CN110243891A - 一种检测癌细胞的免标记均相电化学生物传感方法 - Google Patents

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    • G01N27/28—Electrolytic cell components
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Abstract

本发明属于细胞检测技术领域，涉及一种检测癌细胞的免标记均相电化学生物传感方法。本发明采用已被核酸适配体功能化的DNA四面体纳米结构探针(Apt‑DTNs)与癌细胞特异性结合，分离癌细胞和结合到癌细胞表面的Apt‑DTNs探针后，溶液中剩余的Apt‑DTNs探针浓度发生变化；加入电活性物质后，由于电活性物质嵌入到Apt‑DTNs中，从而导致游离的电活性物质浓度发生变化，通过电化学检测获得信号值，经数据处理后获得癌细胞的存在情况和存在数量。本发明的基于Apt‑DTNs的免标记均相电化学传感方法，在不固定任何生物识别分子的前提下，可直接检测电活性分子的电流信号，无需标记DNA，具有成本低、操作简单等优点。

Description

一种检测癌细胞的免标记均相电化学生物传感方法
技术领域
本发明属于细胞检测技术领域，涉及一种检测癌细胞的免标记均相电化学生物传感方法。
背景技术
癌症是严重危害人类健康的重大疾病，是致人死亡的主要原因之一，其发病率呈逐年上升趋势。癌症的早期发现和诊断对其预防和治疗至关重要。研究表明若能早期发现并及时治疗，可大大提癌症的治愈率和生存率。因此，建立简单、快速、灵敏的癌细胞检测方法具有重要意义。常用检测癌细胞的方法主要有：荧光法、表面增强拉曼散射、酶联免疫、色谱法、放射性免疫与成像技术。但是这些方法或准确度欠佳、灵敏度不够；或步骤冗长、操作繁琐；或依赖大型仪器、分析成本高昂，难以满足日益增长的准确、简单、快速、高灵敏、高特异性检测癌细胞的需求。
电化学生物传感方法是最新兴的一类生物传感方法。相对于其它生物传感方法而言，具有实验设备简单、反应快速、高灵敏性，易实现设备小型化的特点。然而，传统电化学生物传感方法需要通过一系列步骤将识别探针固定到电极表面，其过程繁琐、耗时，大大增加了实验难度。基于电极的均相电化学分析方法受到广泛关注。该类传感方法省去了识别探针的固定步骤，可通过均相溶液中发生的生化反应调节电活性物质与电极之间的距离，进而影响两者之间的电子传递，最终实现目标物的电化学检测。均相电化学分析方法不仅缩短了操作过程和响应时间，而且提高了目标物与识别探针的绑定结合效率，有利于检测灵敏度的提高；同时大大降低了实验难度，实现了操作简单且省时的目的。
然而，大多数已报道的均相电化学生物传感方法需要将电活性的信号分子标记在识别探针上，这样就存在标记复杂且成本高的问题，限制了其进一步发展和广泛应用。因此，开发稳定，简便，免标记的均相电化学策略用于癌细胞检测势在必行。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷，构建了一种基于核酸适配体功能化的DNA四面体纳米结构探针的免标记均相电化学生物传感方法。
本发明是采用以下的技术方案实现的：
本发明提供了一种检测癌细胞的免标记均相电化学生物传感方法，采用已被核酸适配体功能化的DNA四面体纳米结构探针，命名为Apt-DTNs探针，与癌细胞特异性结合，分离癌细胞和结合到癌细胞表面的Apt-DTNs探针后，溶液中剩余的Apt-DTNs探针浓度发生变化；加入电活性物质后，由于电活性物质嵌入到Apt-DTNs中，从而导致游离的电活性物质浓度发生变化，通过电化学检测获得信号值，经数据处理后获得癌细胞的存在情况和存在数量。
其中，所述Apt-DTNs探针包括DNA四面体骨架以及可与靶蛋白识别并结合的核酸适配体序列，核酸适配体序列位于DNA四面体骨架的顶角；所述DNA四面体骨架由四条相互互补的核酸双链及未配对的单碱基构成。
