CN104313099B - 一种高抗氧化活性鸡蛋清蛋白肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高抗氧化活性鸡蛋清蛋白肽的制备方法，具体步骤如下：鸡蛋清蛋白悬浊液在85℃‑95℃条件下保持10min变性，冷却至室温，先后用碱性蛋白酶和胃蛋白酶各水解1‑6h，灭酶，冷却后离心取上清液；采用截留分子量3kDa膜超滤上述上清液，收集滤过液；真空浓缩后冷冻干燥得到白色或淡黄色的鸡蛋清蛋白抗氧化肽粗品；采用DA201‑C大孔吸附树脂吸附上述滤过液，然后用乙醇梯度洗脱，收集、真空浓缩并冷冻干燥75%的乙醇洗脱组分，即可获得高活性鸡蛋清蛋白抗氧化肽。本发明方法的优点是：鸡蛋清蛋白利用率高；工艺简单，成本低廉，便于工业化生产；获得的鸡蛋清蛋白肽具有显著的抗氧化活性，且安全、无毒副作用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及活性多肽的制备及富集技术。
背景技术
我国拥有世界上最为丰富的禽蛋资源，禽蛋产量1985年以来一直居世界第一位。蛋清粉是一种资源丰富、价格低廉的优质蛋白资源，主要包含卵清蛋白、卵转铁蛋白、溶菌酶、卵粘蛋白、类卵粘蛋白、卵球蛋白和抗生物素蛋白，这些蛋白质含有人体所必需的多种氨基酸，且氨基酸组成配比均衡性好，机体利用率高。但是，蛋清粉腥味重、溶解性差、粘度大、受热易凝固，这些性质限制了它在食品加工中的应用。因此，非常有必要对蛋清粉进行深加工，以提高蛋清粉的应用价值。
人类的衰老与人体代谢所产生的氧化物有关，特别是自由基的产生，它会产生许多对人体及细胞的不良影响，引起脂质氧化反应从而生成对人体有害的难以降解的脂褐素，攻击生命大分子物质，破坏细胞内DNA、蛋白质以及细胞膜，诱导细胞凋亡，加速人体衰老。同时，自由基过多，也会诱发一系列疾病，如老年痴呆症、脑血栓、动脉粥样硬化和癌症等。因此，探寻能有效清除自由基的物质成分非常有必要。
天然蛋白来源的抗氧化肽因其分子量小、易吸收、清除自由基活性强、安全性高等特点，在医药、化妆品、保健品和食品与饲料添加剂等方面有广阔的应用前景。目前有关抗氧化肽的研究主要集中在抗氧化肽的酶解制备、分离、鉴定以及酶解产物或抗氧化肽的体内外生物活性研究。尽管部分高纯抗氧化肽被证实具有强效的抗氧化活性，但其分离纯化过程一般较繁琐，成本较高。相对于纯肽，高活性蛋白水解母液或粗分离组分从产品开发方面更具有可行性。
天然蛋白质分子具有紧密的立体结构，氢键、疏水键、二硫键等作用使肽链卷曲于蛋白分子内部，很难被蛋白酶水解。要加快酶解速度、提高蛋白水解度必须考虑对原料进行前处理，使原料蛋白高度压缩、紧密的结构松散开，暴露出分子内部的酶作用位点，以利于蛋白酶的作用。有研究显示，适度的热处理能破坏蛋白质的二、三级或四级结构，打开氢键、二硫键及疏水键，使得蛋白质分子结构松散，分子内部酶作用位点暴露出来，从而更易于蛋白酶的作用。因此，通过热处理变性蛋白可以提高蛋白的水解度，增强蛋白利用率。
蛋白酶解产物的抗氧化活性受许多因素影响，其中所选用蛋白酶的种类及水解条件对酶解产物的抗氧化活性具有重要影响，而所选用蛋白酶种类为重中之重。许多研究显示，相对于其他蛋白酶，碱性蛋白酶和胃蛋白酶对于蛋白原料中的抗氧化肽的释放具有更显著的效果。碱性蛋白酶或胃蛋白酶的酶切释放活性肽段的N末端和/或C末端一般为脂肪族或芳香族的疏水性氨基酸，这些氨基酸的种类及所在位置均能有效增强所形成肽段的抗氧化活性。
除了蛋白酶及其酶解条件影响酶解产物中肽段的活性之外，所形成肽段的分子量及疏水性也是影响肽段抗氧化活性的重要影响。活性高的抗氧化肽其分子量通常在3kDa以下。肽段中高比例的疏水性氨基酸有利于促进该肽段的抗氧化活性。通过超滤可以获得合适分子量的活性肽段。通过大孔吸附树脂可以对酶解产物中疏水性较强的高活性抗氧化肽进行富集。
