×108ppb,磁珠的直径为10-200nm。
2.根据权利要求1所述的金属螯合纳米磁珠,其特征在于螯合的金属离子为铜离子。
3.权利要求1或2所述金属螯合纳米磁珠的制备方法,包括如下步骤:
(1)超顺磁性表面包被羟基的纳米Fe3O4粒子的制备:
溶解FeCl3于强极性有机溶剂中,并在搅拌条件下加入聚乙二醇PEG-1500,充分混匀后在氮气保护下加热回流,然后用弱极性有机溶剂沉淀Fe3O4的纳米磁珠,一步反应得到表面包被羟基的纳米Fe3O4磁珠;
(2)表面螯合金属的纳米磁珠的制备:
①在上述的纳米Fe3O4粒子中加入无机碱液活化,活化后离心分离磁珠,其中无机碱为氨水、氢氧化钠、碳酸钠或氢氧化钾,碱的加入量使溶液的PH值达到10-14,反应温度为20-80℃;
②加入无机碱/二甲基亚砜/环氧氯丙烷,继续活化磁珠使连接上环氧基团,反应完成后离心分离纳米磁珠;
③加入络合试剂并在弱碱条件下进行反应,使磁珠表面连接上络合试剂,反应完成后离心分离纳米磁珠;
④将纳米磁珠于金属盐溶液中反应,使其表面络合金属离子,得到纳米金属螯合磁珠,其中金属盐为硫酸铜、硫酸镍、硫酸铁或硫酸锌,金属离子为铜离子、镍离子、铁离子或锌离子,反应液浓度为0.01-1mol/L。
4.根据权利要求3的制备方法,其中强极性有机溶剂为吡咯烷酮,弱极性有机溶剂为乙醚/丙酮,其比例为5∶1,PEG-1500与FeCl3的摩尔比为1∶1。
5.根据权利要求3的制备方法,其中无机碱为氢氧化钠或氨水,浓度为3mol/L-8mol/L,碱的加入量使溶液的PH值达到12-14。
6.根据权利要求3的制备方法,其中无机碱/二甲基亚砜/环氧氯丙烷的比例为2∶4∶5。
7.根据权利要求3的制备方法,其中络合试剂为亚氨基二乙酸(IDA),弱碱性条件PH值为8-10。
8.根据权利要求3的制备方法,其中金属盐为硫酸铜,磁珠表面络合的金属离子为铜离子。
9.权利要求1或2所述的磁珠在提取体液中的蛋白质或多肽,并用于质谱检测分析中的应用。
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