CN103108952A - 检测目标物质的方法以及用于所述方法中的适体组、传感器和装置 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测目标物质的方法，包括：准备复合物(4)，其包含与试验样品中的目标物质(5)特异结合的第一适体(1)和与所述目标物质(5)以外的第二配体(6)特异结合的第二适体(2)，其中所述第一适体(1)包含一个以上形成双链的双链形成位点，所述第二适体(2)包含两个以上双链形成位点，与所述目标物质(5)结合的所述第一适体(1)的碱基序列包含所述第一适体(1)的所述双链形成位点的碱基序列的至少一部分，且与所述第二配体(6)结合的所述第二适体(2)的碱基序列包含所述第二适体(2)的所述两个以上双链形成位点的碱基序列的至少一部分；将所述目标物质(5)结合到所述第一适体(1)上；将所述第二配体(6)结合到所述第二适体(2)上；检测所述第一适体(1)的所述双链形成位点的开裂。

Description

检测目标物质的方法以及用于所述方法中的适体组、传感器和装置
技术领域
本发明涉及用于检测目标物质的方法和用于所述方法中的适体组(aptamer set)、传感器和装置。
背景技术
适体是指能够结合至特定物质的核酸(DNA、RNA或PNA)和肽。关于适体，具有大结合力的序列通过使用非专利文献1中公开的称作指数富集配体系统进化(SELEX)的方法选自核酸库。
为了诸如诊断疾病、监控环境和检验所有物的各种目的，已经研究并开发了一种利用在适体与所述适体结合的物质(下文中称作目标物质)之间展示的特异结合能力的传感器。许多传感器通过检测由于适体到目标物质的结合而在所述适体和所述目标物质中造成的物理和化学变化来检测目标物质。
作为这种传感器，非专利文献2和3提出了利用适体杂交的传感器。具体地，在非专利文献2中，将适体20的互补链21(具有互补序列的核酸21；此处，核酸不是适体)固定到电极23上，如图1(a)中所示。将利用电极反应物质22改性的适体20与互补链21杂交。其后，当添加目标物质24时，适体20结合到目标物质24上(图1(b))。结果，适体20从互补链21开裂并从电极23的表面释放(图1(c))。与图1(c)的状态相比，在图1(a)的状态中，电极反应物质22改性的适体20的反应电流大。专利文献2公开了，以此方式，使用电流值的大小作为指数能够检测目标物质的存在与否。
另外，非专利文献3公开了一种适体开关探针。在该方法中，将标记有荧光分子的适体与利用淬灭剂改性的互补链杂交。
专利文献1：日本特表2009-505641号公报
非专利文献1：C.Tuerk and L.Gold,Science,vol.249(1990),p505-p510
非专利文献2：Analyst,2008,133p323-p325
非专利文献3：Journal of the American Chemical Society,vol.130(2008),p11268-11269
发明内容
然而，本发明人的研究确认，利用杂交状态的开裂的方法具有如下问题。即，在杂交状态的开裂期间，目标物质和互补链在适体上引起竞争反应，且所述竞争反应是平衡反应。因此，有时目标物质与开裂的适体分离，且互补链再次与适体杂交。结果，当目标物质的浓度低时，开裂的发生程度低，且在某些情况中不能获得足够的信号变化。因此，当目标物质的浓度低时，需要高度灵敏的检测方法。
考虑到上述状况而完成了本发明，本发明的目的是提供一种即使在目标物质的浓度低时也可以以高灵敏度检测目标物质的方法和用于所述方法的适体组、传感器和装置。
根据本发明，提供一种检测目标物质的方法，包括：
准备包含试验样品中的目标物质特异结合的第一适体和所述目标物质以外的非目标物质特异结合的第二适体的复合物，
其中所述第一适体包含一个以上形成双链的双链形成位点，所述第二适体包含两个以上双链形成位点，所述目标物质结合的所述第一适体的碱基序列包含所述第一适体的所述双链形成位点的碱基序列的至少一部分，且所述非目标物质结合的所述第二适体的碱基序列包含所述第二适体的所述两个以上双链形成位点的碱基序列的至少一部分；
将所述目标物质结合到所述第一适体上；
将所述非目标物质结合到所述第二适体上；以及
检测所述第一适体的所述双链形成位点的开裂。
根据本发明，提供一种用于检测目标物质的适体组，包含：
包含试验样品中的目标物质特异结合的第一适体和所述目标物质以外的非目标物质特异结合的第二适体的复合物，
其中所述第一适体包含一个以上形成链的形成链的位点，所述第二适体包含两个以上形成链的位点，所述目标物质结合的所述第一适体的碱基序列包含所述第一适体的所述双链形成位点的碱基序列的至少一部分，且所述非目标物质结合的所述第二适体的碱基序列包含所述第二适体的所述两个以上双链形成位点的碱基序列的至少一部分。
根据本发明，提供一种用于检测目标物质的传感器，包含：
包含试验样品中的目标物质特异结合的第一适体和所述目标物质以外的非目标物质特异结合的第二适体的复合物，
其中所述第一适体包含一个以上形成链的位点，所述第二适体包含两个以上形成链的位点，所述目标物质结合的所述第一适体的碱基序列包含所述第一适体的所述双链形成位点的碱基序列的至少一部分，且所述非目标物质结合的所述第二适体的碱基序列包含所述第二适体的所述两个以上双链形成位点的碱基序列的至少一部分；和
其上固定所述复合物的构件。
根据本发明，提供一种装置，包含：
上述传感器；
将目标物质结合到第一适体上的手段；
将不同于所述目标物质的物质结合到第二适体上的手段；以及
用于检测所述第一适体的双链形成位点的开裂的手段。
另外，上述构成元素与其中在方法和装置方面对本发明的说明书进行改变的实施方案的任意组合，作为本发明的实施方案也是有效的。
根据本发明，提供即使当目标物质浓度低时也可以以高灵敏度检测所述目标物质的方法以及用于所述方法的适体组、传感器和装置。
附图说明
通过下述优选实施方案和伴随所述实施方案的如下附图，对上述目的、其他目的、特征和优势进行进一步说明。
图1是显示相关领域中的检测目标物质的方法的程序的图。
图2是显示在第一实施方案中检测目标物质的方法的程序的图。
图3是显示在第二实施方案中检测目标物质的方法的程序的图。
图4是显示在第三实施方案中检测目标物质的方法的程序的图。
图5是显示在第四实施方案中检测目标物质的方法的程序的图。
图6是显示在第五实施方案中检测目标物质的方法的程序的图。
图7是显示在第六实施方案中检测目标物质的方法的程序的图。
图8是显示在第七实施方案中检测目标物质的方法的程序的图。
图9是显示在第六实施方案中检测目标物质的方法的变形例的图。
图10是显示在第六实施方案中检测目标物质的方法的变形例的图。
图11是显示在第六实施方案中检测目标物质的方法的变形例的图。
图12是显示在第六实施方案中检测目标物质的方法的变形例的图。
具体实施方式
在下文中，使用附图对本发明的实施方案进行说明。另外，在所有附图中，利用相同的标号标记相同的构成要素，从而不再重复说明。
第一实施方案：
使用图2对第一实施方案进行说明。图2显示了根据第一实施方案检测目标物质的方法的程序。
在第一实施方案中检测目标物质5的方法包括准备包含试验样品(试验对象)中的目标物质5特异结合的第一适体1和所述目标物质5以外的非目标物质(第二配体6)特异结合的第二适体2的复合物4的步骤，其中所述第一适体1具有一个以上形成双链的双链形成位点，所述第二适体2具有两个以上双链形成位点，所述目标物质5结合的所述第一适体1的碱基序列包含所述第一适体1的所述双链形成位点的碱基序列的至少一部分，且所述第二配体6结合的所述第二适体2的碱基序列包含所述第二适体2的所述两个以上双链形成位点的碱基序列的至少一部分；将所述目标物质5结合到所述第一适体1上的步骤；将所述第二配体6结合到所述第二适体2上的步骤；以及检测所述第一适体1的所述双链形成位点的开裂的步骤。即，检测目标物质的方法包括准备包含试验样品(试验对象)中的目标物质5特异结合的第一适体1和所述目标物质5以外的非目标物质(第二配体6)特异结合的第二适体2的复合物4的步骤，其中所述第一适体1具有一个以上形成双链的双链形成位点，且所述第二适体2具有两个以上双链形成位点；通过将所述目标物质5结合到所述第一适体1上而将所述第一适体1的所述双链形成位点开裂的步骤；通过将所述物质(所述第二配体6)结合到所述第二适体2上，使得与所述第一适体1形成双链核酸位点的所述第二适体2的结构(所述第二适体2的一部分的结构)变形或使得与所述双链形成位点相对应的所述第一适体1的结构变形的步骤；以及对所述第一适体1的所述双链形成位点的开裂进行检测的步骤。