目前，尽管已有不少有关“鸡蛋清蛋白的碱性蛋白酶酶解液和鸡蛋清蛋白的胃蛋白酶酶解液抗氧化活性”的研究报道（金嫘等. Alcalase碱性蛋白酶酶解蛋清制备抗氧化活性肽[J].食品研究与开发,2009,30(6):59-62.；刘静波等. 蛋清蛋白水解物体内抗氧化作用的实验研究[J].食品工业,2009,(2),5-8.；杨瑾等. 鸡蛋清蛋白水解物的物化及功能性质的研究[J]. 现代食品科技, 2011,27(11), 1316-1319.；陈晨等. 蛋清的蛋白酶解物清除自由基的研究[J].营养学报,2009,(5),471-474.；徐明生. 鸡蛋卵白蛋白酶解物抗氧化肽研究[D].2006,博士学位论文.；发明专利授权号CN1321192C；发明专利授权号CN102586376B等），但未见有“采用碱性蛋白酶和胃蛋白酶分步酶解鸡蛋清蛋白制备抗氧化肽”的相关研究报道，且未见有“通过对鸡蛋清蛋白的热处理变性、碱性蛋白酶和胃蛋白酶分步酶解以及对所得酶解液超滤和大孔吸附树脂粗分离的集成技术制取抗氧化肽”的报道。
鉴于以上技术背景，本发明以鸡蛋清蛋白为原料，采用热处理技术使得蛋白变性，结构松散，接着先后采用碱性蛋白酶和胃蛋白酶对变性蛋白进行分步酶解，最后采用采用超滤和树脂吸附技术富集酶解液中的高活性抗氧化肽。所得抗氧化肽产品可以应用于医药、化妆品、保健品和食品与饲料添加剂等领域。
发明内容
本发明目的是提供一种高抗氧化活性鸡蛋清蛋白肽的制备方法，以解决现有鸡蛋清蛋白活性肽产品存在抗氧化活性肽含量低，抗氧化活性不强的不足的问题。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种高抗氧化活性鸡蛋清蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
(1) 以鸡蛋清蛋白粉为原料，加水配置成鸡蛋清蛋白悬浊液，在85℃-95℃保持10min，并不断搅拌使鸡蛋清蛋白变性，冷却至室温，加入碱性蛋白酶进行水解；
(2) 步骤(1)酶解结束后，加入胃蛋白酶水解，反应后灭酶，冷却至室温后调pH值至5.0-6.0，离心并收集上清液；
(3) 将步骤(2)所得上清液超滤，收集滤过液，真空浓缩后冷冻干燥得鸡蛋清蛋白抗氧化肽粗品；
(4) 取步骤(3)所得鸡蛋清蛋白抗氧化肽粗品用DA201-C大孔吸附树脂吸附，然后用乙醇梯度洗脱，收集、真空浓缩并冷冻干燥洗脱组分，即可获得高活性鸡蛋清蛋白抗氧化肽。
优选的，步骤（1）中，鸡蛋清蛋白悬浊液的质量浓度为1%-6%。
优选的，步骤（1）中，碱性蛋白酶的添加量为每1g鸡蛋清蛋白添加6000U-12000U碱性蛋白酶。
优选的，步骤（1）中，碱性蛋白酶水解条件为：pH值为6.5-11.0；水解温度为50℃-70℃，水解时间为1-6h。
优选的，步骤（2）中，胃蛋白酶的添加量为每1g鸡蛋清蛋白添加10000-30000U胃蛋白酶。
优选的，步骤（2）中，胃蛋白酶的水解条件为： pH值为1.0-2.5；温度为35-40℃，水解时间为1-6h。
优选的，步骤（2）中，灭酶条件为：95℃保持15min，冷却至室温后在转速4000r/min离心15min。
优选的，步骤（3）中，超滤的膜截留分子量为3kDa。
优选的，步骤(3)中，超滤操作前超滤膜要先后用无水乙醇、pH值为1-2的酸液、pH值为11-12碱液和去离子水各循环清洗20min，操作压为0.1-0.2MPa。
优选的，步骤(4)中，取鸡蛋清蛋白抗氧化肽粗品溶于pH值为5.0-6.0的PBS缓冲液中，加入DA201-C大孔吸附树脂静态吸附1-3h，先用体积分数为10-50%的乙醇洗涤后，再用体积分数为50-100%的乙醇洗脱，优选用体积分数为75%的乙醇洗脱，洗脱时间0.5-3h，收集、真空浓缩及冷冻干燥75%的乙醇洗脱组分，实现高活性鸡蛋清蛋白抗氧化肽的富集。