优选地，所述DNA四面体骨架由四条单链DNA进行互补配对组装而成，DNA四面体骨架每条边均由17对脱氧核糖核苷酸通过碱基互补配对形成，核酸适配体序列通过若干重复排列的脱氧核糖核苷酸与单链DNA相连。
具体的，所述核酸适配体序列为与癌细胞表面过表达的蛋白质发生特异性识别并结合的一段核酸序列。
其中，所述Apt-DTNs探针的制备方法，将含有核酸适配体序列的单链DNA加入单链自组装的离子缓冲液中，进行退火处理，使其自组装形成DNA四面体纳米结构探针。
优选地，所述单链DNA序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示，核酸适配体序列如SEQ ID NO.5所示。
以上Apt-DTNs探针的制备方法具体包括如下步骤：
将四条等摩尔量的单链DNA，其中一条或两条以上5’端连接有核酸适配体序列，溶解在TM缓冲溶液中，加热至95℃，反应3-10分钟，然后在冰浴中快速冷却5-10分钟后得到DNA四面体纳米结构探针；其中TM缓冲溶液中含有20mM Tris，50mM MgCl2，溶液pH＝8.0。
上述检测癌细胞的免标记均相电化学生物传感方法，包括如下步骤：
(1)不引入目标癌细胞，将电活性物质加入到含有Apt-DTNs探针的缓冲溶液中，进行电化学测量；
(2)引入目标癌细胞，将目标癌细胞加入到与步骤(1)中缓冲溶液所含等量Apt-DTNs探针的缓冲溶液中，孵育一段时间，离心分离癌细胞和结合到癌细胞表面的Apt-DTNs探针后，获得上清液，上清液中含有未与癌细胞结合的Apt-DTNs探针；
(3)将电活性物质加入到步骤(2)获得的上清液中，进行电化学测量，根据测量结果与标准曲线计算癌细胞数量。
其中，所述电活性物质为亚甲基蓝(MB)；
利用三电极法进行电化学测量，三电极包括氧化铟锡导电玻璃电极(ITO)、Ag/AgCl电极和铂丝，依次分别为工作电极、参比电极和对电极；
所述电化学测量选择差分脉冲伏安法，扫描电压范围是-0.4V至0V。
上述ITO电极是在1.0mM的NaOH溶液中浸泡5-8小时，用超纯水充分淋洗并氮气吹干后即可使用。
所述缓冲溶液为10mM Tris，100mM NaCl，pH 7.4。
具体地，在所述步骤(2)中，将终浓度为100nM的Apt-DTNs探针与不同浓度的癌细胞样品混合，混合10-120分钟后，在1500转/分下离心5分钟，获得上清液。
具体地，在所述步骤(3)中，将终浓度为2μM的MB分子加入上述步骤(1)所述的含有Apt-DTNs探针的缓冲溶液和步骤(2)所述的上清液中，反应15分钟。
本发明还保护上述免标记均相生物传感方法在制备和/或检测待测样本中含有高表达粘蛋白的癌细胞的产品中的应用，所述待测样本为外周血或细胞培养。
本发明的有益效果是：
(1)本发明所述基于Apt-DTNs的免标记均相电化学传感方法，采用分子识别探针，其制备过程简单，不仅对癌细胞具有高靶向性，还对MB具有高装载率的特点；
(2)本发明所述的基于Apt-DTNs的免标记均相电化学传感方法，利用癌细胞易于沉淀分离的特点，实验过程简单便捷、易于操作；
(3)本发明所述的基于Apt-DTNs的免标记均相电化学传感方法，在不固定任何生物识别分子的前提下，可直接检测电活性分子的电流信号，无需标记DNA，具有成本低、操作简单等优点。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
在附图中：
图1为免标记均相电化学生物传感方法中所用的DNA四面体纳米结构图。
图2为基于免标记均相电化学生物传感方法高灵敏检测癌细胞的原理图。
图3为实施例2的免标记均相电化学生物传感方法在不同条件下的差分脉冲伏安曲线图；曲线(a)为Apt(II)-DTNs+MB，曲线(b)为Apt(II)-DTNs+MCF-7乳腺癌细胞+MB。
图4为实施例3的含有不同核酸适配体数目的DNA四面体纳米结构探针在MCF-7乳腺癌细胞是否存在时的峰电流变化值。
图5为实施例4免标记均相电化学生物传感方法在不同浓度MCF-7乳腺癌细胞下的差分脉冲伏安曲线图。
图6为实施例4将MCF-7乳腺癌细胞的不同浓度的对数值作为横坐标、MCF-7乳腺癌细胞的不同浓度下测得的峰电流值作为纵坐标的线性关系图。