首先，准备复合物4。所述复合物4包含具有与第一适体2的一部分互补的序列的核酸片段3。本文中，在复合物4中，第一适体1与第二适体2在至少一个位点处形成双链形成位点，且第二适体2不仅与第一适体1而且与核酸片段3形成双链形成位点(图2(a))。在第一实施方案中，适体的双链形成位点是指其中适体与具有适体的互补序列的互补链(另一个适体或核酸片段)形成双链核酸的位点(下文中简称作双链核酸位点)。另外，第二适体2和第一适体1具有共用的双链核酸位点(共享具有相同碱基序列的区域)，或双链核酸位点是具有与第一适体1的双链核酸位点互补的碱基序列的位点。
在第一实施方案中，目标物质5为第一配体，且不同于目标物质5的物质为第二配体6。而且，已经向试验样品(试验对象)添加了第二配体6。
接下来，通过分为如下第一至第四的步骤对从准备复合物4的步骤至检测目标物质5的步骤的步骤进行描述。在第一实施方案的第一步骤中，将目标物质5结合到第一适体1上(图2(b))。在复合物4中，第一适体1的一端形成双链核酸位点，另一端保持为单链。即，第一适体1的一端的结构可自由变形。因此，第一适体1能够形成如同适体的三维结构并结合到试验对象中的目标物质5上。
随后，在第一实施方案的第二步骤中，将在第一适体1与第二适体2之间形成的双链核酸位点中的双链开裂。即，当在第一步骤中第一适体1结合到目标物质5上时，双链核酸位点因分支移位而损失。当目标物质5与第一适体1之间的结合比形成第一适体1的双链核酸位点的核酸之间的结合强时，发生分支移位。当第一适体1的双链核酸位点以此方式损失时，第一适体1与第二适体2分离(图2(c))。此时，目标物质5结合的第一适体1的碱基序列与第一适体1的双链形成位点的碱基序列部分或完全相同。因此，当目标物质5结合到第一适体1上时，双链核酸位点中第一适体1的结构发生变形，由此第一适体1从第二适体2开裂。
其后，在第一实施方案的第三步骤中，第二配体6结合到第二适体2上(图2(d))。在第二步骤之前，第二适体2的两个位点具有双链核酸位点。即，第二适体2的两端的结构不会自由变形。因此，第二适体2不能形成如同适体的三维结构并不会结合到第二配体6上。另一方面，当在第二步骤中第一适体1的第二适体2开裂时，第二适体2具有一个双链核酸位点。换言之，第二适体2的一端的结构可以自由变形。结果，第二适体2能够形成如同适体的三维结构。因此，第二适体2能够结合到试验样品中存在的第二配体6上。而且，第二配体6结合的第二适体2的碱基序列与第二适体2的两个双链形成位点的碱基序列部分或完全相同。因此，当第二配体6结合到第二适体2上时，第二适体2的两个双链核酸位点的结构发生变形。当与第一适体1的双链核酸位点相对应的第二适体2的双链核酸位点的结构发生变形时，第一适体1不能容易地形成双链核酸位点。另一方面，当与具有核酸片段3的双链核酸位点相对应的第二适体2的双链核酸位点的结构发生变形时，如后所述，第二适体2从核酸片段3开裂。
随后，在第一实施方案的第四步骤中，在第二适体2与核酸片段3之间形成的双链开裂。当在第三步骤中第二适体2结合到第二配体6上时，与第二步骤类似，双链核酸位点因分支移位而损失。在开裂时，第二适体2与互补核酸片段3分离(图2(e))。其后，对第一适体1的双链形成位点的开裂进行检测。此时，对在第一适体1的双链形成位点中的开裂进行检测是指，例如对诸如光信号、电信号和颜色信号的信号的变化进行检测，但不限于此，只要能够对由双链核酸位点中的双链的开裂造成的物理和化学变化进行检测即可。
本文中，以与专利文献中公开的技术进行比较的方式对第一实施方案的作用和效果进行描述。
在上述专利文献中公开的杂交状态的开裂期间，相对于适体，在目标物质与互补链之间发生竞争反应。此外，由于竞争反应是平衡反应，所以当目标物质的浓度低时，在某些情况中开裂的适体与互补链再次形成双链。因此，适体的开裂的发生程度小，且这使得难以获得足够程度的信号变化。
另一方面，在第一实施方案中，由于物质(第二配体6)到第二适体2的结合，所以具有与第一适体1的双链核酸位点互补的碱基序列的第二适体2的一部分的结构发生变形。因此，第一适体1难以与这种变形结构的碱基序列形成双链。结果，即使将目标物质5从第一适体1脱离，仍可抑制第一适体1与第二适体2再次形成双链核酸位点。因此，能够保持第一适体1的双链核酸位点中的双链的开裂。因此，即使当目标物质5的浓度低时，与上述专利文献中公开的技术相比，第一适体1的双链核酸位点的开裂中的信号变化程度仍可以提高。因此，根据第一实施方案，可以以高灵敏度检测目标物质。
而且，在第一实施方案中，当试验对象不含结合到第一适体1上的物质时，第一适体1不会结合到试验样品中的物质上，且第一适体1与第二适体2之间的双链核酸位点中的双链不会消失。因此，第二适体2与互补核酸片段3之间的双链核酸位点中的双链也不会开裂。因此，通过检测在第一适体1与第二适体2之间形成的双链核酸位点中的开裂和在第二适体2与互补核酸片段3之间形成的双链核酸位点中的开裂中的任一种或两种，可检测在试验对象中是否含有目标物质5。
在第一实施方案中，在试验对象中第二配体6的浓度优选等于或高于第二适体2与第二配体6之间的解离常数(Kd2)，并优选等于或高于包含第一适体1、第二适体2和核酸片段3的复合物4的浓度。以该方式，以其中约一半以上的第二适体2结合到第二配体6上的状态放置在第四步骤中从核酸片段3解离的第二适体2。如果这样，即使在第二步骤中从第二适体2分离的第一适体1根据平衡反应释放目标物质5并形成单链，仍抑制第一适体1再次结合到第二适体2上。因此，即使当目标物质5的浓度低时，第一适体1与第二适体2之间的解离仍进行，由此能够获得强的信号。
另外，由于进行第一适体1的解离，所以也进行第二适体2与互补核酸片段3之间的解离，因为已经添加了足够量的第二配体6。结果，对在第二适体2与互补核酸片段3之间形成的双链核酸位点中的开裂进行检测，也可以获得强的信号。
此外，可通过对在第一适体1与第二适体2之间形成的双链核酸位点中的开裂和在第二适体2与互补核酸片段3之间形成的双链核酸位点中的开裂两者都进行检测而进行双重试验。结果，提高了测量的可靠性。为此，例如可将不同类型的荧光分子用于其中第一适体1的双链核酸位点开裂的情况和其中核酸片段3的双链核酸位点开裂的情况中的各种情况，使得发射具有不同波长的荧光，由此可区别由各双链核酸位点的开裂造成的信号变化。
另外，第二配体6的浓度越高，则第二配体2与第二配体6的结合体的存在比例的提高得越多。因此，第二配体6的浓度优选为第二适体2与第二配体之间的解离常数(Kd2)的5倍以上，更优选50倍以上。
而且，在图2(a)中，在第一步骤之前，已经将第二配体6添加至作为测量溶液的试验对象中。尽管添加的时机没有特别限制，但是第二配体6可在第二适体2已经恢复作为适体的结合能力时存在，且可以与第一至第三步骤同时或在各步骤之间添加。
在第一实施方案的检测目标物质的方法中，第一适体1为能够特异结合到目标物质5上的核酸。第一适体1可包含能够与第二适体2形成双链核酸位点的互补碱基序列。第一适体1可以为例如DNA或RNA、或人造核酸如PNA。尽管没有特别限制，但是第一适体1优选具有特异结合到目标物质5的表位上的适体的结构，或可包含不会以其一部分结合到目标物质5的结构区域。通过例如使用已知的适体筛选法如SELEX法，能够得到第一适体1。另外，如果需要，可以合成其中利用期望的碱基序列补充通过SELEX等得到的核酸序列的适体。在第一适体1与第二适体2之间的双链核酸位点可位于第一适体1的任意区域如所述适体的端部或中心中。而且，第一适体1的单链核酸的整个序列可形成双链核酸位点。此处，本文中的双链核酸位点优选以包含结合到目标物质5上的碱基序列的一部分的方式形成，并优选具有5～20个碱基长度，使得在目标物质5结合到第一适体1上时易于发生分支移位。另外，利用用于检测后述双链核酸位点的荧光物质或标记物质如淬灭剂，可对第一适体1进行改性。