本发明的有益效果是：本发明通过鸡蛋清蛋白的热处理变性、碱性蛋白酶与胃蛋白酶的两步酶解，以及超滤和树脂吸附技术的应用，既提高了鸡蛋清蛋白的利用率，又获得了高活性抗氧化肽。该鸡蛋清蛋白抗氧化肽生产方法，鸡蛋清蛋白的热处理、酶解以及酶解液的超滤和大孔吸附分离工艺简单易行，参数容易控制，重复性好，所得产品质量稳定；所用蛋白原料利用率高，所用设备和试剂价格便宜，活性肽生产成本低，便于工业化生产；所获得抗氧化肽产品安全、无毒副作用，抗氧化活性高，质量稳定，可广泛应用于食品、化妆品和医药等领域。
具体实施方式
本发明提供的高活性鸡蛋清蛋白抗氧化肽的制备方法，包括如下步骤：
(1) 以鸡蛋清蛋白粉为原料，加水配置成质量浓度为1%-6%的鸡蛋清蛋白悬浊液，85℃-95℃保持10min，并不断搅拌使鸡蛋清蛋白变性，冷却至室温后调解pH至6.5-11.0，水解温度为50℃-70℃，每1g鸡蛋清蛋白加碱性蛋白酶6000-12000U，水解时间为1-6h；
(2) 步骤(1)酶解结束后，迅速调节pH值至1.0-2.5，按照10000-30000U /1g鸡蛋清蛋白的量加入胃蛋白酶，在35-40℃下反应1-6h后95℃保持15min灭酶，冷却至室温后调pH值至5.0-6.0，4000r/min离心15min，收集上清液；
(3) 将步骤(2)所得上清液用截留分子量为3kDa的超滤膜在0.1-0.2MPa压力下进行超滤，收集滤过液，真空浓缩后冷冻干燥得鸡蛋清蛋白抗氧化肽粗品；超滤操作前超滤膜要先后用无水乙醇、pH值为1-2的酸液、pH值为11-12碱液和去离子水各循环清洗20min；
(4)取鸡蛋清蛋白抗氧化肽粗品溶于pH值为5.0-6.0的PBS缓冲液中，加入DA201-C大孔吸附树脂（该处多肽质量与树脂的比例可以根据需要进行放大），室温静态吸附1-3h，先用体积分数为10-50%的乙醇洗涤后，再用体积分数为50-100%的乙醇洗脱，优选用体积分数为75%的乙醇洗脱，洗脱时间0.5-3h，收集、真空浓缩及冷冻干燥75%的乙醇洗脱组分，实现高活性鸡蛋清蛋白抗氧化肽的富集。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
鸡蛋清蛋白酶解液的制备步骤如下：a、取4g鸡蛋清蛋白粉，加水配置成质量浓度为2%的鸡蛋清蛋白悬浊液，95℃保持10min使鸡蛋清蛋白变性，冷却至室温后调解pH至9.0，按照每克鸡蛋清蛋白10000U的酶量添加碱性蛋白酶，55℃，水解时间3h；b、迅速将步骤a中的酶解液pH值调节至2.0，按照每克鸡蛋清蛋白15000U的酶量添加胃蛋白酶，37℃水解3h后95℃保持15min灭酶，冷却至室温后调pH值至6.0，4000r/min离心15min，收集上清液；c、将步骤b所得酶解液用截留分子量为3kDa的超滤膜在0.2MPa压力下进行超滤，收集滤过液，真空浓缩后冷冻干燥得鸡蛋清蛋白抗氧化肽粗品；超滤操作前超滤膜要先后用无水乙醇、pH值为1的酸液、pH值为12碱液和去离子水各循环清洗20min；d、取步骤c中的鸡蛋清蛋白抗氧化肽粗品，配制成10mg/ml的多肽溶液50mL，保持pH为6.0，加入20g经过清洗及平衡的DA201-C大孔吸附树脂，25℃条件下静态吸附3h，先用体积分数为25%的乙醇洗涤后，再用体积分数为75%乙醇洗脱2h，收集、浓缩并冷冻干燥75%的乙醇洗脱组分，即可获得高活性鸡蛋清蛋白抗氧化肽。
通过对鸡蛋清蛋白变性处理以及碱性蛋白酶和胃蛋白酶的先后分步酶解，使得鸡蛋清蛋白的水解度达到38%。最终所得鸡蛋清蛋白抗氧化肽的还原能力为1.2（肽浓度为1mg/mL），DPPH自由基清除活性IC50值为0.9mg/mL，羟自由基清除活性IC50为70μg/mL，亚油酸脂质过氧化抑制IC50值为0.85mg/mL。
