CN111351944B - 粘蛋白1检测的荧光生物探针、传感器及用途和检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及粘蛋白1的检测技术领域,具体涉及一种用于粘蛋白1检测的荧光生物探针、传感器及用途和检测方法。在本发明中,所述适体探针用于Exo I辅助的靶标循环(EATR)反应,所述发夹探针包括发夹探针H1和发夹探针H2用于GO辅助的杂交链式反应(HCR),将所述适体探针和发夹探针结合,用于检测粘蛋白1,可以实现Exo I辅助的靶标循环反应和GO辅助的杂交链式反应的有机结合,从而实现荧光信号的级联放大,显著提高粘蛋白1的检测灵敏度,降低检测限,可以对低浓度的粘蛋白1实现定量检测,且具有高特异性,可特异识别检测粘蛋白1。

Description

粘蛋白1检测的荧光生物探针、传感器及用途和检测方法
技术领域
本发明涉及粘蛋白1的检测技术领域,具体涉及一种用于粘蛋白1检测的荧光生物探针、传感器及用途和检测方法。
背景技术
粘蛋白1(MUC1)是一种高分子量、高糖基化的蛋白,通过凝胶基质形成完整的跨膜结构域,其多肽骨架由胞外段、跨膜段和胞内段3部分组成。MUC1在信号传导过程中发挥着重要的作用,MUC1可通过下调E-钙粘蛋白的表达,介导细胞间的结合,在肿瘤转移中起抑制作用。MUC1主要表达于各种组织和器官的内腔或腺腔表面附近的上皮细胞。MUC1在正常的上皮细胞中少量表达,而在许多恶性肿瘤细胞中都会高表达,如乳腺癌、胃癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌和胰腺癌。因此,MUC1可以作为一种有效的肿瘤标志物,实现其高灵敏性高特异性的定量检测对癌症的早期诊断具有深远的意义。目前,传统的MUC1检测方法主要包括酶联免疫吸附法、质谱法、电化学法、比色法以及荧光法。然而,传统方法面临着灵敏度低,操作复杂等诸多问题。为了提高目标蛋白的检测灵敏度,获得较低的检测限,研究人员提出了采用双重放大策略的电致化学发光生物传感器来检测目标蛋白。如中国专利文献CN108226141A中公开的一种基于原始合成的Ag纳米簇电致化学发光传感器的研制及其应用,通过原位还原的银纳米簇富集在含有胞嘧啶(C)的环型DNA序列上作为ECL信号探针,通过DNA酶辅助目标循环和杂交链式反应(HCR)双重放大策略,构建电致化学发光生物传感器,实现高灵敏、快速的检测目标凝血酶。然而上述方案中存在如下缺陷:一、电致化学发光传感器所用金电极需要依次修饰聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)、金纳米颗粒(AuNPs)和SH-DNA以及巯基己醇(MCH)封闭,整个传感器的制备过程步骤复杂,操作耗时长(15小时以上);二、金纳米颗粒(AuNPs)采用氯化金(HAuCl4)还原法制备,制备较为繁琐,粒径尺寸难以控制,需要具备一定的有机合成经验。
发明内容
因此,本发明要解决的技术问题在于提供一种高灵敏度、高特异性、检测限低、效率高的用于粘蛋白1检测的荧光生物探针、传感器及用途和检测方法。
为此,本发明提供了如下的技术方案:
第一方面,本发明提供了一种用于粘蛋白1检测的荧光生物探针,包括适体探针和发夹探针;
所述适体探针由序列P1、P2和P3自组装而成;
所述序列P1由5’端到3’端依次包括序列a、序列b和至少2个序列c;
所述序列P2由5’端到3’端依次包括序列a、序列b和与序列c碱基互补的序列c*;
所述序列P3由5’端到3’端依次包括与序列b碱基互补的序列b*,和与序列a碱基互补的序列a*;所述序列P3是靶标的适体序列,能够特异性结合靶标;
所述发夹探针包括发夹探针H1和发夹探针H2;
所述发夹探针H1由5’端到3’端依次包括序列b*,序列a*,形成环区域的序列d,与序列a*碱基互补形成茎干区的序列a,以及可以与荧光基团结合的序列e;
所述发夹探针H2由5’端到3’端依次包括可以与荧光基团结合的序列e,序列a,形成环区域的序列b,与序列a碱基互补形成茎干区的序列a*,以及与序列d碱基互补的序列d*。
优选的,所述序列a、序列b、序列d、序列e、序列a*、序列b*和序列d*包含12-13个碱基。
优选的,所述序列e为包含12个胞嘧啶碱基的序列;进一步优选的,所述序列e结合的荧光基团为AgNCs。
更优选的,所述序列P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述序列P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;所述序列P3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;所述发夹探针H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;和所述发夹探针H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
第二方面,本发明提供了一种制备用于粘蛋白1检测的荧光生物探针的方法,包括适体探针的制备方法,包括如下步骤:
将序列P1、P2和P3按照摩尔比1:2:3混合于孵育体系中孵育。
进一步的,包括荧光发夹探针的制备方法,包括如下步骤:
将所述发夹探针H1、H2分别于反应体系中加温至90-95℃,保持5-10分钟,缓慢冷却至室温,以形成发夹结构,随后结合荧光基团。优选的,加温至95℃,保持5分钟。
第三方面,本发明提供了一种用于粘蛋白1检测的荧光生物传感器,包括所述的荧光生物探针和所述的制备方法制备的用于粘蛋白1检测的荧光生物探针。
进一步的,所述荧光生物传感器,包括第一反应试剂,以总体积为49μL为计,包括:
适体探针,0.8-1.2μM,5μL;
反应缓冲液,32μL;
Exo I液,8-12U/μL,2μL;
1×Exo I缓冲液,10μL。
优选的,所述第一反应试剂,以总体积为49μL为计,包括:
适体探针,1μM,5μL;
反应缓冲液,32μL;
Exo I液,10U/μL,2μL;
1×Exo I缓冲液,10μL。
进一步的,还包括第二反应试剂,以总体积为50μL为计,包括:
荧光发夹探针AgNCs-H1,1μM,10-20μL;
荧光发夹探针AgNCs-H2,1μM,10-20μL;
GO溶液,1mg/mL,20μL。
优选的,所述第二反应试剂,以总体积为50μL为计,包括:
荧光发夹探针AgNCs-H1,1μM,15μL;
荧光发夹探针AgNCs-H2,1μM,15μL;
GO溶液,1mg/mL,20μL。
进一步的,所述1×Exo I缓冲液中含有67mM glycine-KNO3,6.7mM Mg(NO3)2,和1mM DTT,pH 9.0-9.5。优选的,pH为9.4。
进一步的,所述反应缓冲液中含有20mM Tris-HNO3,50mM KNO3,10mM Mg(NO3)2,和1mM DTT,pH 7.5-8.0。优选的,pH为7.9。
第四方面,本发明提供了所述的荧光生物探针、所述的制备方法制备的用于粘蛋白1检测的荧光生物探针和所述的用于粘蛋白1检测的荧光生物传感器在生物靶标检测中的用途。优选的,所述的生物靶标包括粘蛋白1、人α凝血酶、血管内皮生长因子165、血小板衍生生长因子BB、鼠伤寒沙门氏菌和黄曲霉毒素B1。
第五方面,本发明提供了一种粘蛋白1的荧光检测方法,包括利用所述的荧光生物探针、所述的制备方法制备的用于粘蛋白1检测的荧光生物探针和所述的用于粘蛋白1检测的荧光生物传感器。