图7为实施例5免标记均相电化学生物传感方法在不同浓度A549肺癌细胞下的差分脉冲伏安曲线图。
图8为实施例5将A549肺癌细胞的不同浓度的对数值作为横坐标、A549肺癌细胞的不同浓度下测得的峰电流值作为纵坐标的线性关系图。
具体实施方式
为了使本发明目的、技术方案更加清楚明白，下面结合附图，对本发明作进一步详细说明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
主要设备：利用三电极法进行电化学测量，三电极包括氧化铟锡导电玻璃电极(ITO)、Ag/AgCl电极和铂丝，依次分别为工作电极、参比电极和对电极；
上述ITO电极是在1.0mM的NaOH溶液中浸泡5-8小时，用超纯水充分淋洗并氮气吹干后即可使用。
下列实施例采用的骨架单链序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示，分别命名为S1、S2、S3、S4，核酸适配体序列如SEQ ID NO.5所示，命名为Apt。
Apt识别并结合癌细胞表面的mucin 1蛋白。
如图1所示，构成DNA四面体纳米结构的单链DNA包括：S1，S2，S3，S4，Apt-S1，Apt-S2，Apt-S3，Apt-S4。其中，Apt-S1、Apt-S2、Apt-S3和Apt-S4分别包含三个序列段，从5’端开始的核酸适配体Apt序列段，8个T碱基序列段，以及能够形成DNA四面体骨架的序列段，序列分别如SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.9所示。
下列实施例采用的Apt-DTNs包括延伸出的不同数目的核酸适配体序列：延伸出一条核酸适配体序列的DNA四面体纳米结构Apt(I)-DTNs，延伸出两条核酸适配体序列的DNA四面体纳米结构Apt(II)-DTNs，延伸出三条核酸适配体序列的DNA四面体纳米结构Apt(III)-DTNs，延伸出四条核酸适配体序列的DNA四面体纳米结构Apt(IV)-DTNs。
Apt(I)-DTNs由Apt-S1、S2、S3和S4杂交组成；Apt(II)-DTNs由Apt-S1、Apt-S2、S3和S4杂交组成；Apt(III)-DTNs由Apt-S1、Apt-S2、Apt-S3和S4杂交组成；Apt(IV)-DTNs由Apt-S1、Apt-S2、Apt-S3和Apt-S4杂交组成。
下列实施例采用的对照DNA四面体纳米结构为，不含有核酸适配体序列的DNA四面体纳米结构(DTNs)由S1、S2、S3和S4杂交组成。
下列实施例所采用的检测方法，原理如图2所示：
以Apt(II)-DTNs为例，在目标癌细胞不存在时，溶液中存在大量的Apt(II)-DTNs，加入MB分子后，MB分子嵌入到Apt(II)-DTNs中形成Apt(II)-DTNs/MB复合物，该复合物不易扩散到带有负电荷的ITO电极表面，产生相对较小的电化学信号。当目标癌细胞存在时，癌细胞表面过表达的蛋白与Apt(II)-DTNs探针上的核酸适配体特异性结合，将Apt(II)-DTNs绑定到细胞表面。分离癌细胞和结合到癌细胞表面的Apt(II)-DTNs后，上清液中剩余的Apt(II)-DTNs较少，此时将MB加入到上清液中时，大量的MB分子游离在溶液中。由于MB分子容易扩散到ITO电极表面，导致电化学信号增加。随着引入目标癌细胞浓度的增加，结合到癌细胞表面的Apt(II)-DTNs越多，所得上清液中的Apt(II)-DTNs的数量越少，导致加入MB分子后，游离的MB分子数量越多，电化学信号越大，通过电化学信号增加值与目标癌细胞对应关系得出目标癌细胞数量。
实施例1
将八种单链DNA序列S1、S2、S3、S4、Apt-S1、Apt-S2、Apt-S3和Apt-S4分别溶解在TM缓冲溶液(20mM Tris，50mM MgCl2，pH＝8.0)中，得到25μM的对应单链DNA储备液。
分别取4μL上述配制的S1、S2、S3和S4储备液，加入到36μL的上述TM缓冲溶液中，混合均匀。将所得混合液加热至95℃保持3-10分钟，然后在冰浴中快速冷却5-10分钟，制备得到DTNs，将上述溶液保存在4℃下存贮备用。
