JPWO2012029224A1 - 標的物質の検出方法、それに用いるアプタマーセット並びにセンサ及び装置 - Google Patents
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Abstract
Description
被検用試料中の標的物質が特異的に結合する第1のアプタマーと、
前記標的物質以外の標的外物質が特異的に結合する第2のアプタマーと、を備え、
前記第1のアプタマーは1以上の二本鎖が形成される二本鎖形成部位を有しており、
前記第2のアプタマーは2以上の二本鎖形成部位を有しており、
前記標的物質が結合する前記第1のアプタマーの塩基配列は、前記第1のアプタマーの前記二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含み、
前記標的外物質が結合する前記第2のアプタマーの塩基配列は、前記第2のアプタマーの2以上の前記二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含む、複合体を用意する工程と、
前記標的物質と前記第1のアプタマーとを結合させる工程と、
前記標的外物質と前記第2のアプタマーとを結合させる工程と、
前記第1のアプタマーの前記二本鎖形成部位の開裂を検出する工程と、を含む、標的物質の検出方法が提供される。
被検用試料中の標的物質が特異的に結合する第1のアプタマーと、
前記標的物質以外の標的外物質が特異的に結合する第2のアプタマーと、を備え、
前記第1のアプタマーは1以上の二本鎖形成部位を有しており、
前記第2のアプタマーは2以上の二本鎖形成部位を有しており、
前記標的物質が結合する前記第1のアプタマーの塩基配列は、前記第1のアプタマーの前記二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含み、
前記標的外物質が結合する前記第2のアプタマーの塩基配列は、前記第2のアプタマーの2以上の前記二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含む、複合体からなる、標的物質の検出に用いるアプタマーセットが提供される。
被検用試料中の標的物質が特異的に結合する第1のアプタマーと、
前記標的物質以外の標的外物質が特異的に結合する第2のアプタマーと、を備え、
前記第1のアプタマーは1以上の二本鎖形成部位を有しており、
前記第2のアプタマーは2以上の二本鎖形成部位を有しており、
前記標的物質が結合する前記第1のアプタマーの塩基配列は、前記第1のアプタマーの前記二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含み、
前記標的外物質が結合する前記第2のアプタマーの塩基配列は、前記第2のアプタマーの2以上の前記二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含む、複合体と、
前記複合体が固定されている部材と、を有する、標的物質の検出に用いるセンサが提供される。
上記センサと、
標的物質を第1のアプタマーに結合させる手段と、
前記標的物質と異なる物質を第2のアプタマーに結合させる手段と、
前記第1のアプタマーの二本鎖形成部位の開裂を検出する手段と、を含む、装置が提供される。
第1の実施の形態について、図2を用いて説明する。図2は、第1の実施の形態における標的物質の検出方法の手順を示す図である。
第1の実施の形態の標的物質5の検出方法は、被検用試料中(検査対象物)の標的物質5が特異的に結合する第1のアプタマー1と、標的物質5以外の標的外物質(第2のリガンド6)が特異的に結合する第2のアプタマー2と、を備え、第1のアプタマー1は1以上の二本鎖が形成する二本鎖形成部位を有しており、第2のアプタマー2は2以上の二本鎖形成部位を有しており、標的物質5が結合する第1のアプタマー1の塩基配列は、第1のアプタマー1の二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含み、第2のリガンド6が結合する第2のアプタマー2の塩基配列は、第2のアプタマー2の2以上の二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含む、複合体4を用意する工程と、標的物質5と前記第1のアプタマー1とを結合させる工程と、第2のリガンド6と第2のアプタマー2とを結合させる工程と、第1のアプタマー1の二本鎖形成部位の開裂を検出する工程と、を含む。すなわち、この標的物質の検出方法は、被検用試料(検査対象物)中の標的物質5が特異的に結合する第1のアプタマー1と、標的物質5以外の標的外物質(第2のリガンド6)が特異的に結合する第2のアプタマー2と、を備え、第1のアプタマー1は1以上の二本鎖形成部位を有しており、前記第2のアプタマーは2以上の二本鎖形成部位を有している、複合体4を用意する工程と、標的物質5と第1のアプタマー1との結合により、第1のアプタマー1の二本鎖形成部位を開裂させる工程と、物質(第2のリガンド6)と第2のアプタマー2との結合により、第1のアプタマー1と共に二本鎖核酸部位を形成する第2のアプタマー2の構造体(第2のアプタマー2の一部の構造体)を変形させる、または二本鎖形成部位に相当する第1のアプタマー1の構造体を変形させる工程と、第1のアプタマー1の二本鎖形成部位の開裂を検出する工程と、を含む。