进一步的,所述的一种粘蛋白1的荧光检测方法,包括:
S1、将待测蛋白与适体探针于反应体系中孵育,然后加入Exo I液,继续孵育,得扩增反应液,将扩增反应液中的Exo I失活,备用;
S2、将荧光发夹探针AgNCs-H1和AgNCs-H2加入至步骤S1得到的扩增反应液中,振摇,避光孵育,随后加入GO溶液,室温静置。
进一步的,在S1步骤中,第一次孵育的温度为37℃,孵育时间为10-20分钟,第二次孵育的温度为37℃,孵育时间为30-40分钟。优选的,在S1步骤中,第一次孵育的孵育时间为20分钟,第二次孵育的孵育时间为30分钟。
进一步的,在S1步骤中,将得到的扩增反应液于80-90℃加热15-25分钟使Exo I失活。优选的,在S1步骤中,将得到的扩增反应液于80℃加热15分钟使Exo I失活。
进一步的,在S2步骤中,37℃避光孵育60-80分钟,室温静置30-40分钟。优选的,在S2步骤中,37℃避光孵育60分钟,室温静置30分钟。
本发明技术方案,具有如下优点:
(1)、本发明提供的一种用于粘蛋白1检测的荧光生物探针,在本发明中,所述适体探针用于Exo I辅助的靶标循环(EATR)反应,所述发夹探针包括发夹探针H1和发夹探针H2用于GO辅助的杂交链式反应(HCR),将所述适体探针和发夹探针结合,用于检测粘蛋白1,可以实现Exo I辅助的靶标循环反应和GO辅助的杂交链式反应的有机结合,从而实现荧光信号的级联放大,显著提高粘蛋白1的检测灵敏度,降低检测限,可以对低浓度的粘蛋白1实现定量检测,且具有高特异性,可特异识别检测粘蛋白1;
在本发明中,虽然Exo I辅助的靶标循环和GO辅助的杂交链式反应均属于核酸扩增范畴,但两者是完全不同的核酸扩增技术,将两者结合,从理论的构建到成功的实践,需要克服很大的挑战,主要挑战如下:
第一:生物探针设计的巨大挑战。探针的设计是整个分析检测体系的核心。能否设计出合理的探针直接决定着能否实现理论到实践的突破。理论上虽然存在一定的可行性,但是如果不能设计出合理的探针,就不能实现目标检测物的灵敏检测。生物探针通常是一段有序排列的DNA序列,DNA序列主要由4种碱基(A、T、C、G)排列组合而成,组合繁复多样。本发明的用于粘蛋白1检测的荧光生物探针包含一个M形适体探针和两个发夹探针H1和H2。M形适体探针不仅是靶蛋白MUC1的识别探针,而且还需要通过自身构象的变化,触发Exo I辅助的靶标循环扩增,实现第一重信号扩增。进一步地,靶标循环扩增后的产物,还需要能够充当杂交链式反应的引物,结合两个发夹探针,触发杂交链式反应扩增,实现第二重信号扩增。两个发夹探针不仅是杂交链式反应扩增的重要参与方,而且还需要将生物信号转化为荧光信号并进行传导。根据现有的文献,靶蛋白MUC1适体序列和用于合成AgNCs的DNA模板序列是公开的,是一段固定的碱基序列组合。除此之外,M形适体探针和两个发夹探针中的其余序列没有文献可以参考,在纷繁复杂的排列组合中筛选出合理可行的序列组合构成生物探针,并能彼此配合完成精密的级联信号扩增,完全属于创新设计;
第二,检测体系微环境的巨大差别。检测的微环境包括:缓冲液的选择与搭配、盐离子(Ca2+、Mg2+、K+、Na+)的浓度、体系的pH、扩增反应的温度与时间、工具酶的选择和用量等等。检测微环境的合理构建,直接决定着目标物高灵敏检测的成败,这是理论到实践需要跨越的一大障碍。本发明的Exo I辅助的靶标循环和GO辅助的杂交链式反应是两种完全不同的扩增技术,就单一技术而言,彼此都有各自最佳的微环境检测体系。将两者有机结合构建级联信号扩增技术,则需要兼顾两者差异化的检测微环境,现有的文献没有报道,需要自行摸索。本发明中所构建的用于级联信号扩增的检测微环境同样属于创新。
(2)、本发明提供的一种用于粘蛋白1检测的荧光生物探针,所述序列a、序列b、序列d、序列e、序列a*、序列b*和序列d*包含12-13个碱基;所述序列e结合的荧光基团为AgNCs形成DNA-AgNCs作为信号指示剂,不仅可以避免荧光基团的共价标记,而且还可以方便地将DNA模板序列编码到探针中。
将上述各序列限定为12-13个碱基,是基于靶标适体序列的长度进行的多段划分,化整体为部分。化整为零可以有效降低M形适体探针和发夹探针的整体设计难度,设计过程更加灵活且清晰。以功能为导向进行各结构域的分段设计,可以减少一些盲目的设计,避免适体探针和发夹探针的冗余。精简设计的M形适体探针和发夹探针,可以有效避免DNA二级结构的多样性,提升探针的稳定性,从而提升荧光生物传感器的稳定性。
(3)、本发明提供的一种用于粘蛋白1检测的荧光生物探针,所述序列P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述序列P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;所述序列P3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;所述发夹探针H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;和所述发夹探针H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示;
上述的荧光生物探针包括M形适体探针、发夹探针H1和发夹探针H2具有如下优势:
一、本发明的荧光生物探针具有蛋白检测广适性的巨大优势。具体而言,M形适体探针是序列P1、序列P2和序列P3自组装而成,其中序列P3是靶标的适体序列,本发明中仅仅给出了蛋白MUC1的检测实例,通过简单套用实施例1(荧光生物探针的设计)的设计流程,可以很容易地设计出其他蛋白的M形适体探针和发夹探针。其他蛋白包括但不限于人α凝血酶(适体序列:5’-AGT CCG TGG TAG GGC AGG TTG GGG TGA CT-3’)、血管内皮生长因子165(适体序列:5’-ACC CGT CTT CCA GAC AAG AGT GCA GGG-3’)和血小板衍生生长因子BB(适体序列:5’-CAG GCT ACG GCA CGT AGA GCA TCA CCA TGA TCC TG-3’)。
二、本发明的荧光生物探针还具有检测除蛋白外其他生物靶标的巨大优势。具体而言,M形适体探针是序列P1、序列P2和序列P3自组装而成,其中序列P3是靶标的适体序列,本发明中仅仅给出了蛋白MUC1的检测实例,通过简单套用实施例1(荧光生物探针的设计)的设计流程,可以很容易地设计出其他生物靶标的M形适体探针和发夹探针。其他生物靶标包括但不限于鼠伤寒沙门氏菌(适体序列:5’-TCA TTA CGG GCG TAG TTA TTC AAA GATGAG TAC CTT TCC GAA T-3’)和黄曲霉毒素B1(适体序列:5’-GTT GGG CAC GTG TTG TCTCTC TGT GTC TCG TGC CCT TCG CTA GGC CCA CA-3’)
三、本发明的荧光生物探针不需要任何的荧光基团和淬灭基团的标记,也不需要任何的化学修饰,使得发夹探针免于荧光标记,性价比高。充当荧光基团的银纳米团簇(AgNCs),可见光范围内荧光可调、量子产率高、光稳定性好、生物相容性好、合成简单且条件温和。仅仅需要将发夹探针、AgNO3和NaBH4孵育,其中发夹探针提供DNA模板(一段自由的含12个胞嘧啶碱基的序列),AgNO3经NaBH4还原即可得到被DNA包裹的AgNCs(DNA-AgNCs)。