取四条不同的单链DNA储备液，采用同样的方法制备Apt(I)-DTNs、Apt(II)-DTNs、Apt(III)-DTNs和Apt(IV)-DTNs。
实施例2
(1)MCF-7乳腺癌细胞的培养：将MCF-7细胞贴壁生长于1640培养液中，其中含牛胚胎血清10％(v/v)、青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL，在37℃、5％的二氧化碳培养箱中培养。当细胞覆盖面积长到90％左右时，用PBS溶液洗涤2次，加入1mL 0.25％的胰蛋白酶，消化3分钟，除去培养液，用PBS溶液洗涤3次后，细胞待用。
(2)空白信号测试：将MB分子(终浓度2μM)加入到含有100nM Apt(II)-DTNs的缓冲溶液(10mM Tris，100mM NaCl，pH7.4)中，反应15-30分钟，通过差分脉冲伏安法测量电流信号，工作电压范围为-0.4V至0V。
(3)将终浓度为1×106个/mL的MCF-7乳腺癌细胞加入到终浓度为100nM Apt(II)-DTNs的缓冲溶液(10mM Tris，100mM NaCl，pH7.4)中，反应总体积为100μL，温育反应10-120分钟，温度为37℃，将上述所得混合溶液在1500转/分下离心5分钟，获得上清液。将MB分子(终浓度2μM)加入到该上清液中，反应15-30分钟，通过差分脉冲伏安法测量电流信号，工作电压范围为-0.4V至0V。
结果如图3所示，当MB分子直接加入到Apt(II)-DTNs溶液中时，测得的电化学信号较小(曲线a)。当MCF-7乳腺癌细胞存在时，电化学信号明显增加(曲线b)。这表明基于Apt-DTNs的免标记均相生物传感方法能够准确检测MCF-7乳腺癌细胞。
实施例3
本实施例中，与实施例2不同的是步骤(2)、(3)中将Apt(II)-DTNs分别替换成DTNs、Apt(I)-DTNs、Apt(III)-DTNs和Apt(IV)-DTNs。
结果如图4所示，没有修饰核酸适配体的DTNs电流信号变化值Δip接近于零，而修饰了不同核酸适配体数目的DNA四面体纳米结构探针电流信号变化值Δip变化很明显，说明基于不同核酸适配体数目的DNA四面体纳米结构探针都能够实现MCF-7乳腺癌细胞的检测。从图4中还可以看出，与Apt(II)-DTNs相比，Apt(III)-DTNs和Apt(IV)-DTNs增加的电流值没有明显的变化，因此实施例4、5中选用Apt(II)-DTNs用于癌细胞的定量分析。
图4为含有不同核酸适配体数目的DNA四面体纳米结构探针在MCF-7乳腺癌细胞是否存在时的峰电流变化值；Δip＝ip-ip,0，其中ip为MCF-7乳腺癌细胞存在时的峰电流值，ip,0为MCF-7乳腺癌细胞不存在时的峰电流值，峰电流值是电压为0.21V时所对应的电流值。
实施例4
(1)MCF-7乳腺癌细胞的培养：同实施例2；
(2)将不同浓度MCF-7乳腺癌细胞加入到终浓度为100nM Apt(II)-DTNs的溶液中，反应总体积为100μL，反应60分钟，温度为37℃，将上述所得混合溶液在1500转/分下离心5分钟，获得上清液。将MB分子(终浓度2μM)加入到上述所说的上清液中，反应15-30分钟，通过差分脉冲伏安法测量电流信号，工作电压范围为-0.4V至0V。
结果如图5所示，随着MCF-7乳腺癌细胞的浓度增加，电流信号逐渐升高。将MCF-7乳腺癌细胞的不同浓度的对数值设为横坐标，将一系列MCF-7乳腺癌细胞的不同浓度下测得的峰电流值设为纵坐标，建立MCF-7乳腺癌细胞浓度与峰电流值之间的线性关系，线性回归方程为：峰电流值＝38.33C+89.43(R＝0.9971)。结果如图6所示，利用该线性曲线，可以实现对MCF-7乳腺癌细胞的定量分析，由于检测体系只有100μL，说明本发明可以检测最低5个MCF-7乳腺癌细胞。