上記の特許文献に記載のハイブリダイズの開裂においては、アプタマーに対して標的物質と相補鎖とが競争反応を起こしている。そして、この競争反応は平衡反応であるため、標的物質の濃度が低いと、開裂したアプタマーは、再度相補鎖と二本鎖を形成することがあった。このため、アプタマーの開裂量が低下して、充分なシグナル変化量を得ることが困難であった。
第2の実施の形態では、第1のアプタマー1、第2のアプタマー2および核酸断片3を含む複合体4において、少なくとも1カ所が部材に固定されている場合について説明する。図3は、第2の実施の形態における標的物質の検出方法の手順を示す図である。
なお、第2の実施の形態は、第1の実施の形態の応用であるので、第1の実施の形態と同様な点については説明を省略する。
第3の実施の形態は、第2の実施の形態の応用であり、同様な点については説明を省略する。
図4は、第3の実施の形態における標的物質の検出方法の手順を示す図である。第3の実施の形態において、第1のアプタマー1、第2のアプタマー2及び核酸断片3を含む複合体4が部材に固定される点は、第2の実施の形態と同じであるが、この部材が導電性部材である点が異なる。導電性の部材としては、電極12が挙げられる。電極12としては、電気伝導性が高く、かつ表面を修飾するのが容易であることから、金、白金、炭素等の材料が好適に用いられる。また、電極12としては、表面に表面積を大きくして感度を高める目的で、その表面に、金微粒子や白金微粒子、カーボンナノチューブなどの微細材料が付着していても良い。
第4の実施の形態では、第1のアプタマー1は第2のアプタマー2と2箇所の二本鎖核酸部位を形成して複合体4を構成している。
第4の実施の形態において、第1のアプタマー1は第2のアプタマー2と2箇所の二本鎖核酸部位を形成して複合体4を構成している。この複合体4は、第1のアプタマー1の一端が電極12(部材)に固定されている。第2のアプタマー2には、電極12に近い側の一端に電極反応物質としてメチレンブルー14が修飾されている(図5(a))。
第5の実施の形態は、第1のアプタマー1は第2のアプタマー2と少なくとも1箇所の二本鎖核酸部位における二本鎖を形成して複合体4を構成している。第2のアプタマー2は、第1のアプタマー1との二本鎖核酸部位に加え、自身の配列の相補的な塩基配列同士でハイブリダイズした二本鎖核酸部位を有している。
第5の実施の形態において、複合体4は、第1のアプタマー1の一端が電極12である部材に固定されている。第2のアプタマー2は、自身の配列の相補的な塩基配列同士でハイブリダイズした二本鎖核酸部位を有しており、電極12に近い側の一端に電極反応物質としてメチレンブルー14が修飾されている(図6(a))。
第6の実施の形態では、第1のアプタマー1の塩基配列部分と第2のアプタマー2の塩基配列部分を有する連結アプタマー16が、核酸断片3と少なくとも2箇所の二本鎖核酸部位を有している。この連結アプタマー16および核酸断片3で複合体4が構成されている。
第7の実施の形態は、連結アプタマー16の第1のアプタマー1の塩基配列部分に結合した標的物質5は、第2のリガンド6と第2のアプタマー2の塩基配列部分の結合によって、第1のアプタマー1から離れ、別の第1のアプタマー1に結合する。そして、この別の第1のアプタマー1の二本鎖核酸部位が開裂することにより、二本鎖核酸部位の開裂を増幅する。第7の実施の形態は第6の実施の形態の応用であるので、第6の実施の形態と同様の点は説明を省略する。
[1]標的物質をリガンドとする第1のアプタマーと、上記標的物質とは別の物質である第2のリガンドと結合する第2のアプタマーと、を備え、上記第1のアプタマーは少なくとも1カ所以上の二本鎖核酸部位を有しており、上記第2のアプタマーは二カ所以上の二本鎖核酸部位を有しており、上記第1のアプタマーと上記第2のアプタマーとを含む、複合体を用意し、被検用試料中の上記標的物質と上記第1のアプタマーとの結合により、上記第1のアプタマーおよび上記第2のアプタマーの二本鎖核酸部位を開裂させ、上記二本鎖核酸部位の開裂を検出することにより、上記標的物質を検出することを特徴とする標的物質の検出方法。
[2]上記第1のアプタマーおよび/または第2のアプタマーが、核酸断片と二本鎖核酸部位において二本鎖を形成して上記複合体を形成していることを特徴とする、[1]に記載の標的物質の検出方法。