(4)、本发明提供了一种粘蛋白1的荧光检测方法,首次提出了Exo I辅助的靶标循环与GO辅助的杂交链式反应相结合的级联信号扩增策略用于MUC1的荧光检测。利用优化设计的M形适体探针,在Exo I的辅助下,目标MUC1首先触发高效的EATR扩增实现第一重信号扩增。接着,两个发夹探针相互配合触发HCR扩增实现第二重信号扩增。由于级联信号扩增的高扩增效率,该方法能够高灵敏地检测MUC1,检测限低,线性范围广。此外,该方法在区分靶蛋白MUC1和其它非靶蛋白方面具有较高的选择性,并成功地应用于稀释人血清中MUC1的检测,在临床诊断中具有很大的应用潜力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明的粘蛋白1的荧光检测方法的工作原理;
图2是本发明实施例1中用于粘蛋白1检测的荧光生物探针的设计过程图;
图3是本发明实验例1中6组方案的荧光信号强度检测结果图;
图4是本发明实验例2中适体探针P1-P2-P3的优化实验中信噪比(F/F0)结果图;
图5是本发明实验例2中荧光发夹探针AgNCs-H1和AgNCs-H2的优化实验中信噪比(F/F0)结果图;
图6是本发明实验例2中HCR扩增反应时间的优化实验中荧光信号强度检测结果图;
图7是本发明实验例3中本发明的荧光生物传感器的分析性能检测结果图;图中(a)为不同浓度的MUC1下荧光生物传感器的荧光响应图;(b)为荧光信号强度(λem=552nm)与MUC1浓度间的指数关系,插图显示荧光信号强度与MUC1浓度的对数间的线性关系;
图8是本发明实验例4中本发明的荧光生物传感器的特异性检测结果图。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明,并不局限于所述最佳实施方式,不对本发明的内容和保护范围构成限制,任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品,均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者,按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
下述实施例中涉及的试剂:核酸外切酶I(Exo I)和二乙基焦碳酸酯(DEPC)处理水购自生工生物工程(上海)股份有限公司(中国上海)。氧化石墨烯(GO,1mg/mL)购自苏州恒球石墨烯技术有限公司(中国江苏)。人粘蛋白1(MUC1)、癌胚抗原(CEA)和甲胎蛋白(AFP)购自艾博抗(上海)贸易有限公司(中国上海)。免疫球蛋白G(IgG)、凝血酶(Tb)、硝酸银(AgNO3)和硼氢化钠(NaBH4)由西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(中国上海)提供。本发明涉及的其他化学品(分析级)均来自国药控股化学试剂有限公司(中国上海),未经进一步纯化而使用。
下述实施例中涉及的仪器:荧光测量使用SpectraMax M5e多模式酶标仪,该酶标仪搭载有SoftMax Pro 6.3数据采集和分析工作站(美国加利福尼亚州,美谷分子仪器有限公司)。采用低背景荧光和低光散射的384孔黑色微孔板(德国弗里肯豪森,葛莱娜第一生化有限公司)作为检测用酶标板。激发波长为460nm,收集500-620nm范围内的荧光发射光谱。最大荧光发射波长为552nm。
下述实施例中涉及的待测样品按照如下方法获得:获取全血样本(由江苏省江原医院提供,采集自健康的志愿者,采集后统一4℃保存),将得到的全血样本3500rpm离心15分钟,获得人血清。然后将获得的人血清用20mM Tris-HNO3缓冲液(含20mM NaNO3,10mMNH4NO3,2mM Mg(NO3)2,pH 7.4)稀释50倍,然后将相应浓度的MUC1加标到稀释的人血清中,即得。
下述实施例中涉及的室温是指10-30℃。
下述实施例中涉及的本发明粘蛋白1的荧光检测方法,是基于目标触发的级联信号扩增策略检测粘蛋白1,该扩增策略是Exo I辅助的靶标循环和GO辅助的杂交链式反应的级联。如图1所示,图1(a)中为M形适体探针P1-P2-P3自组装过程,图1(b)为目标MUC1不存在情况下的荧光生物传感器,图1(c)为目标MUC1存在情况下的荧光生物传感器。在图1(b)中可以看到,荧光生物传感器主要由M形适体探针P1-P2-P3,两个荧光发夹探针AgNCs-H1和AgNCs-H2,生物催化剂Exo I以及淬灭剂GO组成。在目标MUC1不存在情况下,M形适体探针P1-P2-P3的三条支臂呈双链结构,由于Exo I对双链DNA没有剪切活性,因此M形适体探针P1-P2-P3的构象不会发生变化,同时还可以看到,荧光发夹探针AgNCs-H1和AgNCs-H2也没有与M形适体探针P1-P2-P3进行杂交。综上,说明在目标MUC1不存在情况下,M形适体探针P1-P2-P3既不会被Exo I剪切,也不与荧光发夹探针AgNCs-H1和AgNCs-H2杂交,三者在溶液中稳定共存。加入GO后,荧光发夹探针AgNCs-H1和AgNCs-H2通过π-π堆积紧密吸附在GO的表面,荧光信号被有效地淬灭,使得检测系统的荧光背景可以忽略不计。在图1(c)中可以看到,荧光生物传感器主要由M形适体探针P1-P2-P3,两个荧光发夹探针AgNCs-H1和AgNCs-H2,生物催化剂Exo I以及淬灭剂GO组成。在目标MUC1存在情况下,目标MUC1与M形适体探针P1-P2-P3中的序列P3结合形成复合物MUC1-P3,M形适体探针的构象变化为P1-P2双链体,Exo I识别复合物MUC1-P3并逐步催化去除序列P3的单核苷酸,从而释放出MUC1。释放出的MUC1再次与新的M形适体探针P1-P2-P3结合进行新一轮的Exo I辅助的靶标循环。在Exo I辅助的靶标循环扩增过程中产生的P1-P2双链体虽然具有三条单链支臂(5’至3’),但并不会被Exo I剪切,因为Exo I仅具备3’至5’的单链剪切活性,因此P1-P2双链体被保留在反应体系中充当引物,引发荧光发夹探针AgNCs-H1和AgNCs-H2之间的杂交链式反应。具体过程为P1-P2双链体的三条单链支臂中暴露的序列a和b首先与发夹AgNCs-H1中的序列a*和b*杂交,从而导致AgNCs-H1打开并形成结构P1-P2-AgNCs-H1,AgNCs-H1的打开暴露了序列d和a,序列d和a进一步与发夹AgNCs-H2中的序列d*和a*杂交,导致AgNCs-H2的打开并形成结构P1-P2-AgNCs-H1-AgNCs-H2。随着发夹AgNCs-H1和AgNCs-H2的自发十字交叉打开,杂交链式反应不断进行,生成了许多条包含大量AgNCs重复单元的长线状双链纳米线。由于长双链DNA与GO之间的亲和力较弱,因此,上述形成的长线状双链纳米线无法被GO淬灭,从而保留了指示MUC1浓度的强荧光信号。
实施例1荧光生物探针的设计
本实施例提供的用于粘蛋白1检测的荧光生物探针,包括适体探针和发夹探针;
所述适体探针由序列P1、P2和P3自组装而成;
所述序列P1由5’端到3’端依次包括序列a、序列b和至少2个序列c;
所述序列P2由5’端到3’端依次包括序列a、序列b和与序列c碱基互补的序列c*;
所述序列P3由5’端到3’端依次包括与序列b碱基互补的序列b*,和与序列a碱基互补的序列a*;所述序列P3是靶标的适体序列,能够特异性结合靶标;
所述发夹探针包括发夹探针H1和发夹探针H2;
