CN105876075A - 一种磁珠分离制备骨多肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种骨多肽的制备方法，采用磁珠表面包被壳多糖后，经柠檬酸处理可与样品中的多肽类物质特异性结合，通过外加磁场，磁珠与多肽被一起吸附而滞留在磁场中，从而达到多肽的快速富集与分离，可以解决其他纯化方法所遇到的问题，并且能够大量快速的从动物骨骼酶解液中选择性提取多肽，所得产品为白色几无腥味，含氮量高。
Description
技术领域
本发明涉及保健食品领域，特别涉及一种磁珠分离制备骨多肽的方法。
背景技术
近年来生物活性肽结构和功能研究再现高潮，促进了多肽营养的发展与概念更新，饮食中的多肽除了作为营养物具有促进机体新陈代谢、生长发育功能外，还赋予调节机体生理功能和免疫力的双重功能。因此，多肽产品已经成为人体健康的重要物质，受到广大消费者的青睐。
现阶段开发的产品主要集中在海洋鱼低聚肽、鸡头骨多肽等产品，其基本方法是将动物鲜骨在高温、高压下蒸煮脱脂后，加入蛋白酶制剂对骨液酶解，酶解后得小分子多肽物质。然而，这些多肽产品虽然具有良好的功效，但是，目前制备骨肽产品的工艺主要采用提取活性成分后加热酶解后喷雾干燥得到产品，采用的纯化手段是色谱法或者有机溶剂萃取等，缺点是难以大规模制备、环境污染、无法完全避免混入脂肪等杂质影响多肽产品的品质。
发明内容
本发明的目的是提供一种得到高纯骨多肽的方法，其特征在于使用磁珠分离法，通过吸附反吸附配合，选择性提取酶解液中的多肽类物质。解决目前生产骨多肽产品中含有脂肪等非多肽类杂质缺点。
本发明为实现上述目的所采用的的技术方案为：
选择性分离多肽磁珠的制备：取1单位重量的裸磁珠，加入磁珠重量1-5倍的壳聚糖醋酸溶液，搅拌10分钟至60分钟，去掉上清液，然后加入与磁珠重量1-10倍的柠檬酸钠水溶液，剧烈搅拌下室温反应30分钟至60分钟，去掉上清液，用与磁珠重量1-3倍的清水洗涤磁珠三次，备用；
多肽的吸附：在制备好的骨多肽酶解液中加入步骤(1)中制备好的磁珠，磁珠用量占骨重量5～10％，搅拌0.5至2小时，外加磁场将磁珠固定于反应釜底部，除去上清液，再用纯净水洗磁珠3次；
多肽的反吸附：向反应釜加入牛骨质量相等的纯净水，煮沸搅拌，然后通过磁场将磁珠固定于反应釜底部，吸取上清液，得多肽溶液；
喷雾干燥：将所得上清液喷雾干燥，控制进风口温度150-160℃，出风口70-80℃，既得骨多肽粉。
本发明步骤(2)所用骨酶解液按如下操作制备：
活性成分的提取：取清洗好的动物骨骼，破碎成1～8cm左右的碎块，称取1单位重量的碎骨加至反应釜中，加入3-5单位重量的水，控制体系温度在101℃至110℃，压力为0.2MPa至1MPa；8至12小时后，将固液分离，除去脂肪层，收集水层；
酶解：将收集的水层置于反应釜中，加入酶，控制温度为35℃至45℃，pH值为6.0～7.0；6至8小时后加热至90℃保持15分钟，停止加热；将酶解液离心取上清液加入0.1％单位的活性炭搅拌15min，超滤除去活性炭，收集酶解液，即得。
酶解步骤所用的酶为胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、弹性蛋白酶中的一种或多种。所述酶的用量为骨骼重量的0.1～0.5％。优选为木瓜蛋白酶和风味蛋白酶，所述木瓜蛋白酶的用量为骨骼重量的0.1～0.2％，优选0.15％。所述风味蛋白酶的用量为骨骼重量的0.3～0.5％，优选0.4％。
本发明采用磁珠表面包被壳多糖后，经柠檬酸处理可与样品中的多肽类物质特异性结合，通过外加磁场，磁珠与多肽被一起吸附而滞留在磁场中，从而达到多肽的快速富集与分离，可以解决其他纯化方法所遇到的问题。并且能够大量快速的从动物骨骼酶解液中选择性提取多肽，所得产品为白色几无腥味，含氮量高。