[3]上記第2のアプタマーが、自身の配列の相補的な塩基配列同士でハイブリダイズした二本鎖核酸部位を形成していることを特徴とする、[1]または[2]に記載の標的物質の検出方法。
[4]上記第1のアプタマーと上記第2のアプタマーが、連結されていることを特徴とする[1]〜[3]のいずれか一項に記載の標的物質の検出方法。
[5]上記第1のアプタマーと結合した上記標的物質が、上記第2のリガンドと上記第2のアプタマーの結合によって上記第1のアプタマーと離れ、再び別の第1のアプタマーと結合することにより二本鎖核酸部位の開裂を増幅することを特徴とする、[4]に記載の標的物質の検出方法。
[6]上記第1のアプタマーと上記標的物質との解離定数に対する上記第2のアプタマーと上記第2のリガンドとの解離定数の比が1以下であることを特徴とする、[1]〜[5]のいずれか一項に記載の標的物質の検出方法。
[7]上記第1のアプタマーと上記標的物質との解離定数に対する上記第2のアプタマーと上記第2のリガンドとの解離定数の比が、0.2以下であることを特徴とする[6]に記載の標的物質の検出方法。
[8]上記複合体が、部材に固定されていることを特徴とする、[1]〜[7]のいずれか一項に記載の標的物質の検出方法。
[9]上記部材が、電極であり、二本鎖核酸部位の開裂を、電気的反応として検出することを特徴とする、[1]〜[8]のいずれか一項に記載の標的物質の検出方法。
[10]上記複合体が、電極反応物質により修飾されており、二本鎖核酸部位の開裂を、上記電極反応物質と上記電極との間の電子伝達の検出値により検出することを特徴とする、[9]に記載の標的物質の検出方法。
[11]上記第2のリガンドの濃度が、上記第2のアプタマーと上記第2のリガンドとの解離定数の5倍以上であることを特徴とする、[1]〜[10]のいずれか一項に記載の標的物質の検出方法。
[12]上記第2のリガンドの濃度が、上記第2のアプタマーと上記第2のリガンドとの解離定数の50倍以上であることを特徴とする、[11]に記載の標的物質の検出方法。
[13]上記第1のアプタマーおよび/または上記第2のアプタマーが、核酸断片と二本鎖核酸部位を形成して上記複合体を形成していることを特徴とする、[1]〜[12]のいずれか一項に記載の標的物質の検出方法。
[14]標的物質をリガンドとする第1のアプタマーと、標的物質とは別の物質である第2のリガンドと結合する第2のアプタマーと、部材と、を備え、上記第1のアプタマーは少なくとも1カ所以上の二本鎖核酸部位を有し、上記第2のアプタマーが二カ所以上の二本鎖核酸部位を有し、上記第1のアプタマーと上記第2のアプタマーとが二本鎖核酸部位により結合して形成した複合体が、上記部材に固定され、標的物質の検出方法に使用することを特徴とする、センサ(標的物質検出用の装置)。
[15]上記第1のアプタマーおよび/または上記第2のアプタマーが、核酸断片と二本鎖核酸部位を形成して形成した上記複合体が、上記部材に固定されていることを特徴とする、[16]に記載のセンサ(標的物質検出用の装置)。
[16]上記第2のアプタマーが、自身の配列の相補的な塩基配列同士でハイブリダイズした二本鎖核酸部位を形成していることを特徴とする、[14]または[15]に記載のセンサ(標的物質検出用の装置)。
[17]上記第1のアプタマーと上記第2のアプタマーが、連結されていることを特徴とする[14]〜[16]のいずれか一項に記載のセンサ(標的物質検出用の装置)。
[18]上記第1のアプタマーと上記標的物質との解離定数に対する上記第2のアプタマーと上記第2のリガンドとの解離定数の比が、1以下である、[14]〜[17]のいずれか一項に記載のセンサ(標的物質検出用の装置)。
[19]上記第1のアプタマーと上記標的物質との解離定数に対する上記第2のアプタマーと上記第2のリガンドとの解離定数の比が、0.2以下であることを特徴とする[18]に記載のセンサ(標的物質検出用の装置)。
[20]上記部材が電極であり、二本鎖核酸部位の開裂を、電気的反応として検出可能なことを特徴とする[14]〜[19]のいずれか一項に記載のセンサ(標的物質検出用の装置)。
[21]上記複合体が、電極反応物質により修飾されており、二本鎖核酸部位の開裂を、上記電極反応物質と上記電極との間の電子伝達の検出値により検出可能なことを特徴とする[20]に記載のセンサ(標的物質検出用の装置)。
[22]標的物質をリガンドとする第1のアプタマーと、上記標的物質とは別の物質である第2のリガンドと結合する第2のアプタマーと、を備え、上記第1のアプタマーは少なくとも1カ所以上の二本鎖核酸部位を有しており、上記第2のアプタマーは二カ所以上の二本鎖核酸部位を有しており、上記第1のアプタマーと上記第2のアプタマーとを含む、複合体と被検用試料とを接触させる手段と、上記被検用試料中の上記標的物質との結合による二本鎖核酸部位の開裂を検出する手段とを含み、標的物質の検出方法に使用することを特徴とする、標的物質検出装置。