图5为在不同浓度的MCF-7乳腺癌细胞存在下的差分脉冲伏安曲线，a为不加细胞的空白对照，b-h分别为50个/mL、1×102个/mL、1×103个/mL、1×104个/mL、1×105个/mL、3×105个/mL和1×106个/mL的MCF-7乳腺癌细胞。图6为将MCF-7乳腺癌细胞不同浓度的对数值设为横坐标，MCF-7乳腺癌细胞不同浓度下测得的峰电流值作为纵坐标，得到的线性关系图。峰电流值是电压为0.21V时所对应的电流值。
实施例5
(1)A549肺癌细胞的培养：培养方法同实施例2步骤(1)。与实施例2不同的是将MCF-7乳腺癌细胞替换为A549肺癌细胞。
(2)A549肺癌细胞的检测：检测步骤同实施例4。结果如图7所示，随着A549肺癌细胞的浓度增加，电流信号逐渐升高。将A549肺癌细胞的不同浓度的对数值设为横坐标，将一系列A549肺癌细胞的不同浓度下测得的峰电流值设为纵坐标，得到A549肺癌细胞浓度与峰电流值之间的线性关系，线性回归方程为：峰电流值＝37.80C+59.74(R＝0.9910)。结果如图8所示，利用该线性曲线，可以实现对A549肺癌细胞的定量分析。该结果表明本发明具有通用性，可实现不同癌细胞检测。
图7为在不同浓度的A549肺癌细胞存在下的差分脉冲伏安曲线，a为不加细胞的空白对照，b-h分别为50个/mL、1×102个/mL、1×103个/mL、1×104个/mL、1×105个/mL、3×105个/mL和1×106个/mL的A549肺癌细胞。图8为将A549肺癌细胞不同浓度的对数值设为横坐标，A549肺癌细胞不同浓度下测得的峰电流值作为纵坐标，得到的线性关系图。峰电流值是电压为0.21V时所对应的电流值。
当然，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 一种检测癌细胞的免标记均相电化学生物传感方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acattcctaa gtctgaaaca ttacagcttg ctacacgaga agagccgcca tagta 55
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tatcaccagg caattgacag tgtagcaagc tgtaatagat gcgagggtcc aatac 55
<210> 3
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcaattgcct ggtgataaaa cgacactacg tgggaatcta ctatggcggc tcttc 55
<210> 4
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttcagactta ggaatgtgct tcccacgtag tgtcgtttgt attggaccct cgcat 55
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<210> 6
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcagttgatc ctttggatac cctggttttt tttacattcc taagtctgaa acattacagc 60
ttgctacacg agaagagccg ccatagta 88
<210> 7
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcagttgatc ctttggatac cctggttttt ttttatcacc aggcaattga cagtgtagca 60
agctgtaata gatgcgaggg tccaatac 88
<210> 8
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcagttgatc ctttggatac cctggttttt ttttcaattg cctggtgata aaacgacact 60