在第一实施方案的检测目标物质的方法中，第二适体2为能够特异结合到第二配体6上的核酸，且可具有能够与第一适体1和核酸片段3形成双链核酸位点的互补碱基序列。作为第二适体2，能够使用利用已知的适体筛选法如SELEX得到的DNA、RNA、PNA等，正如第一适体1。如果需要，可合成其中利用期望的碱基序列补充通过SELEX等得到的核酸序列的适体。在第二适体2与第一适体1之间的双链核酸位点可位于第二适体2的任意区域如第二适体2的端部或中心中。此处，第二适体2与第一适体1之间的双链核酸位点优选以包含结合到第二适体2上的碱基序列的一部分的方式形成，从而在第二配体6结合时抑制第一适体1再次结合，并优选具有5～20个碱基长度。即，第二配体6(物质)的结合使得可使得与双链核酸位点相对应的第一适体1的互补链(第二适体2)的结构变形。另外，在第二适体2与核酸片段3之间形成的双链核酸位点优选以包含结合到第二配体6上的碱基序列的一部分的方式形成，使得在第二配体6结合到其上时易于发生分支移位，并具有5～20个碱基长度。而且，为了检测后述双链核酸位点，可利用荧光物质或标记物质如淬灭剂对第二适体2进行改性。
在第一实施方案的检测目标物质的方法中，核酸片段3具有能够与第二适体2形成双链核酸位点的互补碱基序列并能够使用例如DNA、RNA和PNA。而且，除了与第二适体2互补的碱基序列之外，核酸片段3可在其一部分中还具有非互补的碱基序列。在核酸片段3与第二适体2之间的双链核酸位点可位于核酸片段3的任意区域如其端部或中心中。另外，为了检测后述双链核酸位点，可利用荧光物质或标记物质如淬灭剂对核酸片段3进行改性。
在第一实施方案的检测目标物质的方法中，通过对含有各核酸的混合物的溶液进行退火能够形成具有其中第一适体1和核酸片段3结合到第二适体2上的构造的复合物4。关于实施退火的条件如温度或时间，可应用一般条件。根据所使用的序列的互补碱基对的长度或类型、盐浓度等，对条件进行适当设置。
在第一实施方案的检测目标物质的方法中，复合物4的浓度没有特别限制。然而，所述浓度优选等于或大于1nM且等于或小于1mM，使得易于检测在双链核酸位点中的开裂。
通常在含有试验对象的溶液中实施第一实施方案的检测目标物质的方法。本文中的溶液可以为一般的反应溶液。另外，在实施各步骤时的条件如温度、pH和金属离子可适当设置。为了促进目标物质5到第一适体1上的结合，优选将Mg2+离子添加到溶液中。此处，在本实施方案的检测目标物质的方法中，使用核酸的双链区域，从而使得不能保持核酸的双链结合的温度条件或pH是不期望的。
在第一实施方案的检测目标物质的方法中，作为检测在第一适体1与第二适体2之间形成的双链核酸位点中的开裂和在第二适体2与互补核酸片段3之间形成的双链核酸位点中的开裂的方法，能够使用检测双链核酸的开裂的一般方法，且所述方法没有特别限制。作为检测双链核酸的开裂的方法，能够使用例如使用荧光染料或淬灭剂的方法(非专利文献3)、利用金纳米粒子对核酸进行改性以检测其聚集和分散的方法(专利文献1)、使用用于通过真实时间PCR确定双链核酸位点的量的双链核酸用指示剂如SYBR Green I的方法等。
本文中，再次使用图2对在使用荧光染料(荧光物质8)和淬灭剂9作为改性物质时对双链核酸位点的开裂进行检测的实例进行说明。在图2(a)中，利用荧光物质8对第二适体2的一端进行改性，并利用淬灭剂9对核酸片段3的一端进行改性。第二适体2的末端的碱基序列和核酸片段3的末端的碱基序列形成相互互补的连续序列，使得荧光物质8和淬灭剂9变得相互接近。
首先，在与复合物4接触之前对试验对象的溶液(图2(a))进行荧光测量。当利用激发光照射溶液时，因为荧光物质8接近核酸片段3的淬灭剂9，所以对第二适体2进行改性的荧光物质8的荧光变弱。
其后，在使试验对象与复合物4接触之后，对溶液实施荧光测量。当试验对象含有目标物质5时，目标物质5结合到第一适体1的双链核酸位点上(图2(b))，且第一适体1与第二适体2分离(图2(c))。随后，第二适体2结合到第二配体6上(图2(d))，第二配体的双链核酸位点发生损失，且第二适体2与核酸片段3分离(图2(e))。结果，淬灭剂9与荧光物质8分离，由此第二适体2的荧光物质8的荧光恢复。因此，当使目标物质5与第一适体1接触时，溶液的荧光强度提高。当试验对象不含目标物质5时，因为连续保持第一适体1到核酸片段3上的结合，所以第二适体2不分离，从而使得溶液的荧光强度不变。
通过使用上述方法，对使试验对象与复合物4接触前后的荧光强度进行比较，由此能够研究目标物质5的存在与否。
而且，在第一实施方案中，能够将含有复合物4的适体组用于检测目标物质5。即，该适体组包括包含试验样品中的目标物质5特异结合的第一适体1和目标物质5以外的非目标物质(第二配体6)特异结合的第二适体2的复合物，其中第一适体1具有一个以上双链核酸位点，第二适体2具有两个以上双链核酸位点，目标物质5结合的第一适体1的碱基序列包含第一适体1的双链核酸位点的碱基序列的至少一部分，且第二配体6结合的第二适体2的碱基序列包含第二适体2的两个以上双链核酸位点的碱基序列的至少一部分。在适体组中，将目标物质5结合到第一适体1上导致第一适体1的双链形成位点开裂。另一方面，将第二配体6结合到第二适体2上导致与双链形成位点相对应的第一适体1的结构变形、或与第一适体1形成双链核酸位点的结构变形。以这种方式，获得了本实施方案的效果。
另外，根据第一实施方案检测目标物质5的装置包含：接触单元，所述接触单元使得含有目标物质5的试验对象与其中第一适体1、第二适体2和核酸片段3各自在双链核酸位点中形成双链的复合物4接触；和检测单元，所述检测单元对复合物4的双链核酸位点中的开裂进行检测。即，检测装置包含：接触单元，所述接触单元使得上述适体组与目标物质5接触；和检测单元，所述检测单元对复合物4的双链核酸位点的开裂进行检测。对双链核酸位点的开裂进行检测的这种检测单元没有限制，只要其能够对由双链核酸位点的开裂造成的物理和化学变化进行检测即可，且例如所述检测单元对信号如光信号、电信号和颜色信号的变化进行检测。在检测目标物质的装置中，即使目标物质的浓度低，通过检测目标物质的上述方法仍会造成很大的信号变化，并获得高的测量灵敏度。
而且，在第一实施方案中，第一适体1和/或第二适体2与双链核酸位点中的核酸片段3形成双链，由此构成复合物4。
第二实施方案：
在第二实施方案中，对其中将含有第一适体1、第二适体2和核酸片段3的复合物4的至少一个位点固定在构件上的情况进行说明。图3是显示第二实施方案中检测目标物质的方法的程序的图。
而且，由于第二实施方案是第一实施方案的应用，所以不再对以与第一实施方案相同方式应用的要点进行重复说明。
在第二实施方案的复合物4中，第一适体1与第二适体2在至少一个位点中形成双链核酸位点，且第二适体2不仅与第一适体1而且与核酸片段3形成双链核酸位点。将第一适体1、第二适体2和核酸片段3中的至少一个位点固定在构件上，结果，将复合物4固定在构件上。
在第二实施方案中，可使用与第一实施方案中相同的第一适体1、第二适体2和核酸片段3。然而，优选的是，它们中的至少一个具有用于固定在构件上的官能团。这种官能团没有限制，只要其能够与构件表面形成共价键或能够特定吸附在表面上即可。其实例包括羧基、氨基、硫醇基、二硫化物基、琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基、生物素等。作为这些官能团，能够使用通过一般核酸合成法制备的官能团。而且，官能团可以对任意位点进行改性，只要其不会妨碍适体到配体上的特异结合即可。例如，官能团可以对第一适体1、第二适体2或核酸片段3的末端或中心区域进行改性。
根据第二实施方案的构件在其材料方面没有特别限制，只要能够将核酸固定在构件上或能够对构件进行处理以固定核酸即可。将核酸固定在构件上的方法的实例包括：通过使用核酸的官能团和构件表面的官能团形成肽键的方法；向构件表面上提供金、铂、银、钯等并然后使得核酸的硫醇基化学吸附到表面上的方法；以及将抗生物素蛋白固定到构件表面上以形成生物素-抗生物素蛋白键的方法等。当构件不含这些官能团时，可利用硫醇、硅烷等对构件进行处理以形成期望的官能团。作为构件，可以使用基材11、粒子如小球、微阵列芯片等。将核酸固定在构件上的时机没有特别限制，且时机可以为在形成包含第一适体1、第二适体2和核酸片段3的复合物4之后的时机。或者，在将具有官能团的核酸固定在构件上之后，另一个核酸可以与固定的核酸杂交。另外，当将导电材料用于构件时，也可以将其上固定复合物4的构件用作传感器元件，将在本发明的第三实施方案中对所述传感器元件进行说明。
将对根据第二实施方案的目标物质5的检测进行说明。当在第二目标分子(第二配体6)的存在下传感器(其上固定复合物4的基材11)接触目标物质5时，在第一适体1与第二适体2之间形成的双链核酸位点中的双链和在第二适体2与核酸片段3之间形成的双链核酸位点中的双链以与第一实施方案中所述的第一至第四步骤中相同的机制开裂。因此，与第一实施方案类似，对双链核酸位点的开裂进行检测使得可检验在试验对象中是否存在目标物质5。另外，在第二实施方案中，获得了与第一实施方案中相同的效果。