所述发夹探针H1由5’端到3’端依次包括序列b*,序列a*,形成环区域的序列d,与序列a*碱基互补形成茎干区的序列a,以及可以与荧光基团结合的序列e;
所述发夹探针H2由5’端到3’端依次包括可以与荧光基团结合的序列e,序列a,形成环区域的序列b,与序列a碱基互补形成茎干区的序列a*,以及与序列d碱基互补的序列d*;
在本实施例中,具体设计了一个M形适体探针用于Exo I辅助的靶标循环扩增和两个发夹探针用于GO辅助的杂交链式反应扩增,设计过程如图2所示:
所述M形适体探针由序列P1、P2和P3自组装而成,序列P3是靶标的适体序列,在本实施例中序列P3被设计成特异性识别并结合靶标粘蛋白1。首先将序列P3划分成序列a*和b*,序列a*和b*分别包含12-13个碱基。序列P3划分确定后,根据碱基互补原则确定了序列P1和序列P2中的序列a和序列b,同时还确定了发夹探针H1和发夹探针H2中的序列a、序列a*和序列b*。为了避免寡核苷酸的单体或共聚物的交替折叠,使用了在线软件OligoAnalyzer(版本3.1)来设计未确定的序列。经过计算和筛选,设计出了序列P1中未确定的序列c和发夹探针H1中的序列d,进而根据碱基互补原则确定了序列P2中的序列c*和发夹探针H2中的序列d*。发夹探针H1和H2中的序列e是一段为12个胞嘧啶碱基的序列以用于结合荧光基团AgNCs。通过以上的优化设计,所得的M型适体探针P1-P2-P3,发夹探针H1以及发夹探针H2可以相互配合进行目标触发的级联信号扩增。
上述设计的寡核苷酸序列(P1、P2、P3、H1和H2)由金斯瑞(南京)有限公司(中国江苏)合成并HPLC纯化。上述寡核苷酸序列如SEQ ID NO.1-5所示,具体的如下表1中列出,在表1中用字母a、b、c、d、e、a*、b*、c*、d*标出了上述寡核苷酸序列的相应序列。其中序列a、序列b、序列c、序列d分别与序列a*、序列b*、序列c*、序列d*碱基互补。
表1用于粘蛋白1检测的荧光生物探针
Figure BDA0002414800190000101
实施例2用于粘蛋白1检测的荧光生物探针的制备
一、适体探针的制备
(1)分别将表1中的寡核苷酸序列P1、P2和P3的干粉进行离心,12000rpm离心5分钟,然后分别溶解于20mM Tris-HNO3缓冲液(含20mM NaNO3,10mM NH4NO3,2mM Mg(NO3)2,pH7.4)中,分别得到100μM的储备液;
(2)移取序列P1的储备液10μL,移取序列P2的储备液20μL,移取序列P3的储备液30μL,将上述移取的储备液加入至40μL的反应缓冲液(含20mM Tris-HNO3,50mM KNO3,10mM Mg(NO3)2,1mM DTT,pH 7.9)中,37℃孵育20分钟,得到M形适体探针P1-P2-P3,浓度为10μM,4℃保存。
二、荧光发夹探针的制备
(1)将寡核苷酸序列H1的干粉进行离心,12000rpm离心5分钟,然后溶解于20mMTris-HNO3缓冲液(含20mM NaNO3,10mM NH4NO3,2mM Mg(NO3)2,pH 7.4)中,得到100μM的储备液;
(2)将所得的储备液加热至95℃,保持5分钟,然后缓慢冷却至室温(25℃),以形成发夹结构;
(3)移取1μL的序列H1的储备液和10μL的AgNO3溶液(60μM)加入至79μL的柠檬酸钠缓冲液(含10mM柠檬酸钠,体积百分比0.05%吐温20,pH 7.0)中,室温(25℃)避光孵育30分钟,随后加入10μL的NaBH4溶液(60μM),最终体积为100μL,接着室温(25℃)避光孵育60分钟后,获得稳定的荧光发夹探针AgNCs-H1,浓度为1μM,4℃保存。
荧光发夹探针AgNCs-H2(1μM)采用上述(1)-(3)同样的方法制备。
实施例3用于粘蛋白1检测的荧光生物传感器
本实施例提供了一种用于粘蛋白1检测的荧光生物传感器,包括实施例2制备的适体探针和荧光发夹探针AgNCs-H1、AgNCs-H2。
进一步的,包括第一反应试剂,以总体积为49μL为计,包括:
适体探针,1μM,5μL;
反应缓冲液,32μL;
Exo I液,10U/μL,2μL;
1×Exo I缓冲液,10μL。
进一步的,包括第二反应试剂,以总体积为50μL为计,包括:
荧光发夹探针AgNCs-H1,1μM,15μL;
荧光发夹探针AgNCs-H2,1μM,15μL;
GO溶液,1mg/mL,20μL。
进一步的,所述Exo I液,含有10U/μL的Exo I;
所述1×Exo I缓冲液中含有67mM glycine-KNO3,6.7mM Mg(NO3)2,和1mM DTT,pH9.4;
所述反应缓冲液中含有20mM Tris-HNO3,50mM KNO3,10mM Mg(NO3)2,和1mM DTT,pH 7.9。
实施例4用于粘蛋白1检测的荧光生物传感器
本实施例与实施例3基本相同,区别仅在于,第一反应试剂中的适体探针浓度为0.8μM,Exo I液浓度为8U/μL;第二反应试剂中的荧光发夹探针AgNCs-H1的体积为10μL,荧光发夹探针AgNCs-H2的体积为20μL;所述1×Exo I缓冲液的pH为9.0;所述反应缓冲液pH为7.5。
实施例5用于粘蛋白1检测的荧光生物传感器
本实施例与实施例3基本相同,区别仅在于,第一反应试剂中的适体探针浓度为1.2μM,Exo I液浓度为12U/μL;第二反应试剂中的荧光发夹探针AgNCs-H1的体积为20μL,荧光发夹探针AgNCs-H2的体积为10μL;
所述1×Exo I缓冲液的pH为9.5;所述反应缓冲液pH为8.0。
实施例6粘蛋白1的荧光检测方法
本实施例提供了一种粘蛋白1的荧光检测方法,包括使用实施例1和2的荧光生物探针以及实施例3的荧光生物传感器,具体包括如下步骤:
(1)分别将1μL的待测样品和5μL的M形适体探针P1-P2-P3(1μM)加入到32μL的反应缓冲液(含20mM Tris-HNO3,50mM KNO3,10mM Mg(NO3)2,1mM DTT,pH 7.9)中,于37℃孵育20分钟后,加入2μL的Exo I液(10U/μL)和10μL的1×Exo I缓冲液(含67mMglycine-KNO3,6.7mMMg(NO3)2,1mM DTT,pH 9.4),继续于37℃孵育30分钟,得扩增反应液。将所得扩增反应液于80℃加热15分钟使Exo I失活,备用;
(2)将15μL的荧光发夹探针AgNCs-H1(1μM)和15μL的荧光发夹探针AgNCs-H2(1μM)加入至步骤(1)中的扩增反应液中,剧烈振摇1分钟,随后,37℃避光孵育60分钟,然后,加入20μL的GO溶液(1mg/mL),反应混合物室温(25℃)静置30分钟。最后,将所得反应液使用多模式酶标仪进行荧光分析。
实施例7粘蛋白1的荧光检测方法
本实施例提供了一种粘蛋白1的荧光检测方法,包括使用实施例1和2的荧光生物探针以及实施例4的荧光生物传感器,具体包括如下步骤:
(1)分别将1μL的待测样品和5μL的M形适体探针P1-P2-P3(0.8μM)加入到32μL的反应缓冲液(含20mM Tris-HNO3,50mM KNO3,10mM Mg(NO3)2,1mM DTT,pH 7.5)中,于37℃孵育10分钟后,加入2μL的Exo I液(8U/μL)和10μL的1×Exo I缓冲液(含67mMglycine-KNO3,6.7mMMg(NO3)2,1mM DTT,pH 9.0),继续于37℃孵育40分钟,得扩增反应液。将所得扩增反应液于90℃加热25分钟使Exo I失活,备用;