[23][14]〜[21]のいずれか一項に記載のセンサ(標的物質検出用の装置)と、被検用試料中の標的物質と第1のアプタマーとの結合による上記複合体からの二本鎖核酸部位の開裂を検出する手段と、を備える、[22]に記載の標的物質検出装置。
[24]上記被検用試料中の上記標的物質と第1のアプタマーの結合による上記複合体からの二本鎖核酸部位の開裂を電気的反応として検出する電気反応検出手段を備える、[23]に記載の標的物質検出装置。
[25]上記二本鎖核酸部位の開裂を上記電極反応物質と上記電極との間の電子伝達の検出値により検出する電子伝達検出手段を備える、[24]に記載の標的物質検出装置。
Claims (10)
- 被検用試料中の標的物質が特異的に結合する第1のアプタマーと、
前記標的物質以外の標的外物質が特異的に結合する第2のアプタマーと、を備え、
前記第1のアプタマーは1以上の二本鎖が形成される二本鎖形成部位を有しており、
前記第2のアプタマーは2以上の二本鎖形成部位を有しており、
前記標的物質が結合する前記第1のアプタマーの塩基配列は、前記第1のアプタマーの前記二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含み、
前記標的外物質が結合する前記第2のアプタマーの塩基配列は、前記第2のアプタマーの2以上の前記二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含む、複合体を用意する工程と、
前記標的物質と前記第1のアプタマーとを結合させる工程と、
前記標的外物質と前記第2のアプタマーとを結合させる工程と、
前記第1のアプタマーの前記二本鎖形成部位の開裂を検出する工程と、を含む、標的物質の検出方法。 - 前記第1のアプタマーまたは前記第2のアプタマーが、前記二本鎖形成部位において核酸断片と二本鎖を形成して前記複合体を構成している、請求項1に記載の標的物質の検出方法。
- 前記第2のアプタマーが、前記二本鎖形成部位において、自身の配列の相補的な塩基配列同士でハイブリダイズしている、請求項1または2に記載の標的物質の検出方法。
- 前記第1のアプタマーと前記第2のアプタマーとが連結している、請求項1から3のいずれか1項に記載の標的物質の検出方法。
- 前記第1のアプタマーと結合した前記標的物質が、前記標的外物質と前記第2のアプタマーとの結合により、前記第1のアプタマーから離れ、別の前記第1のアプタマーと結合する、請求項4に記載の標的物質の検出方法。
- 前記複合体が部材に固定されている、請求項1から5のいずれか1項に記載の標的物質の検出方法。
- 被検用試料中の標的物質が特異的に結合する第1のアプタマーと、
前記標的物質以外の標的外物質が特異的に結合する第2のアプタマーと、を備え、
前記第1のアプタマーは1以上の二本鎖形成部位を有しており、
前記第2のアプタマーは2以上の二本鎖形成部位を有しており、
前記標的物質が結合する前記第1のアプタマーの塩基配列は、前記第1のアプタマーの前記二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含み、
前記標的外物質が結合する前記第2のアプタマーの塩基配列は、前記第2のアプタマーの2以上の前記二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含む、複合体からなる、標的物質の検出に用いるアプタマーセット。 - 被検用試料中の標的物質が特異的に結合する第1のアプタマーと、
前記標的物質以外の標的外物質が特異的に結合する第2のアプタマーと、を備え、
前記第1のアプタマーは1以上の二本鎖形成部位を有しており、
前記第2のアプタマーは2以上の二本鎖形成部位を有しており、
前記標的物質が結合する前記第1のアプタマーの塩基配列は、前記第1のアプタマーの前記二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含み、
前記標的外物質が結合する前記第2のアプタマーの塩基配列は、前記第2のアプタマーの2以上の前記二本鎖形成部位の塩基配列の一部を少なくとも含む、複合体と、
前記複合体が固定されている部材と、を有する、標的物質の検出に用いるセンサ。 - 前記部材が導電性を有する、請求項8に記載のセンサ。
- 請求項8または9に記載のセンサと、
標的物質を第1のアプタマーに結合させる手段と、
前記標的物質と異なる物質を第2のアプタマーに結合させる手段と、
前記第1のアプタマーの二本鎖形成部位の開裂を検出する手段と、を含む、装置。
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