在第二实施方案中，对双链核酸位点的开裂进行检测的方法没有特别限制。例如，在复合物4中，将核酸片段3固定在基材11(构件)上，并对第一适体1进行标记。利用荧光染料(荧光物质8)、放射性同位素(RI)、荧光淬灭剂等提前对第一适体1进行标记。其后，通过测量由这些标记产生的基材表面上的信号强度，能够检测在第一适体1与第二适体2之间的开裂。另外，通过已知方法如表面等离子体共振和石英晶体微天平可确定结合到构件表面上的核酸的重量。下文中，使用图3对使用荧光染料作为标记物质并使用基材11作为构件的实例进行说明。
首先，在尚未与试验对象接触的基材11的表面上实施荧光测量(图3(a))。利用激发光对基材11进行照射以激发对第一适体1进行改性的荧光物质8。从荧光物质8发射荧光，由此能够测量强度随基材11表面上的荧光物质8(荧光分子)的量的变化。
随后，对已经与试验对象接触的基材11实施荧光测量。当试验对象含有目标物质5时(图3(b))，如果使目标物质5与复合物接触，则第一适体1的双链核酸位点发生损失。因此，第一适体1与第二适体2并与基材11分离(图3(c))。其后，第二适体2结合到第二配体6上(图3(d))，第二适体2的双链核酸位点发生损失，且第二适体2与基材11分离(图3(e))。因此，当使目标物质5与复合物接触时，基材11表面上的荧光强度变弱。当试验对象不含目标物质5时，连续保持第一适体1到基材11上的结合，从而使得基材11表面的荧光强度不会变化。
通过使用上述方法，对使试验对象与复合物接触前后基材11表面上的荧光强度进行比较，由此能够研究目标物质5的存在与否。与基材11分离的第一适体1能够通过平衡反应从目标物质5解离。为了使解离的第一适体1再次结合到构件(基材11)上，其中第一适体1接触第二适体2以再次形成双链核酸位点的过程与其中第一适体1和第二适体2的组合接触基材11上的互补核酸片段3的过程是必要的。由因为试验样品的溶液在高浓度下含有第二配体6，所以结合到第一适体1上的第二适体2的比例极小的要点以及即使第一适体1再次结合到第二适体2上，分散在溶液中的组合仍在低频率下接触基材11表面上的互补核酸片段3的要点产生协同效应。因此，曾经从构件释放的第一适体1实际上不会再次结合到基材11上。因此，与不使用构件的第一实施方案相比，即使当目标物质5的浓度低时，第一适体1与第二适体2之间的解离仍然进行，由此能够获得更大的信号变化。
另外，如果需要，通过在实施荧光测量之前改变测量溶液可除去与构件分离的适体。以这种方式，将溶液中的荧光物质除去，从而使得背景信号下降，由此能够提高测量灵敏度。
此外，尽管在第二实施方案中将互补核酸片段3固定在构件上，但是所述核酸片段不是仅有的固定在构件上的物质，并也可以固定第一适体1或第二适体2。另外，第一适体1不是仅有的被标记的核酸，且也可以对第二适体2或互补核酸片段3进行标记。这些核酸可以以适当的组合使用，只要它们使得在第一实施方案的第一步骤至第四步骤中所述的双链核酸位点的开裂可产生信号变化即可。
而且，在第二实施方案中，能够将包含复合物4的传感器用于检测目标物质5。这种传感器还包含其上固定复合物4的构件。即，该传感器包括包含试验样品中的目标物质5特异结合的第一适体1和目标物质5以外的非目标物质(第二配体6)特异结合的第二适体2的复合物，其中第一适体1具有一个以上双链形成位点，第二适体2具有两个以上双链形成位点，目标物质5结合的第一适体1的碱基序列包含第一适体1的双链核酸位点的碱基序列的至少一部分，且第二配体6结合的第二适体2的碱基序列包含第二适体2的两个以上双链核酸位点的碱基序列的至少一部分；和其上固定复合物的构件。在该传感器中，将目标物质5结合到第一适体1上导致第一适体1的双链形成位点开裂。另一方面，将第二配体6结合到第二适体2上导致与双链形成位点相对应的第一适体1的结构变形、或与第一适体1形成双链核酸位点的结构变形。以这种方式，获得了本实施方案的效果。而且，由于提供了已经将这些核酸的复合物4固定至其的构件，所以在需要时使用者能够立即实施目标物质的检测。
另外，第二实施方案的对目标物质5进行检测的装置包含：其上固定复合物4的构件(基材11)，在所述复合物4中第一适体1、第二适体2和核酸片段3各自在双链核酸位点中形成双链；接触单元，所述接触单元使得目标物质5与固定在构件上的复合物4接触；以及检测单元，所述检测单元对复合物4的双链核酸位点的开裂进行检测。即，该检测装置包含：结合单元，所述结合单元将目标物质5结合到第一适体1上；偶合单元，所述偶合单元将不同于目标物质5的偶合配体6偶合到第二适体2上；以及检测单元，所述检测单元对第一适体1的双链形成位点的开裂进行检测。在该装置中，将复合物4固定在构件上。因此，能够简化用于混合多种溶液的流动通道或阀机构。
第三实施方案：
第三实施方案是第二实施方案的应用，从而不再对相同要点进行重复说明。
图4是显示第三实施方案的检测目标物质的方法的程序的图。在将包含第一适体1、第二适体2和核酸片段3的复合物4固定在构件上方面，第三实施方案与第二实施方案相同。然而，在构件为导电构件方面，第三实施方案与第二实施方案不同。导电构件的实例包括电极12。作为电极12，优选使用诸如金、铂和碳的材料，因为这些材料具有高电导率高和可以容易地改性的表面。另外，为了通过扩大表面积来提高灵敏度，可将细材料如细金粒子、细铂粒子和碳纳米管连接到电极12的表面上。
除了将导电构件用作电极12并通过电化学测量对双链核酸位点的开裂进行检测之外，第三实施方案的检测目标物质5的方法与第二实施方案相同。作为通过电化学测量对双链核酸位点的开裂进行检测的方法，例如存在添加双链核酸结合物质如嵌入剂并通过使用在已经结合到双链核酸位点上的双链核酸结合物质在电极12中被氧化和还原时流动的电流的值来确定双链核酸位点的量的方法；利用电极反应物质对第一适体1、第二适体2或核酸片段3进行改性并通过使用电极12对伴随双链核酸位点的开裂的电子转移的变化进行测量的方法等。
下文中，通过使用图4，利用具体实例对在将导电材料用作电极12并利用作为电极反应物质的亚甲基蓝14对核酸片段3进行改性的情况中目标物质的检测机制进行说明。
在第三实施方案中，将核酸片段3固定在电极12上，并利用作为电极反应物质的亚甲基蓝14对核酸片段3进行标记。然而，固定在电极12上的核酸、利用电极反应物质改性的核酸以及所述电极反应物质不限于此，且能够适当选择并使用使得双链核酸位点的开裂可产生信号变化的组合。
首先，对尚未与试验对象接触的电极12(导电构件)(图4(a))与亚甲基蓝14之间的电子转移进行测量。通过例如将作为工作电极的电极12与图中未示出的参考电极和对电极一起连接到恒电位仪上，并在相对于银/氯化银参考电极在+0.1V～-0.5V的电位范围内实施方波伏安法(SWV)，能够测量电子转移。通过SWV，亚甲基蓝14根据亚甲基蓝14与电极12之间的接触频率而经历还原反应。以这种方式，将电子转移到电极上，并对还原电流进行观察。
其后，通过SWV对已经与试验对象接触的电极12与亚甲基蓝14之间的电子转移进行测量。当试验对象含有目标物质5时，如果使试验对象与复合物接触(图4(b))，则第一适体1的双链核酸位点发生损失。因此，第一适体1与第二适体2并与电极12分离(图4(c))。随后，第二适体2结合到第二配体6上(图4(d))。结果，第二适体2的双链核酸位点发生损失，且第二适体2与电极12分离(图4(e))。如果这样，则因为互补核酸片段3的双链核酸位点发生损失，所以互补核酸片段3的自由度提高，由此亚甲基蓝14与电极之间的接触频率提高。因此，当使目标物质5与复合物接触时，在很大程度上发生亚甲基蓝14与电极12之间的电子转移，从而观察到更大的还原电流。当试验对象不含目标物质5时，连续保持第一适体1到电极12上的结合。因此，亚甲基蓝14的电子转移没有变化，且还原电流值不会改变。
通过使用上述方法，对在使试验对象与复合物接触前后亚甲基蓝14与电极12之间的电子转移进行比较，由此能够研究目标物质5的存在与否。如同在第二实施方案中所述的，曾经与电极12分离的第一适体1不会再次结合到电极12上。因此，即使当目标物质5的浓度低时，在第一适体1与第二适体2之间的解离仍然进行，从而能够获得大的信号变化。另外，在第三实施方案中获得了与第一实施方案中相同的效果。
另外，在需要的情况如其中在使试验对象与复合物接触之前已经确定电子转移状态的情况、或其中在可忽略的程度上发生电子转移的情况中，在使试验对象与复合物接触之前的电子转移可不测量。