具体实施方式
对比实施例1
骨多肽酶解液的制备：取清洗好的牛骨骼，破碎成1～8cm左右的碎块，称取1单位重量的碎骨加至反应釜中，加入3-5单位重量的水，控制体系温度在101℃至110℃，压力为0.2MPa至1MPa；8至12小时后，将固液分离，除去脂肪层，收集水层；将收集的水层置于反应釜中，加入骨骼重量0.2％的木瓜蛋白酶，控制温度为35℃至45℃，pH值为6.0～7.0；6至8小时后加热至90℃保持15分钟，停止加热；将酶解液离心取上清液加入0.1％单位的活性炭搅拌15min，超滤除去活性炭，收集酶解液，即得。
色谱法分离：将制备好的牛骨多肽酶解液500mL通过装有大孔树脂的色谱柱，收集滤液；
喷雾干燥：将所得上清液喷雾干燥，控制进风口温度150-160℃，出风口70-80℃，既得多肽粉。
对比实施例2
骨多肽酶解液的制备：取清洗好的牛骨骼，破碎成1～8cm左右的碎块，称取1单位重量的碎骨加至反应釜中，加入3-5单位重量的水，控制体系温度在101℃至110℃，压力为0.2MPa至1MPa；8至12小时后，将固液分离，除去脂肪层，收集水层；将收集的水层置于反应釜中，加入骨骼重量0.5％的风味蛋白酶，控制温度为35℃至45℃，pH值为6.0～7.0；6至8小时后加热至90℃保持15分钟，停止加热；将酶解液离心取上清液加入0.1％单位的活性炭搅拌15min，超滤除去活性炭，收集酶解液，即得。
有机溶剂提取法脱脂：将取100mL酶解液蒸干，加100mL正己烷搅拌30分钟，过滤收集滤饼；将滤饼烘干，加水50mL溶解，离心取上清液；
喷雾干燥：将所得上清液喷雾干燥，控制进风口温度150-160℃，出风口70-80℃，既得多肽粉。
实施例1
(1)选择性分离多肽磁珠的制备：取1单位重量的裸磁珠，加入与磁珠3倍质量体积比的用1％的醋酸溶解的壳聚糖溶液，搅拌15分钟，去掉上清液，然后加入与磁珠5倍质量体积比的10％的柠檬酸钠水溶液，剧烈搅拌下室温反应30分钟，去掉上清液，用与磁珠1倍质量体积比的清水洗涤磁珠三次备用；
(2)多肽的吸附：将制备好的牛骨多肽酶解液加入牛骨重量10％按步骤1中制备好的磁珠，搅拌2小时，通过磁场将磁珠固定于反应釜底部，除去上清液，再用纯净水洗磁珠3次；
(3)多肽的反吸附：向反应釜加入牛骨质量相等的纯净水，煮沸搅拌，然后通过磁场将磁珠固定于反应釜底部，吸取上清液，得多肽溶液；
(4)喷雾干燥：将所得上清液喷雾干燥，控制进风口温度150-160℃，出风口70-80℃，既得多肽粉。
步骤(2)骨多肽酶解液的制备：取清洗好的牛骨骼，破碎成1～8cm左右的碎块，称取1单位重量的碎骨加至反应釜中，加入3-5单位重量的水，控制体系温度在101℃至110℃，压力为0.2MPa至1MPa；8至12小时后，将固液分离，除去脂肪层，收集水层；将收集的水层置于反应釜中，加入骨骼重量0.2％的木瓜蛋白酶，控制温度为35℃至45℃，pH值为6.0～7.0；6至8小时后加热至90℃保持15分钟，停止加热；将酶解液离心取上清液加入0.1％单位的活性炭搅拌15min，超滤除去活性炭，收集酶解液，即得。
实施例2
(1)选择性分离多肽磁珠的制备：取1单位重量的裸磁珠，加入与磁珠5倍质量体积比的用3％的醋酸溶解的壳聚糖溶液，搅拌60分钟，去掉上清液，然后加入与磁珠10倍质量体积比的8％的柠檬酸钠水溶液，剧烈搅拌下室温反应30分钟，去掉上清，用与磁珠3倍质量体积比的清水洗涤磁珠三次备用；
(2)多肽的吸附：将制备好的牛骨多肽酶解液加入牛骨重量7％按步骤1中制备好的磁珠，搅拌1小时，外加磁场将磁珠固定于反应釜底部，除去上清液，再用纯净水洗磁珠3次；
(3)多肽的反吸附：向反应釜加入牛骨质量相等的纯净水，煮沸搅拌，然后通过磁场将磁珠固定于反应釜底部，吸取上清液，得多肽溶液；