acgtgggaat ctactatggc ggctcttc 88
<210> 9
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcagttgatc ctttggatac cctggttttt tttttcagac ttaggaatgt gcttcccacg 60
tagtgtcgtt tgtattggac cctcgcat 88

Claims (10)

1.一种检测癌细胞的免标记均相电化学生物传感方法，其特征在于，采用已被核酸适配体功能化的DNA四面体纳米结构探针，命名为Apt-DTNs探针，与癌细胞特异性结合，分离癌细胞和结合到癌细胞表面的Apt-DTNs探针后，溶液中剩余的Apt-DTNs探针浓度发生变化；加入电活性物质后，由于电活性物质嵌入到Apt-DTNs中，从而导致游离的电活性物质浓度发生变化，通过电化学检测获得信号值，经数据处理后获得癌细胞的存在情况和存在数量。
2.根据权利要求1所述的免标记均相电化学生物传感方法，其特征在于，所述Apt-DTNs探针包括DNA四面体骨架以及可与靶蛋白识别并结合的核酸适配体序列，核酸适配体序列位于DNA四面体骨架的顶角；所述DNA四面体骨架由四条相互互补的核酸双链及未配对的单碱基构成。
3.根据权利要求2所述的免标记均相电化学生物传感方法，其特征在于，所述DNA四面体骨架由四条单链DNA进行互补配对组装而成，DNA四面体骨架每条边均由17对脱氧核糖核苷酸通过碱基互补配对形成，核酸适配体序列通过若干重复排列的脱氧核糖核苷酸与单链DNA相连。
4.根据权利要求1所述的免标记均相电化学生物传感方法，其特征在于，所述核酸适配体序列为与癌细胞表面过表达的蛋白质发生特异性识别并结合的一段核酸序列。
5.根据权利要求2-4任一项所述的免标记均相电化学生物传感方法，其特征在于，所述Apt-DTNs探针的制备方法，将含有核酸适配体序列的单链DNA加入单链自组装的离子缓冲液中，然后进行退火处理，使其自组装形成DNA四面体纳米结构探针。
6.根据权利要求5所述的免标记均相电化学生物传感方法，其特征在于，所述单链DNA序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示，核酸适配体序列如SEQ ID NO.5所示。
7.根据权利要求5或6所述的免标记均相电化学生物传感方法，其特征在于，将四条等摩尔量的单链DNA，其中一条或两条以上5’端连接有核酸适配体序列，溶解在TM缓冲溶液中，加热至95℃，反应3-10分钟，然后在冰浴中快速冷却5-10分钟后得到DNA四面体纳米结构探针；其中TM缓冲溶液中含有20mM Tris，50mM MgCl2，溶液pH＝8.0。
8.根据权利要求7所述的免标记均相电化学生物传感方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)不引入目标癌细胞，将电活性物质加入到含有Apt-DTNs探针的缓冲溶液中，进行电化学测量；
(2)引入目标癌细胞，将目标癌细胞加入到与步骤(1)中缓冲溶液所含等量Apt-DTNs探针的缓冲溶液中，孵育一段时间，离心分离癌细胞和结合到癌细胞表面的Apt-DTNs探针后，获得上清液，上清液中含有未与癌细胞结合的Apt-DTNs探针；
(3)将电活性物质加入到步骤(2)获得的上清液中，进行电化学测量，根据测量结果与标准曲线计算癌细胞数量。
9.根据权利要求8所述的免标记均相电化学生物传感方法，其特征在于，
所述电活性物质为亚甲基蓝；
利用三电极法进行电化学测量，三电极包括氧化铟锡导电玻璃电极(ITO)、Ag/AgCl电极和铂丝，依次分别为工作电极、参比电极和对电极；
所述电化学测量选择差分脉冲伏安法，扫描电压范围是-0.4 V至0V。
10.根据权利要求1所述的免标记均相电化学生物传感方法，其特征在于，所述方法在制备和/或检测待测样本中含有高表达粘蛋白的癌细胞的产品中的应用，所述待测样本为外周血或细胞培养。
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