而且，在第三实施方案中，随着核酸自由度因双链核酸位点的开裂而增大，电子转移效率发生变化。然而，本发明不限于此，且例如可利用电子反应物质对从构件释放的核酸进行改性。例如，可以利用亚甲基蓝14对第二适体2进行改性。在此情况中，第二适体2因目标物质5而与电极12分离，从而使得在存在目标物质5时SWV中的还原电流值变小。
另外，根据第三实施方案的电极反应物质可以为展示电子转移效率随与电极12的接触频率而变化的物质。例如，能够使用金属或其复合物、杂环化合物、催化剂、酶等。金属的实例具体包括Os、Fe、Ru、Co、Cu、Ni、Ti、V、Mo、Cr、Mn、Ag、Pd、W和Au；这些金属的盐或氧化物；具有金属离子作为中心金属的复合物等的粒子。杂环化合物的实例包括醌如氢醌或蒽醌及其衍生物、亚甲基蓝及其衍生物、吡咯、吡啶、紫精等。催化剂的实例包括Pt、氧化钛等的细粒子。尽管没有特别限制，但是酶的实例包括氧化酶如葡萄糖氧化酶或胆红素氧化酶、脱氢酶如葡萄糖脱氢酶、辅酶氧化酶如心肌黄酶和过氧化物还原酶如山葵过氧化物酶或过氧化氢酶。
测量电子转移的方法没有特别限制，且能够使用各种电化学测量方法。所述方法的实例包括SWV、循环伏安法、差示脉冲伏安法、交流伏安法、交流阻抗法、电流分析法、电势测定法等。
另外，当将双链核酸结合物质用于检测双链核酸位点时，双链核酸结合物质没有限制，只要其具有特异结合到双链核酸位点上的性质和电极反应性即可。其实例包括亚甲基蓝、醌、吖啶、它们的衍生物等。而且，还可使用利用具有电极反应性的分子改性的嵌入剂。例如，可使用通过利用上述电极反应物质对含氮稠环化合物如吖啶或溴化乙锭或者嵌入剂如亚甲基蓝、苯并芘、放线菌素、诺加霉素、偏端霉素A、甲锭及它们的衍生物进行改性而得到的那些物质。作为检测这些物质的方法，可使用例如上述测量电子转移的方法。
第三实施方案的检测目标物质的装置包含：导电构件(电极12)，在其上固定了其中第一适体1、第二适体2和核酸片段3在双链核酸位点中形成双链的复合物4；接触单元，所述接触单元使得试验对象与电极12接触；以及检测单元，所述检测单元通过电化学测量对双链核酸位点的开裂进行检测。该装置不使用光学机制。因此，装置的构造能够简化，且所述装置能够小型化且成本低。
第三实施方案的传感器(用于检测目标物质的器件)为其上固定了其中第一适体1、第二适体2和核酸片段3形成双链核酸位点的复合物4的导电构件(电极12)。通过使用其上已经固定了这些核酸的构件，使用者在需要时能够立即对目标物质进行检测。
第四实施方案：
在第四实施方案中，第一适体1与第二适体2形成两个双链核酸位点，由此构成复合物4。
在第四实施方案中，第一适体1包含能够结合到上述目标物质5上的碱基序列、能够与第二适体2形成双链核酸位点的碱基序列以及任选的能够固定在构件(电极12)上的官能团和改性物质。第一适体1可还包含不结合到目标物质5上的碱基序列。不结合到目标物质上的碱基序列为例如能够与上述第二适体2形成双链核酸位点的核酸片段3的碱基序列。结合到目标物质5上的碱基序列优选不位于能够形成双链核酸位点的这两种碱基序列之间，使得第一适体1能够形成能够结合到目标物质5上的三维结构。另外，第一适体1可具有不结合到目标物质5上的结构区域。
作为第二适体2，可使用与第一至第三实施方案中所述相同的第二适体2。
接下来，通过使用图5对第四实施方案的检测机制进行详细说明。而且，不再对以与第一至第三实施方案中相同方式应用的要点进行重复说明。图5是显示第四实施方案的检测目标物质的方法的程序的图。
在第四实施方案中，第一适体1与第二适体2形成两个双链核酸位点，由此构成复合物4。在复合物4中，将第一适体1的一端固定在电极12(构件)上。利用作为电极反应物质的亚甲基蓝14对接近电极12的第二适体2的一端进行改性(图5(a))。
首先，通过SWV对尚未与试验对象接触的电极12(图5(a))与亚甲基蓝14之间的电子转移进行测量。通过SWV，亚甲基蓝14根据亚甲基蓝14与电极12之间的接触频率而经历还原反应，由此对还原电流进行观察。
其后，通过SWV对与试验对象接触的电极12与亚甲基蓝14之间的电子转移进行测量。当试验对象含有目标物质5时，如果使试验对象与复合物接触，则第一适体1的双链核酸位点中的一个由于分支移位而发生损失，且第一适体1的一部分与第二适体2分离(图5(b))。随后，第二适体2结合到第二配体6上(图5(c))，且第二适体2的双链核酸位点发生损失。结果，第二适体2与电极12分离(图5(d))。如果这样，则亚甲基蓝14与电极12分离，从而使得亚甲基蓝14与电极12之间的接触频率下降。因此，当使目标物质5与复合物接触时亚甲基蓝14与电极12之间的电子转移发生较少，且测得的还原电流下降。另一方面，当试验对象不含目标物质5时，连续保持第二适体2到电极上的结合。因此，亚甲基蓝14的电子转移没有变化，且还原电流值不会改变。
通过使用上述方法，对在使试验对象与复合物接触前后亚甲基蓝14与电极12之间的电子转移进行比较，由此能够检测第一适体1与第二适体2之间的双链核酸位点的开裂。以这种方式，能够研究目标物质5的存在与否。由于第二配体6的浓度高，所以与第一适体1分离的第二适体2不能变为能够再次结合到第一适体1上的单链核酸。因此，即使当目标物质5的浓度低时，在第一适体1与第二适体2之间的解离仍然发生，从而能够获得大的信号变化。
另外，尽管在第四实施方案中通过亚甲基蓝14的SWV对目标物质5进行检测，但是本发明不限于此，并可以使用能够对由双链核酸位点的开裂造成的物理和化学变化进行检测的方法。以这种方式，能够实施目标物质5的检测。因此，构件不限于导电构件，且第一适体1和第二适体2的复合物4可不固定在构件上。
在第四实施方案的检测目标物质的方法中，由于第一适体1具有能够与第二适体2形成双链核酸位点的核酸片段3的碱基序列，所以可不使用核酸片段3。
第四实施方案的检测目标物质的装置包含：复合物4，其中第一适体1与第二适体2形成双链核酸位点；接触单元，所述接触单元使得检测对象与复合物4接触；以及检测单元，所述检测单元对双链核酸位点的开裂进行检测。在该检测装置中，即使当目标物质的浓度低时，通过上述检测目标物质的方法仍能够造成大的信号变化，并获得高测量灵敏度。
第四实施方案的传感器(用于检测目标物质的器件)包含其上固定了其中第一适体1与第二适体2形成双链核酸位点的复合物4的构件。由于提供其上已经固定了这些核酸的构件，所以使用者在需要时能够立即对目标物质进行检测。
第五实施方案：
在第五实施方案中，第一适体1与第二适体2在至少一个双链核酸位点中形成双链，由此构成复合物4。第二适体2与第一适体1形成双链核酸位点，并具有通过与第二适体自身的序列互补的碱基序列的杂交而形成的双链核酸位点。
在第五实施方案中，可使用与第一至第三实施方案中所述相同的第一适体1。另外，在第五实施方案中，第二适体2包含能够结合到第二配体6上的碱基序列、能够与第一适体1形成双链核酸位点的碱基序列、任选的能够固定在构件上的官能团和改性物质以及与第二适体自身的序列互补并能够与其杂交的碱基序列。使得与第二适体自身的序列互补的序列能够相互杂交的碱基序列，在第二配体6结合到该序列时，易于造成分支移位。因此，该序列优选以包含结合到第二配体6上的碱基序列的一部分的方式形成，并优选具有5～20个碱基长度。而且，第二适体2可具有不结合到第二配体6上的结构区域。
通过使用图6对第五实施方案的检测机制进行详细说明。另外，不再对以与第一至第三实施方案中相同的方式应用的要点进行重复说明。图6是显示第五实施方案的检测目标物质的方法的程序的图。
在第五实施方案的复合物4中，将第一适体1的一端固定在作为电极12的构件上。第二适体2具有通过与第二适体自身的序列互补的碱基序列的杂交而形成的双链核酸位点，并利用作为电极反应物质的亚甲基蓝14对接近电极12的适体的一端进行改性(图6(a))。
首先，通过SWV对尚未与试验对象接触的电极12(图6(a))与亚甲基蓝14之间的电子转移进行测量。通过SWV，亚甲基蓝14根据亚甲基蓝14与电极12之间的接触频率而经历还原反应，由此对还原电流进行观察。
其后，通过SWV对与试验对象接触的电极12与亚甲基蓝14之间的电子转移进行测量。当试验对象含有目标物质5时，如果使试验对象与复合物接触，则第一适体1的双链核酸位点由于分支移位而发生损失，且第一适体1与第二适体2分离(图6(b))。由于第二适体2的分离，对第二适体2进行改性的亚甲基蓝14与电极12分离。