(2)将10μL的荧光发夹探针AgNCs-H1(1μM)和20μL的荧光发夹探针AgNCs-H2(1μM)加入至步骤(1)中的扩增反应液中,剧烈振摇1分钟,随后,37℃避光孵育80分钟,然后,加入20μL的GO溶液(1mg/mL),反应混合物室温(25℃)静置40分钟。最后,将所得反应液使用多模式酶标仪进行荧光分析。
实施例8粘蛋白1的荧光检测方法
本实施例提供了一种粘蛋白1的荧光检测方法,包括使用实施例1和2的荧光生物探针以及实施例5的荧光生物传感器,具体包括如下步骤:
(1)分别将1μL的待测样品和5μL的M形适体探针P1-P2-P3(1.2μM)加入到32μL的反应缓冲液(含20mM Tris-HNO3,50mM KNO3,10mM Mg(NO3)2,1mM DTT,pH 8.0)中,于37℃孵育15分钟后,加入2μL的Exo I液(12U/μL)和10μL的1×Exo I缓冲液(含67mMglycine-KNO3,6.7mMMg(NO3)2,1mM DTT,pH 9.5),继续于37℃孵育35分钟,得扩增反应液。将所得扩增反应液于85℃加热20分钟使Exo I失活,备用;
(2)将20μL的荧光发夹探针AgNCs-H1(1μM)和10μL的荧光发夹探针AgNCs-H2(1μM)加入至步骤(1)中的扩增反应液中,剧烈振摇1分钟,随后,37℃避光孵育70分钟,然后,加入20μL的GO溶液(1mg/mL),反应混合物室温(25℃)静置35分钟。最后,将所得反应液使用多模式酶标仪进行荧光分析。
实验例1
本实验例通过如下6组方案考察了本发明的级联信号扩增策略检测粘蛋白1的可行性。
本实验考察的荧光生物传感器的反应条件和实验步骤如下:
(1)分别将1μL的MUC1水溶液(1ng/mL)和5μL的适体探针P1-P2-P3(1μM)加入到32μL的反应缓冲液(含20mM Tris-HNO3,50mM KNO3,10mM Mg(NO3)2,1mM DTT,pH 7.9)中,于37℃孵育20分钟后,加入2μL的Exo I液(10U/μL)和10μL的1×Exo I缓冲液(含67mM glycine-KNO3,6.7mM Mg(NO3)2,1mM DTT,pH 9.4),继续于37℃孵育30分钟,得扩增反应液。将所得扩增反应液于80℃加热15分钟使Exo I失活,备用;
(2)将15μL的荧光发夹探针AgNCs-H1(1μM)和15μL的荧光发夹探针AgNCs-H2(1μM)加入至步骤(1)中的扩增反应液中,剧烈振摇1分钟,随后,37℃分别避光孵育60分钟,然后,加入20μL的GO溶液(1mg/mL),反应混合物室温(25℃)静置30分钟。最后,将所得反应液使用多模式酶标仪进行荧光分析。
方案a:按照上述荧光生物传感器的反应条件和实验步骤实施,区别仅在于将步骤(1)中的1μL的MUC1水溶液替换为1μL的反应缓冲液,步骤(2)中20μL的GO溶液替换为20μL的反应缓冲液,即,方案a中仅包括P1-P2-P3、AgNCs-H1、AgNCs-H2和Exo I。
方案b:按照上述荧光生物传感器的反应条件和实验步骤实施,区别仅在于将步骤(1)中的1μL的MUC1水溶液替换为1μL的反应缓冲液。即,方案b仅包括P1-P2-P3、AgNCs-H1、AgNCs-H2、Exo I和GO。
方案c:按照上述荧光生物传感器的反应条件和实验步骤实施,区别仅在于将步骤(1)中的2μL的Exo I液替换为2μL的反应缓冲液,步骤(2)中20μL的GO溶液替换为20μL的反应缓冲液。即,方案c仅包括P1-P2-P3、AgNCs-H1、AgNCs-H2和MUC1。
方案d:按照上述荧光生物传感器的反应条件和实验步骤实施,区别仅在于将步骤(1)中的2μL的Exo I液替换为2μL的反应缓冲液。即方案d仅包括P1-P2-P3、AgNCs-H1、AgNCs-H2、MUC1和GO。
方案e:按照上述荧光生物传感器的反应条件和实验步骤实施,区别仅在于将步骤(2)中20μL的GO溶液替换为20μL的反应缓冲液。即方案e仅包括P1-P2-P3、AgNCs-H1、AgNCs-H2、MUC1和Exo I。
方案f:为按照上述荧光生物传感器的反应条件和实验步骤实施。即方案f包括P1-P2-P3、AgNCs-H1、AgNCs-H2、MUC1、Exo I和GO。
将上述方案a-f最后所得反应液,使用多模式酶标仪进行荧光分析,荧光分析条件为激发波长460nm,收集500-620nm范围内的荧光发射光谱。
荧光分析结果如下:
(1)方案a,结果如图3中曲线a,可以看出在目标MUC1不存在的情况下,仅含有荧光生物探针和Exo I的混合液显示出强烈的荧光信号。在没有目标MUC1时,适体探针P1-P2-P3既不会被Exo I催化消化,也不与荧光发夹探针AgNCs-H1和AgNCs-H2杂交,三者在溶液中稳定共存。由于未引入GO溶液,荧光发夹探针AgNCs-H1和AgNCs-H2未被GO吸附,导致混合液显示出强烈的荧光信号。
(2)方案b,结果如图3中曲线b,可以看出当在a方案的混合液基础上添加GO溶液后,所得的混合液中的荧光发夹探针AgNCs-H1和AgNCs-H2通过π-π堆积紧密吸附在GO的表面上,溶液的荧光信号被全部淬灭,此时的荧光背景信号可以忽略不计。
(3)方案c,结果如图3中曲线c,可以看出当在a方案的混合液基础上去除Exo I液,而添加目标MUC1后,所得混合液显示出强烈的荧光信号,并与未加入目标MUC1的a方案的荧光信号强度相当,说明由于未引入GO溶液,荧光发夹探针AgNCs-H1和AgNCs-H2未被GO吸附,导致混合液显示出强烈的荧光信号。
(4)方案d,结果如图3中曲线d,可以看出当在c方案的混合液基础上添加GO溶液后,所得混合液的荧光信号强度显著下降,说明其引入GO溶液,导致混合液的荧光信号被部分淬灭。
(5)方案e,结果如图3中曲线e,可以看出当在c方案的混合液基础上添加Exo I液后,所得混合液显示出强烈的荧光信号,并与未加入目标MUC1的a方案的荧光信号强度相当,说明由于未引入GO溶液,荧光发夹探针AgNCs-H1和AgNCs-H2未被GO吸附,导致混合液显示出强烈的荧光信号。
(6)方案f,结果如图3中曲线f,可以看出当在d方案的混合液基础上添加Exo I液后,所得混合液的荧光强度略有下降。
综上,上述各方案的检测结果与本发明的级联扩增策略检测粘蛋白1的原理相一致。在方案d中,当Exo I不存在时,适体探针P1-P2-P3中的序列P3与目标MUC1特异性结合形成复合物MUC1-P3并从适体探针P1-P2-P3中脱离,产生的P1-P2双链体十字交叉打开荧光发夹探针AgNCs-H1和AgNCs-H2,触发杂交链式反应,可视为仅有杂交链式反应的单重信号扩增。而在方案f中,当Exo I存在时,适体探针P1-P2-P3中的序列P3与目标MUC1特异性结合形成复合物MUC1-P3并从适体探针P1-P2-P3中脱离,复合物MUC1-P3中的序列P3可以被Exo I催化降解并释放出MUC1,释放出的MUC1再次与新的适体探针P1-P2-P3结合,触发Exo I辅助的靶标循环扩增,产生更多的P1-P2双链体。产生的P1-P2双链体十字交叉打开更多的荧光发夹探针AgNCs-H1和AgNCs-H2,触发更多的杂交链式反应。这构成了Exo I辅助的靶标循环结合杂交链式反应的级联信号扩增。比较两种扩增策略(f vs d)的荧光信号,发现级联信号扩增具有更高的放大效率,信号增强了41%。因此,本发明提出的级联信号扩增策略可用于高灵敏地检测粘蛋白1。