(4)喷雾干燥：将所得上清液喷雾干燥，控制进风口温度150-160℃，出风口70-80℃，既得多肽粉。
步骤(2)骨多肽酶解液的制备：取清洗好的牛骨骼，破碎成1～8cm左右的碎块，称取1单位重量的碎骨加至反应釜中，加入3-5单位重量的水，控制体系温度在101℃至110℃，压力为0.2MPa至1MPa；8至12小时后，将固液分离，除去脂肪层，收集水层；将收集的水层置于反应釜中，加入骨骼重量0.5％的风味蛋白酶，控制温度为35℃至45℃，pH值为6.0～7.0；6至8小时后加热至90℃保持15分钟，停止加热；将酶解液离心取上清液加入0.1％单位的活性炭搅拌15min，超滤除去活性炭，收集酶解液，即得。
实施例3
(1)选择性分离多肽磁珠的制备：取1单位重量的裸磁珠，加入与磁珠5倍质量体积比的用3％的醋酸溶解的壳聚糖溶液，搅拌30分钟，去掉上清，然后加入与磁珠10倍质量体积比的15％的柠檬酸钠水溶液，剧烈搅拌下室温反应30分钟，去掉上清，用与磁珠3倍质量体积比的清水洗涤磁珠三次备用；
(2)多肽的吸附：将制备好的牛骨多肽酶解液加入牛骨重量10％按步骤1中制备好的磁珠，搅拌1小时，外加磁场将磁珠固定于反应釜底部，除去上清液，再用纯净水洗磁珠3次；
(3)多肽的反吸附：向反应釜加入牛骨质量相等的纯净水，煮沸搅拌，然后通过磁场将磁珠固定于反应釜底部，吸取上清液，得多肽溶液；
(4)喷雾干燥：将所得上清液喷雾干燥，控制进风口温度150-160℃，出风口70-80℃，既得多肽粉。
所得产品色泽白色，几乎无腥味，口感好于实施例1和2。
步骤(2)骨多肽酶解液的制备：取清洗好的牛骨骼，破碎成1～8cm左右的碎块，称取1单位重量的碎骨加至反应釜中，加入3-5单位重量的水，控制体系温度在101℃至110℃，压力为0.2MPa至1MPa；8至12小时后，将固液分离，除去脂肪层，收集水层；将收集的水层置于反应釜中，加入骨骼重量0.15％的风味蛋白酶和骨骼重量0.4％的木瓜蛋白酶，控制温度为35℃至45℃，pH值为6.0～7.0；6至8小时后加热至90℃保持15分钟，停止加热；将酶解液离心取上清液加入0.1％单位的活性炭搅拌15min，超滤除去活性炭，收集酶解液，即得。
实施例4
(1)选择性分离多肽磁珠的制备：取1单位重量的裸磁珠，加入与磁珠5倍质量体积比的用3％的醋酸溶解的壳聚糖溶液，搅拌30分钟，去掉上清，然后加入与磁珠10倍质量体积比的12％的柠檬酸钠水溶液，剧烈搅拌下室温反应30分钟，去掉上清，用与磁珠1-3倍质量体积比的清水洗涤磁珠三次备用；
(2)多肽的吸附：将制备好的猪骨多肽酶解液加入猪骨重量10％按步骤1中制备好的磁珠，搅拌1小时，外加磁场将磁珠固定于反应釜底部，除去上清液，再用纯净水洗磁珠3次；
(3)多肽的反吸附：向反应釜加入猪骨质量相等的纯净水，煮沸搅拌，然后通过磁场将磁珠固定于反应釜底部，吸取上清液，得多肽溶液；
(4)喷雾干燥：将所得上清液喷雾干燥，控制进风口温度150-160℃，出风口70-80℃，既得多肽粉。
步骤(2)骨多肽酶解液的制备：取清洗好的猪骨，破碎成1～8cm左右的碎块，称取1单位重量的碎骨加至反应釜中，加入3-5单位重量的水，控制体系温度在101℃至110℃，压力为0.2MPa至1MPa；8至12小时后，将固液分离，除去脂肪层，收集水层；将收集的水层置于反应釜中，加入骨骼重量0.15％的风味蛋白酶和骨骼重量0.4％的木瓜蛋白酶，控制温度为35℃至45℃，pH值为6.0～7.0；6至8小时后加热至90℃保持15分钟，停止加热；将酶解液离心取上清液加入0.1％单位的活性炭搅拌15min，超滤除去活性炭，收集酶解液，即得。
| 项目 | 对比实施例1 | 对比实施例2 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 |