随后，第二适体2结合到第二配体6上(图6(c))，且第二适体2的双链核酸位点发生损失(图6(d))。
通过使用上述方法，对在使试验对象与复合物接触前后亚甲基蓝14与电极12之间的电子转移进行比较，由此能够检测第一适体1与第二适体2之间的双链核酸位点的开裂。以这种方式，能够研究目标物质5的存在与否。当试验对象含有目标物质5时，亚甲基蓝14因双链核酸位点的开裂而与电极12分离。结果，亚甲基蓝14与电极12之间的接触频率下降。因此，当使目标物质5与复合物接触时，亚甲基蓝14与电极12之间的电子转移发生较少，由此测得的还原电流下降。当试验对象不含目标物质5时，第二适体2仍与第一适体1形成双链核酸位点，且通过与第二适体自身的序列互补的碱基序列的杂交而形成的双链核酸位点仍保持其形成时的状态。因此，第二适体2不能形成如同适体的三维结构，且不会结合到第二配体6上。因此，由于连续保持第二适体2到电极12上的结合，所以亚甲基蓝14的电子转移没有变化，且还原电流值不会改变。
由于第二配体6的浓度高，所以与第一适体1分离的第二适体2实际上不能变为能够再次结合到第一适体1上的单链核酸。因此，即使当目标物质5的浓度低时，在第一适体1与第二适体2之间的解离仍然进行，且能够获得大的信号变化。另外，在第五实施方案中，获得了与第一实施方案中相同的效果。
另外，尽管在第五实施方案中通过亚甲基蓝14的SWV对目标物质5进行检测，但是本发明不限于此。可以使用能够对由双链核酸位点的开裂造成的物理和化学变化进行检测的方法对目标物质5进行检测。因此，构件不限于导电构件，且第一适体1和第二适体2的复合物4可不固定在构件上。
在第五实施方案中，由于第二适体2具有一种与第二适体自身的其他序列互补的碱基序列并能够与其杂交，所以可不使用核酸片段3。
第五实施方案的检测目标物质的装置包含：接触单元，所述接触单元使得复合物4与检测对象接触，在所述复合物4中在双链核酸位点中第一适体1与通过使用与第二适体自身的序列互补的碱基序列形成双链的第二适体2形成至少一个双链核酸位点；以及检测单元，所述检测单元对双链核酸位点的开裂进行检测。在检测目标物质的装置中，即使当目标物质的浓度低时，通过上述检测目标物质的方法仍能够造成大的信号变化，并获得高测量灵敏度。
第五实施方案的传感器(用于检测目标物质的器件)具有其上固定了复合物4的构件，在所述复合物4中第一适体1与通过使用与第二适体自身的序列互补的碱基序列形成双链核酸位点的第二适体2形成至少一个双链核酸位点。由于提供其上已经固定了这些核酸的构件，所以使用者在需要时能够立即对目标物质进行检测。
第六实施方案：
在第六实施方案中，具有第一适体1的碱基序列和第二适体2的碱基序列的连结适体16与核酸片段3形成至少两个双链核酸位点。复合物4由连结适体16和核酸片段3构成。
第一适体1的碱基序列区域是指在第一至第三实施方案中所述的能够结合到目标物质上的第一适体1的碱基序列。所述碱基序列区域可具有不结合到目标物质5上的结构区域。另外，第二适体2的碱基序列区域是指在第一至第三实施方案中所述的能够结合到第二配体6上的碱基序列。所述碱基序列区域可具有不结合到第二配体6上的结构区域。第一适体1的碱基序列区域和第二适体2的碱基序列区域可位于连结适体16的任意区域中。例如，第一适体1的碱基序列区域和第二适体2的碱基序列区域中的各个碱基序列区域可位于连结适体的末端或中心。
能够与核酸片段3形成双链核酸位点的位点可位于连结适体16的任意区域中。例如，所述位点可位于连结适体16的末端或中心区域中。此处，优选以包含结合到目标物质5上的碱基序列的一部分的方式形成能够形成双链核酸位点的位点中的一个，使得在目标物质5结合到连结适体16上时易于发生分支移位，且其长度优选由5～20个碱基构成。所述长度更优选由5～10个碱基构成，使得与目标物质5分离的第一适体1不易再次结合到其上。另外，能够形成双链核酸位点的位点优选包含结合到第二配体上的碱基序列的一部分，使得在第二配体6结合到适体上时易于抑制连结适体再次结合到核酸片段3上。更优选地，结合到双链核酸位点中的第二配体上的碱基序列由不超过10个的碱基构成，使得双链核酸位点易于因在目标物质5结合到适体上时造成的分支移位而开裂。而且，优选以包含结合到第二配体6上的碱基序列的一部分的方式形成能够形成双链核酸位点的位点中的其他区域，使得在第二配体6结合到适体上时易于发生分支移位，且其长度优选由5～20个碱基构成。
在第六实施方案中，目标物质5结合的第一适体1的碱基序列包含第一适体1的双链形成位点的碱基序列的至少一部分。因此，当目标物质5结合到第一适体1时，第一适体1的双链核酸位点的结构变形，且第一适体1与核酸片段3开裂(图7(b))。另外，第二配体6结合的第二适体2的碱基序列与第二适体2的两个双链形成位点的碱基序列部分或完全相同。因此，当第二配体6结合到第二适体2时，与第一适体1的双链核酸位点的一部分相对应的第二适体2的一个双链核酸位点的结构变形。由于第一适体1变形时仍保持其结构，所以抑制了第一适体1与核酸片段3再次形成双链核酸位点。另一方面，当第二配体6结合到第二适体2上时，具有与另一个与核酸片段3形成的双链核酸位点互补的碱基序列的第二适体2的双链核酸位点的结构发生变形。结果，第二适体2与核酸片段3开裂。因此，由于第二适体2与核酸片段3分离，所以构成连结适体16的第一适体1也与第二适体2一起与核酸片段3分离。以这种方式，进一步抑制了第一适体1与核酸片段3再次形成双链核酸位点(图7(d))。
另外，连结适体16可任选地含有能够固定在构件上的官能团和能够对双链核酸位点的开裂进行检测的改性物质。
在第六实施方案中，核酸片段3具有能够与连结适体16形成双链核酸位点的碱基序列。作为核酸片段，可以使用能够结合到连结适体的两个双链核酸位点上的两种核酸片段，或可以使用具有能够与连结适体形成两个双链核酸位点的碱基序列的一个核酸片段3。核酸片段3可任选地含有能够固定在构件上的官能团和能够对双链核酸位点的开裂进行检测的改性物质。在第六实施方案中，获得了与第一实施方案中相同的效果。
通过使用图7对第六实施方案的检测机制进行详细说明。另外，不再对以与第一至第三实施方案中相同的方式应用的要点进行重复说明。图7是显示第六实施方案的检测目标物质的方法的程序的图。
在第六实施方案中，包含第一适体1的碱基序列区域和第二适体2的碱基序列区域的连结适体16与核酸片段3形成两个双链核酸位点。一个双链核酸位点包含结合到目标物质5上的第一适体1的碱基序列和结合到第二配体6上的碱基序列，且另一个双链核酸位点包含结合到第二配体6上的碱基序列。将核酸片段3的一端固定在电极12上，并利用作为电极反应物质的亚甲基蓝14对另一端进行改性(图7(a))。
首先，通过SWV对尚未与试验对象接触的电极12(图7(a))与亚甲基蓝14之间的电子转移进行测量。通过SWV，亚甲基蓝14根据亚甲基蓝14与电极12之间的接触频率而经历还原反应，由此对还原电流进行观察。
其后，通过SWV对与试验对象接触的电极12与亚甲基蓝14之间的电子转移进行测量。当试验对象含有目标物质5时，如果使试验对象与复合物接触，则包含第一适体1的碱基序列的双链核酸位点由于分支移位而发生损失，且第一适体1与核酸片段3分离(图7(b))。随后，第二适体2结合到第二配体6上。在先前步骤中，与第一适体1的碱基序列区域形成双链核酸位点的第二适体2的碱基序列区域被释放。因此，第二适体2的碱基序列区域获得了如同适体的结构，从而使得第二适体2恢复了结合到第二配体6上的能力。结果，第二适体2的碱基序列区域结合到已经添加入溶液中的第二配体6上(图7(c))。当第二适体2的碱基序列区域结合到第二配体6上时，第二适体2的双链核酸位点发生损失，由此连结适体16与核酸片段3分离(图7(d))。由于连结适体16的双链核酸位点发生损失，所以核酸片段3的自由度提高，且亚甲基蓝14与电极12之间的接触频率提高。
通过使用上述方法，对在使试验对象与复合物接触前后亚甲基蓝14与电极12之间的电子转移进行比较，由此能够检测连结适体16与核酸片段3之间的双链核酸位点的开裂。以这种方式，能够研究目标物质5的存在与否。当试验对象含有目标物质5时，核酸片段3的自由度因双链核酸位点的开裂而提高，使得亚甲基蓝14与电极12之间的接触频率提高。因此，当使目标物质5与复合物接触时，在很大程度上发生亚甲基蓝14与电极12之间的电子转移。当试验对象不含目标物质5时，连续保持连结适体16到核酸片段3上的结合。因此，亚甲基蓝14的电子转移没有变化。