实验例2
为了使得本发明的技术方案获得最佳的分析性能,系统地研究了M形适体探针P1-P2-P3的浓度、荧光发夹探针AgNCs-H1和AgNCs-H2的浓度以及HCR扩增反应时间等条件。采用信噪比(F/F0)来评估荧光生物传感器的灵敏度,其中F和F0分别为存在和不存在MUC1的情况下的荧光信号强度(λem=552nm)。使用多模式酶标仪进行荧光分析,荧光分析条件为激发波长460nm,收集最大发射波长552nm处的荧光信号强度。
(一)适体探针P1-P2-P3浓度的优化
在研究中发现,M形适体探针P1-P2-P3既是靶标识别探针又是HCR的扩增模板,对于荧光生物传感器的性能有重大影响。因此,本实验例首先考察了适体探针P1-P2-P3浓度的影响。具体如下:
F的反应体系:包括适体探针P1-P2-P3、AgNCs-H1、AgNCs-H2、MUC1、GO溶液和Exo I液;所述反应体系中的AgNCs-H1和AgNCs-H2浓度均固定为50nM,适体探针P1-P2-P3浓度从25nM梯度变化为125nM,即25nM、50nM、75nM、100nM、125nM,分别检测适体探针P1-P2-P3在不同浓度下的荧光信号强度F。反应条件和实验步骤如下:
(1)分别将5μL的适体探针P1-P2-P3(0.5μM、1μM、1.5μM、2μM、2.5μM)和1μL的MUC1水溶液(1ng/mL)加入到32μL的反应缓冲液(含20mM Tris-HNO3,50mM KNO3,10mM Mg(NO3)2,1mM DTT,pH 7.9)中,于37℃孵育20分钟后,加入2μL的Exo I液(10U/μL)和10μL的1×Exo I缓冲液(含67mM glycine-KNO3,6.7mM Mg(NO3)2,1mM DTT,pH 9.4),继续于37℃孵育30分钟,得扩增反应液。将所得扩增反应液于80℃加热15分钟使Exo I失活,备用;
(2)将15μL的荧光发夹探针AgNCs-H1(1μM)和15μL的荧光发夹探针AgNCs-H2(1μM)加入至步骤(1)中的扩增反应液中,剧烈振摇1分钟,随后,37℃避光孵育60分钟,然后,加入20μL的GO溶液(1mg/mL),反应混合物室温(25℃)静置30分钟。最后,将所得反应液使用多模式酶标仪进行荧光分析。
注:适体探针P1-P2-P3初始加入的体积5μL乘以初始浓度0.5μM除以级联扩增反应的总体积100μL,即得反应体系中的适体探针P1-P2-P3浓度25nM。50、75、100、125nM的折算方式类似。步骤(1)是Exo I辅助的靶标循环扩增50μL,步骤(2)是杂交链式反应扩增50μL,因此,级联扩增反应总体积是100μL。
F0的反应体系:与F的反应体系的区别仅在于不含有MUC1,其他条件均相同,分别检测适体探针P1-P2-P3在不同浓度下的荧光信号强度F0
计算信噪比(F/F0),结果如图4所示(图中误差棒代表三次独立实验的标准偏差),浓度为50nM的适体探针P1-P2-P3具有最高的信噪比。因此,适体探针P1-P2-P3最佳的浓度为50nM。
(二)荧光发夹探针AgNCs-H1和AgNCs-H2浓度的优化
在研究中发现,荧光发夹探针AgNCs-H1和AgNCs-H2的浓度是影响荧光生物传感器性能的另一个重要因素。高浓度的荧光发夹探针可提高本发明的技术方案中杂交链式反应的杂交效率,但同时也存在非特异性打开发夹而导致高背景信号的问题。低浓度的荧光发夹探针则会降低杂交链式反应的杂交效率并导致低的响应信号,不利于低浓度靶标的检测。一个合适的荧光发夹探针浓度显得尤为重要。因此,本实验例优化了荧光发夹探针AgNCs-H1和AgNCs-H2的浓度。具体如下:
F的反应体系:包括适体探针P1-P2-P3、AgNCs-H1、AgNCs-H2、MUC1、GO溶液和Exo I液;所述反应体系中的适体探针P1-P2-P3的浓度固定为50nM,AgNCs-H1和AgNCs-H2浓度均从50nM梯度变化为250nM,即50nM、100nM、150nM、200nM、250nM,分别检测AgNCs-H1和AgNCs-H2在不同浓度下的荧光信号强度F。反应条件和实验步骤如下:
(1)分别将1μL的MUC1水溶液(1ng/mL)和5μL的适体探针P1-P2-P3(1μM)加入到32μL的反应缓冲液(含20mM Tris-HNO3,50mM KNO3,10mM Mg(NO3)2,1mM DTT,pH 7.9)中,于37℃孵育20分钟后,加入2μL的Exo I液(10U/μL)和10μL的1×Exo I缓冲液(含67mM glycine-KNO3,6.7mM Mg(NO3)2,1mM DTT,pH 9.4),继续于37℃孵育30分钟,得扩增反应液。将所得扩增反应液于80℃加热15分钟使Exo I失活,备用;
(2)分别将15μL的荧光发夹探针AgNCs-H1(0.33μM、0.67μM、1μM、1.33μM、1.67μM)和15μL的荧光发夹探针AgNCs-H2(0.33μM、0.67μM、1μM、1.33μM、1.67μM)加入至步骤(1)中的扩增反应液中,剧烈振摇1分钟,随后,37℃避光孵育60分钟,然后,加入20μL的GO溶液(1mg/mL),反应混合物室温(25℃)静置30分钟。最后,将所得反应液使用多模式酶标仪进行荧光分析。
注:荧光发夹探针AgNCs-H1初始加入的体积15μL乘以初始浓度0.33μM除以级联扩增反应的总体积100μL,即得50nM。100、150、250、250nM的折算方式类似。步骤(1)是Exo I辅助的靶标循环扩增50μL,步骤(2)是杂交链式反应扩增50μL,因此,级联扩增反应总体积是100μL。
注:荧光发夹探针AgNCs-H1和荧光发夹探针AgNCs-H2是相同的浓度作为一组加入的。即加入的荧光发夹探针AgNCs-H1浓度是0.33μM,则加入的荧光发夹探针AgNCs-H2浓度也是0.33μM。
F0的反应体系:与F的反应体系的区别仅在于不含有MUC1,其他条件均相同,分别检测AgNCs-H1和AgNCs-H2在不同浓度下的荧光信号强度F0
计算信噪比(F/F0),结果如图5所示(图中误差棒代表三次独立实验的标准偏差),AgNCs-H1和AgNCs-H2浓度均在150nM的浓度下获得最佳的信噪比(F/F0)。因此,选择150nM作为AgNCs-H1和AgNCs-H2的最佳浓度。
(三)HCR扩增反应时间的优化
研究中发现,HCR扩增反应时间对于荧光生物传感器的性能具有重要的影响。因此,本实验例优化了HCR扩增反应时间。具体如下:
F的反应体系:包括适体探针P1-P2-P3、AgNCs-H1、AgNCs-H2、MUC1、GO溶液和Exo I液;所述反应体系中的适体探针P1-P2-P3浓度为50nM,AgNCs-H1和AgNCs-H2浓度均为150nM,然后杂交链式反应(HCR)的扩增反应时间从30分钟梯度变化为90分钟,即30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、70分钟、80分钟、90分钟,分别检测不同反应时间下的荧光信号强度F。
反应条件和实验步骤如下:
(1)分别将1μL的MUC1水溶液(1ng/mL)和5μL的适体探针P1-P2-P3(1μM)加入到32μL的反应缓冲液(含20mM Tris-HNO3,50mM KNO3,10mM Mg(NO3)2,1mM DTT,pH 7.9)中,于37℃孵育20分钟后,加入2μL的Exo I液(10U/μL)和10μL的1×Exo I缓冲液(含67mM glycine-KNO3,6.7mM Mg(NO3)2,1mM DTT,pH 9.4),继续于37℃孵育30分钟,得扩增反应液。将所得扩增反应液于80℃加热15分钟使Exo I失活,备用;