| 外观 | 类白色粉末 | 淡黄色粉末 | 白色粉末 | 白色粉末 | 白色粉末 |
| 气味 | 有腥味 | 腥味明显 | 略有异味 | 略有异味 | 几乎无异味 |
| 口感 | 味苦 | 苦涩 | 稍有苦味 | 淡淡的苦味 | 几乎无苦味 |
| 含氮量 | 13.7％ | 12.5％ | 14.7％ | 14.5％ | 14.9％ |
| 炽灼残渣 | 0.91％ | 1.26％ | 0.30％ | 0.25％ | 0.27％ |
Claims (8)
1.一种骨多肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)选择性分离多肽磁珠的制备：取1单位重量的裸磁珠，加入磁珠重量1-5倍的壳聚糖醋酸溶液，搅拌10分钟至60分钟，去掉上清液，然后加入与磁珠重量1-10倍的柠檬酸钠水溶液，剧烈搅拌下室温反应30分钟至60分钟，去掉上清液，用与磁珠重量1-3倍的清水洗涤磁珠三次，备用；
(2)多肽的吸附：在制备好的骨多肽酶解液中加入步骤(1)中制备好的磁珠，磁珠用量占骨重量5～10％，搅拌0.5至2小时，外加磁场将磁珠固定于反应釜底部，除去上清液，再用纯净水洗磁珠3次；
(3)多肽的反吸附：向反应釜加入牛骨质量相等的纯净水，煮沸搅拌，然后通过磁场将磁珠固定于反应釜底部，吸取上清液，得多肽溶液；
(4)喷雾干燥：将所得上清液喷雾干燥，得骨多肽。
2.根据权利要求1所述的骨多肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的骨多肽酶解液采用如下方式制备：取清洗好的动物骨骼，破碎成1～8cm左右的碎块，称取1单位重量的碎骨加至反应釜中，加入3-5单位重量的水，控制体系温度在101℃至110℃，压力为0.2MPa至1MPa；8至12小时后，将固液分离，除去脂肪层，收集水层；将收集的水层置于反应釜中，加入酶，控制温度为35℃至45℃，pH值为6.0～7.0；6至8小时后加热至90℃保持15分钟，停止加热；将酶解液离心取上清液加入0.1％单位的活性炭搅拌15min，超滤除去活性炭，收集酶解液，即得。
3.根据权利要求2所述的骨多肽的制备方法，其特征在于，所述酶为胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、弹性蛋白酶中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的骨多肽的制备方法，其特征在于，所述酶的用量为骨骼重量的0.1～0.5％。
5.根据权利要求3所述的骨多肽的制备方法，其特征在于，所述的酶为木瓜蛋白酶和风味蛋白酶。
6.根据权利要求5所述的骨多肽的制备方法，其特征在于，所述木瓜蛋白酶的用量为骨骼重量的0.1～0.2％，所述风味蛋白酶的用量为骨骼重量的0.3～0.5％。
7.根据权利要求6所述的骨多肽的制备方法，其特征在于，所述木瓜蛋白酶的用量为骨骼重量的0.15％，所述风味蛋白酶的用量为骨骼重量的0.4％。
8.一种骨多肽，其特征在于，该骨多肽采用权利要求1至7任一权利要求所述的方法制备而得。
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Citations (4)
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- 2014-12-28 CN CN201410856321.1A patent/CN105876075A/zh not_active Withdrawn
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