在与核酸片段3分离的连结适体16中，因为第二配体6的浓度高，所以连续保持第二适体2的碱基序列区域到第二配体6上的结合。因此，第一适体1实际上不能变为能够再次结合到核酸片段3上的单链核酸。鉴于此，即使当目标物质5的浓度低时，在第一适体1与第二适体2之间的解离仍然进行，由此能够获得大的信号变化。
另外，尽管在第六实施方案中通过亚甲基蓝14的SWV对目标物质5进行检测，但是本发明不限于此，且可以使用能够对由双链核酸位点的开裂造成的物理和化学变化进行检测的方法。因此，构件不限于导电构件，且核酸片段3与连结适体16的复合物4可不固定在构件上。当如同在QCM或SPR中使用核酸自身的重量或介电常数的变化对双链核酸位点的开裂进行检测时，可不利用改性物质对核酸进行改性。
在第六实施方案的检测目标物质的方法中，第一适体1和第二适体2中的各种适体可不由单独的单链核酸构成。
而且，在图7中，使用具有能够与连结适体16形成两个双链核酸位点的碱基序列的一个核酸片段3。然而，本发明不限于此，且可采用各种变形例。将这些变形例示于图9～12中。在这些变形例中，可采用其中连结适体16的第一适体1的碱基序列形成一个双链核酸位点、第二适体2的碱基序列形成两个以上的双链核酸位点、目标物质5充当触发器且所述双链核酸位点发生开裂的构造。例如，如图9中所示，可将两种不同的核酸片段3与连结适体16杂交以形成双链核酸位点。另外，如图10中所示，可将第二适体2的碱基序列与连结适体16的具有与核酸片段3相同的碱基序列的区域杂交以形成双链核酸位点。而且，如图11中所示，第一适体1的碱基序列可以与连结适体16的具有与核酸片段3相同的碱基序列的区域杂交以形成双链核酸位点，且第二适体2的碱基序列区域可与核酸片段3形成双链核酸位点。所述实施方案中的任一个都产生与第六实施方案中相同的效果。
此外，如图12中所示，连结适体16可具有能够与第一适体1的碱基序列和第二适体2的碱基序列形成双链核酸位点的碱基序列，且所述碱基序列可相互杂交以形成双链核酸位点。在该实施方案中，正如第六实施方案，获得了通过第一适体1的结构的变形而抑制第一适体1与第二适体2再次形成双链核酸位点的效果。
第六实施方案的检测目标物质的装置包含：接触单元，所述接触单元使得复合物4与检测对象接触，在所述复合物4中具有第一适体1的碱基序列区域和第二适体2的碱基序列区域的连结适体16与核酸片段3形成至少两个双链核酸位点；和检测单元，所述检测单元对双链核酸位点的开裂进行检测。在该检测目标物质的装置中，即使当目标物质的浓度低时，通过上述检测目标物质的方法仍能够造成大的信号变化，并获得高测量灵敏度。
第六实施方案的传感器(用于检测目标物质的器件)包含其上固定了复合物4的构件，在所述复合物4中具有第一适体1的碱基序列区域和第二适体2的碱基序列区域的连结适体16与核酸片段3形成至少两个双链核酸位点。由于提供其上已经固定了这些核酸的构件，所以使用者在需要时能够立即对目标物质进行检测。
第七实施方案：
在第七实施方案中，结合到连结适体16的第一适体1的碱基序列区域上的目标物质5因第二配体6到第二适体2的碱基序列区域上的结合而与第一适体1分离，并结合到另一个第一适体1上。随后，另一个第一适体1的双链核酸位点开裂，由此使得双链核酸位点的开裂放大。由于第七实施方案是第六实施方案的应用，所以不再对以与第六实施方案相同的方式应用的要点进行重复说明。
通过使用图8对第七实施方案的检测机制进行详细说明。图8是显示第七实施方案的检测目标物质的方法的程序的图。在第七实施方案中，与第六实施方案中相同，连结适体16与核酸片段3形成两个双链核酸位点，由此构成复合物4(图8(a))。核酸片段3利用亚甲基蓝14改性并固定在电极12上。
首先，与第六实施方案类似，通过SWV对尚未与试验对象接触的电极12(图8(a))与亚甲基蓝14之间的电子转移进行测量。
接下来，使试验对象与复合物4接触。当试验对象含有目标物质5时，如果使试验对象与复合物4接触，则目标物质5结合到第一适体1上(图8(b))。结果，包含第一适体1的碱基序列区域的双链核酸位点因分支移位而发生损失，由此第一适体1与核酸片段3分离(图8(c))。
其后，第二适体2结合到第二配体6上。在先前步骤中，与第一适体1的碱基序列区域形成双链核酸位点的第二适体2的碱基序列区域被释放。因此，与第六实施方案类似，第二适体2的碱基序列区域结合到已经添加入溶液中的第二配体6上(图8(d))。
随后，目标物质5与第一适体1的碱基序列分离。第一适体1的碱基序列区域接近第二适体2的碱基序列区域。因此，由于目标物质5和第二配体6的空间位阻，目标物质5和第二配体6相互竞争以结合到连结适体16上。因此，如果在溶液中存在第二配体6，则由于第一适体1的碱基序列结合到目标物质5上的平衡反应与第二适体2的碱基序列结合到第二配体6上的平衡反应之间的竞争反应，导致其中结合到第一适体1的区域上的目标物质5被逐出的反应。另外，目标物质5与第一适体1的碱基序列分离(图8(e))。当目标物质5分离时，第二适体2的双链核酸位点发生损失，且连结适体16与核酸片段3分离(图8(f))。由于核酸片段3与连结适体16之间的双链核酸位点发生损失，所以核酸片段3的自由度提高，且亚甲基蓝14与电极12之间的接触频率提高。
通过使用上述方法，对在使试验对象与复合物接触前后亚甲基蓝14与电极12之间的电子转移进行比较，由此能够检测连结适体16与核酸片段3之间的双链核酸位点的开裂。以这种方式，能够研究目标物质5的存在与否。
由于第二配体6造成空间位阻，所以已经结合到第二配体6上的连结适体16相对于目标物质5的表观结合常数下降。因此，与第一适体1的碱基序列分离的目标物质5优先结合到与不结合到第二配体6上的核酸片段3形成双链核酸位点中的双链的连结适体上(图8(a))。其后，双链核酸位点开裂，连结适体16与核酸片段3分离，且目标物质5再次与第一适体1的碱基序列分离。以这种方式，重复其中连结适体16因目标物质5而与核酸片段3分离的反应。结果，将双链核酸位点的开裂放大，且这使得可以以高灵敏度对目标物质5进行检测。
在第七实施方案中，可使用与第六实施方案中相同的第一适体1的碱基序列、相同的第二适体2的碱基序列和相同的连结适体16。本文中，第二适体2的碱基序列与第二配体6之间的解离常数(Kd2)对第一适体1的解离常数与目标物质5之间的解离常数(Kd1)之比(Kd2/Kd1)优选不超过1，更优选不超过0.2。以这种方式，易于导致其中目标物质5由于第二配体6到第二适体2的碱基序列上的结合而被逐出的反应。
添加至溶液中的第二配体6的浓度越高，第二适体2和第二配体6的组合的存在比例越高。因此，第二配体6的浓度优选为第二适体2与第二配体6之间的解离常数(Kd2)的5倍以上，更优选Kd2的50倍以上。以这种方式，易于导致其中目标物质5由于第二配体6到第二适体2的碱基序列的结合上而被逐出的反应。
另外，尽管在第七实施方案中通过亚甲基蓝14的SWV对目标物质5进行检测，但是本发明不限于此，且可以使用能够对由双链核酸位点的开裂造成的物理和化学变化进行检测的方法。因此，构件不限于导电构件，且核酸片段3与连结适体16的复合物4可不固定在构件上。当如同在QCM或SPR中使用核酸自身的重量或介电常数的变化对双链核酸位点的开裂进行检测时，可不利用改性物质对核酸进行改性。
第七实施方案的检测目标物质的装置包含：接触单元，所述接触单元使得复合物4与检测对象接触，在所述复合物4中具有第一适体1的碱基序列区域和第二适体2的碱基序列区域的连结适体16与核酸片段3形成至少两个双链核酸位点；和检测单元，所述检测单元对双链核酸位点的开裂进行检测。在检测目标物质的装置中，即使当目标物质的浓度低时，通过上述检测目标物质的方法仍能够以放大的方式造成双链核酸位点的开裂，并获得高测量灵敏度。
第七实施方案的传感器(用于检测目标物质的器件)包含其上固定了复合物4的构件，在所述复合物4中具有第一适体1的碱基序列区域和第二适体2的碱基序列区域的连结适体16与核酸片段3形成至少两个双链核酸位点。由于提供其上已经固定了这些核酸的构件，所以使用者在需要时通过使用本实施方案的检测目标物质的方法能够立即对目标物质进行检测。
而且，本实施方案还包含如下实施方案：
[1]一种检测目标物质的方法，所述方法包括：准备包含第一适体和第二适体的复合物，所述第一适体使用目标物质作为配体且所述第二适体为不同于所述目标物质的物质，其中所述第一适体具有至少一个以上双链核酸位点，所述第二适体具有至少两个以上双链核酸位点；通过将试验样品中的所述目标物质结合到所述第一适体上而使得所述第一适体和所述第二适体的所述双链核酸位点开裂；以及对所述双链核酸位点的开裂进行检测以对所述目标物质进行检测。