实施例2
鸡蛋清蛋白酶解液的制备步骤如下：a、取4g鸡蛋清蛋白粉，加水配置成质量浓度为4%的鸡蛋清蛋白悬浊液，95℃保持10min使鸡蛋清蛋白变性，冷却至室温后调解pH至9.0，按照每克鸡蛋清蛋白10000U的酶量添加碱性蛋白酶，60℃，水解时间5h；b、迅速将步骤a中的酶解液pH值调节至2.0，按照每克鸡蛋清蛋白15000U的酶量添加胃蛋白酶，37℃水解3h后95℃保持15min灭酶，冷却至室温后调pH值至6.0，4000r/min离心15min收集上清液；c、将步骤b所得酶解液用截留分子量为3kDa的超滤膜在0.2MPa压力下进行超滤，收集滤过液，真空浓缩后冷冻干燥得鸡蛋清蛋白抗氧化肽粗品；超滤操作前超滤膜要先后用无水乙醇、pH值为2的酸液、pH值为11碱液和去离子水各循环清洗20min ；d、取步骤c中的鸡蛋清蛋白抗氧化肽粗品，配制成10mg/ml的多肽溶液50mL，保持pH为5.0，加入20g经过清洗及平衡的DA201-C大孔吸附树脂，25℃条件下静态吸附3h，先用体积分数为25%的乙醇洗涤后，再用体积分数为75%乙醇洗脱2h，收集、浓缩并冷冻干燥75%的乙醇洗脱组分，即可获得高活性鸡蛋清蛋白抗氧化肽。
通过对鸡蛋清蛋白变性处理以及碱性蛋白酶和胃蛋白酶的先后分步酶解，使得鸡蛋清蛋白的水解度达到45%。最终所得鸡蛋清蛋白抗氧化肽的还原能力为0.85（肽浓度为1mg/mL），DPPH自由基清除活性IC50值为0.6mg/mL，羟自由基清除活性IC50为15μg/mL，亚油酸脂质过氧化抑制IC50值为0.35mg/mL。
实施例3
鸡蛋清蛋白酶解液的制备步骤如下：a、取4g鸡蛋清蛋白粉，加水配置成质量浓度为1%的鸡蛋清蛋白悬浊液，85℃保持10min使鸡蛋清蛋白变性，冷却至室温后调解pH至11.0，按照每克鸡蛋清蛋白6000U的酶量添加碱性蛋白酶，50℃，水解时间1h；b、迅速将步骤a中的酶解液pH值调节至2.5，按照每克鸡蛋清蛋白10000U的酶量添加胃蛋白酶，35℃水解6h后95℃保持15min灭酶，冷却至室温后调pH值至5.5，4000r/min离心15min收集上清液；c、将步骤b所得酶解液用截留分子量为3kDa的超滤膜在0.1MPa压力下进行超滤，收集滤过液，真空浓缩后冷冻干燥得鸡蛋清蛋白抗氧化肽粗品；超滤操作前超滤膜要先后用无水乙醇、pH值为2的酸液、pH值为11碱液和去离子水各循环清洗20min ；d、取步骤c中的鸡蛋清蛋白抗氧化肽粗品，配制成10mg/ml的多肽溶液50mL，保持pH为5.5，加入20g经过清洗及平衡的DA201-C大孔吸附树脂，25℃条件下静态吸附2h，先用体积分数为10%的乙醇洗涤后，再用体积分数为75%乙醇洗脱，洗脱时间0.5h，收集、浓缩并冷冻干燥75%的乙醇洗脱组分，即可获得高活性鸡蛋清蛋白抗氧化肽。
通过对鸡蛋清蛋白变性处理以及碱性蛋白酶和胃蛋白酶的先后分步酶解，使得鸡蛋清蛋白的水解度达到30%。最终所得鸡蛋清蛋白抗氧化肽的还原能力为1.1（肽浓度为1mg/mL），DPPH自由基清除活性IC50值为2.1mg/mL，羟自由基清除活性IC50为240μg/mL，亚油酸脂质过氧化抑制IC50值为1.75mg/mL。
实施例4
鸡蛋清蛋白酶解液的制备步骤如下：a、取4g鸡蛋清蛋白粉，加水配置成质量浓度为6%的鸡蛋清蛋白悬浊液，90℃保持10min使鸡蛋清蛋白变性，冷却至室温后调解pH至6.5，按照每克鸡蛋清蛋白12000U的酶量添加碱性蛋白酶，70℃，水解时间6h；b、迅速将步骤a中的酶解液pH值调节至1.0，按照每克鸡蛋清蛋白30000U的酶量添加胃蛋白酶，40℃水解1h后95℃保持15min灭酶，冷却至室温后调pH值至5.0，4000r/min离心15min收集上清液；c、将步骤b所得酶解液用截留分子量为3kDa的超滤膜在0.1MPa压力下进行超滤，收集滤过液，真空浓缩后冷冻干燥得鸡蛋清蛋白抗氧化肽粗品；超滤操作前超滤膜要先后用无水乙醇、pH值为1的酸液、pH值为11碱液和去离子水各循环清洗20min ；d、取步骤c中的鸡蛋清蛋白抗氧化肽粗品，配制成10mg/ml的多肽溶液50mL，保持pH为6.0，加入20g经过清洗及平衡的DA201-C大孔吸附树脂，25℃条件下静态吸附1h，先用体积分数为50%的乙醇洗涤后，再用体积分数为75%乙醇洗脱，洗脱时间3h，收集、浓缩并冷冻干燥75%的乙醇洗脱组分，即可获得高活性鸡蛋清蛋白抗氧化肽。
通过对鸡蛋清蛋白变性处理以及碱性蛋白酶和胃蛋白酶的先后分步酶解，使得鸡蛋清蛋白的水解度达到36%。最终所得鸡蛋清蛋白抗氧化肽的还原能力为0.78（肽浓度为1mg/mL），DPPH自由基清除活性IC50值为1.6mg/mL，羟自由基清除活性IC50为120μg/mL，亚油酸脂质过氧化抑制IC50值为1.4mg/mL。
Claims (2)
1.一种抗氧化活性鸡蛋清蛋白肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）以鸡蛋清蛋白粉为原料，加水配制成质量浓度为1%-6%的鸡蛋清蛋白悬浊液，在 85℃ -95℃保持10min，并不断搅拌使鸡蛋清蛋白变性，冷却至室温后调节pH至6.5-11.0，按照每克鸡蛋清蛋白6000U-12000U的酶量添加碱性蛋白酶，50℃-70℃，水解时间1-6h；
（2）步骤 (1) 酶解结束后，迅速调节pH 值至 1.0-2.5，按照10000U-30000U/1g鸡蛋清蛋白的量加入胃蛋白酶，在35℃-40℃下反应 1-6h后 95℃保持 15min 灭酶，冷却至室温后调 pH 值至5.0-6.0，4000r/min 离心 15min， 收集上清液；
（3）将步骤 (2) 所得上清液超滤，收集滤过液，真空浓缩后冷冻干燥得鸡蛋清蛋白抗氧化肽粗品；所述超滤的膜截留分子量为 3kDa；
（4）取步骤 (3) 所得鸡蛋清蛋白抗氧化肽粗品溶于pH 值为5.0-6.0 的PBS 缓冲液中，加入DA201-C 大孔吸附树脂静态吸附 1-3h，用体积分数为 10-50% 的乙醇洗涤后，再用体积分数为 50-100% 的乙醇洗脱，洗脱时间 0.5-3h，收集、真空浓缩及冷冻干燥 75%的乙醇洗脱组分，实现高活性鸡蛋清蛋白抗氧化肽的富集。
2.如权利要求 1 所述的抗氧化活性鸡蛋清蛋白肽的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，超滤操作前超滤膜要先后用无水乙醇、pH 值为 1-2 的酸液、pH 值为 11-12 的碱液和去离子水各循环清洗 20min，超滤操作压为 0.1-0.2MPa。
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Citations (3)
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| CN101012472A (zh) * | 2007-02-07 | 2007-08-08 | 东北农业大学 | 高f值蛋清寡肽的制备方法 |
| CN101906455A (zh) * | 2010-07-22 | 2010-12-08 | 东北农业大学 | 蛋清蛋白源辅助降血压肽的制备方法 |
| CN102337318A (zh) * | 2011-07-26 | 2012-02-01 | 南京林业大学 | 银杏抗氧化活性肽及其制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
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