(2)将15μL的荧光发夹探针AgNCs-H1(1μM)和15μL的荧光发夹探针AgNCs-H2(1μM)加入至步骤(1)中的扩增反应液中,剧烈振摇1分钟,随后,37℃分别避光孵育(30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、70分钟、80分钟、90分钟),然后,加入20μL的GO溶液(1mg/mL),反应混合物室温(25℃)静置30分钟。最后,将所得反应液使用多模式酶标仪进行荧光分析。
注:37℃分别避光孵育(30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、70分钟、80分钟、90分钟)即对应杂交链式反应(HCR)的扩增时间。
检测结果如图6所示(图中误差棒代表三次独立实验的标准偏差),随着扩增时间的增加,荧光信号强度在60分钟前迅速增加,然后趋于稳定。因此,选择60分钟作为HCR扩增反应的最佳反应时间。
实验例3
本实验例考察了本发明的荧光生物传感器的分析性能,通过将含有不同浓度目标MUC1(浓度从0到1ng/mL)水溶液的待测样品加入到荧光生物传感器中,检测荧光信号强度(λem=552nm),使用多模式酶标仪进行荧光分析,荧光分析条件为激发波长460nm,收集500-620nm范围内的荧光发射光谱,同时收集最大发射波长552nm处的荧光信号强度。
所述的荧光生物传感器的反应条件和实验步骤如下:
(1)分别将1μL的待测样品和5μL的适体探针P1-P2-P3(1μM)加入到32μL的反应缓冲液(含20mM Tris-HNO3,50mM KNO3,10mM Mg(NO3)2,1mM DTT,pH 7.9)中,于37℃孵育20分钟后,加入2μL的Exo I液(10U/μL)和10μL的1×Exo I缓冲液(含67mM glycine-KNO3,6.7mMMg(NO3)2,1mM DTT,pH 9.4),继续于37℃孵育30分钟,得扩增反应液。将所得扩增反应液于80℃加热15分钟使Exo I失活,备用;
(2)将15μL的荧光发夹探针AgNCs-H1(1μM)和15μL的荧光发夹探针AgNCs-H2(1μM)加入至步骤(1)中的扩增反应液中,剧烈振摇1分钟,随后,37℃避光孵育60分钟,然后,加入20μL的GO溶液(1mg/mL),反应混合物室温(25℃)静置30分钟。最后,将所得反应液使用多模式酶标仪进行荧光分析。
结果如图7所示,图7(a)为含有不同浓度目标MUC1的待测样品加入到所述的荧光生物传感器中的荧光发射光谱,图中a-h的字母分别代表目标MUC1浓度从0到1ng/mL梯度变化的曲线,a代表0fg/mL,b代表1fg/mL,c代表10fg/mL,d代表100fg/mL,e代表1pg/mL,f代表10pg/mL,g代表100pg/mL和h代表1ng/mL。如预期的那样,荧光信号强度随目标MUC1浓度从0到1ng/mL的增加而增加。目标MUC1浓度与荧光信号强度之间的高度依赖关系进一步证实了检测原理,即更多的目标MUC1可以结合更多的M形适体探针进行Exo I辅助的靶标循环扩增,产生更多的靶标循环扩增产物,进一步与荧光发夹探针结合进行HCR扩增,产生更多的含AgNCs的长线性双链纳米线,从而导致更高的荧光信号强度。图7(b)显示了荧光信号强度与目标MUC1浓度间的指数关系,图7(b)中的插图显示了荧光信号强度与目标MUC1浓度的对数间的线性关系。线性回归方程为F=1589.13+272.77log10 C,相关系数为0.9993,其中F和C分别表示荧光信号强度和MUC1的浓度(pg/mL)。根据3σ方法,计算得出的检出限(LOD)为0.36fg/mL。
将上述荧光生物传感器的分析性能与已经报道的MUC1检测方法进行了比较,详细情况见下表2。
表2基于不同方法检测MUC1的比较
Figure BDA0002414800190000201
上述表2中涉及的文献见下表3。
表3参考文献
Figure BDA0002414800190000202
Figure BDA0002414800190000211
实验例4
本实验例考察了本发明的荧光生物传感器的特异性,选择了人血清中能与MUC1共存的四种蛋白CEA、AFP、IgG和Tb进行特异性实验,具体如下:
6组待测样品:MUC1水溶液(1ng/mL)、CEA水溶液(10ng/mL)、AFP水溶液(10ng/mL)、IgG水溶液(10ng/mL)、Tb水溶液(10ng/mL)以及反应缓冲液(空白对照)。所述反应缓冲液中含有20mM Tris-HNO3,50mM KNO3,10mM Mg(NO3)2,和1mM DTT,pH 7.9。
分别取上述待测样品使用下述的荧光生物传感器进行分析,检测荧光信号强度(λem=552nm),使用多模式酶标仪进行荧光分析,荧光分析条件为激发波长460nm,收集最大发射波长552nm处的荧光信号强度。
所述的荧光生物传感器的反应条件和实验步骤如下:
(1)分别将1μL的待测样品和5μL的适体探针P1-P2-P3(1μM)加入到32μL的反应缓冲液(含20mM Tris-HNO3,50mM KNO3,10mM Mg(NO3)2,1mM DTT,pH 7.9)中,于37℃孵育20分钟后,加入2μL的Exo I液(10U/μL)和10μL的1×Exo I缓冲液(含67mM glycine-KNO3,6.7mMMg(NO3)2,1mM DTT,pH 9.4),继续于37℃孵育30分钟,得扩增反应液。将所得扩增反应液于80℃加热15分钟使Exo I失活,备用;
(2)将15μL的荧光发夹探针AgNCs-H1(1μM)和15μL的荧光发夹探针AgNCs-H2(1μM)加入至步骤(1)中的扩增反应液中,剧烈振摇1分钟,随后,37℃避光孵育60分钟,然后,加入20μL的GO溶液(1mg/mL),反应混合物室温(25℃)静置30分钟。最后,将所得反应液使用多模式酶标仪进行荧光分析。
检测结果如图8所示(图中误差棒代表三次独立实验的标准偏差),CEA、AFP、IgG和Tb的荧光信号强度与空白对照几乎相同,即使它们的浓度比MUC1的浓度高10倍。当存在靶蛋白MUC1时,相比空白对照和四种非靶蛋白,荧光生物传感器的荧光信号强度显著增加,其原因在于M形适体探针与靶蛋白之间的高特异性亲和力以及GO对荧光发夹探针的有效荧光淬灭。以上结果表明,本发明的荧光生物传感器对MUC1的检测具有很好的选择性。
实验例5
本实验例考察了本发明的荧光生物传感器在实际样品中检测目标MUC1的应用能力,进行了基于标准加入法的回收实验。将四种不同浓度的MUC1(1、10、100和1000pg/mL)加标到50倍稀释的人血清中,使用下述的荧光生物传感器进行分析,检测荧光信号强度(λem=552nm),使用多模式酶标仪进行荧光分析,荧光分析条件为激发波长460nm,收集最大发射波长552nm处的荧光信号强度。
所述的荧光生物传感器的反应条件和实验步骤如下:
(1)分别将1μL的待测样品和5μL的适体探针P1-P2-P3(1μM)加入到32μL的反应缓冲液(含20mM Tris-HNO3,50mM KNO3,10mM Mg(NO3)2,1mM DTT,pH 7.9)中,于37℃孵育20分钟后,加入2μL的Exo I液(10U/μL)和10μL的1×Exo I缓冲液(含67mM glycine-KNO3,6.7mMMg(NO3)2,1mM DTT,pH 9.4),继续于37℃孵育30分钟,得扩增反应液。将所得扩增反应液于80℃加热15分钟使Exo I失活,备用;
(2)将15μL的荧光发夹探针AgNCs-H1(1μM)和15μL的荧光发夹探针AgNCs-H2(1μM)加入至步骤(1)中的扩增反应液中,剧烈振摇1分钟,随后,37℃避光孵育60分钟,然后,加入20μL的GO溶液(1mg/mL),反应混合物室温(25℃)静置30分钟。最后,将所得反应液使用多模式酶标仪进行荧光分析。
检测结果如下表4所示,四种浓度的MUC1的回收率分别为98.9%、94.5%、102.3%和106.6%,相对标准偏差(RSD)为3.7%、4.8%、5.7%和3.2%。上述结果表明,本发明的荧光生物传感器在复杂生物样品中测定MUC1具有潜在的应用价值。
表4 50倍稀释人血清样品中MUC1检测的回收率结果(n=3)
Figure BDA0002414800190000221
Figure BDA0002414800190000231
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省原子医学研究所
<120> 粘蛋白1检测的荧光生物探针、传感器及用途和检测方法
<130> WXHA202000002
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工合成(P1)
<400> 1
ccagggtatc caaaggatca actgcaattc attaccatca caatttaatt cattaccatc 60
acaattt 67
<210> 2
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成(P2)
<400> 2
ccagggtatc caaaggatca actgcaaatt gtgatggtaa tgaatt 46
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成(P3)
<400> 3
gcagttgatc ctttggatac cctgg 25
<210> 4
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工合成(H1)
<400> 4
gcagttgatc ctttggatac cctggagaaa cttagagcca gggtatccaa cccccccccc 60
cc 62
<210> 5
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工合成(H2)
<400> 5
cccccccccc ccccagggta tccaaaggat caactgcttg gataccctgg ctctaagttt 60
ct 62

Claims (14)

1.一种用于粘蛋白1检测的荧光生物探针,其特征在于,包括适体探针和发夹探针;
所述适体探针由序列P1、P2和P3自组装而成;
所述序列P1由5’端到3’端依次包括序列a、序列b和至少2个序列c;
所述序列P2由5’端到3’端依次包括序列a、序列b和与序列c碱基互补的序列c*;
所述序列P3由5’端到3’端依次包括与序列b碱基互补的序列b*,和与序列a碱基互补的序列a*;所述序列P3是靶标的适体序列,能够特异性结合靶标;
所述序列P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述序列P2的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示;所述序列P3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;
所述发夹探针包括发夹探针H1和发夹探针H2;
所述发夹探针H1由5’端到3’端依次包括序列b*,序列a*,形成环区域的序列d,与序列a*碱基互补形成茎干区的序列a,以及可以与荧光基团结合的序列e;
所述发夹探针H2由5’端到3’端依次包括可以与荧光基团结合的序列e,序列a,形成环区域的序列b,与序列a碱基互补形成茎干区的序列a*,以及与序列d碱基互补的序列d*;
所述发夹探针H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;和所述发夹探针H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2.根据权利要求1所述的荧光生物探针,其特征在于,所述序列a、序列b、序列d、序列e、序列a*、序列b*和序列d*包含12-13个碱基。
3.根据权利要求2所述的荧光生物探针,其特征在于,
所述序列e为包含12个胞嘧啶碱基的序列。
4.根据权利要求2所述的荧光生物探针,其特征在于,所述序列e结合的荧光基团为AgNCs。
5.一种制备如权利要求1-4任一项所述的用于粘蛋白1检测的荧光生物探针的方法,其特征在于,包括适体探针的制备方法,包括如下步骤:
将所述序列P1、P2和P3按照摩尔比1:2:3混合于孵育体系中孵育。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,包括荧光发夹探针的制备方法,包括如下步骤:
将所述发夹探针H1、H2分别于反应体系中加温至90-95℃,保持5-10分钟,缓慢冷却至室温,以形成发夹结构,随后结合荧光基团。
7.一种用于粘蛋白1检测的荧光生物传感器,其特征在于,包括权利要求1-4任一项所述的荧光生物探针和权利要求5或6制备的用于粘蛋白1检测的荧光生物探针。
8.权利要求1-4任一项所述的荧光生物探针、权利要求5或6制备的用于粘蛋白1检测的荧光生物探针和权利要求7所述的用于粘蛋白1检测的荧光生物传感器在生物靶标检测中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途,其特征在于,所述的生物靶标包括粘蛋白1。
10.一种粘蛋白1的荧光检测方法,其特征在于,包括利用权利要求1-4任一项所述的荧光生物探针、权利要求5或6的制备方法制备的用于粘蛋白1检测的荧光生物探针和权利要求7所述的用于粘蛋白1检测的荧光生物传感器。
11.根据权利要求10所述的荧光检测方法,其特征在于,包括:
S1、将待测蛋白与适体探针于反应体系中孵育,然后加入Exo I液,继续孵育,得扩增反应液,将扩增反应液中的Exo I失活,备用;
S2、将荧光发夹探针AgNCs-H1和AgNCs-H2加入至步骤S1得到的扩增反应液中,振摇,避光孵育,随后加入GO溶液,室温静置。
12.根据权利要求11所述的荧光检测方法,其特征在于,在S1步骤中,第一次孵育的温度为37℃,孵育时间为10-20分钟,第二次孵育的温度为37℃,孵育时间为30-40分钟。
13.根据权利要求12所述的荧光检测方法,其特征在于,在S1步骤中,将得到的扩增反应液于80-90℃加热15-25分钟使Exo I失活。
14.根据权利要求12所述的荧光检测方法,其特征在于,在S2步骤中,37℃避光孵育60-80分钟,室温静置30-40分钟。
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