[2]根据实施方案[1]的检测目标物质的方法，其中所述第一适体和/或第二适体与核酸片段形成所述双链核酸位点中的双链以形成复合物。
[3]根据实施方案[1]或[2]的检测目标物质的方法，其中所述第二适体2形成通过与所述适体自身的序列互补的碱基序列的杂交而形成的双链核酸位点。
[4]根据实施方案[1]～[3]中任一项的检测目标物质的方法，其中所述第一适体与所述第二适体相互连结。
[5]根据实施方案[4]的检测目标物质的方法，其中已经结合到所述第一适体上的所述目标物质由于所述第二配体到所述第二适体上的结合而与所述第一适体分离，并再次结合到另一个第一适体上，从而放大所述双链核酸位点的开裂。
[6]根据实施方案[1]～[5]中任一项的检测目标物质的方法，其中所述第二适体与所述第二配体之间的解离常数对所述第一适体与所述目标物质之间的解离常数之比不超过1。
[7]根据实施方案[6]的检测目标物质的方法，其中所述第二适体与所述第二配体之间的解离常数对所述第一适体与所述目标物质之间的解离常数之比不超过0.2。
[8]根据实施方案[1]～[7]中任一项的检测目标物质的方法，其中将所述复合物固定在构件上。
[9]根据实施方案[1]～[8]中任一项的检测目标物质的方法，其中所述构件为电极，且对所述双链核酸位点的开裂作为电反应进行检测。
[10]根据实施方案[9]的检测目标物质的方法，其中利用电极反应物质对所述复合物进行改性，并使用根据所述电极反应物质与所述电极之间的电子转移检测到的值对所述双链核酸位点的开裂进行检测。
[11]根据实施方案[1]～[10]中任一项的检测目标物质的方法，其中所述第二配体的浓度为所述第二适体与所述第二配体之间的解离常数的5倍以上。
[12]根据实施方案[11]的检测目标物质的方法，其中所述第二配体的浓度为所述第二适体与所述第二配体之间的解离常数的50倍以上。
[13]根据实施方案[1]～[12]中任一项的检测目标物质的方法，其中所述第一适体和/或第二适体与核酸片段形成双链核酸位点以形成复合物。
[14]一种用于检测目标物质的方法中的传感器(用于检测目标物质的器件)，所述传感器包含：第一适体和第二适体以及构件，所述第一适体使用目标物质作为配体且所述第二适体作为不同于所述目标物质的物质结合到第二配体上，在所述构件中所述第一适体具有至少一个以上双链核酸位点，所述第二适体具有至少两个以上双链核酸位点，且由通过所述双链核酸位点相互结合的所述第一适体和所述第二适体形成的复合物固定在所述构件上。
[15]根据实施方案[16]的传感器(用于检测目标物质的器件)，其中将在所述第一适体和/或第二适体与核酸片段形成双链核酸位点时形成的复合物固定在构件上。
[16]根据实施方案[14]或[15]的传感器(用于检测目标物质的器件)，其中所述第二适体形成通过与所述第二适体自身的序列互补的碱基序列的杂交而形成的双链核酸位点。
[17]根据实施方案[14]～[16]中任一项的传感器(用于检测目标物质的器件)，其中所述第一适体与所述第二适体相互连结。
[18]根据实施方案[14]～[17]中任一项的传感器(用于检测目标物质的器件)，其中所述第二适体与所述第二配体之间的解离常数对所述第一适体与所述目标物质之间的解离常数之比不超过1。
[19]根据实施方案[18]的传感器(用于检测目标物质的器件)，其中所述第二适体与所述第二配体之间的解离常数对所述第一适体与所述目标物质之间的解离常数之比不超过0.2。
[20]根据实施方案[14]～[19]中任一项的传感器(用于检测目标物质的器件)，其中所述构件为电极，且对所述双链核酸位点的开裂作为电反应进行检测。
[21]根据实施方案[20]的传感器(用于检测目标物质的器件)，其中所述复合物利用电极反应物质改性，并可以使用根据所述电极反应物质与所述电极之间的电子转移检测到的值对所述双链核酸位点的开裂进行检测。
[22]一种对用于检测目标物质的方法中的目标物质进行检测的装置，包括：使得试验样品与复合物接触的手段，所述复合物包含第一适体和第二适体，所述第一适体使用目标物质作为配体且所述第二适体作为不同于所述目标物质的物质结合到第二配体上，其中所述第一适体具有至少一个以上双链核酸位点，所述第二适体具有至少两个以上双链核酸位点；以及对通过结合所述试验样品中的所述目标物质而造成的所述双链核酸位点的开裂进行检测的单元。
[23]根据实施方案[22]的检测目标物质的装置，还包含根据实施方案[14]～[21]中任一项的传感器(用于检测目标物质的器件)和对由所述试验样品中的所述目标物质到所述第一适体上的结合而造成的所述双链核酸位点从所述复合物的开裂进行检测的手段。
[24]根据实施方案[23]的检测目标物质的装置，还包含电反应检测手段，所述电反应检测手段对由所述试验样品中的所述目标物质到所述第一适体上的结合而造成的所述双链核酸位点从所述复合物的开裂作为电反应进行检测。
[25]根据实施方案[24]的检测目标物质的装置，还包含电子转移检测手段，所述电子转移检测手段通过使用根据所述电极反应物质与所述电极之间的电子转移检测到的值对所述双链核酸位点的开裂进行检测。
另外，不必说，上述实施方案和多个变形例，能够在其内容不相互冲突的范围内进行组合。而且，尽管在上述实施方案和变形例中对各个区域的结构等进行了详细说明，但是在满足本申请的发明的范围内能够以各种方式对所述结构等进行改变。
本申请要求基于2010年9月1日提交的日本专利申请2010-196053号的优先权，并将其内容并入本文中。

Claims (10)

1.一种检测目标物质的方法，包括：
准备复合物，所述复合物包含与试验样品中的目标物质特异结合的第一适体和与所述目标物质以外的非目标物质特异结合的第二适体，
其中所述第一适体包含一个以上形成双链的双链形成位点，所述第二适体包含两个以上双链形成位点，与所述目标物质结合的所述第一适体的碱基序列包含所述第一适体的所述双链形成位点的碱基序列的至少一部分，且与所述非目标物质结合的所述第二适体的碱基序列包含所述第二适体的所述两个以上双链形成位点的碱基序列的至少一部分；
将所述目标物质结合到所述第一适体上；
将所述非目标物质结合到所述第二适体上；以及
检测所述第一适体的所述双链形成位点的开裂。
2.如权利要求1所述的检测目标物质的方法，其中所述第一或第二适体通过与所述双链形成位点中的核酸片段形成双链而构成复合物。
3.如权利要求1或2所述的检测目标物质的方法，其中将所述第二适体的所述双链形成位点中的碱基序列相互杂交，其中所述碱基序列相互互补。
4.如权利要求1～3中任一项所述的检测目标物质的方法，其中将所述第一适体和所述第二适体相互结合。
5.如权利要求4所述的检测目标物质的方法，其中由于所述非目标物质与所述第二适体的结合而将结合到所述第一适体上的所述目标物质与所述第一适体分离，并使所述目标物质结合到另一个第一适体上。
6.如权利要求1～5中任一项所述的检测目标物质的方法，其中将所述复合物固定在构件上。
7.一种用于检测目标物质的适体组，包含：
复合物，所述复合物包含与试验样品中的目标物质特异结合的第一适体和与所述目标物质以外的非目标物质特异结合的第二适体，
其中所述第一适体包含一个以上形成双链的位点，所述第二适体包含两个以上双链形成位点，与所述目标物质结合的所述第一适体的碱基序列包含所述第一适体的所述双链形成位点的碱基序列的至少一部分，且与所述非目标物质结合的所述第二适体的碱基序列包含所述第二适体的所述两个以上双链形成位点的碱基序列的至少一部分。
8.一种用于检测目标物质的传感器，包含：
复合物，所述复合物包含与试验样品中的目标物质特异结合的第一适体和与所述目标物质以外的非目标物质特异结合的第二适体，
其中所述第一适体包含一个以上双链形成位点，所述第二适体包含两个以上双链形成位点，与所述目标物质结合的所述第一适体的碱基序列包含所述第一适体的所述双链形成位点的碱基序列的至少一部分，且与所述非目标物质结合的所述第二适体的碱基序列包含所述第二适体的所述两个以上双链形成位点的碱基序列的至少一部分；和
构件，在所述构件上固定有所述复合物。
9.如权利要求8所述的传感器，其中所述构件具有导电性。
10.一种装置，包含：
权利要求8或9的传感器；
将目标物质结合到第一适体上的手段；
将与所述目标物质不同的物质结合到第二适体上的手段；以及
用于检测所述第一适体的双链形成位点的开裂的手段。
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